JP4423397B2

JP4423397B2 - 特異的配列をもつニ本鎖ｄｎａを検出する方法

Info

Publication number: JP4423397B2
Application number: JP2006510260A
Authority: JP
Inventors: 憲彦箕浦; 真佐代小木曽
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-21
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2025-02-21
Also published as: JPWO2005080958A1; WO2005080958A1

Description

本発明は、ニ本鎖DNAを塩基特異的に検出するための新規な電気泳動用媒体、その製造方法及び該電気泳動用媒体を用いたニ本鎖ＤＮＡの検出方法に関する。

特定の塩基配列をもつDNAを、他のＤＮＡと識別し、検出する技術は、病気の予防や診断、創薬の研究等に応用が期待され、医療の分野で注目を浴びている。DNA塩基配列を検出するには、ジデオキシ法（非特許文献１参照）と呼ばれるDNA配列決定法を用いるのが一般的である。この方法は、一本鎖DNAを二本鎖へ修復する際に、ジデオキシヌクレオチドがデオキシヌクレオチドと同じように取り込まれ、３'-OHをブロックしてそこで修復を止めるという原理を利用している。加えるジデオキシヌクレオチド三リン酸の種類に応じてそれぞれの出現する位置で終止したDNA鎖が得られ、シークエンスゲルにかけて分析するという方法である。分析に使用するオートシークエンサーは高価であり、試料の調製に技術を要するので、ジデオキシ法は、もっぱら実験研究レベルで使用されている。より簡便に利用できる方法として、DNAマイクロアレイ（非特許文献２参照）が開発されている。

この方法は、DNAのハイブリダイゼーションを基本原理とするもので、具体的には、検出目的の塩基配列と相補的に結合する一本鎖DNAを基板上に固定し、あらかじめ蛍光物質やアイソトープでラベル化した検体の一本鎖DNAと相補的に結合させ、基板上に固定化した一本鎖DNAと結合した検体DNAを、蛍光やアイソトープ等で検出する方法である。このDNAマイクロアレイは、異なる検体DNAの塩基配列を比較解析できるので、臨床診断への応用が期待されている。
F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,74, 5463 (1977) 山下健一、竹中繁織、高木誠、ぶんせき, 5, 227-232 (2002)]

ジデオキシ法は、上述のとおり高価な設備を必要とし、試料の調製に技術を要するので、コストがかさみ、日常的に利用できる技術ではない。また、DNAマイクロアレイを利用し特定の塩基配列のDNAの有無を検出するには、始めに検体であるニ本鎖DNAを変性させて一本鎖にしなければならない。また、DNAのチップを作成するため、検出目的の塩基配列と相補的に結合する一本鎖DNAをあらかじめスライドガラスやシリコン等の基板に固定化させる必要がある。さらに、ハイブリダイゼーションの過程で、基板上に固定化したDNAと検体DNAのミスマッチが生じることがあるので、ハイブリダイゼーション条件を適正化し、ミスマッチを減らさなければならないため、条件の適正化に時間を要する。

上記の問題は、一本鎖DNAを使用するがゆえの問題である。ニ本鎖DNAをそのまま検体に利用でき、検出する手段があれば、検体DNAを変性させたり、一本鎖DNAを基板に固定化する必要がない。また、ハイブリダイゼーションを行なわないので、 DNA間のミスマッチも起こらない。一方、現在使用されている二本鎖DNAの分析方法は、もっぱら塩基長の違いを利用した電気泳動法によるもので、塩基配列が異なる二本鎖DNA同士でも、塩基長が同じであるならば、両者を区別し、検出しあるいは分離することができない。そのため、二本鎖DNAを一本鎖に変性させることなく、塩基特異的に検出、分離する方法が求められていた。

本発明者は、二本鎖DNA を二本鎖のまま塩基特異的に検出する方法を得るべく鋭意研究を進めた結果、特定の塩基配列を有する二本鎖DNAを認識して捕捉する高分子材料を分子インプリント法で作成し、これを電気泳動媒体に使用することにより、二本鎖DNAを塩基特異的に識別して、検出し、さらに分離することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。すなわち、本発明は、以下に示されるとおりのものである。

（１）検出及び／または分離対象の２本鎖のＤＮＡ分子形状が鋳型としてインプリントされた空孔を有するとともに、該空孔内に２本鎖ＤＮＡの塩基対を認識する置換基を有するインプリントポリマーゲルからなる電気泳動用媒体、２本鎖ＤＮＡを鋳型としてインプリントされていない非インプリントポリマーゲルからなる電気泳動用媒体、及び分子長既知の２本鎖ＤＮＡからなることを特徴とする、２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。

（２）上記２本鎖ＤＮＡの塩基対を認識する置換基が、以下の化学構造を有するものであることを特徴とする、上記（１）に記載の２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。
（３）ポリマーゲルが、架橋されたポリアクリルアミドゲルである、上記（１）又は（２）に記載の２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。

（４）上記（１）に記載のインプリントポリマーゲルおよび非インプリントポリマーゲルに、２本鎖ＤＮＡ含有被験試料をそれぞれ滴下して電気泳動を行い、以下のａ）またはｂ）を指標にして、該試料中の２本鎖含有試料を検出及び／または分離することを特徴とする、２本鎖ＤＮＡを検出及び／又は分離する方法。
ａ）上記インプリントポリマーゲルにおける分子長既知の２本鎖ＤＮＡの泳動距離に対する２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の相対泳動距離が、上記非インプリントポリマーゲルにおける分子長既知の２本鎖ＤＮＡ含有試料の泳動距離に対する２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の相対泳動距離よりも短縮化される２本鎖ＤＮＡが検出されるか否か。

ｂ）２つ以上の分子長既知の２本鎖ＤＮＡの混合試料を用いて、上記インプリントポリマーゲル及び非インプリントポリマーゲルにおける泳動距離と分子長を測定して検量線を作成しておき、該検量線を用いて上記インプリントポリマーゲル及び非インプリントポリマーゲルにおける２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の各泳動距離から分子長を求めたとき、インプリントポリマーゲルでの検量線より求めた分子長が、非インプリントポリマーゲルでの検量線より求めた分子長より大きくなる２本鎖ＤＮＡが検出されるか否か。

本発明は、ニ本鎖ＤＮＡ分子をインプリントしたポリマーゲルを電気泳動の媒体に用いることで、試料中のニ本鎖ＤＮＡを塩基特異的に検出及び／又は分離するものであり、この方法によれば、従来のジデオキシ法のように高価な設備を必要としないほか、試料の調製に格別の技術を必要とせず、また、マイクロアレイを使用するＤＮＡ検出において問題となっていた、検体二本鎖DNAの一本鎖への変性、一本鎖DNAの基板への固定化、ミスマッチを起こさないハイブリダイゼーションの条件設定等、手間のかかる操作を行うことなく、目的の塩基配列を持つDNAを簡便、迅速に検出及び／又は分離することが可能となるものである。

図１は本発明のインプリントポリマーゲルの製造工程の概略を示す模式図である。図２は本発明の被験試料中のニ本鎖ＤＮＡの検出法の概略を示す模式図である。図３はDNA混合サンプル中の鋳型分子と同じ塩基配列を持つDNAを検出するために用いた、インプリントゲル媒体とポリアクリルアミドゲル媒体における泳動用標準サンプルの泳動距離の相関グラフである。

本発明の特異的配列をもつニ本鎖 DNAを検出及び／又は分離する方法は、分子捕捉能を有する高分子材料を調製する工程と、調製した高分子材料を電気泳動用媒体として用いて電気泳動を行い、DNAを検出する工程とからなる。
分子捕捉能を有する高分子材料を調製する工程では、分子インプリンティングの技術を用いる。分子インプリント法は、ゲスト分子を鋳型として作成した空孔を有するポリマー（ホストポリマー）を得る方法であり、大別すると、ゲスト分子と、該ゲスト分子と非共有結合する機能性モノマーとを混合し、該ホストポリマーを形成するモノマーとを重合反応させた後、ゲスト分子を除く方法と、ゲスト分子と共有結合させた機能性モノマーと、該ホストポリマーを形成するモノマーとを重合反応させた後、ゲスト分子と機能性モノマーの共有結合を切断し、ゲスト分子を除去する方法とがある。
本発明においては、上記２つの方法を用いることができるが、実質的には前者の方法が好ましい。本発明においてはゲスト分子として、検出あるいは分離目的のニ本鎖ＤＮＡ分子を変性させることなくそのまま用い、
また、機能性モノマーとして該ニ本鎖ＤＮＡの塩基対を認識し、該塩基対と非共有結合的に結合する置換基を有し、かつホストポリマーを形成するモノマーと重合可能な官能基を有する化合物を用いる。
上記ニ本鎖ＤＮＡの塩基対を認識し、該塩基対と非共有結合的に結合する置換基としては、例えば以下の置換基が挙げられる。
（但し、式中、Yは、CＨ又はNを表す。）
また、ホストポリマーを形成するためのモノマーとしては、電気泳動用媒体として使用できる親水性ゲルを形成しうるモノマーであれば良い。

したがって、例えば、ホストポリマーとして、ポリアクリルアミドゲルを形成する場合、モノマーとしてはアクリルアミドを用い、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアリル酒石酸ジアミド、ビスアクリリルシステアミン等の架橋剤を使用してもよい。この場合において、機能性モノマーにおけるホストポリマーを形成する官能基は、アクリルアミドと共重合可能な官能基であり、例えば、ビニル基、アリル基、アクリロイル基、（メタ）アクリロイルオキシ基、ブタジエニル基、アクリルアミド基、シアノアクリロイルオキシ基等が挙げられる。このような機能性モノマー化合物の例は、以下の一般式に示される。
（但し、式中Ｘは、アクリルアミドと共重合可能な基であり、Yは、CＨ又はNを表す。）

上記［化１］の置換基は、二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン・チミン（Ａ・Ｔ）からなる塩基対を認識し、該塩基対と水素結合により非共有結合的に結合するため、該置換基を有する上記機能性モノマーは二本鎖ＤＮＡと自己集合する。
本発明において、二本鎖ＤＮＡ分子を検出するための電気泳動用媒体を得るには、検出目的の二本鎖ＤＮＡと上記機能性モノマーを混合し、自己集合物を得、該自己集合物の機能性モノマー部分と上記ポリマーゲルを形成するモノマーとを重合反応させ、次いで、この重合反応物から、上記二本鎖ＤＮＡを除去する。
これにより、ニ本鎖ＤＮＡ分子形状がインプリントされたポリマーゲルが得られる。該ポリマーゲルは、その構造中に、上記二本鎖ＤＮＡに対応する鋳型としての空孔を有し、該空孔表面には、上記機能性モノマーに由来する上記ニ本鎖ＤＮＡのA・T塩基対を認識し、該塩基対と非共有結合的に結合する置換基が存在する。

このポリマーゲルからなる電気泳動用媒体は、ＤＮＡ試料中から目的の塩基配列を持つニ本鎖ＤＮＡを検出及び／又は分離するために用いる。試料中のニ本鎖ＤＮＡを検出するには、上記ニ本鎖ＤＮＡを含有する試料を、上記電気泳動用媒体の陰極側に滴下して電気泳動を行う。試料中のニ本鎖ＤＮＡは陽極側に移動するが、上記試料中に目的とする塩基配列のニ本鎖ＤＮＡが存在する場合には、該ニ本鎖ＤＮＡは電気泳動用媒体を構成するポリマーゲル中にインプリントされた該ニ本鎖ＤＮＡ分子形状に対応する鋳型としての空孔に捕捉され、移動が妨げられる結果、電気泳動距離が短くなる。したがって、この電気泳動距離を検出することにより、試料中の目的とする塩基配列を持つニ本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させることなくその存在の有無を検出し、またこの泳動距離が短縮されたニ本鎖ＤＮＡを電気泳動用媒体から採取することにより、試料から目的とする塩基配列を持つニ本鎖ＤＮＡを単離することができる。

本発明においては、目的とするニ本鎖ＤＮＡと他のニ本鎖ＤＮＡとを塩基配列特異的に識別できる。その理由は以下のとおりである。
ニ本鎖ＤＮＡの塩基対はＡ・ＴとＣ・Ｇの２とおりではあるが、その並び方あるいは各塩基対の含有比は様々である。例えば、ニ本鎖ＤＮＡとして、Ａ（Ｔ）−Ｇ（Ｃ）−Ｇ（Ｃ）−Ｇ（Ｃ）−Ｇ（Ｃ）−Ａ（Ｔ）の塩基配列を有するあるＤＮＡを検出しようとする場合（なお、Ａ（Ｔ）は、ニ本鎖ＤＮＡ中の塩基対Ａ・Ｔを表し、Ｇ（Ｃ）は同塩基対Ｇ・Ｃを表す。）、上記ニ本鎖ＤＮＡをもとに、機能性モノマーとして、塩基対Ａ・Ｔを認識するモノマーを使用して上記ポリマーゲルを作製する。この場合、ポリマーゲル中にニ本鎖ＤＮＡの分子形状を鋳型としてインプリントされたポリマーゲルの空孔表面には、前者のニ本鎖ＤＮＡのＡ・Ｔの位置に対応した位置に、Ａ・Ｔを認識する置換基が配置されることになる。

したがって、被験試料中に上述の配列を持つニ本鎖ＤＮＡが存在すれば、そのニ本鎖ＤＮＡの塩基対Ａ・Ｔの位置は、上記ポリマーゲル中の鋳型空孔内にあるＡ・Ｔを認識する置換基の位置に合致し、自己集合により強固に捕捉される。これに対して、試料中に、例えばＡ（Ｔ）−Ｇ（Ｃ）−Ｇ（Ｃ）−Ａ（Ｔ）−Ｇ（Ｃ）−Ｇ（Ｃ）の塩基配列を有するニ本鎖ＤＮＡが存在していたとしても、空孔中の上記置換基の位置とこのニ本鎖ＤＮＡ中のＡ・Ｔの位置とは一部合致したとしても、完全には一致しない。この差異は、ポリマーゲルの捕捉能の差となって現れ、電気泳動による泳動距離に反映する。また、このようなポリマーゲルの捕捉能は、ニ本鎖ＤＮＡの塩基対Ａ・Ｔの含有比によっても異なる。したがって、本発明は、２本鎖ＤＮＡの分子形状による識別のみではなく、ポリマーゲル中の空孔内表面に特定の塩基対を識別する置換基を設けたことにより、塩基配列特異的にニ本鎖ＤＮＡを識別するものであって、特に該識別を電気泳動による泳動距離を指標として、簡便かつ容易に行い得るという全く新しい知見に基づくものである。

さらに、本発明のニ本鎖ＤＮＡを検出及び又は分離する方法について、第１図及び第２図を参照して、機能性モノマーとして２−ビニル−４，６−ジアミノ−１，３，５−トリアジン（VDAT）を、ポリマーゲル形成用モノマーとして、アクリルアミドを使用する場合を例にとり、さらに具体的に説明する。

本発明は、上記したように、（１）分子捕捉能を有するポリマーゲルを調製する工程と、（２）調製したポリマーゲルを用いて、電気泳動を行い被験試料中のニ本鎖ＤＮＡを検出及び／または分離する工程からなる。

（１）本発明においては、まず、検出目的の配列を持つニ本鎖DNAの認識部位を有するポリマーゲルを合成する。この工程は、目的分子と同一配列を持つニ本鎖DNA（鋳型ニ本鎖DNA）と、鋳型ニ本鎖DNAのA・T塩基対に特異的に相互作用する機能性モノマー、２−ビニル−４，６−ジアミノ−１，３，５−トリアジン(VDAT)との自己集合体を作成する工程（第１工程）、該自己集合体とポリマーゲル原料のモノマーを電気泳動用の泳動ゲル重合容器内で、重合させて鋳型ニ本鎖DNAとVDATを含有するポリマーゲルを形成する工程（第２工程）、該ポリマーゲルから鋳型ニ本鎖DNAを除去し、ポリマーゲル中に目的ニ本鎖DNAの認識部位を作成する工程（第３工程）に細分化される（第１図参照）。

第１の工程では、鋳型ニ本鎖DNAとVDATとを混合し、鋳型ニ本鎖DNA のA・T塩基対にVDATを自己集合させる操作を行う（第１図中、自己集合と表示）。この工程で用いられる鋳型ニ本鎖DNAは、ポリマーゲル中に作成する認識部位の鋳型となり、かつ検出、分離目的のニ本鎖DNAと同一の配列のものが用いられる。鋳型ニ本鎖DNAやVDATを溶解する溶液としては、蒸留水、精製水、超純水等の水の他、各種塩溶液、トリス塩酸等から成るpH緩衝液が用いられる。これらの溶解液は、鋳型二本鎖DNAの変性を起こさない濃度、pHでなければならない。鋳型二本鎖DNAとVDATの混合比は、用いるDNAの塩基配列より異なる。好ましくは、DNA中のA・T塩基対：VDATのモル比２０：１〜１：１の範囲である。より好ましくは、A・T塩基対：VDATのモル比１０：１〜１：１の範囲である。A・T塩基対とVDATのモル比で２０：１よりもA・T塩基対のモル比が多いと、後の操作で泳動ゲル中に作成される認識部位のVDATとの相互作用点が少なくなるため、認識効果が低下する。

また、A・T塩基対とVDATのモル比で１：１よりもVDATのモル比が多いと、鋳型二本鎖DNAと自己集合できない過剰量のVDATが生じる。過剰量のVDATは、第２工程での高分子原料モノマーの重合時、泳動ゲル中の認識部位以外の場所に不規則に固定化され、非特異的吸着を引き起こす原因となる。鋳型二本鎖DNAとVDATは混合後、たとえば室温あるいは冷蔵庫で２時間以上放置することにより、鋳型二本鎖ＤＮＡのA・T塩基対にVDATが結合した自己集合体が得られる。

第２工程では、第１工程で作成した鋳型二本鎖ＤＮＡとVDATの自己集合体溶液、ポリマーゲルの原料モノマーであるアクリルアミド、架橋剤のN, N´-メチレンビスアクリルアミドを混合した重合用溶液を作成し、電気泳動用の泳動ゲル重合容器中に充填して重合させる操作を行う（第１図中、重合反応と表示）。重合用溶液中の自己集合体溶液の濃度は、15v/v%以上30v/v%以下が好ましい。より好ましくは、20v/v%以上30v/v%以下である。15v/v%より少ないと、生成したポリマーゲル中の認識部位の数が少なくなり、充分な認識効果が得られない。また、30v/v%より多いと重合生成物が脆弱となる。

アクリルアミドとN, N´-メチレンビスアクリルアミド混合液（アクリルアミド：N,N´-メチレンビスアクリルアミドの重量比19:1）は、重合用溶液中に3.5v/v%以上となるよう混合する。混合量は、目的の二本鎖ＤＮＡの分子長により適宜選択する。自己集合体溶液に、あらかじめ減圧環境下で溶液中の酸素を追い出したアクリルアミドとN, N´-メチレンビスアクリルアミド混合液を混合し、重合用溶液を作成した後、重合開始剤の10w/v%過硫酸アンモニウム水溶液および重合促進剤のN,N,N´, N´-テトラメチレンジアミンを加え、電気泳動用の泳動ゲル重合容器中で重合させてポリマーゲルを得る。

第３工程では、第２工程で得たポリマーゲルから、鋳型二本鎖ＤＮＡを除去し、その溶出除去跡に所望とするＤＮＡ分子形状鋳型となる空孔（二本鎖DNA認識部位）を形成する。具体的には、第２工程で得たポリマーゲルを電気泳動装置に設置し、例えば、トリス−ホウ酸緩衝液、トリス-酢酸緩衝液、トリス-リン酸緩衝液等の適当な緩衝液を用いて、２〜10mAの電流で約３時間予通電することにより、鋳型二本鎖ＤＮＡを除去する（第１図中、電気泳動による抽出と表示）。このようにしてインプリントポリマーゲルを得る。また、鋳型ニ本鎖DNAを加えないで、これまでのすべての工程を同様に実施して非インプリントポリマーゲルを得る。

（２）第３工程を経たポリマーゲルを用いて DNAを検出する工程では、被験試料溶液について上記インプリントポリマーゲルを媒体として電気泳動を行い、分離された二本鎖DNAを染色して可視化する。この工程では、従来行われている、DNAの電気泳動方法が適用されるが、従来の泳動ゲルの替わりに上述のインプリントポリマーゲルを使用したものである。泳動後、インプリントポリマーゲル中に分離されたDNAをエチジウムブロマイドで染色し、DNAの泳動バンドを可視化した後、ポリマーゲルの認識部位に捕捉されて移動距離が短くなったDNA を検出する（第２図参照）。

この工程においては、まず、検出対象のニ本鎖ＤＮＡがインプリントされてない非インプリントポリマーゲル（従来、ニ本鎖DNAを分子長の違いにより分離する際に使用されるポリアクリルアミドゲル、第２図中A）２本と、検出対象のニ本鎖ＤＮＡがインプリントされたインプリントポリマーゲル（第２図中B）２本を用意する。それぞれのポリマーゲルで、分子長既知のニ本鎖ＤＮＡ（第２図中A、Bとも左側）と被検試料（第２図中A、Bとも右側）を各ポリマーゲルの上側より適用し、電気泳動を実施する。エチジウムブロマイドでDNAの泳動バンドを染色した後、検出された泳動バンドの泳動距離を測定し（図中a〜f に相当）、分子長既知のニ本鎖DNAの泳動距離を1.00 とした時の被験試料の相対移動距離を算出する(第２図中b/a、c/a、e/d、f/d)。

検出対象でないDNAに由来する泳動バンドの場合には、A、Bポリマーゲルでの相対移動距離は同じである（c/a ＝ f/d）のに対して、検出対象のDNAに由来する泳動バンドの場合には、Bポリマーゲルでの相対移動距離は、Aポリマーゲルでの相対移動距離より小さくなる（b/a＞e/d）。従って、相対移動距離の小さくなったeの泳動バンドが検出対象のDNAであると判断される。より簡便な方法として、エチジウムブロマイドでDNAの泳動バンドを染色した後、各々のポリマーゲルでの相対移動距離の違いを目視で判断することも可能である。

また、より正確に検出対象のニ本鎖DNAを検出する方法として、２つ以上の分子長既知のニ本鎖DNAを混合した試料を上述の分子長既知のニ本鎖ＤＮＡ試料の替わりに用い、同上の方法で泳動バンドの泳動距離を測定した後、各々のポリマーゲルについて泳動距離と分子長の検量線を作成する方法がある。この検量線を用いて、各々のポリマーゲルについての被験試料の分子長を求める。インプリントポリマーゲルの検量線より求められた被験試料中のニ本鎖ＤＮＡの分子長が、非インプリントポリマーゲルの検量線より求められた被験試料中のニ本鎖ＤＮＡの分子長より大きいものが検出対象の二本鎖DNAに相当する。さらに、染色された泳動バンド部分を採取することにより目的の２本鎖ＤＮＡを単離、分析することもできる。

また、本発明の電気泳動法は、分子長による泳動距離の差を利用した分離に加えてニ本鎖ＤＮＡがインプリントされたポリマーゲルのニ本鎖ＤＮＡの捕捉能の差に基づく泳動距離の差を利用するものである。それゆえに、インプリントされたニ本鎖ＤＮＡを鋳型とした空孔に対する親和性は、各種ニ本鎖ＤＮＡの塩基配列の類似性により各々異なる。したがって、本発明の電気泳動法によれば、単に目的とするニ本鎖ＤＮＡの検出、分離のみではなく、同一サイズのニ本鎖ＤＮＡであっても、塩基配列を特異的に識別し、これらを分離することが可能となり、従来の電気泳動法ではできない、塩基配列に依存した分析を行うことができる。

さらに、上記本発明の電気泳動法においては、ニ本鎖ＤＮＡがインプリントされてない非インプリントポリマーゲルと、検出対象のニ本鎖ＤＮＡがインプリントされたポリマーゲル、別の検出対象のニ本鎖DNAがインプリントされたポリマーゲルとを同じ電気泳動装置に並列に設置し、同じ緩衝液を用いて同時に分析を行うことができ、この意味でも簡便、迅速なニ本鎖ＤＮＡの検出、分離方法である。

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。

〔実施例１〕
１. 自己集合体液の作成
鋳型二本鎖DNAとしてpoly dA・poly dT（分子長1033bp）を用意した。poly dA・poly dT (0.1 A_２６０units)、VDAT（0.8μM）を0.2M NaCl入り50mM HEPES緩衝液 (pH7.3) に混合し、一晩冷蔵庫に放置した。

２. 泳動用ゲル(インプリントゲル)の作成
アクリルアミド38g とN, N´-メチレンビスアクリルアミド２gをMilliQ水に溶解し、全100ml とした（アクリルアミド-BIS混合液）。このアクリルアミド-BIS混合液0.44mlをトリス-ホウ酸緩衝液（0.045Mトリス、0.045Mホウ酸、0.00125MEDTA、pH8.3）に溶解し、全量４mlとした。この溶液を減圧下で脱気した後、１mlの自己集合体液を混入し、さらに10w/v% 過硫酸アンモニウム水溶液7.5μl、N,N,N´N´-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）2.4μlを混入した。下端をパラフィルムで止めた泳動ゲル重合用ガラス管（内径0.4cm、長さ14.5cm）２本に、上記の溶液を２mlづつ入れ、蒸留水を重層して室温に放置し、重合させた。

３. 鋳型分子二本鎖DNAの除去
上記操作により、重合したインプリントポリマーゲルを電気泳動装置に設置し、トリス-ホウ酸緩衝液（0.089Mトリス、0.089Mホウ酸、0.0025M EDTA、pH8.3）を陰極側と陽極側の緩衝液槽に満たし、５mAの一定電流値で約３時間通電し、鋳型分子二本鎖DNAを除いた。

４. 電気泳動実験
泳動サンプルDNAとして、サイズスタンダードDNA（分子長1000bp）とpoly dA・poly dT（鋳型分子二本鎖DNAと同じもの、1033bp）を用意した。それぞれの泳動サンプル４μlをサンプルバッファー（50w/v% グリセリン、10mM EDTA、0.05w/v% ブロモフェノールブルー）２μl、MilliQ水14μlに混合し、その混合液の6μlをそれぞれインプリントポリマーゲルの陰極側に適用した。５mA一定でブロモフェノールブルーの青い色素がゲルの陽極側の端に泳動するまで通電した。通電後、泳動ゲル重合用ガラス管よりインプリントポリマーゲルを取り出し、0.5μg/ml臭化エチジウム水溶液に室温で30分浸漬して、分離されたDNAのバンドを染色した。その後、蒸留水で30分２回洗浄し、UVライトをゲルに照射し、臭化エチジウムで染色されたDNAのバンドを確認した。

〔比較例１〕ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（二本鎖DNAの分子長に基づく分析方法、従来法）
実施例１の２で、１mlの自己集合体液の替わりに0.2M NaCl入り50mM HEPES緩衝液(pH7.3)を用いた他は、実施例１と同様の操作を行った。

〔実施例２〕
実施例１と比較例１で得られた、サイズスタンダードDNA（分子長1000bp）とpoly dA・poly dT（分子長1033bp）の泳動距離を測定した。結果は、サイズスタンダードDNAの泳動距離(cm)を1.00とした時の相対泳動距離で示した（表１）。

比較例１のサイズスタンダードDNAとpoly dA・poly dTの相対泳動距離は0.91であるのに対して、実施例１で用いたインプリントポリマーゲルを使用した場合は、相対泳動距離が0.81で、比較例１より小さい値となることが分かった。従ってインプリントポリマーゲルは鋳型分子と同じDNAを認識して、その泳動距離を短くすることが証明された。泳動距離の短くなった泳動バンドを選別することにより、鋳型分子と同じ塩基配列を持つ二本鎖DNAを検出することが可能である。

〔実施例３〕
ＤＮＡ混合サンプル中の検出対象ＤＮＡの検出

１．インプリントゲルを用いた電気泳動
ａ）λファージDNA 560bpフラグメントをインプリントした泳動媒体の作成
鋳型二本鎖DNAとして、poly dA・poly dTの替わりにλファージDNAの560bpフラグメントを用いた他は、実施例1の1〜３と同様に操作し、λファージDNA 560bpフラグメントを検出するための泳動ゲル媒体（インプリントゲル）を作成した。

ｂ）電気泳動実験
泳動用標準サンプルとして、サイズスタンダードDNA（100bp−1000bp、100bp Molecular Ruler、総DNA濃度100μg/ml）８μl、サンプルバッファー（50w/v%グリセリン、10mM EDTA、0.05w/v% ブロモフェノールブルー）４μl、MilliQ水28μlの混合溶液を、DNA混合サンプルとして、λファージDNAの560bpフラグメント（1.0 A₂₆₀Units）８μl、λファージDNAの700bpフラグメント（1.7A₂₆₀Units）８μl、poly dA・poly dT（1.5 A₂₆₀Units）８μl、サンプルバッファー４μl、MilliQ水12μlの混合溶液を用意し、これらのサンプルを19μlずつ、インプリントゲル媒体の陰極側に適用した以外は、実施例１の４と同様に操作した。

２．ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（二本鎖DNAの分子長に基ずく分析方法、従来法）
上記１ａ）のプロセスにおいて、λファージDNAの560bpフラグメントの替わりに0.2M NaCl入り50mM HEPES緩衝液（pH7.3）を用いる他は、上記１ａ）のプロセスと同様にしてポリアクリルアミド泳動媒体を作成し、該ポリアクリルアミド泳動媒体を用いて、上記１ｂ）と同様の操作を行った
。

３．結果
上記１と２の各電気泳動実験で得られた泳動用標準サンプルの泳動距離を測定し、上記インプリントゲル媒体とポリアクリルアミドゲル媒体における泳動距離の相関グラフを作成した（図３）。この相関グラフに、DNA混合サンプル中の個々のDNAから得られた泳動距離をプロットし、相関直線からのずれを確認した。
インプリントゲル作成時に使用する鋳型分子DNAと同じ塩基配列DNAが被験試料中に含まれていた場合、インプリントゲル媒体中の認識部位の捕捉効果により、泳動距離が短くなるため、該当するDNAより得られたプロットは、相関直線から上方にずれることになる。一方、インプリントゲル作成時に使用する鋳型分子DNAとは異なったDNAが被験試料中に含まれていた場合、該当するDNAより得られたプロットは、相関グラフ作成時に使用された泳動用標準サンプルと同様に泳動されるため相関直線上に乗ることになる。
検討の結果、DNA混合サンプルより得られた３つのプロットのうち、λファージDNAの700bpフラグメント（図３中、bで表示）とpoly dA・poly dT（図３中、aで表示）は、相関直線上に乗っていたのに対し、λファージDNAの560bpフラグメントから得られたプロット（図３中、cで表示）は相関直線より上方にずれたことがわかった。従って、相関グラフからのずれを確認することにより、DNA混合サンプル中に、インプリントゲル作成時に使用した鋳型分子DNAと同じ塩基配列を持つDNAがあるかどうか調べられることがわかった。

Claims

検出及び／または分離対象の２本鎖ＤＮＡの分子形状が鋳型としてインプリントされた空孔を有するとともに、該空孔内に２本鎖ＤＮＡの塩基対を認識する置換基を有するインプリントポリマーゲルからなる電気泳動用媒体、２本鎖ＤＮＡを鋳型としてインプリントされていない非インプリントポリマーゲルからなる電気泳動用媒体、及び分子長既知の２本鎖ＤＮＡからなることを特徴とする、２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。
上記２本鎖ＤＮＡの塩基対を認識する置換基が、以下の化学構造を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載の２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。
ポリマーゲルが、架橋されたポリアクリルアミドゲルである、請求項１又は２に記載の２本鎖ＤＮＡの検出及び／または分離用材料。
請求項１に記載のインプリントポリマーゲルおよび非インプリントポリマーゲルに、２本鎖ＤＮＡ含有被験試料をそれぞれ滴下して電気泳動を行い、以下のａ）またはｂ）を指標にして、該試料中の２本鎖含有試料を検出及び／または分離することを特徴とする、２本鎖ＤＮＡを検出及び／又は分離する方法。
ａ）上記インプリントポリマーゲルにおける分子長既知の２本鎖ＤＮＡの泳動距離に対する２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の相対泳動距離が、上記非インプリントポリマーゲルにおける分子長既知の２本鎖ＤＮＡ含有試料の泳動距離に対する２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の相対泳動距離よりも短縮化される２本鎖ＤＮＡが検出されるか否か。

ｂ）２つ以上の分子長既知の２本鎖ＤＮＡの混合試料を用いて、上記インプリントポリマーゲル及び非インプリントポリマーゲルにおける泳動距離と分子長を測定して検量線を作成しておき、該検量線を用いて上記インプリントポリマーゲル及び非インプリントポリマーゲルにおける２本鎖ＤＮＡ含有被験試料の各泳動距離から分子長を求めたとき、インプリントポリマーゲルでの検量線より求めた分子長が、非インプリントポリマーゲルでの検量線より求めた分子長より大きくなる２本鎖ＤＮＡが検出されるか否か。