JP4414761B2 - 雌馬尿からエストロゲンを取得する方法 - Google Patents

Description

本発明は、妊娠雌馬の尿から抱合エストロゲン(konjugierter Oestrogene)の天然混合物を取得することに関する。

エストロゲンは、医療においてホルモン置換療法のために使用される。殊に、エストロゲン混合物は、婦人に現れる自然の又は人為的閉経期の後の更年期障害の治療及び予防のために使用される。この際、妊娠雌馬の尿中に存在するような抱合エストロゲンの天然混合物が特別に有効であり、かつ良好な認容性であることが判明した。

妊娠雌馬中の尿（＝妊娠雌馬尿、以後「ＰＭＵ」と略記する）中の溶解固体含分は、当然広い範囲で変動し、一般的に１リットル当たり乾燥物質４０〜９０ｇの範囲内に存在しうる。尿素及びその他の通常の尿内容物質と並んで、ＰＭＵ中の固体含分中には乾燥物質に対して約２〜５質量％の量でフェノール成分を含有している。このフェノール成分には、クレゾール及びＨＰＭＦとして公知のジヒドロ−３，４−ビス［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−２（３Ｈ）−フラノンがある。これらは、遊離の又は抱合した形で存在することができる。ＰＭＵ中にはエストロゲンの天然混合物が含有されており、これは充分に抱合した形で、例えば硫酸半エステル−ナトリウム塩（以後、「硫酸塩」と略記する）として存在する。抱合エストロゲンの含分（エストロゲン硫酸塩として計算）は、乾燥物質に対して０．３〜１質量％でありうる。

ＷＯ９８／０８５２６から、既に、半極性の、殊に非イオン性で半極性のポリマー吸着剤樹脂での固相−抽出時に、フェノール性尿内容物が減少された、充分にクレゾール−及びＨＰＭＦ−不含で、ＰＭＵの天然エストロゲン−分を完全に含有する混合物を得ることができる適当な方法が公知である。この抽出物は、抱合エストロゲンの天然混合物を作用物質成分として含有する医薬品を製造するための出発物質として好適である。

しかしながら、医薬品の作用物質成分として使用することができるためには、得られる抱合エストロゲンの天然混合物は、特定の薬剤学的仕様を満足すべきであり、例えば、ＵＳＰ（United States Pharmacopeia：米国薬局方）又はヨーロッパ薬局方で規定されている仕様に合致すべきである。乾燥物質に対して遊離のエストロゲンの含分も特定の限界値を超えるべきではない。通常は、所定の薬剤学的仕様要求は、ＷＯ９８／０８５２６の方法によりＰＭＵから得られる抱合エストロゲンの混合物によって満足される。

「老化した」尿、例えば長時間にわたり及び／又は場合により高い温度で貯蔵された又は輸送されたＰＭＵが抱合エストロゲンの天然混合物の取得のために使用される場合には、要求される薬剤学的仕様、例えば遊離のエストロゲンの最大許容含分の前記の限界値は、屡々保守され得ないことが明らかである。このＰＭＵの老化は、おそらく、貯蔵及び／又は輸送条件に応じて抱合エストロゲンの含分が時間に伴い又は高い温度で減少し、他方で、その後に不所望の遊離のエストロゲンの含分が増加することに帰因している。これにより、エストロゲンの天然混合物の本来の組成は、新鮮尿に比べて老化した尿では不利に変化されていることがありうる。ＷＯ９８／０８５２６の方法で得られる抱合エストロゲンの天然混合物には、老化した出発物質の場合により変化した組成で、屡々、得られる抽出物がもはや要求される薬剤学的仕様、殊に遊離エストロゲンの最大許容含分を保守することができない危険がある。更に、老化したPMUから得られる、抱合エストロゲンの混合物の有用な作用物質−抽出物を有するチャージは、薬剤学的製剤の製造のためにはもはや使用できず、従って破棄しなければならないことは特に不利である。有用な天然の薬剤学的作用物質のこの損失は、経費がかかり、妊娠の特定の期間にのみ実施可能なＰＭＵの収集及びそれに伴う論理的辺縁条件を考慮すると、実際に、かつ経済的観点から多いに不満足である。

従って、本発明の課題は、出発物質として、老化したＰＭＵ、即ち長時間及び／又は高温で貯蔵された又は輸送されたＰＭＵ（これは、場合により高い割合の遊離のエストロゲンを有することがある）も廃棄せずに確実に使用でき、かつ、殊にこのＰＭＵから得られる抱合エストロゲンの天然混合物が良好な作用物質含分を有し、必要な薬剤学的仕様を、殊に遊離エストロゲンの最大許容含分の観点でも満足する方法で、ＰＭＵからフェノール性尿内容物の減少された抱合エストロゲンの天然混合物を取得するための工業的及び経済的に最適な方法を開発することである。

ところで、意外にも簡単な方法で、老化した、即ち殊に場合により高割合の遊離のエストロゲンを含有するＰＭＵからも抱合エストロゲンの混合物を得ることができる方法が発見され、この際、得られる抱合エストロゲンの混合物は、高い製品品質を有し、殊に遊離エストロゲンの最大許容含分に関しても薬剤学的仕様の要件を確実に満足する。

本発明の方法は、ＷＯ９８／０８５２６に記載の方法から出発し、この方法は、ＰＭＵからフェノール性尿内容物の減少された抱合エストロゲンの天然混合物を取得するために役立つ。従って、本発明は、妊娠雌馬の尿からフェノール性尿内容物の減少された抱合エストロゲンの天然混合物を取得する方法に関し、この方法では、
ａ）場合により粘液物質及び固体物質不含の尿液体、この尿液体の濃縮コンセントレート又はこの尿液体の膜濾過により得られる濃縮尿保留物である尿液体を、尿液体中に含有する抱合エストロゲンの混合物の吸着のために充分な量の半極性ポリマー吸着剤樹脂と接触させ、かつ抱合エストロゲンの混合物で負荷された半極性ポリマー吸着剤樹脂を、余分の尿液体から分離し、
ｂ）この抱合エストロゲンの混合物で負荷された半極性ポリマー吸着剤樹脂を、少なくとも１２．０、殊に１２．５〜１４．０のｐＨ範囲まで調節された洗浄水で洗浄し、
ｃ）この洗浄された吸着剤樹脂を、その上に吸着された抱合エストロゲンの混合物の脱着のために充分な量の溶離液（これは水と混和可能なエーテル、低級アルカノール及び低級脂肪族ケトンの群からの水と混和可能な有機溶剤又は水と混和可能な有機溶剤と場合によりアルカリ性に調節された水とからの混合物である）と接触させ、抱合エストロゲンの天然混合物を含有する溶離物を吸着剤樹脂から分離させ、かつ場合によっては濃縮させる、
この際、本発明による方法は、技術水準の方法に比べて、方法工程ｂ）とｃ）の間で、抱合エストロゲンのこの混合物で負荷された半極性吸着剤樹脂を水で洗浄する中間洗浄を実施することを特徴とする。

チャージ前処理、自体公知の方法工程ａ）、ｂ）及びｃ）並びに方法工程ｃ）で得られる天然の抱合エストロゲンの混合物を含有する溶離物の使用は、一般に既に国際特許出願ＷＯ９８／０８５２６明細書に記載されており、従ってこの公開特許出願から当業者に周知されている。このＷＯ９８／０８５２６の内容は、開示の目的にも本出願の目的にもなる。一般的方法及び使用可能な材料の更なる詳細は、本出願の実施例部分にまとめられている。例えば、ＷＯ９８／０８５２６によれば、半極性の、殊に非イオン性で半極性の吸着剤樹脂が使用できる。更に、本発明の方法によれば、意外にも可能な他の吸着剤樹脂も本発明の中間洗浄で、製品品質又は保守すべき薬物学的仕様に悪影響を及ぼすことなく使用することができる。本発明の範囲で使用可能な吸着剤樹脂は、更にこの明細書中で下記のように詳述される。

本発明によれば、方法工程ａ）で抱合エストロゲンの混合物で負荷された半極性吸着剤樹脂を、方法工程ｂ）に引き続く中間洗浄において水で洗浄する。洗浄水の量を、引き続く方法工程ｃ）で得られる溶離物が遊離のエストロゲンの最高含分の要求を満足し、従って医薬品の作用物質成分として使用されうる抱合エストロゲンの混合物を含有するように、選択する。例えば、吸着剤樹脂１床体積当たり２〜８、有利に３〜５床体積の洗浄水の使用が有利であると判明した。この場合に、吸着剤樹脂を含有する反応器に、１時間当たり吸着剤樹脂１体積部当たり洗浄水３〜１０、有利に５〜７体積部の流過速度で洗浄水を導通させるのが有利である。

方法工程ｂ）とｃ）の間で実施される水での吸着剤樹脂の推定簡単な洗浄が、老化したＰＭＵの使用の際にも、本発明により確認されたように、作用物質−抽出物として得られる抱合エストロゲンの天然混合物の薬剤学的仕様の至適化をもたらすことは、全く意想外であるというべきである。殊に、特に老化したＰＭＵ中に場合により含有する高割合の遊離エストロゲンが、方法工程ｃ）で溶離物として、薬剤学的仕様の高い要求、例えばＵＳＰ又はヨーロッパ薬局方により設定されている要求を満足する天然の抱合エストロゲンの混合物が得ることができ、かつ、殊に老化したＰＭＵからも、天然の抱合エストロゲン−混合物を含有する定量的かつ定性的に高価な作用物質−抽出物を得ることができるように、確実に減少されうることは、非常に意想外である。この作用物質−抽出物は、使用ＰＭＵの老化齢及び由来に無関係に、遊離のエストロゲンの最大許容含有率を確実に保持し、従って、医薬品の製造のための有利又は有用な出発物質であることが判明した。従って、ここでは天然の抱合エストロゲンの混合物のような重要な医薬品原料の不所望かつ経済的に不利な損失は、困難な条件下でも避けることができる。

本発明の方法での更なる利点として、方法工程ｃ）で得られる溶離物が技術水準と比べて乾燥物質に対して高い全ホルモン含有率を有することが判明した。これにより、例えば、作用物質含有率に関して明らかに改善された品質製品が得られる。

本発明の方法の有利な１実施態様では、室温を下回る温度、殊に０〜１０℃の温度で中間洗浄が実施される。それというのも、この付加的中間洗浄によって、場合による条件のホルモン−又は作用物質損失を明白に減少することができることが明らかであるからである。室温とは、通常、環境温度、例えば２０〜３０℃にある温度である。実際に０℃又はほぼ０℃の温度でこの方法を実施するのが非常に有利である。従って、実際には、０℃付近でそれを上回る温度で操作し、かつ、適当な手段により記載の温度範囲の保持を取りはからうことが推奨される。このためには、温度を低下するための自体慣用の手段、例えば冷却された反応器、冷却された材料及び／又は冷却された出発物質、例えばＰＭＵの使用がこれに該当する。０℃又はほぼ０℃の温度としては、実際の観点では、０℃〜約５℃、殊に０〜約３℃の温度範囲を考慮することができる。

この中間洗浄の間の可能なホルモン損失をできるだけ僅かに保持するために、本発明のこの変法により、中間洗浄及び／又は方法工程ｂ）で使用されるアルカリ性にされた洗浄水を、室温より下回る温度、殊に０〜１０℃の温度まで予め冷却する。更なる有利かつ好ましい温度範囲は、前記のような０〜約５℃、殊に０〜３℃の温度である。０℃又はほぼ０℃の温度で操作するのが有利である、即ち中間洗浄で及び／又は方法工程ｂ）でも使用されるアルカリ性にされた洗浄水を、０℃付近でそれを上回る温度まで予め冷却するのが有利である。方法工程ｂ）での、冷却されたアルカリ性にされた洗浄水の使用により、例えば、冷却された洗浄水を中間洗浄に使用する際に、不所望なそれ自体の再加熱が起こることを避けるために、予備冷却の方法又は既に行われた吸着剤樹脂の冷却の保持が行われる。従って、中間洗浄及び先行の方法工程ｂ）の双方を、同じ温度で、例えば室温を下回る温度、殊に０〜１０℃の温度で、又は特に前記のような温度範囲で実施するのが有利である。

室温を下回る温度でその方法が実施される本発明の前記の変法では、すべての使用装置、例えば半極性吸着剤樹脂を収容するための反応器又は既にこれを含有する反応器及び／又は使用ＰＭＵを、相応して室温を下回る温度まで、殊に０〜１０℃の温度又は前記の有利な温度範囲まで予め冷却して使用することが望ましい。

本発明の方法のための吸着剤として、ポリマー吸着剤樹脂が使用に好適である。特に有利な吸着剤樹脂は、半極性の、殊に非イオン性で半極性のポリマー吸着剤樹脂である。本発明の方法で吸着剤として使用可能な半極性ポリマー吸着剤樹脂は、非極性で疎水性のポリマー吸着剤樹脂とは反対に、中間極性（＝例えば樹脂の活性表面が１．０〜３．０、殊に１．５〜２．０デバイの範囲の双極子モーメントを有する）及びいくらか親水性の構造を有する多孔性の有機非イオン性ポリマー、例えばポリカルボン酸エステル樹脂が有利である。有利にマクロ網状構造及び５０〜１５０、有利に７０〜１００オングストロームの範囲の平均孔径及び３００〜９００、有利に４００〜５００ｍ^２／ｇの範囲の比表面積を有するマクロ多孔性の半極性樹脂を使用するのが有利である。マクロ多孔性で架橋結合された脂肪族ポリカルボン酸エステル樹脂、殊に架橋結合されたポリアクリルエステル樹脂、例えばFa.Rohm und HaasのアンバーライトＸＡＤ−７^Ｒ（これは、非イオン性の半極性吸着剤樹脂である）が特に好適であることが判明した。

この有利な記載の吸着剤と並んで、他の吸着剤樹脂も使用できる。この場合には、吸着剤樹脂として、非極性、半極性の吸着剤樹脂も、極性の吸着剤樹脂も好適である。この場合に、吸着剤の上にポンプ導入されうる尿の量は、予めその都度の吸着剤キャパシティに基づき決めることができる。使用可能な吸着剤樹脂の例は、市販のタイプ、例えばスチレンジビニルベンゼン基本骨格を有するポリマーアンバーライト吸着剤（例えばタイプＸＡＤ−１１８０、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６）、アクリルエステル基本骨格を有するもの（例えばＸＡＤ−７）又は窒素及び酸素を含有する高極性基本骨格を有するもの（例えばＸＡＤ−１２）である。他の吸着剤樹脂は、ダウエックス−樹脂（スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー）、例えばダウエックス１１２、ダウエックス オプチポレ（Dowex Optipore)、ダウエックス オプチポレＶ４９３；レワタイト（架橋されたポリスチレン）、例えばレワタイトＯＣ１０６４、レワタイトＯＣ１０６６又はレワタイト ＯＣ１１６３、ポリアミンアニオン交換樹脂、例えばダウエックス−樹脂である。有利な吸着剤樹脂は、殊にＸＡＤ−７、ＸＡＤ−１６（タイプＨＰ）、ＸＡＤ１１８及びダウエックス オプチポレ、好ましくはダウエックス オプチポレＶ４９３並びにレワタイト ＯＣ１０６４、ＯＣ１０６６及びＯＣ１１６３である。

本発明の方法は、先に詳述されているように技術水準に比べて一連の利点及び改善を提供する。従って、本発明は、守るべき薬剤学的仕様を危険にさらすことなく、高割合の遊離エストロゲンを有してもよい老化したＰＭＵの使用をも可能とする。従って、本発明の方法は、薬剤学的仕様の非保守の場合の、例えばもはや許容不可能な遊離のエストロゲンの含分の場合の有用な作用物質を失う危険を明らかに避けているので、経済的利点をも有している。本発明の方法は、乾燥物質−含分に対して高められたホルモン含有率を有する品質改善された作用物質成分を提供する。この作用物質成分は、作用物質として天然の抱合エストロゲンの混合物を含有する医薬品の製造のために極めて好適である。

次の実施例で、本発明を詳述するが、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例
次の実施例に、ＰＭＵ中に含有する抱合エストロゲンの天然混合物を含有し、フェノール性尿内容物が充分に減少されているＰＭＵから、作用物質−抽出物を取得するための一般的操作処方を挙げる。本発明によれば、高割合の遊離のエストロゲンを含有していてよい老化したＰＭＵからも、高い作用物質含有率を有する高品質抽出物を得ることができることが明らかになる。

ＷＯ９８／０８５２６の方法
本発明の方法のために、ＷＯ９８／０８５２６と同様に、ＰＭＵが、それ自体、それから濃縮により得られるコンセントレート又はそれから膜濾過により得られる保留物（Retentat)として使用されうる。集めた尿から先ず自体公知の方法で、粘液物質及び固体を除去する。固体及び粘液物質を沈殿させ、これらを自体公知の分離法、例えばデカンテーシヨン、分離及／又は濾過により分離除去するのが有利である。従って、このＰＭＵを、例えば自体公知の分離装置、例えば分離器、濾過装置又は沈殿装置上に導入することができる。分離装置としては、例えばサンドベッド（Sandbett)を用いることができるか、又は市販の分離器、例えばノズル−又はチェンバー分離器を使用することができる。所望の場合には、マイクロフィルター又は限外濾過装置も使用でき、これらの使用時には、同時に濾過されたＰＭＵの充分な細菌−及びウイルス不含を達成することができる。

所望の場合には、尿に保存剤、抗菌剤、殺菌剤及び／又は駆虫剤を添加することができる。

ＰＭＵの代わりに濃縮されたＰＭＵ−保留物を使用すべき場合には、これは、ＰＭＵから自体公知の膜濾過により取得することができる。この保留物の固体含有率及びその組成を、使用ＰＭＵ及び膜濾過のために使用される膜に応じて、例えばその孔径並びに濾過の条件を変えることができる。例えばナノ濾過膜の使用時には、ＰＭＵ−保留物中のエストロゲン含有率のほとんど損失なしの濃縮が、低分子量ＰＭＵ−内容物質の５０質量％までの除去と同時に達成することができる。本発明の方法のために、約１：１０の割合まで、例えば約１：７の割合まで濃縮され、その体積が当初ＰＭＵ−体積の約１／１０、例えば約１／７まで濃縮されていてよいＰＭＵ−保留物を使用することができる。

方法工程ａ）で使用可能な半極性ポリマー吸着剤樹脂は、非極性の疎水性ポリマー吸着剤樹脂とは反対に、中間極性（＝例えば、１．０〜３．０、殊に１．５〜２．０デバイの範囲の樹脂の活性表面の双極子モーメントを有する）及びいくらか親水性の構造を有する多孔性の有機非イオン性ポリマー、例えばポリカルボン酸エステル樹脂である。マクロ網状構造及び５０〜１５０、有利に７０〜１００オングストロームの範囲の平均孔径及び３００〜９００、有利に４００〜５００ｍ^２／ｇの範囲の比表面積を有するマクロ多孔性の半極性樹脂を使用するのが有利である。マクロ多孔性で、架橋結合された脂肪族ポリカルボン酸エステル樹脂、殊に架橋結合されたポリアクリルエステル樹脂、例えばFa.Rohm und HaasのアンバーライトＸＡＤ−７^Ｒが特に好適であると判明した。

半極性吸着剤樹脂への抱合エストロゲンの吸着は、ＷＯ９８／０８５２６によれば本発明の方法におけると同様に、ＰＭＵ又はその保留物と吸着剤樹脂との接触により行うことができ、ここでは、尿液体を、吸着剤樹脂を含有する反応器中に導入し、かつその中でエストロゲン含分の吸着のために充分な時間、この吸着剤樹脂と接触して保持する。半極性吸着剤樹脂への抱合エストロゲンの吸着実施の後に、抱合エストロゲンのこの混合物で負荷された吸着剤樹脂から、自体公知の方法で余分の尿液体を分離させることができる。有利に、この尿液体を、吸着剤樹脂含有カラムに、接触時間がエストロゲン含分の吸着のために充分であるような流過速度で通すことができる。例えばＰＭＵ３〜１０、特に５〜７体積部／吸着剤樹脂１体積部／時間の流過に相応する流過速度が好適である。有利に、反応器を通る尿液体のこの流過速度を僅かな超過圧又は減圧での操作により制御することができる。使用すべき半極性吸着剤樹脂の量は、使用される吸着剤樹脂の種類及び尿液体中の固体含分の量に応じて変えることができる。ＰＭＵの使用の際に、例えば吸着剤樹脂、例えば架橋結合された脂肪族ポリカルボン酸エステル−吸着剤樹脂１体積部を、流出する尿液体中にはっきりした量のエストロゲンが検出可能になることなしに、前処理されたＰＭＵ８０体積部までで負荷することができる。ＰＭＵ−コンセントレート又はＰＭＵ−保留物の使用の際には、吸着剤樹脂の負荷能力は、当然これが濃縮されている程度に応じて低下する。例えば、架橋結合された脂肪族ポリカルボン酸エステル−吸着剤樹脂１体積部は、２０〜８０、有利に３０〜５０体積部のＰＭＵに相応する量の尿液体で負荷することができる。

抱合エストロゲンの混合物で負荷された半極性吸着剤樹脂を、方法工程ｂ）で、少なくとも１２．０、殊に１２．５〜１４、有利に約１２．５〜１３．５のpH範囲に調節された洗浄水で洗浄する。洗浄水としては、尿液体中に可溶な不活性の塩基物質の水溶液（これは、少なくとも１２．５のpH値を達するために充分な濃度である）を使用することができる。半極性ポリマー吸着剤樹脂に比べて不活性の水溶性塩基物質としては、有利に水溶性の無機塩基、例えばアルカリ金属−又はアルカリ土類金属水酸化物、殊に水酸化ナトリウムが好適である。この洗浄水は、所望のpH値、特に約pH１３の達成のために必要であるだけの量の塩基物質を含有するのが有利である。洗浄水の量は、それがその際に相当量の抱合エストロゲンが共に洗浄除去されることなしに、フェノール性尿内容物を充分に除去するために充分であるように選択される。例えば、吸着剤樹脂１床体積当たり洗浄液２〜１０、殊に４〜６床体積の使用が有利であることが判明した。この場合に、洗浄水を、この吸着剤樹脂を含有する反応器に、洗浄水３〜１０、有利に５〜７体積部／吸着剤樹脂１体積部／時間の流過速度で通すのが有利である。

引き続き、方法工程ｃ）で、この洗浄された抱合エストロゲンの混合物で負荷された吸着剤樹脂を、抱合エストロゲンの混合物の溶離のために充分な量の溶離液で処理し、このＰＭＵの抱合エストロゲンの天然混合物を含有する溶離物を取得する。本発明により使用される溶離液は、水と混和可能なエーテル、低級アルカノール及び低級脂肪族ケトンの群からの水と混和可能な有機溶剤又はこれの１種と水と混和可能な溶剤及び場合によってはアルカリ性に調節された水とからの混合物である。溶離液のエーテル成分としては、水と混和可能な環状エーテル、例えばテトラヒドロフラン又はジオキサンも、水と混和可能な開鎖状エーテル、例えばエチレングリコールジメチルエーテル（＝モノグライム）、ジエチレングリコールジメチルエーテル（＝ジグライム）又はエチルオキシエチルオキシエタノール（＝カルビトール）も好適である。低級アルカノールとしては、水と混和可能な炭素原子数１〜４、有利に１〜３を有するアルキルアルコール、殊にエタノール又はイソプロパノールが好適である。低級脂肪族ケトンとしては、水と混和可能な炭素原子数３〜５を有するケトン、殊にアセトンが好適である。その中の有機溶剤がエタノールである溶離液が特別好適であることが判明した。溶離液としては、前記の水と混和可能な有機溶剤と場合によりアルカリ性に調節された水とからの混合物が有利に使用される。このような水含有溶離液のｐＨ値は、中性〜ｐＨ１３までのアルカリ性範囲であり、約１０〜１２であるのが有利であり得る。水含有溶離液中の溶剤成分としては、使用ｐＨ−範囲で安定な溶剤が選択される。約１０〜１２のｐＨ−値を有する水含有アルカリ性溶離液中で、溶剤成分としては、低級アルカノール、特にエタノールが好適である。この水含有溶離剤の望ましいｐＨ−値は、相当量の水溶性の不活性塩基物質、有利に、無機塩基、例えばアルカリ金属−又はアルカリ土類金属水酸化物、殊に水酸化ナトリウムの添加によって調節される。水含有溶離液中では、水と混和可能な有機溶剤と水との体積割合が４０：６０〜２０：８０の範囲、有利に約３０：７０の範囲内に存在することができる。溶離剤の使用量は、吸着剤樹脂１床体積当たり約３〜１０、殊に約４〜６床体積であってよい。溶離液を、エストロゲン混合物で負荷された吸着剤樹脂を含有する反応器に、接触時間が抱合エストロゲンの混合物の完全な溶離のために充分であるような流過速度で通すのが有利である。エタノールと水との３０：７０の体積比の混合物の使用の際には、例えば１時間当たり、吸着剤樹脂１体積部当たり溶離液３〜１０、有利には５〜７体積部の流過速度が好適である。この溶離を室温〜約６０℃、特に約４０〜５０℃の温度範囲で実施するのが有利である。所望の場合には、僅かに高められた圧力、例えば０．２バールまでの過圧での操作により流過速度が調節され、溶離物は複数のフラクションで捕集される。個々の溶離物フラクシヨンの抱合エストロゲン及びフェノール性尿内容物、例えばクレゾール及びＨＰＭＦの含有率は、自体公知の方法で、高性能液体クロマトグラフィ（＝high performance liquid chromatography、HPLCと略記）によって測定することができる。

この溶離の際に、先ず僅かに着色された〜無色の、実質的にエストロゲン不含の初流フラクシヨンが得られ、その量は一般に、約１床体積に相当する。抱合エストロゲンの主要量、例えば出発−ＰＭＵ中に存在する抱合エストロゲンの８０〜９９％は、後続の暗黄褐色に着色された主溶離物フラクション中に存在し、その量は一般に２〜４床体積を包含する。後続の後流出フラクシヨン中には、一般になお痕跡量の抱合エストロゲンを含有している。乾燥物質に対して１０質量％を超える抱合エストロゲンを含有し、かつ乾燥物質に対して０．６質量％より少ないクレゾール及びＨＰＭＦを含有する後続フラクシヨンが得られる場合には、これを、更なる後処理のためにエストロゲンの多い主溶離物と一緒にすることができる。

例１（比較例）
ａ）半極性ポリアクリルエステル−吸着剤樹脂へのＰＭＵのエストロゲン含分の吸着
直径４０ｍｍを有する高さ２２０ｍｍのカラムに、水中で膨潤された半極性ポリアクリルエステル−吸着剤樹脂（＝Fa.Rohm und HaasのアンバーライトＸＡＤ−７、粒径０．３〜１．２ｍｍ、双極子モーメント１．８デバイ、平均孔径８０オングストローム、比表面積約４５０ｍ^２／ｇ乾燥）３００ｍｌを充填する。限外濾過装置を通して濾過されたＰＭＵ（ＨＰＬＣを用いて測定されたエストロゲン硫酸塩及びクレゾールの含有率は、後の表を参照）１０．５リットル（＝３５床体積）を、室温で、平均２４ｍｌ／ｍｉｎの流過速度（＝１時間当たり４．８床体積）でカラムに通す。ＰＭＵのエストロゲン含分は、このように負荷された半極性吸着剤樹脂−カラム上に完全に吸着される。流出尿液体を、ＨＰＬＣを用いて、抱合エストロゲンのその含有率（エストロゲン硫酸塩として計算）について検査し、実際にエストロゲン不含であることが判明した。この流出液を捨てる。

ｂ）負荷吸着剤樹脂−カラムの洗浄
負荷吸着剤樹脂−カラムを、１３のｐＨ−値を有する水酸化ナトリウム水溶液１．５リットルで洗浄する。このために、アルカリ性洗浄水を平均２４．６ｍｌ／ｍｉｎの流過速度（＝１時間当たり４．９床体積）でカラムに通す。流出する洗浄液を、ＨＰＬＣを用いて、そのエストロゲン硫酸塩及びクレゾールの含有率について検査する。この検査は、洗浄相の間にカラムに与えられた全てのエストロゲンの５％より少ない分が洗出されることを示している。

ｃ）洗浄された吸着剤樹脂−カラムからの抱合エストロゲンの脱着
溶離液（エタノール／水３０：７０）１．５リットルを、２５ｍｌ／ｍｉｎの流速（＝１時間当たり５．０床体積）で、実施例表中に記載の溶離温度まで予め加熱されたカラムに通す。流出する溶離物を５フラクシヨンで捕集する。これらのフラクシヨンは、それぞれ３００ｍｌ（＝１床体積）であり、ＨＰＣＬを用いて、そのエストロゲン硫酸塩及びクレゾールの含有率につき検査する。

第１フラクシヨンは、痕跡量のみのエストロゲン硫酸塩を含有する。この溶離物は、無色〜淡黄色である。引き続くフラクシヨン２〜４中には、抱合エストロゲンのカラムに吸着された全量の約８０〜９８％が含有されている。ここで、溶離物は、強い暗褐色を有する。最後のフラクシヨンは、明らかに色強度の低下でも判るなお少量のエストロゲン硫酸塩を含有している。

後の表中に、抱合エストロゲンの主要量を含有するフラクシヨンにつき、それぞれＴＳ−含有率（質量％で）及びＨＰＬＣにより測定されたエストロゲン硫酸塩及びクレゾールの含有率が挙げられている。これらのフラクシヨンは、製剤学的な更なる加工のために好適である抽出物である。

ｄ）吸着剤樹脂−カラムの再生
再生のために、カラムを、先ずｐＨ１２に調節された５０％エタノール含有エタノール／水−混合物６００ｍｌで、次いでｐＨ１２に調節された７０％エタノール含有エタノール／水−混合物６００ｍｌで、引き続き１０％クエン酸ナトリウム水溶液６００ｍｌで、かつ、最後に蒸留水６００ｍｌで洗浄する。この全ての再生を４５℃の温度で行う。カラムは、何回も、例えば４０−回まで負荷でき、繰り返し再生することができる。

例２（本発明の方法）：
本発明による方法工程ｂ）及びｃ）の間の中間洗浄を伴って、例１を繰り返した。

中間洗浄
負荷吸着剤樹脂−カラムを水９００ｍｌで洗浄する。このために、中性の洗浄水を、平均２５．０ｍｌ／ｍｉｎの流過速度（＝１時間当たり５．０床体積）で、このカラムに通す。

流出する洗浄液を、ＨＰＬＣを用いてそのエストロゲン硫酸塩及びクレゾールの含有率につき検査する。この検査は、この洗浄相の間にカラムに与えられた全エストロゲンの小部分のみ（最大で約２、３パーセントのみ）が洗出されることを示している。しかしながら、本発明によれば、本発明の方法の実施の際には、遊離エストロゲン分も減少する（例４参照）。

例３（冷却を伴う本発明の方法）：
中性洗浄の間のホルモン損失の減少
例１及び２に記載のように、但し冷却下に操作する。この冷却は、中間洗浄の間のホルモン損失の最少化のために役立つ。室温での代わりに氷水を用いて中間洗浄を実施すると、ホルモン損失は約５０％までも低下させることができ、殊にこの方法での温度は実際に０℃又はほぼ０℃である。この場合に、室温で存在するカラム内容物に基づき比較的急速に温度上昇する氷水を加えるだけでなく、むしろ全カラムを０℃まで冷却することが推奨される。

実験実施
中間洗浄に必要な０℃のカラム温度を、先行の塩基洗浄の間の冷却により達成させた、即ち既に塩基洗浄を０℃で行った。この場合に、塩基洗浄の際の０℃での５床体積の施与が、室温のカラム内容物を０℃まで冷却するために充分であった。次いで、引き続く中間洗浄を０℃で進行させることができた。ホルモン損失の最少化と並んで、この塩基洗浄の間のクレゾール分離除去への可能な温度影響も共に検査した。

直接比較のために、２つの実験を行った：
例３ａ：
室温での塩基洗浄及び中間洗浄。

例３ｂ：
０℃での塩基洗浄及び中間洗浄。

他のすべての工程は、上記のＷＯ９８／０８５２６に記載のような標準法で、又は例１及び２に記載のように実施した。

実験結果
第ＩＩＩ表は、実験温度及び室温での及び０℃までの熱処理を伴う実験結果を示している。

この実験結果から、明らかに次のことが認識できる：
ａ）塩基洗浄、即ちクレゾール除去は、０℃までの温度低下により妨げられない。クレゾールの分離除去は、定量的に進行する。第ＩＩＩ表は概観を示している。
ｂ）中間洗浄の間のホルモン損失は、温度低下により約５０％も減少される。第ＩＩ表は概観を示している。

従って、塩基洗浄の間の約０℃まで熱調節された苛性ソーダの施与は、クレゾール分離除去の妨げなしに、中間洗浄のホルモン損失を約０℃での操作によって同様に低下させる簡単な可能性を提供する。

中間洗浄の間の約０℃までの温度の低下は、付加的な中間洗浄による不可避のホルモン損失の最少化、即ち約５０％までの低下を可能にする。

中間洗浄の間のカラム熱調節は、中間洗浄の前に実施される塩基洗浄を、同様に約０℃で流出させる際に簡単な方法で達成することができる。この塩基洗浄時に起こるクレゾール分離除去は、温度低下により負に影響されない。

例４（遊離ホルモンの含有率の低下）：
前記の例１〜３の方法により、遊離ホルモンの含有率が本発明の方法の使用時にいかに低下するかを検査した。結果は、次の第ＩＶａ表（中間洗浄なしの比較実験）及び第ＩＶｂ表（中間洗浄を伴う本発明による実験）に記載されている。

Claims (18)

1. ａ）場合により粘液物質及び固体物質不含の尿液体、この尿液体の濃縮コンセントレート又はこの尿液体の膜濾過により得られる濃縮尿保留物である尿液体を、この尿液体中に含有する抱合エストロゲンの混合物の吸着のために充分な量のポリマー吸着剤樹脂と接触させ、かつこの抱合エストロゲンの混合物で負荷されたポリマー吸着剤樹脂を、余分の尿液体から分離し、
   ｂ）この抱合エストロゲンの混合物で負荷されたポリマー吸着剤樹脂を、少なくとも１２．０のｐＨ範囲に調節された洗浄水で洗浄し、かつ
   ｃ）この洗浄された吸着剤樹脂を、その上に吸着された抱合エストロゲンの混合物の脱着のために充分な量の溶離液（これは水と混和可能なエーテル、低級アルカノール及び低級脂肪族ケトンの群からの水と混和可能な有機溶剤又は水と混和可能な有機溶剤と場合によりアルカリ性に調節された水とからの混合物である）と接触させ、抱合エストロゲンの天然混合物を含有する溶離物を吸着剤樹脂から分離させ、かつ場合によっては濃縮させる
   ことからなる、妊娠雌馬の尿からフェノール性尿内容物の減少された抱合エストロゲンの天然混合物を取得する方法において、
   方法工程ｂ）とｃ）との間で、抱合エストロゲンの混合物で負荷されたポリマー吸着剤樹脂を水で洗浄する中間洗浄を実施することを特徴とする、妊娠雌馬の尿からフェノール性尿内容物の減少された抱合エストロゲンの天然混合物を取得する方法。
2. 中間洗浄を、室温を下回る温度で実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 中間洗浄を、０〜１０℃の温度で実施することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 中間洗浄を、０℃付近でそれを上回る温度で実施することを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
5. 中間洗浄のために使用される洗浄水を、室温を下回る温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
6. 中間洗浄のために使用される洗浄水を、０〜１０℃の温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. 中間洗浄のために使用される洗浄水を、０℃付近でそれを上回る温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. 方法工程ｂ）で使用されるアルカリ性にされた洗浄水を、室温を下回る温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 方法工程ｂ）で使用されるアルカリ性にされた洗浄水を、０〜１０℃の温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 方法工程ｂ）で使用されるアルカリ性にされた洗浄水を、０℃付近でそれを上回る温度まで予め冷却することを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
11. 中間洗浄及び先行の方法工程ｂ）を、室温を下回る温度で実施することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
12. 中間洗浄及び先行の方法工程ｂ）を、０〜１０℃の温度で実施することを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
13. 中間洗浄及び先行の方法工程ｂ）を、０℃付近でそれを上回る温度で実施することを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
14. ポリマー吸着剤樹脂を収容するための使用装置又はこれを既に含有する装置及び／又は使用ＰＭＵを、相応して室温を下回る温度まで予め冷却して使用することを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
15. ポリマー吸着剤樹脂を収容するための使用装置又はこれを既に含有する装置及び／又は使用ＰＭＵを、相応して０〜１０℃の温度まで予め冷却して使用することを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
16. ポリマー吸着剤樹脂を収容するための使用装置又はこれを既に含有する装置及び／又は使用ＰＭＵを、相応して０℃付近でそれを上回る温度まで予め冷却して使用することを特徴とする、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
17. ポリマー吸着剤樹脂として、半極性吸着剤樹脂を使用することを特徴とする、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
18. ポリマー吸着剤樹脂として、非イオン性の半極性吸着剤樹脂を使用することを特徴とする、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。