JP4392238B2 - 腫瘍形成性の診断及び抗癌療法に対する耐性の決定 - Google Patents
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Description
多細胞生物における細胞の増殖及び分化は高度に調節されたプロセスに委ねられている。癌細胞の際立った特徴は、このプロセスに対する制御が無いことであり、増殖及び分化が調節されなくなって、成長が統制されなくなる。正常な細胞と腫瘍細胞とのこの違いを更に良く理解するために、多大な研究努力が行われてきた。研究の焦点の1つの領域は成長因子、より具体的にはオートクリン成長刺激である。
ここで本発明者は予想外なことに、糖タンパク質(GP88)(正常な細胞内において厳密に調節されて発現される)が正常細胞に由来する腫瘍形成性の高い細胞内において過剰に発現されて調節されないこと、GP88が腫瘍形成性細胞にとって厳格に(stringently)必要とされる成長刺激因子として働くこと、及び腫瘍形成性細胞内においてGP88の発現又は働きを阻害すれば該過剰産生細胞の腫瘍形成特性が阻害されることを発見した。さらに、細胞内のGP88のレベルは、その細胞の腫瘍形成性と直接相関している。
これから本発明の現在好適な実施形態について詳しく言及する。これらの実施形態は、その後の実施例と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
本発明は、GP88、ならびにGP88の発現量の変化(増加)に関係する疾患を治療及び診断するのに有用な抗腫瘍組成物及び抗ウイルス組成物に関する。あるいは本発明は、GP88に対する反応性の増大に関係する疾患を治療及び診断するために使用される。3つの細胞系からなるマウスモデル系を用いて、本発明者は、GP88を過剰発現する細胞が腫瘍を形成することを証明した。親細胞系1246は、インスリンによるストリンジェントな調節下において決まった培地内で増殖して脂肪細胞へと分化するC3Hマウス脂質生成細胞系である。1246細胞は、高い細胞密度で注入された場合であっても、同系動物(C3Hマウス)内で腫瘍を形成することができない。インスリン独立型細胞系1246-3Aは、インスリンを含まない培地内に維持された1246細胞から単離された。1246-3A細胞は、同系マウスの皮下に106個を注射した場合に、分化して腫瘍を形成する能力を失った。腫瘍形成性の高い細胞系PCは、in vitro-in vivoシャトル技法により1246-3A細胞から開発された。PC細胞は、同系マウスに104個の細胞を注射したときに、腫瘍を形成した。
本発明は、GP88の発現量の増加に関連する疾患を治療及び診断するための組成物を提供する。この方法は、GP88に対する反応性の増大に関係する疾患の治療及び診断にも適用できる。この発明の組成物は、GP88の生物学的活性を中和する抗-GP88抗体を含む。
また本発明は、GP88アンチセンス成分も提供する。細胞内におけるアンチセンスRNAの構成的発現は、20を超える遺伝子の発現を阻害することが分かっており、そのリストは増え続けている。アンチセンス効果について考え得るメカニズムは、翻訳の遮断又はスプライシングの妨げであり、これらはいずれもin vitroで観察されている。スプライシングの妨げにより、あまり保存されるべきではないイントロン配列の使用が可能になるので、特異性が増し、1つの種の遺伝子産物の発現を阻害するが他の種のその相同体の発現は阻害しないようになる。
また本発明は、他の哺乳動物DNA配列を実質的に含まない、組換えGP88ポリペプチド又はその機能的誘導体を発現するためのDNA発現系にも関する。このようなDNAは、二本鎖のものであっても一本鎖のものであってもよい。このDNA配列は、他のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にするために、好ましくは約20以上のヌクレオチドを有するべきである。特異性の高いハイブリダイゼーション(GP88タンパク質又はその相同体もしくは機能的誘導体をコードする配列以外の配列へのハイブリダイゼーションがないことを特徴とする)を達成するために、少なくとも50ヌクレオチド長が好ましい。
また本発明は、腫瘍形成性を決定するためのGP88診断方法、及び抗エストロゲン薬療法の抗新生物作用に対して患者が耐性であるか否かを決定するための診断方法も提供する。上記のように、GP88レベルの上昇は、腫瘍形成性の上昇を示す。さらに、本発明者らは、予期せぬことに、GP88レベルの上昇が、抗エストロゲン薬の抗新生物作用に対する耐性を示すことを発見した。
エストロジェン受容体陽性細胞において、エストロジェン代替化合物である17-β-エストラジオール(E2)は、用量および時間依存的にPCDGFの転写による発現を促進した。本発明者らは、本明細書において、PCDGFがMCF-7細胞におけるエストラジオール(E2)の細胞分裂促進効果を媒介することを証明する。PCDGFはE2に代わってDNA合成を促進する。E2の細胞分裂促進効果は抗PCDGF中和抗体によって用量依存的に阻害された。アンチセンストランスフェクションによるMCF-7細胞でのPCDGF発現の阻害もまた、E2の細胞分裂促進効果を阻害した。一方、MCF-7細胞におけるPCDGFの過剰発現は、エストロジェン非存在下で増殖可能なタモキシフェン耐性の細胞を生じさせた。E2と同様に、PCDGFはマイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性を促進する。PCDGFはE2に代わってサイクリンD1の発現を促進する。E2によるサイクリンD1の活性化は、抗PCDGF抗体によって50%阻害された。一方、PCDGFは別のE2標的分子であるc-myc発現を促進しなかった。本発明者らは、自己分泌PCDGFがサイクリンD1の活性化を介してE2の細胞分裂促進効果を媒介するとの結論に至った。
PCDGFはエストロジェン非存在下でMCF-7細胞のDNA合成を促進する
本発明者らは最初に、PCDGFの添加がE2非存在下で維持したMCF-7細胞のDNA合成を促進するかどうかを調べた。これらの条件下において、内因性のPCDGFの産生は非常に低かった。10 ng/ mlのPCDGFで、対照(E2およびPCDGF非存在下で維持した細胞)より2倍の(p<0.01)3H-チミジン取り込みの増加が観察された(図16A)。図16AはPCDGFがE2非存在下においてMCF-7細胞のDNA合成を促進することを図示している。MCF-7細胞(105細胞/ウェル)をDMEMおよびHam's F-12培地の1:1 5% FBS添加混合培地中に播種した。48時間後、培地をPFMEMに交換し、24時間後無血清α-MEMに交換した。ヒトPCDGFを濃度を勾配をつけて培地に添加した(三連)。陰性および陽性の対照としてそれぞれ、EtOH のみ(CON)または10-9 M E2(E2)を用いた。5時間後、3H-チミジン(1 μCi/ml)を24時間添加した。結果は三回の測定の平均値±標準偏差として示した。10-9 M E2によって観察されるものと同様に、100 ng/mlのPCDGFによって最大4倍の活性化が観察された(p<0.001)。PCDGFは別のER+細胞であるT47DのDNA合成を促進した。100 ng/ mlのPCDGFによって2.9±0.3倍の DNA合成活性化が観察された。
本発明者らは次に、E2と比較して、MCF-7細胞でPCDGFによって活性化されるシグナル伝達経路を調べた。E2は細胞周期のG1期の通過を刺激することが示されている。現在、いくつかの下流の標的分子が解明されている。E2はMCF-7細胞においてMAPキナーゼ活性を活性化することが知られている。下流において、E2はc-myc経路およびD-型サイクリン/cdk複合体を活性化する。最近の研究では乳癌細胞においてc-mycおよびサイクリンD1経路が独立にE2によって活性化されることが示された。従って、本発明者らはMCF-7細胞においてPCDGFがE2に代わってMAPキナーゼ、サイクリンD1および/またはc-myc経路を活性化できるかどうかの決定を試みた。
サイクリンD1発現に対するPCDGFの効果を判定するための実験を行った。PCDGFはMCF-7細胞において時間依存的にサイクリンD1発現を促進し、5時間後には最大で無処理の対照の4倍に達した(図20A)。サイクリンD1促進効果はPCDGFの細胞分裂促進効果の阻害と同一の方法でPD98059によって阻止された。図20AはPCDGFによるサイクリンD1発現の促進を示す。MCF-7細胞をPFMEM培地中で三連で培養し、1μMタモキシフェン処理によって同調させた。培地を200ng/ml PCDGF単独または30μM PD98059(上)もしくは10-9M E2(下)を添加した新しい培地に交換した。細胞を表示した時間に溶解し、60μgの全細胞溶解液と抗サイクリンD1抗体を用いたウェスタンブロット解析によってサイクリンD1発現を測定した。サンプルは、200ng/ml PCDGFで0時間(レーン1)、3時間(レーン2)、5時間(レーン3)および12時間(レーン4)処理したMCF-7細胞、無処理で5時間目のMCF-7細胞(レーン5)、200ng/ml PCDGFおよびPD98059で5時間処理したMCF-7細胞(レーン6)、ならびに10-9M E2で0、3時間および5時間処理したMCF-7細胞(それぞれレーン7〜9)である。
本発明者らは以前に、ER+ヒト乳癌細胞がPCDGFを発現し、E2が用量および時間依存的にPCDGF発現を促進することを報告した。本発明者らは本明細書においてPCDGFがE2の増殖促進効果を媒介することを証明する。本発明者らはPCDGFがE2非存在下で維持されたヒト乳癌細胞MCF-7およびT47Dの増殖を促進することを示す。本発明者らは次に、抗PCDGF抗体によるPCDGFオートクライン経路の遮断がE2の細胞分裂促進効果を阻害することを示す。抗体は、IGF-IIの細胞分裂促進効果を阻害できなかったため、この効果はPCDGFに特異的であった。更に、アンチセンスcDNAトランスフェクションによるPCDGF発現の阻害が、PCDGF発現の阻害の程度と相関したMCF-7細胞におけるE2の細胞分裂促進効果の低減を示したことによって、E2の細胞分裂促進効果へのPCDGFの関与を実証した。外因性PCDGFの添加は、これらのアンチセンス細胞の増殖を回復させた。更に、MCF-7細胞におけるPCDGF発現の増加はE2非存在下での細胞の増殖とタモキシフェン耐性を引き起こした。ER発現、エストロジェン応答配列-ルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性化、またはプロゲステロン受容体発現の促進などの、E2応答の他の因子に変化がなかったという事実は、トランスフェクトされた細胞におけるE2の細胞分裂促進効果の変化がE2受容体の変化によるものではなく、PCDGF発現の変化に特異的なものであることを示唆した。
本発明者らは、アンチセンスcDNAトランスフェクションによるER陰性乳癌細胞でのGP88発現の阻害が腫瘍形成の阻害を引き起こすことを示し、乳癌細胞の腫瘍形成特性におけるGP88過剰発現の重要性を示している。乳癌は本質的に不均一であり、乳腺の多様な機能性細胞区画に影響を及ぼすことができるので、進行モデルの様々な段階のGP88発現の生検代表値を調べることが望ましい。腫瘍マーカーの検出は診断または初期治療の際に乳癌の臨床経過を評価・予測するために望ましい方法であり、治療法の選択の判断に重要であることが示されている。これらの研究は乳癌の潜在的な予後マーカーとしての新規増殖因子PCDGFの解析を提供するので、女性の健康に直接関連している。
組織のプレパラート。パラフィンブロックから厚さ4μmの組織切片を切り、電荷を帯びたスライドグラスに載せた。標準的な方法によって、切片の脱パラフィン、固定、抗原の回復および再水和を行った。
パラフィン包埋した乳癌患者からの乳房組織の生検を、免疫組織化学的手法を用いて抗GP88抗体によって染色した。図21に示したように、良性の病巣はGP88染色を示さず、一方、浸潤性乳管癌(IDC)のサンプルはGP88陽性細胞の強い染色を示した。GP88発現は良性の病巣と比較して発癌性の浸潤性乳管癌において上昇している。
IDC腫瘍の生体サンプルを抗GP88抗体で免疫染色し、それらのエストロジェン受容体状態(ER+ =エストロジェン受容体陽性、ER- =エストロジェン受容体陰性)およびGP88染色強度の等級によって分類した。図22に示すようにGP88染色強度の増加はIDC腫瘍におけるエストロジェン受容体の減少と直接相関している。染色強度0の際、解析したすべてのIDC腫瘍サンプルはER+であった。染色強度1の際、IDC腫瘍の80%がER+、20%がER-であった。染色強度2の際、IDC腫瘍の50%がER+、50%がER-であった。染色強度3の際、IDC腫瘍の20%がER+であるのに対して、80%はER-であった。このように、GP88染色強度が増加するに従って、ER+ IDC腫瘍の割合は減少する。
GP88染色強度の増加は、細胞が増殖に対するエストロジェン依存性を喪失し、エストロジェン非依存性になったことを示す。細胞の増殖はもはやエストロジェンのようなホルモンからの外部シグナルによって制御されず、むしろGP88からの自己分泌増殖シグナルによって制御される。以前は、エストロジェン受容体の存在が、細胞が抗エストロジェン治療に応答できるかどうかの指標であると考えられた。しかし、細胞がエストロジェン依存性からエストロジェン非依存性の増殖に転換した時、細胞増殖シグナルは構成的であり、エストロジェンまたは抗エストロジェン剤の存在・非存在によって制御されないので、エストロジェン受容体の存在は抗エストロジェン治療が有効かどうかと無関係である。従って、高レベルのGP88(+2以上)を含むエストロジェン受容体陽性腫瘍は、細胞がエストロジェン受容体を表示するにも関わらず、抗エストロジェン治療耐性である。
Claims (8)
- ヒト患者において腫瘍形成性を判定するための検査方法であって、
前記患者由来の生物学的サンプルの細胞中のPCDGFを検出する工程、
前記サンプル中のPCDGF陽性細胞の数を決定する工程、及び
前記生物学的サンプル中の細胞の総数に対するPCDGF陽性細胞の比率を決定する工程
を含み、前記比率が少なくとも1%であれば腫瘍形成性を示すものである上記方法。 - ヒト患者が抗エストロゲン療法の抗腫瘍作用に対して耐性があるか否かを決定する方法であって、
前記患者由来の生物学的サンプルの細胞中のPCDGFを検出する工程、
前記サンプル中のPCDGF陽性細胞の数を決定する工程、及び
前記生物学的サンプル中の細胞の総数に対するPCDGF陽性細胞の比率を決定する工程
を含み、前記比率が少なくとも5%であれば抗エストロゲン療法の抗腫瘍作用に対する耐性を示すものである、上記方法。 - 前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、尿、乳頭吸引液、脳脊髄液、肝臓、腎臓、胸、骨、精巣、脳、結腸、肺および卵巣からなる群より選択される物質を含む、請求項1又は2記載の方法。
- 前記PCDGF陽性細胞の数が、顕微鏡検査、FACS分析、ルミネックス(luminex)検出、抗体マイクロアレイ、デジタルスキャナ及びセルソーティングからなる群より選択される技法によって決定される、請求項1又は2記載の方法。
- 腫瘍形成性を判定するための検査方法であって、
抗ヒトPCDGF抗体を用いた免疫染色により患者由来の胸部組織サンプルの細胞中のPCDGFを検出する工程、
顕微鏡検査により前記サンプル中のPCDGF陽性細胞の数を決定する工程、及び
前記胸部組織サンプル中の細胞の総数に対するPCDGF陽性細胞の比率を決定する工程
を含み、該比率が少なくとも1%であれば腫瘍形成性を示すものである、上記方法。 - エストロゲン受容体陽性患者が抗エストロゲン療法の抗腫瘍作用に対して耐性があるか否かを決定する方法であって、
抗ヒトPCDGF抗体を用いた免疫組織化学的染色により前記患者由来の胸部組織サンプルの細胞中のPCDGFを検出する工程、
顕微鏡検査により前記サンプル中のPCDGF陽性細胞の数を決定する工程、及び
前記胸部組織サンプル中の細胞の総数に対するPCDGF陽性細胞の比率を決定する工程
を含み、該比率が少なくとも10%であれば前記患者が抗エストロゲン療法の抗腫瘍作用に対して耐性があることを示すものである、上記方法。 - 前記患者が癌と診断されていることを特徴とする、請求項2又は6記載の方法。
- 容器及び抗ヒトPCDGF抗体を含む、請求項1記載の方法を実施するためのキット。
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