JP4404555B2 - ガス組成物を検出するためのセンサー配合物およびそれを製造する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
微生物はわれわれの環境に広がり、われわれの生活に有益な面と有害な面の両方で影響を及ぼす。そのため、微生物の存在および代謝活動を検出、同定および研究するために高感度、効果的で迅速な仕組みを提供する必要性は絶えず増大している。
【０００２】
近年、微生物科学は多くの進歩を経験した。このことは、微生物の習性の検出、同定および分析に使用するセンサー分野で特に正しい。微生物をモニターする分野では進歩がある一方、一般的に使用されるモニター方法では、まだ、非能率が存在する。例えば、遅いが有効な抗菌感受性試験方法、Bauer-Kirbyディスク法は、病院の環境内で、まだ、使用されている。この方法は、抗菌性化合物の効能を示す微生物の可視的な増殖の存否を利用するが、結果が得られる前に微生物の増殖を考慮すると、通常18から24時間の培養期間を必要とする。
【０００３】
抗菌感受性試験で別の好評な方法には、生物の同定および抗菌感受性試験のためのシステム、Septor RTM (米国メリーランド州スパークスのBecton Dickinson診断器械システム)のような培養液微量希釈法がある。このシステムは、複数の低容積カピュラ(カピュラ当り約0.4ml)を有する使い捨てプラスチックパネルを使用し、各カピュラは、カピュラ表面上で乾燥した異なる試験化合物または異なる濃度の試験化合物を含有する。試験すべき生物は、所望の試験媒体中に懸濁させ、分取物は試験パネルの個別カピュラに分配する。パネル上で乾燥させた試薬はサンプル中に溶解され、この系は次に生物が試薬と反応して、増殖が可視的に現れるために十分な時間を与えるように一晩(18から24時間)培養する。パネルはその後の増殖の存否を視覚的に検査し、それにより試験を受ける生物の感受性に関する情報を得る。別のウェルは生物の同定を助ける。しかし、この試験法もまたBauer-Kirbyディスク法と同様に長い培養期間を必要とする欠点により苦しむ。
【０００４】
近年、上記モニター方法に必要とされる長い培養時間を避ける努力がされている。これらの改革はコロニーの成育をモニターするのではなく、むしろ微生物の代謝活性をモニターする点に焦点が置かれている。微生物の代謝活性をモニターする多くのアプローチは、そのような代謝活性を迅速かつ正確にモニターする試みで報告されている。
【０００５】
微生物をモニターする分野における1つの改革は、様々な抗菌化合物の存在下での微生物の大きさ、または、数の変化を厳密に調べて、感受性を決定する光散乱光学手段を利用する装置である。この方法を利用する市販機器の1例には、Vitec System(BioMerieux社)が挙げられる。この最良のシステムは、多くの生物および薬の組合わせに対して、6時間以内に微生物の抗菌感受性についての情報を与えると期待される。別の組合わせは、生物の抗菌感受性をVitec System方法により決定できるまでに18時間もの長さが必要となり得る。
【０００６】
Bauer-Kirby法を改良する努力では、一定のサンプルを4から6時間で読取れるような改良がされた。しかし、この改良システムは、試験板上に色をつける色素の現像液の吹き付けを必要とし、事実上有害である。初期の迅速な手法が失敗した場合には、現像液の有害な効果により、その後の再培養および読取りは妨害される。したがって、標準的な評価をするため、その後は実験を継続できない。
【０００７】
さらに別のアプローチは微生物の酸素消費を、pHおよび/またはヘモグロビンの色変化の測定か、または、液体試験媒体の全酸化還元電位差に応答する色変化をトリフェニルテトラゾリウムクロライドおよびレサズリン等の色素の使用により、モニターすることを含んでいる。
【０００８】
微生物の代謝マーカーとして、微生物により消費される溶解した酸素のモニターは、多年研究がされている。例えば。C. E. Cliftonは1937年にヴァールブルクフラスコを使用し、数日間にわたり微生物の酸素消費をモニターした。酸素濃度の変化は、遅く、めんどうなこの方法で測定された。
【０００９】
電気化学装置、「クラーク」電極も溶解した酸素を測定するために一般に使用される。残念ながら、クラーク電極は使用中に酸素を消費し(それにより微生物が利用できる酸素を減少させ)、そのため「標準」サイズの電極は、典型的に電極による測定妨害を防止するため、100ml以上の容量の測定にのみ使用する。
【００１０】
「縮小型」クラーク電極は記述されているが、この電極は複雑な多数の構成部分があり、大きな電極と同様に測定する溶液と接触しなければならない。装置の電極構成部分は、試験溶液成分との反応を防ぐために酸素透過性の膜を使用できるが、酸素は試験溶液と測定系との間でも平衡しなければならず、酸素は一旦膜を通過すると消費される。
【００１１】
酸素濃度データを与えることができる光学システムは、クラーク電極システムの欠点を克服するために開発されている。そのような光学法の主な利点は、定量値を測定するために必要な計測器を、それ自体試験溶液と物理的に接触させる必要がないことである。酸素の比色分析および蛍光分析の両方を速やかに再現性よく行える光学技術が知られており、そのような分析にかかる費用は極めて低い。例えば、酸素を測定するための発光技術はいくつか記載されているが、それらは様々な化合物の蛍光またはりん光の発光を消光させる酸素活性に基づいている。しかし、上記の方法は微生物のモニターに直ちに適応されるわけではない。さらに、そのようなシステムは、クラーク電極システムと同様に、微生物による溶解した酸素の消費のみのモニターに限定される。
【００１２】
8時間以内に微生物の存在、同定、抗菌感受性についての情報を提供するその他のシステムが述べられている。微生物の存在を判断するために、電極と高インピーダンスの電位差計を使用するシステムが開示されている(例えば、特許文献1参照。)。微生物の成長と関連するフラスコ上部のヘッドスペースの圧力変化を利用する生物の検出と調査用の分析法が開示されている(例えば、特許文献2参照。)。試験用サンプル上部のヘッドスペースのガスを微生物の存在を測定するために外部の酸素検知器に通すシステムが開示されている(例えば、特許文献3参照。)。試験用サンプル上部の密閉されたヘッドスペース中で成長する生物によって生ずる真空のモニターにより分析するシステムが開示されている(例えば、特許文献4参照。)。バクテリアの成長を検出し、モニターするために、成長中の微生物培養物の濁度または光学的濃度増加に基づく光学手段を使用する例がある(例えば、特許文献5参照。)。クラーク電極システムと同様、これらのシステムは、酸素消費に限定されたデータを提供するように設計されている。
【００１３】
二酸化炭素濃度を連続してモニターするために開発された光学センサーが見本としてある(例えば、特許文献6参照。)。このようなセンサーは、二酸化炭素の存在に感度が良く、化学標識を含有するゾル・ゲルセンサー素子と組み合わせたグラスファイバーの光学機器の使用を含む。このシステムは、溝の中に付着させた化学標識を有するゾル・ゲル材料と溝をつけた基材を含む。光ファイバーケーブルはその溝に結合され、光が光ファイバーケーブルを通過するとき、ゾル・ゲルセンサー素子により、伝達は影響を受ける。
【００１４】
上記に例示した試験法は、微生物の成長および代謝活性を検出するためにより迅速で正確な手段を提供するため、近年改良されているが、サンプル中の嫌気性および好気性微生物両方の成長を同時に検出可能な生物学的センサーを提供する改革がないことが、上記試験法の共通の欠点である。このようなシステムは典型的に1つのセンサーユニットで1つのガス成分だけしか検出できないため、一般に使用されるモニターシステムでは、この限界が存在する。
【００１５】
微生物の代謝活性の検出に使用できるガス組成物モニターシステムは、酸素または二酸化炭素のいずれかのモニターに限定される。二酸化炭素センサーでは、酸塩基指示発色団を使用して蛍光物質の信号出力を調製ができる。そのようなシステムでは、測定サンプルのpH値が変化すると、発色団の吸光度スペクトルは変化する。測定サンプルのpH値は、サンプル環境の二酸化炭素濃度に依存するので、このシステムにより二酸化炭素濃度を判断できる。酸素センサーの採用により、微生物の代謝活性を判断するモニターシステムでは、サンプル環境の酸素濃度変化を検出するために酸素感応性蛍光物質を採用できる。本発明以前は、ガス組成物中の二酸化炭素濃度と酸素濃度の両方を同時にモニターする能力の組合わせは、システムセンサー間のクロストークの抗しがたい問題により妨げられていた。
【００１６】
本発明は、酸素および二酸化炭素に独立して、同時に応答できるセンサー配合物およびシステムを提供することにより、この問題と取り組むものである。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第4,200,493号明細書
【００１８】
【特許文献２】
米国特許第3,907,646号明細書
【００１９】
【特許文献３】
米国特許第4,200,715号明細書
【００２０】
【特許文献４】
米国特許第4,152,213号明細書
【００２１】
【特許文献５】
米国特許第4,116,775号明細書
【００２２】
【特許文献６】
米国特許第5,629,533号明細書
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、液体または半固体の媒体中に存在する嫌気性または好気性微生物の存在を検出し、代謝活性を評価するために改良されたモニターシステムを提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物中の酸素濃度および二酸化炭素濃度を独立して、同時にモニターすることができる微生物モニターシステムを提供することである。本発明の他の目的は、酸素を消費する酵素または酵素システムの活性、並びに、微生物に対する抗生物質等の成長抑制化合物の効果を検出および/またはモニターできる改良されたシステムを提供することである。本発明の他の目的は、生物の代謝活性のモニターに使用する新規な配合物を提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物の異なる成分を同時にモニターする個別のガス成分センサー間のクロストークを最小限にする手段を提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物中の酸素濃度および二酸化炭素濃度を個別に、同時に検出することにより、微生物の代謝活性をモニターするために使用できる改良された配合物を製造する方法を提供することである。さらに追加すれば、本発明の目的は、微生物の代謝活性をモニターする方法であって、本発明のモニターシステムを使用することを含む方法を提供することである。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
上記およびそれと関連する目的は本発明によって実現される。本発明は、微生物の代謝活性と関連する酸素濃度および二酸化炭素濃度に対して、異なるセンサー化合物間のクロストークが最小限かまたはなく、はっきりと応答するように蛍光センサー化合物を採用する新規な蛍光検出システムを使用することを含む。
【００２５】
本発明の蛍光システムでは、市販品として入手できる、例えば、限定はしないが、BD 9050機器から作られたブレッドボードなどの、修正した蛍光読取装置を使用できる。修正した蛍光読取装置は、少なくとも2つのセンサーを有し、各センサーは対応する蛍光色素の波長と別々に適合するように修正もできる。そのように修正した蛍光読取機器の例には、2つの対応する蛍光色素の個々の波長(感度)に適合する2つのセンサーを有する修正がされた、市販品として入手できるBD 9050装置であり、蛍光色素の1つは調査するサンプル中の酸素濃度に反応する目的で本発明の配合物中に含まれ、第2の蛍光色素は試験するサンプル中の二酸化炭素濃度に反応する目的で配合物中に含まれる。ガス組成物中の別のガスを測定することを所望する場合、別のガスのモニターに、別のセンサーに対応する別の蛍光色素を使用できることは、本発明の概念内である。別のセンサーは、必要に応じて、対応する別の蛍光色素の各波長に別々に識別可能に適合させてもよい。
【００２６】
本発明のセンサー配合物は(直接に、または、酸素透過性膜より分離された)試験サンプルと接触させることができ、組成物個々の蛍光色素の蛍光濃度は上記蛍光読取機器を使用して測定できる。蛍光増加は、サンプル中の酸素を利用(それにより酸素は減少)して呼吸している好気性微生物を暗示する。
【００２７】
このシステムは、このように、呼吸する様々な嫌気性および好気性の両方の微生物を検出するために使用できる。これはさらに微生物の代謝活性における抗生物質などの化合物の有効性を検出するために使用できることも期待される。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の生物学的センサーシステムは、このセンサーシステムに使用したときにサンプル中の嫌気性および好気性微生物の両方の成育を検出できる新規なセンサー配合物を提供する。2つのガスに対する別々のセンサー間のクロストークを最小限にするか、なくし、ガス組成物中の酸素と二酸化炭素のガス濃度変化を同時に検出するという、予想外の結果が新規センサー配合物により得られた。センサー配合物は、同じセンサーマトリックス中の別の蛍光物質色素により同時に検出される組成変化との相互作用なしに別個の様式で、各活性蛍光物質が特定のガス組成変化に対応できるように、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料の混合物から構成される。本発明のセンサーシステムは、新規なセンサー配合物によりセンサー間のクロストークを最小限にする。
【００２９】
本発明は、したがって、1つの検出素子中でCO2とO2を検出する「コンビセンサー (combi-sensor)」のための組成物の新規配合物、そのセンサーの製造方法、病気を引き起こす広く多様な微生物の成育(あるいは抗生物質薬剤の場合は成育の抑制であってもよい)をCO2の生産とO2の消費の両方によって検出するためのセンサーの用途を提供する。このセンサーは、真核生物細胞、例えば、組織培養で成長し、薬品のスクリーニングに使用されるもの等の成長(または成長の抑制)を検出するために使用することもまた可能である。
【００３０】
本発明の新規配合物によると、センサー間で予期されるクロストーク（異なる信号同士の干渉による障害）なしで、CO2生産とO2消費の両方のモニターができる。したがって、サンプルのCO2濃度が変化するにしたがい、発色団の吸収スペクトルは変化する。CO2センサーには、蛍光物質色素の信号出力を調節するモジュレーターとして酸塩基指示発色団を使用する。サンプル環境のCO2濃度が変化するにしたがい、pH値はそれに対応して変化する。発色団吸収スペクトルはpH値の変化と関連して変化する。O2センサーには、サンプル環境のO2濃度の変化に対応して変化する酸素感応性蛍光物質を使用する。蛍光読取装置のセンサーは、モニターする各別々のガスに対して識別可能な色素の波長に合わせられる。しかし、異なるセンサー間のクロストークは、ガス組成をモニターするどんな努力も無にするほどひどいこともあり得る。
【００３１】
本発明は、センサー間のこのクロストーク問題を解決し、新規センサー配合物の使用により、モニターするガスの個々に対して高い応答を示す識別可能なセンサーを提供する。本発明の例としては、どんなO2感応性蛍光物質色素でも高密度シリカ粉末を被膜できる。高密度シリカ粉末により、蛍光物質で被膜されたシリカはセンサーマトリックスの底部に、それが形成されるにしたがいおさまる。CO2の検出に使用する蛍光物質色素は、軽密度シリカを被膜し、その結果CO2と関連する蛍光物質はセンサーマトリックス全体に浮かび上がる。酸塩基指示発色団は、エマルションにし、センサーマトリックス中に入り、そのためセンサーマトリックス全体に分散する。配合物成分の注意深い選択により、O2感応性蛍光物質とCO2感応性蛍光物質のスペクトル輪郭の重なりを最小限にするか、なくすことができる。マトリックスの形成中で使用される選択したシリカの識別可能な密度に起因する、異なるセンサーの隔離された配置により、O2の信号はCO2の変動から独立して密接に作動する。同様に、CO2の調節は上記配合物の隔離された配置により、酸素濃度センサーから独立して密接に作動する。
【００３２】
（実施例）
センサー配合物は、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料の混合物から構成できる。本発明の新規センサー配合物の限定されない例に、(a)トリス(4,7-ジフェニル-10-フェナントロリン)ルテニウムジクロライド五水和物、(b)1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチリンドジカルボバイアニンヨウ化物、(c)酸塩基指示色素、(d)シリコン（ケイ素）ポリマー、(e)水素・ケイ素化合物、(f)触媒、および任意選択により、(g)抑制剤、および新規組成物を調製する方法が含まれうる。重要なことは、新規配合物の成分を選択により、当業者は試験する各サンプルのガス組成の明確な決定を与えるセンサーシステムの調整をできる。示された実施例はガス組成物中のO2とCO2の濃度を同時に検出できるセンサー配合物およびシステムに関するが、この配合およびシステムは、所望される場合には、別のガスを同時にモニターできる、別のセンサーおよび別の対応する蛍光物質色素を含むように拡張できることが分かることは重要である。このセンサーシステムは、したがって、非常に広範囲の可能性を有し、本明細書に記載した実施例には限定されない。
【００３３】
本発明のセンサー組成物のいくつかの、限定されない例としての配合物を表1の中に示す。表1の各実施例で示した特定成分は、本発明を実施するために選択できる成分の代表である。本発明の新規配合物は、組合せにより対応するセンサー間のクロストークを最小限にするか、なくして、識別可能な蛍光物質色素の蛍光信号の高い応答を起こさせる、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料のいかなる混合物も含まれる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
1 MCPストック溶液は、m-クレゾールパープル0.19g + CAPS 4.54g + チモールフタレン0.086g + 1N NaOH 22.14g + DI H2Oストック溶液78.5gである。
2 HFCSは、HIDC蛍光物質で被膜したシリカである。
3 クレゾールレッドストック溶液は、クレゾールレッド0.345g + トリシン0.54g + 1N NaOH 4.95g + KCl 0.19g + DI H2O 25.2gである。
4 BTB色素は、BTB 2.0g + CAPS 28.0g + チモールフタレン0.53g + 1N NaOH 16.0g + KCl 0.65g + DI H2O 100gである。
5 ポリマーA部は、ポリジメチルシロキサン、好ましくは、ビニルジメチル末端のポリジメチルシロキサンである。
6 ポリマーB部は、ポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体とシロキサン共重合体の混合物である。
7 RFCSは、ルテニウム蛍光物質で被膜したシリカである。
【００３６】
表2に示したチャンネル配置を有する、修正したBD9050蛍光読取装置を用意した。同様のチャンネル配置は当業者が微生物の代謝のモニターに使用するどのような蛍光読取装置でも用意することができる。
【００３７】
【表２】
【００３８】
1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチリンドジカルボシアニンヨウ化物(以後「HIDC」と呼ぶ)で被膜したシリカを調製するため、45gの95%エタノール中に、0.0715gのHIDCを含む溶液を作製した。その溶液を次にDegussa Aerosil(登録商標)R812シリカ(以後「R812」と呼ぶ)と混合した。その混合物を次に空気乾燥し、得られた固体を粉砕した。
【００３９】
クレゾールレッド指示薬ストック溶液(以後「CR」と呼ぶ)は、0.345gのクレゾールレッド(CAS#1733-12-6)と、0.54gのトリシン(CAS#5704-04-1)と、0.19gのKClを、4.95gの1N NaOHと25.2gの脱イオン水の中に溶解して調製した。
【００４０】
トリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウムクロライド五水和物/ルテニウム(II)クロライド水和物で被膜したシリカ(以後「RFCS」と呼ぶ)を、開示の全てが参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第5,567,598号に記載されている方法に従って調製した。
【００４１】
ポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体、または、ビニル末端ポリジメチルシロキサンとポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体の混合物である熱硬化性シリコン（ケイ素）系ポリマーを、ビニル末端ポリジメチルシロキサンを様々な量の触媒、抑制剤および架橋剤と混合することにより製造した。触媒は、配合物中で1ppmから5%含まれ、抑制剤は1ppmから10%含まれうる。満足できる限定されない触媒と抑制剤の例には、光反射材としての、白金触媒と環状ビニルメチル-ジメチルシロキサン抑制剤がある。
【００４２】
センサー配合物は、0.36gのCR、0.2gのHIDCで被膜したシリカ、0.03gのデュポンTi-Pure二酸化チタン、および21gのポリマーから構成できる。得られた混合物は機械的に混合できる。上記混合物にRFCS(0.25g)を加えて、再度混合できる。配合物の2回目の混合後、3.5gの架橋剤を加え、3回目の混合をすることができる。所望の架橋度により適当な架橋剤を使用できる。得られたセンサー混合物の2グラムはBactec 9000ガラス瓶に入れた。センサーの瓶を次に部屋の周囲温度で3時間置き、その後、75℃で3.5時間、熱硬化させることができる。本発明の概念から逸脱することなくこの方法に変更を加えることができる。
【００４３】
組合わさったセンサー信号は、同じセンサー装置上の同じ機械ユニットの2つの異なる波長を2つの別の検出器により測定する。サンプル中のセンサーの機能をモニターするために使用するブレッドボードは、修正したBD 9050機器から作製した。この機器は、センサー組成物中の色素/蛍光物質の識別可能な波長がその機器に適合するように修正した。修正した機器には2つの検出器チャンネルを用意した。1つ目は酸素の変化信号のために用意し、2つ目はCO2の変化信号のために用意した。いずれの検出器による波長の制御も、適当なLEDまたはフィルタ、または、それら2つの組合わせにより達成できる。蛍光読取できるどんな装置への修正も、そのような機器に精通している当業者とっては容易なものに入る。
【００４４】
約30mlの脱イオン水をセンサー配合物に加え、容器をブチルゴム隔膜で密封した。センサー配合物の最初の信号は、カテゴリー「空気」の信号として修正した蛍光読取装置で測定された。次にそれに窒素を流し込み、「N2」または無酸素環境下の信号として測定値を得た。次に同じセンサーに、「N2/30%CO2」の信号として30%CO2を含む窒素を流した。最後に、空気と平衡させた30%CO2を同じセンサーに流し、対応する信号を測定した。図1および図2は、実施例4の試験サンプルのCO2モニターグラフ表示を提供する。示されているのは、実施例4のセンサー配合物のそれぞれ570nmと470nmのスペクトルである。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、および、N2単独のもとでのセンサーの対応がグラフで表示されている。表2は、上記と同じ技法を使用した実施例1-4のモニター結果を示している。センサー配合物の組成を変更することにより、当業者はサンプルモニター結果をどのように制御できるかが分かる。
【００４５】
修正したBD9050装置による様々なガス組成物のもとでの信号の測定は、好ましい実施形態の実施例4を含む例で以下に要約される。
【００４６】
最良の結果は、高いダイナミックレンジ、および、酸素と二酸化炭素の両方のチャンネルで低いクロストークを示す実施例4で得られた。ダイナミックレンジは、ガス組成の変化に応じる信号の変化を測定する。クロストークは、1のガス組成物の変化の他からの独立性を示す。
【００４７】
本発明の配合物の評価に一貫性を与えるため、全ての配合物の例で使用した試験材料は人工的に用意したガス組成物であった。用意したガス組成物は、30%CO2を含み、実際の微生物の成育を模倣するものとして一般に容認されている。その人工的なガス組成物を含むガラス製のセンサー瓶は、ゴムの隔膜で蓋をする。次に、1本の針がガスを供給するものにつながっており、他の針が大気に開放されている2本針の器具を挿入する。ガスの供給は、例えば、純粋な窒素、窒素と平衡させた30%CO2など特定のガス組成物のガスボンベである。これらのガスボンベは、市販業者から直接購入するか、業者を通じて注文できる。特定ガスは次に、センサー瓶中に適当な時間(標準的には5分間)流して空気を所望のガスで置換する。ガスボンベからガスがまだセンサー瓶に流れている間に、針の器具を抜いて操作を完了させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例4のセンサー配合物の570nmにおけるスペクトルを示す。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、およびN2単独のセンサーの応答をグラフで表示している。
【図２】実施例4のセンサー配合物の470nmにおけるスペクトルを示す。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、およびN2単独のセンサーの応答をグラフで表示している。
【発明の属する技術分野】
微生物はわれわれの環境に広がり、われわれの生活に有益な面と有害な面の両方で影響を及ぼす。そのため、微生物の存在および代謝活動を検出、同定および研究するために高感度、効果的で迅速な仕組みを提供する必要性は絶えず増大している。
【０００２】
近年、微生物科学は多くの進歩を経験した。このことは、微生物の習性の検出、同定および分析に使用するセンサー分野で特に正しい。微生物をモニターする分野では進歩がある一方、一般的に使用されるモニター方法では、まだ、非能率が存在する。例えば、遅いが有効な抗菌感受性試験方法、Bauer-Kirbyディスク法は、病院の環境内で、まだ、使用されている。この方法は、抗菌性化合物の効能を示す微生物の可視的な増殖の存否を利用するが、結果が得られる前に微生物の増殖を考慮すると、通常18から24時間の培養期間を必要とする。
【０００３】
抗菌感受性試験で別の好評な方法には、生物の同定および抗菌感受性試験のためのシステム、Septor RTM (米国メリーランド州スパークスのBecton Dickinson診断器械システム)のような培養液微量希釈法がある。このシステムは、複数の低容積カピュラ(カピュラ当り約0.4ml)を有する使い捨てプラスチックパネルを使用し、各カピュラは、カピュラ表面上で乾燥した異なる試験化合物または異なる濃度の試験化合物を含有する。試験すべき生物は、所望の試験媒体中に懸濁させ、分取物は試験パネルの個別カピュラに分配する。パネル上で乾燥させた試薬はサンプル中に溶解され、この系は次に生物が試薬と反応して、増殖が可視的に現れるために十分な時間を与えるように一晩(18から24時間)培養する。パネルはその後の増殖の存否を視覚的に検査し、それにより試験を受ける生物の感受性に関する情報を得る。別のウェルは生物の同定を助ける。しかし、この試験法もまたBauer-Kirbyディスク法と同様に長い培養期間を必要とする欠点により苦しむ。
【０００４】
近年、上記モニター方法に必要とされる長い培養時間を避ける努力がされている。これらの改革はコロニーの成育をモニターするのではなく、むしろ微生物の代謝活性をモニターする点に焦点が置かれている。微生物の代謝活性をモニターする多くのアプローチは、そのような代謝活性を迅速かつ正確にモニターする試みで報告されている。
【０００５】
微生物をモニターする分野における1つの改革は、様々な抗菌化合物の存在下での微生物の大きさ、または、数の変化を厳密に調べて、感受性を決定する光散乱光学手段を利用する装置である。この方法を利用する市販機器の1例には、Vitec System(BioMerieux社)が挙げられる。この最良のシステムは、多くの生物および薬の組合わせに対して、6時間以内に微生物の抗菌感受性についての情報を与えると期待される。別の組合わせは、生物の抗菌感受性をVitec System方法により決定できるまでに18時間もの長さが必要となり得る。
【０００６】
Bauer-Kirby法を改良する努力では、一定のサンプルを4から6時間で読取れるような改良がされた。しかし、この改良システムは、試験板上に色をつける色素の現像液の吹き付けを必要とし、事実上有害である。初期の迅速な手法が失敗した場合には、現像液の有害な効果により、その後の再培養および読取りは妨害される。したがって、標準的な評価をするため、その後は実験を継続できない。
【０００７】
さらに別のアプローチは微生物の酸素消費を、pHおよび/またはヘモグロビンの色変化の測定か、または、液体試験媒体の全酸化還元電位差に応答する色変化をトリフェニルテトラゾリウムクロライドおよびレサズリン等の色素の使用により、モニターすることを含んでいる。
【０００８】
微生物の代謝マーカーとして、微生物により消費される溶解した酸素のモニターは、多年研究がされている。例えば。C. E. Cliftonは1937年にヴァールブルクフラスコを使用し、数日間にわたり微生物の酸素消費をモニターした。酸素濃度の変化は、遅く、めんどうなこの方法で測定された。
【０００９】
電気化学装置、「クラーク」電極も溶解した酸素を測定するために一般に使用される。残念ながら、クラーク電極は使用中に酸素を消費し(それにより微生物が利用できる酸素を減少させ)、そのため「標準」サイズの電極は、典型的に電極による測定妨害を防止するため、100ml以上の容量の測定にのみ使用する。
【００１０】
「縮小型」クラーク電極は記述されているが、この電極は複雑な多数の構成部分があり、大きな電極と同様に測定する溶液と接触しなければならない。装置の電極構成部分は、試験溶液成分との反応を防ぐために酸素透過性の膜を使用できるが、酸素は試験溶液と測定系との間でも平衡しなければならず、酸素は一旦膜を通過すると消費される。
【００１１】
酸素濃度データを与えることができる光学システムは、クラーク電極システムの欠点を克服するために開発されている。そのような光学法の主な利点は、定量値を測定するために必要な計測器を、それ自体試験溶液と物理的に接触させる必要がないことである。酸素の比色分析および蛍光分析の両方を速やかに再現性よく行える光学技術が知られており、そのような分析にかかる費用は極めて低い。例えば、酸素を測定するための発光技術はいくつか記載されているが、それらは様々な化合物の蛍光またはりん光の発光を消光させる酸素活性に基づいている。しかし、上記の方法は微生物のモニターに直ちに適応されるわけではない。さらに、そのようなシステムは、クラーク電極システムと同様に、微生物による溶解した酸素の消費のみのモニターに限定される。
【００１２】
8時間以内に微生物の存在、同定、抗菌感受性についての情報を提供するその他のシステムが述べられている。微生物の存在を判断するために、電極と高インピーダンスの電位差計を使用するシステムが開示されている(例えば、特許文献1参照。)。微生物の成長と関連するフラスコ上部のヘッドスペースの圧力変化を利用する生物の検出と調査用の分析法が開示されている(例えば、特許文献2参照。)。試験用サンプル上部のヘッドスペースのガスを微生物の存在を測定するために外部の酸素検知器に通すシステムが開示されている(例えば、特許文献3参照。)。試験用サンプル上部の密閉されたヘッドスペース中で成長する生物によって生ずる真空のモニターにより分析するシステムが開示されている(例えば、特許文献4参照。)。バクテリアの成長を検出し、モニターするために、成長中の微生物培養物の濁度または光学的濃度増加に基づく光学手段を使用する例がある(例えば、特許文献5参照。)。クラーク電極システムと同様、これらのシステムは、酸素消費に限定されたデータを提供するように設計されている。
【００１３】
二酸化炭素濃度を連続してモニターするために開発された光学センサーが見本としてある(例えば、特許文献6参照。)。このようなセンサーは、二酸化炭素の存在に感度が良く、化学標識を含有するゾル・ゲルセンサー素子と組み合わせたグラスファイバーの光学機器の使用を含む。このシステムは、溝の中に付着させた化学標識を有するゾル・ゲル材料と溝をつけた基材を含む。光ファイバーケーブルはその溝に結合され、光が光ファイバーケーブルを通過するとき、ゾル・ゲルセンサー素子により、伝達は影響を受ける。
【００１４】
上記に例示した試験法は、微生物の成長および代謝活性を検出するためにより迅速で正確な手段を提供するため、近年改良されているが、サンプル中の嫌気性および好気性微生物両方の成長を同時に検出可能な生物学的センサーを提供する改革がないことが、上記試験法の共通の欠点である。このようなシステムは典型的に1つのセンサーユニットで1つのガス成分だけしか検出できないため、一般に使用されるモニターシステムでは、この限界が存在する。
【００１５】
微生物の代謝活性の検出に使用できるガス組成物モニターシステムは、酸素または二酸化炭素のいずれかのモニターに限定される。二酸化炭素センサーでは、酸塩基指示発色団を使用して蛍光物質の信号出力を調製ができる。そのようなシステムでは、測定サンプルのpH値が変化すると、発色団の吸光度スペクトルは変化する。測定サンプルのpH値は、サンプル環境の二酸化炭素濃度に依存するので、このシステムにより二酸化炭素濃度を判断できる。酸素センサーの採用により、微生物の代謝活性を判断するモニターシステムでは、サンプル環境の酸素濃度変化を検出するために酸素感応性蛍光物質を採用できる。本発明以前は、ガス組成物中の二酸化炭素濃度と酸素濃度の両方を同時にモニターする能力の組合わせは、システムセンサー間のクロストークの抗しがたい問題により妨げられていた。
【００１６】
本発明は、酸素および二酸化炭素に独立して、同時に応答できるセンサー配合物およびシステムを提供することにより、この問題と取り組むものである。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第4,200,493号明細書
【００１８】
【特許文献２】
米国特許第3,907,646号明細書
【００１９】
【特許文献３】
米国特許第4,200,715号明細書
【００２０】
【特許文献４】
米国特許第4,152,213号明細書
【００２１】
【特許文献５】
米国特許第4,116,775号明細書
【００２２】
【特許文献６】
米国特許第5,629,533号明細書
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、液体または半固体の媒体中に存在する嫌気性または好気性微生物の存在を検出し、代謝活性を評価するために改良されたモニターシステムを提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物中の酸素濃度および二酸化炭素濃度を独立して、同時にモニターすることができる微生物モニターシステムを提供することである。本発明の他の目的は、酸素を消費する酵素または酵素システムの活性、並びに、微生物に対する抗生物質等の成長抑制化合物の効果を検出および/またはモニターできる改良されたシステムを提供することである。本発明の他の目的は、生物の代謝活性のモニターに使用する新規な配合物を提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物の異なる成分を同時にモニターする個別のガス成分センサー間のクロストークを最小限にする手段を提供することである。本発明の他の目的は、ガス組成物中の酸素濃度および二酸化炭素濃度を個別に、同時に検出することにより、微生物の代謝活性をモニターするために使用できる改良された配合物を製造する方法を提供することである。さらに追加すれば、本発明の目的は、微生物の代謝活性をモニターする方法であって、本発明のモニターシステムを使用することを含む方法を提供することである。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
上記およびそれと関連する目的は本発明によって実現される。本発明は、微生物の代謝活性と関連する酸素濃度および二酸化炭素濃度に対して、異なるセンサー化合物間のクロストークが最小限かまたはなく、はっきりと応答するように蛍光センサー化合物を採用する新規な蛍光検出システムを使用することを含む。
【００２５】
本発明の蛍光システムでは、市販品として入手できる、例えば、限定はしないが、BD 9050機器から作られたブレッドボードなどの、修正した蛍光読取装置を使用できる。修正した蛍光読取装置は、少なくとも2つのセンサーを有し、各センサーは対応する蛍光色素の波長と別々に適合するように修正もできる。そのように修正した蛍光読取機器の例には、2つの対応する蛍光色素の個々の波長(感度)に適合する2つのセンサーを有する修正がされた、市販品として入手できるBD 9050装置であり、蛍光色素の1つは調査するサンプル中の酸素濃度に反応する目的で本発明の配合物中に含まれ、第2の蛍光色素は試験するサンプル中の二酸化炭素濃度に反応する目的で配合物中に含まれる。ガス組成物中の別のガスを測定することを所望する場合、別のガスのモニターに、別のセンサーに対応する別の蛍光色素を使用できることは、本発明の概念内である。別のセンサーは、必要に応じて、対応する別の蛍光色素の各波長に別々に識別可能に適合させてもよい。
【００２６】
本発明のセンサー配合物は(直接に、または、酸素透過性膜より分離された)試験サンプルと接触させることができ、組成物個々の蛍光色素の蛍光濃度は上記蛍光読取機器を使用して測定できる。蛍光増加は、サンプル中の酸素を利用(それにより酸素は減少)して呼吸している好気性微生物を暗示する。
【００２７】
このシステムは、このように、呼吸する様々な嫌気性および好気性の両方の微生物を検出するために使用できる。これはさらに微生物の代謝活性における抗生物質などの化合物の有効性を検出するために使用できることも期待される。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の生物学的センサーシステムは、このセンサーシステムに使用したときにサンプル中の嫌気性および好気性微生物の両方の成育を検出できる新規なセンサー配合物を提供する。2つのガスに対する別々のセンサー間のクロストークを最小限にするか、なくし、ガス組成物中の酸素と二酸化炭素のガス濃度変化を同時に検出するという、予想外の結果が新規センサー配合物により得られた。センサー配合物は、同じセンサーマトリックス中の別の蛍光物質色素により同時に検出される組成変化との相互作用なしに別個の様式で、各活性蛍光物質が特定のガス組成変化に対応できるように、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料の混合物から構成される。本発明のセンサーシステムは、新規なセンサー配合物によりセンサー間のクロストークを最小限にする。
【００２９】
本発明は、したがって、1つの検出素子中でCO2とO2を検出する「コンビセンサー (combi-sensor)」のための組成物の新規配合物、そのセンサーの製造方法、病気を引き起こす広く多様な微生物の成育(あるいは抗生物質薬剤の場合は成育の抑制であってもよい)をCO2の生産とO2の消費の両方によって検出するためのセンサーの用途を提供する。このセンサーは、真核生物細胞、例えば、組織培養で成長し、薬品のスクリーニングに使用されるもの等の成長(または成長の抑制)を検出するために使用することもまた可能である。
【００３０】
本発明の新規配合物によると、センサー間で予期されるクロストーク（異なる信号同士の干渉による障害）なしで、CO2生産とO2消費の両方のモニターができる。したがって、サンプルのCO2濃度が変化するにしたがい、発色団の吸収スペクトルは変化する。CO2センサーには、蛍光物質色素の信号出力を調節するモジュレーターとして酸塩基指示発色団を使用する。サンプル環境のCO2濃度が変化するにしたがい、pH値はそれに対応して変化する。発色団吸収スペクトルはpH値の変化と関連して変化する。O2センサーには、サンプル環境のO2濃度の変化に対応して変化する酸素感応性蛍光物質を使用する。蛍光読取装置のセンサーは、モニターする各別々のガスに対して識別可能な色素の波長に合わせられる。しかし、異なるセンサー間のクロストークは、ガス組成をモニターするどんな努力も無にするほどひどいこともあり得る。
【００３１】
本発明は、センサー間のこのクロストーク問題を解決し、新規センサー配合物の使用により、モニターするガスの個々に対して高い応答を示す識別可能なセンサーを提供する。本発明の例としては、どんなO2感応性蛍光物質色素でも高密度シリカ粉末を被膜できる。高密度シリカ粉末により、蛍光物質で被膜されたシリカはセンサーマトリックスの底部に、それが形成されるにしたがいおさまる。CO2の検出に使用する蛍光物質色素は、軽密度シリカを被膜し、その結果CO2と関連する蛍光物質はセンサーマトリックス全体に浮かび上がる。酸塩基指示発色団は、エマルションにし、センサーマトリックス中に入り、そのためセンサーマトリックス全体に分散する。配合物成分の注意深い選択により、O2感応性蛍光物質とCO2感応性蛍光物質のスペクトル輪郭の重なりを最小限にするか、なくすことができる。マトリックスの形成中で使用される選択したシリカの識別可能な密度に起因する、異なるセンサーの隔離された配置により、O2の信号はCO2の変動から独立して密接に作動する。同様に、CO2の調節は上記配合物の隔離された配置により、酸素濃度センサーから独立して密接に作動する。
【００３２】
（実施例）
センサー配合物は、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料の混合物から構成できる。本発明の新規センサー配合物の限定されない例に、(a)トリス(4,7-ジフェニル-10-フェナントロリン)ルテニウムジクロライド五水和物、(b)1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチリンドジカルボバイアニンヨウ化物、(c)酸塩基指示色素、(d)シリコン（ケイ素）ポリマー、(e)水素・ケイ素化合物、(f)触媒、および任意選択により、(g)抑制剤、および新規組成物を調製する方法が含まれうる。重要なことは、新規配合物の成分を選択により、当業者は試験する各サンプルのガス組成の明確な決定を与えるセンサーシステムの調整をできる。示された実施例はガス組成物中のO2とCO2の濃度を同時に検出できるセンサー配合物およびシステムに関するが、この配合およびシステムは、所望される場合には、別のガスを同時にモニターできる、別のセンサーおよび別の対応する蛍光物質色素を含むように拡張できることが分かることは重要である。このセンサーシステムは、したがって、非常に広範囲の可能性を有し、本明細書に記載した実施例には限定されない。
【００３３】
本発明のセンサー組成物のいくつかの、限定されない例としての配合物を表1の中に示す。表1の各実施例で示した特定成分は、本発明を実施するために選択できる成分の代表である。本発明の新規配合物は、組合せにより対応するセンサー間のクロストークを最小限にするか、なくして、識別可能な蛍光物質色素の蛍光信号の高い応答を起こさせる、発色団、蛍光物質、および支持不活性材料のいかなる混合物も含まれる。
【００３４】
【表１】
1 MCPストック溶液は、m-クレゾールパープル0.19g + CAPS 4.54g + チモールフタレン0.086g + 1N NaOH 22.14g + DI H2Oストック溶液78.5gである。
2 HFCSは、HIDC蛍光物質で被膜したシリカである。
3 クレゾールレッドストック溶液は、クレゾールレッド0.345g + トリシン0.54g + 1N NaOH 4.95g + KCl 0.19g + DI H2O 25.2gである。
4 BTB色素は、BTB 2.0g + CAPS 28.0g + チモールフタレン0.53g + 1N NaOH 16.0g + KCl 0.65g + DI H2O 100gである。
5 ポリマーA部は、ポリジメチルシロキサン、好ましくは、ビニルジメチル末端のポリジメチルシロキサンである。
6 ポリマーB部は、ポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体とシロキサン共重合体の混合物である。
7 RFCSは、ルテニウム蛍光物質で被膜したシリカである。
【００３６】
表2に示したチャンネル配置を有する、修正したBD9050蛍光読取装置を用意した。同様のチャンネル配置は当業者が微生物の代謝のモニターに使用するどのような蛍光読取装置でも用意することができる。
【００３７】
【表２】
1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチリンドジカルボシアニンヨウ化物(以後「HIDC」と呼ぶ)で被膜したシリカを調製するため、45gの95%エタノール中に、0.0715gのHIDCを含む溶液を作製した。その溶液を次にDegussa Aerosil(登録商標)R812シリカ(以後「R812」と呼ぶ)と混合した。その混合物を次に空気乾燥し、得られた固体を粉砕した。
【００３９】
クレゾールレッド指示薬ストック溶液(以後「CR」と呼ぶ)は、0.345gのクレゾールレッド(CAS#1733-12-6)と、0.54gのトリシン(CAS#5704-04-1)と、0.19gのKClを、4.95gの1N NaOHと25.2gの脱イオン水の中に溶解して調製した。
【００４０】
トリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウムクロライド五水和物/ルテニウム(II)クロライド水和物で被膜したシリカ(以後「RFCS」と呼ぶ)を、開示の全てが参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第5,567,598号に記載されている方法に従って調製した。
【００４１】
ポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体、または、ビニル末端ポリジメチルシロキサンとポリメチルヒドロジメチルシロキサン共重合体の混合物である熱硬化性シリコン（ケイ素）系ポリマーを、ビニル末端ポリジメチルシロキサンを様々な量の触媒、抑制剤および架橋剤と混合することにより製造した。触媒は、配合物中で1ppmから5%含まれ、抑制剤は1ppmから10%含まれうる。満足できる限定されない触媒と抑制剤の例には、光反射材としての、白金触媒と環状ビニルメチル-ジメチルシロキサン抑制剤がある。
【００４２】
センサー配合物は、0.36gのCR、0.2gのHIDCで被膜したシリカ、0.03gのデュポンTi-Pure二酸化チタン、および21gのポリマーから構成できる。得られた混合物は機械的に混合できる。上記混合物にRFCS(0.25g)を加えて、再度混合できる。配合物の2回目の混合後、3.5gの架橋剤を加え、3回目の混合をすることができる。所望の架橋度により適当な架橋剤を使用できる。得られたセンサー混合物の2グラムはBactec 9000ガラス瓶に入れた。センサーの瓶を次に部屋の周囲温度で3時間置き、その後、75℃で3.5時間、熱硬化させることができる。本発明の概念から逸脱することなくこの方法に変更を加えることができる。
【００４３】
組合わさったセンサー信号は、同じセンサー装置上の同じ機械ユニットの2つの異なる波長を2つの別の検出器により測定する。サンプル中のセンサーの機能をモニターするために使用するブレッドボードは、修正したBD 9050機器から作製した。この機器は、センサー組成物中の色素/蛍光物質の識別可能な波長がその機器に適合するように修正した。修正した機器には2つの検出器チャンネルを用意した。1つ目は酸素の変化信号のために用意し、2つ目はCO2の変化信号のために用意した。いずれの検出器による波長の制御も、適当なLEDまたはフィルタ、または、それら2つの組合わせにより達成できる。蛍光読取できるどんな装置への修正も、そのような機器に精通している当業者とっては容易なものに入る。
【００４４】
約30mlの脱イオン水をセンサー配合物に加え、容器をブチルゴム隔膜で密封した。センサー配合物の最初の信号は、カテゴリー「空気」の信号として修正した蛍光読取装置で測定された。次にそれに窒素を流し込み、「N2」または無酸素環境下の信号として測定値を得た。次に同じセンサーに、「N2/30%CO2」の信号として30%CO2を含む窒素を流した。最後に、空気と平衡させた30%CO2を同じセンサーに流し、対応する信号を測定した。図1および図2は、実施例4の試験サンプルのCO2モニターグラフ表示を提供する。示されているのは、実施例4のセンサー配合物のそれぞれ570nmと470nmのスペクトルである。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、および、N2単独のもとでのセンサーの対応がグラフで表示されている。表2は、上記と同じ技法を使用した実施例1-4のモニター結果を示している。センサー配合物の組成を変更することにより、当業者はサンプルモニター結果をどのように制御できるかが分かる。
【００４５】
修正したBD9050装置による様々なガス組成物のもとでの信号の測定は、好ましい実施形態の実施例4を含む例で以下に要約される。
【００４６】
最良の結果は、高いダイナミックレンジ、および、酸素と二酸化炭素の両方のチャンネルで低いクロストークを示す実施例4で得られた。ダイナミックレンジは、ガス組成の変化に応じる信号の変化を測定する。クロストークは、1のガス組成物の変化の他からの独立性を示す。
【００４７】
本発明の配合物の評価に一貫性を与えるため、全ての配合物の例で使用した試験材料は人工的に用意したガス組成物であった。用意したガス組成物は、30%CO2を含み、実際の微生物の成育を模倣するものとして一般に容認されている。その人工的なガス組成物を含むガラス製のセンサー瓶は、ゴムの隔膜で蓋をする。次に、1本の針がガスを供給するものにつながっており、他の針が大気に開放されている2本針の器具を挿入する。ガスの供給は、例えば、純粋な窒素、窒素と平衡させた30%CO2など特定のガス組成物のガスボンベである。これらのガスボンベは、市販業者から直接購入するか、業者を通じて注文できる。特定ガスは次に、センサー瓶中に適当な時間(標準的には5分間)流して空気を所望のガスで置換する。ガスボンベからガスがまだセンサー瓶に流れている間に、針の器具を抜いて操作を完了させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例4のセンサー配合物の570nmにおけるスペクトルを示す。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、およびN2単独のセンサーの応答をグラフで表示している。
【図２】実施例4のセンサー配合物の470nmにおけるスペクトルを示す。N2とCO2、CO2と空気、空気単独、およびN2単独のセンサーの応答をグラフで表示している。
Claims (14)
- ガス組成物の少なくとも2成分を同時にモニターするためのセンサー配合物であって、
少なくとも第1の蛍光物質と第2の蛍光物質と、
酸塩基指示発色団色素と、
ポリマーマトリックスと、を含み、
前記第1および第2の蛍光物質は、前記マトリックスの重合前に前記ポリマーマトリックス内で混合され、
前記第1の蛍光物質は第1のシリカ粉末の粒子上に被膜されており、
前記第2の蛍光物質は第2のシリカ粉末の粒子上に被膜されており、
前記第1のシリカ粉末は前記第2のシリカ粉末よりも重い密度を有することを特徴とするセンサー配合物。 - 請求項1に記載のセンサー配合物であって、
前記酸塩基指示発色団色素は前記ガス組成物中の二酸化炭素濃度変化に応答し、
前記第1の蛍光物質はガス組成物中の酸素濃度変化に応答し、
前記第2の蛍光物質は前記発色団色素の変化に応答することを特徴とするセンサー配合物。 - 前記発色団色素は前記ポリマーマトリックス内で均一に分配されていることを特徴とする請求項２に記載のセンサー配合物。
- 前記第1の蛍光物質は、前記第1のシリカ粉末と前記第2のシリカ粉末の密度の相違により、前記ポリマーマトリックス内で前記第2の蛍光物質から隔離されていることを特徴とする請求項３に記載のセンサー配合物。
- 前記ポリマーマトリックスはポリマー成分と、架橋剤成分とを含むことを特徴とする請求項４に記載のセンサー配合物。
- 前記ポリマーマトリックスはさらに抑制剤を含むことを特徴とする請求項5に記載のセンサー配合物。
- 呼吸する微生物の存在を検出する方法であって、
請求項５に記載のセンサー配合物を提供し、
前記第1の蛍光物質の波長を識別して、その波長に適合する第1のセンサー素子と、前記第2の蛍光物質の波長を識別して、その波長に適合する第2のセンサー素子とを少なくとも有する各蛍光物質の波長を検出する蛍光読取装置を提供し、
モニターする微生物を提供し、
前記蛍光読取装置中で前記微生物を前記センサー配合物にさらし、
前記微生物に対する前記第1のセンサー素子および前記第2のセンサー素子の応答を記録する、
工程を具えること特徴とする方法。 - 前記第1の蛍光物質は、トリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウムクロライド五水和物/ルテニウムクロライド(II)水和物の蛍光物質であり、且つ前記第2の蛍光物質は、1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチルリンドジカルボシアニンヨウ化物色素であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記酸塩基発色団指示色素は、クレゾールレッド色素、またはブロメチロールブルーであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 微生物の代謝に対する組成物の効果をモニターする方法であって、
請求項５に記載のセンサー配合物を提供し、
前記第1の蛍光物質の波長を識別して、その波長に適合する第1のセンサー素子と、前記第2の蛍光物質の波長を識別して、その波長に適合する第2のセンサー素子とを少なくとも有する各蛍光物質の波長を検出する蛍光読取装置を提供し、
モニターする微生物を提供し、
前記微生物の代謝に対する組成物の効果を試験する組成物を前記微生物にさらし、
前記蛍光読取装置中で前記微生物を前記センサー配合物にさらし、
前記微生物に対する前記第1のセンサー素子および前記第2のセンサー素子の応答を記録する、
工程を具えること特徴とする方法。 - 前記ポリマーマトリックスは、さらに触媒を含むことを特徴とする請求項５に記載のセンサー配合物。
- 前記触媒は白金触媒であることを特徴とする請求項１１に記載のセンサー配合物。
- 前記第1の蛍光物質は、トリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウムクロライド五水和物/ルテニウムクロライド(II)水和物の蛍光物質であり、且つ、前記第2の蛍光物質は、1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチルリンドジカルボシアニンヨウ化物色素であることを特徴とする請求項５に記載のセンサー配合物。
- 前記酸塩基発色団指示色素は、クレゾールレッド色素、またはブロメチロールブルーであることを特徴とする請求項５に記載のセンサー配合物。
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