JP4376740B2 - 多糖類低生産性納豆菌 - Google Patents

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、多糖類生産性の低い納豆菌に関する。

背景技術
納豆は、原料である大豆を低温で一晩浸漬後加圧蒸煮し、得られた煮豆に納豆菌の種菌を散布した後、所定の容器に充填し、次いで発酵室に配置して３７〜４０℃で１６〜２０時間発酵させた後、１〜２日間低温で熟成させるという方法で一般的に製造されている。原料の大豆としては、丸大豆が多く用いられているが、一部には挽き割り大豆が使用されている。納豆の品質は原料大豆の品質の影響を受けるが、特に、原料大豆中の可溶性糖分の含量が重要である。煮豆中の可溶性糖分は、納豆菌が生育するときのエネルギー源として利用される。従って、可溶性糖分の少ない煮豆では納豆菌の生育が充分でなく、糸引きの素であるポリ‐γグルタミン酸（以下、ＰＧＡという）の生産量も減って糸引きの弱い納豆になってしまう。特に、死豆率の高い旧穀大豆や挽き割り大豆では、浸漬中に可溶性糖分の溶出が著しく、糸引きの強い納豆を作ることが難しい。このような原料から糸引きの強い納豆を作るために従来煮豆に砂糖を添加することも行われたが、自然食品である納豆に砂糖を添加することは納豆のイメージダウンになることから、例えば、特開平４−３５１９９２号公報（特許文献１）では、玄米粉を添加する方法が、また、特開２００２−２９１４３６号公報（特許文献２）では、蕎麦又は山芋粉末を加える方法が提案されている。しかし浸漬した大豆や煮豆にこれ等の物質を均一に加えることは難しく、コストアップにもなり優れた方法とは言えない。

なお、上記記載中で挙げられた文献を列記すると下記の通りである。
特開平４−３５１９９２号公報 特開２００２−２９１４３６号公報

発明の概要

納豆菌は生育中に粘質物としてＰＧＡと多糖類（フラクタン）を生産するが、糸引きの主体はＰＧＡである。糸引き性にあまり関係しない多糖類は発酵の初期において煮豆中の可溶性糖分から生産されるため、この多糖類の生産量が多いと糖分不足が起こりやすい。従って、多糖類の生産性の低い納豆菌を開発すれば、煮豆中の可溶性糖分が多糖類生産に消費される割合を減らすことができるために、糖分含量が低い大豆や挽き割り大豆であっても、糸引きの強い良質の納豆を生産することが期待できる。
よって、本発明は、多糖類の生産性の低い納豆菌を開発することを主な目的とする。

本発明者らは、上記の目的に即して鋭意研究を重ねる過程において、納豆の粘質物に関する藤井の研究報告（農化、第３８巻、第７号、Ｐ４０７、１９６３年 並びに 農化、第３７巻、第８号、Ｐ４７４、１９６３年）に接した。前者は、納豆の粘質物の成分はＰＧＡと多糖類（フラクタン）であり、多糖類の割合は粘質物全体の２５〜４０％であることを報告している。また、後者は、納豆の糸引き性の主体はＰＧＡであり、多糖類は多少の粘性はあるものの糸引き性には関係していないと報告している。

本発明者らは、これらの研究報告に基いて市販の納豆の粘質物について実際に分析してみたところ、納豆の粘質物中多糖類の占める割合は２８〜３８％であった。この結果から、多糖類の割合がこれより低い納豆菌を開発すれば、煮豆中の可溶性糖分が菌の生育のためにより有効に利用でき、可溶性糖分含量の低い原料からでも糸引き性の強い納豆を生産できるであろうという可能性を認識した。当分野において、本発明者らの知る限り、多糖類の生産性の低い納豆菌について、並びにこのような納豆菌の奏する効果についてはこれまで何らの報告もなされてはいない。本発明者らはこのような納豆菌の開発に際して、まず、突然変異の手段により、例えば、納豆菌を紫外線照射や変異剤で処理して突然変異を作出させることにより目的とする納豆菌を創製することができるであろうと考え、試みたところ、粘質物中の多糖類の割合が２３％以下である納豆菌が実際に得られた。次いで、こうして得られた納豆菌を用いて、可溶性糖分の低い煮豆で納豆を実際に試作してみたところ、通常の納豆菌より糸引きの強い良質の納豆ができることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、多糖類生産性の低い納豆菌であって、該納豆菌を用いて製造した納豆中に生産される全粘質物中の多糖類の割合が２３％以下であることを特徴とする上記納豆菌を提供するものである。

本発明の納豆菌は、可溶性糖分含量の低い煮豆からでも糸引きの強い良質の納豆を製造するという効果を奏し得るものである。このような納豆菌変異菌株の１株、即ち、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＴＭ−１は、平成１６年６月２３日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２００９６号として寄託されている。

発明の具体的な説明

測定法
本発明において、糸引きの強さ（粘りの強さともいう）、多糖類含量、ＰＧＡ含量の測定法は以下の通りである。

糸引きの強さ（粘りの強さ）：納豆５０グラムを計量して５００ｍｌのビーカーに取り、水２００ｍｌを加えてマグネチックスターラーにより３０分間攪拌後、金網で濾過し、濾液を２００ｍｌのビーカーに入れ、東京計器製Ｂ型粘度計（ＢＨ型）でローターＮｏ１を用いて粘度（ｃＰ：センチポアズ）を測定する。

多糖類含量：粘度測定に用いた濾液を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清１０グラムを１００ｍｌビーカーに計量する。これにエタノール５０ｍｌを加えてガラス棒で攪拌し、糸状の沈殿物をガラス棒で定量的にからめ取る。スパチュラでガラス棒から粘質物を剥がし取り、蒸留水に溶解して１００ｍｌにフィルアップする。砂糖を標準液として、フェノール硫酸法（M.Dubois et al,Anal.Chem.,Vol28,No.3,350,1956）で全糖量を測定し、多糖類含量（ｍｇ／１００ｇ）とする。

ＰＧＡ含量：多糖類測定と同様に遠沈上清１０グラムを１００ｍｌビーカーに計量し、エタノール５０ｍｌを加え、ガラス棒で糸状の沈殿物を定量的に回収する。スパチュラで粘質物を剥がし取り、計量るつぼに入れ、１０５℃で３時間加熱し、乾物重量を測定する。この乾物重量から上記測定の多糖類含量を引いた値をＰＧＡ含量（ｍｇ／１００ｇ）とする。

上記の方法により、市販の納豆菌（三浦菌）を用いて発酵中の納豆の糸引きの強さ（粘りの強さ）、多糖類含量、ＰＧＡ含量を経時的に測定した結果を、下記の表１に示す。

表１に示す通り、多糖類は発酵の前半においてほとんどが生産され、糸引きの素であるＰＧＡは発酵の後期において生産されることがわかる。

同様に、市販の納豆（３社のトレイ及びカップ製品）の糸引きの強さ（粘りの強さ）、多糖類含量、ＰＧＡ含量をそれぞれ測定した結果、並びに、該結果に基いて算出した、全粘質物（多糖類＋ＰＧＡ）中の多糖類の割合（％）を、下記の表２に示す。

表２に示す通り、現在使用されている納豆菌で製造した納豆では、いずれも全粘質物中の多糖類の割合は２８〜３５％である。

突然変異作出手段
多糖類の生産性の低い納豆菌株の取得方法について以下説明する。なお、本発明において、％は重量％を意味する。
多糖類低生産性変異株を得るために親株として用いる納豆菌としては、三浦菌、高橋菌等の市販されている納豆菌であっても、或いは自然界から直接分離した納豆菌であってもよい。変異処理法としては公知の通常の方法、例えばニトロソグアニジン等の変異剤で処理する化学的な方法、紫外線やＸ線を照射する物理的な方法、遺伝子工学的な方法など、いずれの方法であってもよいが、本発明においては紫外線の照射による方法が好ましい。具体的には、宮城野納豆製造所から購入しうる種菌（三浦菌）をＬＢ培地（バクトトリプトン１％、イーストエキス０．５％、食塩０．５％含有）で３０℃、１６時間振盪培養後、集菌、洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁し、紫外線ランプ下１０ｃｍの所で３０秒間照射する。その後菌体懸濁液を適当に希釈し、粘質物形成寒天培地（ニュートリエントブロス０．８％、イーストエキス０．１％、グルタミン酸ナトリウム１％、砂糖１％含有）にプレーティングして４０℃、１８時間培養する。

生育したコロニーの中で、培地上に形成したゼリー状の粘質物が親株より大きいコロニーを変異株として分離する。分離した変異株を用いて常法により丸大豆から納豆を試作し、納豆の糸引きの強さ、多糖類含量、ＰＧＡ含量を測定し、親株の三浦菌より多糖類の割合が少なく、かつ糸引きの強い良質の納豆を作る菌株を選択する。

変異体の同定
このような方法により、下記の表３に示す５株（ＴＭ−１〜ＴＭ−５）を、目的とする変異株として取得した。なお、表中の官能評価は、５名のパネラーによる納豆の糸引き性と風味についての５点法による評価である。

これら菌株の菌学的性質を調べたところ、多糖類低生産性であること以外の菌学的性質は、親株の三浦菌とほぼ同一であった。すなわち、これらの変異株は、いずれも、好気性、グラム染色陽性の桿菌であり、菌（栄養細胞）の大きさ（１×２〜３μｍ）、生育適温（３５〜４５℃）、各種の糖の発酵性、ＤＮＡのＧＣ含量等の性質がＢｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ８版の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の性質と一致しており、かつ粘質物を生成し、ビオチン要求性であること、及び、納豆菌のファ−ジに対して感受性であることから、いわゆる納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）に属しているものである、と判断された。

変異体の特徴
親株（三浦菌）及び得られた変異株を使用して、劣化した丸大豆（２年前の旧穀大豆）及び劣化した挽き割り大豆（常温で２ヶ月間保管したもの）を用いて納豆を試作し、得られた納豆の、糸引きの強さ、多糖類含量、ＰＧＡ含量の測定、並びに、官能評価（５点法評価）を行った。なお、丸大豆は、一晩浸漬後、１２０℃で４０分間蒸煮し、まだ熱いうちにそれぞれの納豆菌を散布して４０℃で１８時間発酵を行い、５℃で２日間熟成させて納豆を製造した。また、挽き割り大豆は、３時間浸漬後、１１５℃で２０分間蒸煮し、同様にそれぞれの納豆菌を散布後４０℃で１６時間発酵を行い、５℃で２日間熟成させて納豆を製造した。分析結果を下記の表４及び表５に示す。

表４及び表５に示された結果と、劣化していない丸大豆を原料として製造した納豆に関する前記の表３に示された結果との比較によれば、多糖類は発酵初期に生産されるためか、可溶性糖分の低い煮豆から作った納豆でも、多糖類含量は、劣化していない良好な大豆から作った納豆と比べてあまり変化していないことがわかる。また、表４及び表５の結果から、多糖類生産量の多い菌株（三浦菌、ＴＭ−４，ＴＭ−５）では、納豆菌がエネルギー源として必要とする可溶性糖分が不足して菌の生育が悪くなるためか、ＰＧＡの生産量が減り、結果的に糸引きが弱くなると共に風味も悪くなることがわかる。

これに対して、表３、４及び５の結果から更に、多糖類の生産割合が全粘質物の２３％以下である菌株（ＴＭ−１，ＴＭ−２，ＴＭ−３）では、煮豆中の可溶性糖分含量が多少少なくなってもエネルギー不足は起こらず、納豆菌が十分生育するためか、ＰＧＡの生産量もさほど減少せず、その結果、標準レベルの納豆が得られることがわかる。

多糖類の生産割合が全粘質物の２３％以下であるような納豆菌は、現在使用されている市販の納豆菌にはなく、また報告もされていないことから、ＴＭ−１，ＴＭ−２，ＴＭ−３は新規変異株であると認定された。このうちＴＭ−１株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２００９６号として寄託されている。
発明の効果

従来の納豆菌を使用すると糸引き不良を起こすような、可溶性糖分含量の低い、劣化した丸大豆や挽き割り大豆からでも、新規変異株ＴＭ−１，ＴＭ−２，ＴＭ−３を用いることにより、糸引きの強い正常な納豆を製造することができる。よって、このような原料から糸引きの強い納豆を作るために従来行われていたような、煮豆に砂糖やでんぷん粉等を添加するという方法を採用することなく、納豆の生産を安定して行うことが可能となる。

以下、本発明を実施例をもって更に詳しく説明する。

実施例１
変異株の取得
三浦菌（親株）を、ＬＢ培地（バクトトリプトン１％、イーストエキス０．５％、食塩０．５％含有）を用いて３０℃で１６時間振盪培養後、遠心分離により菌体を集め、０．７％食塩水で２回洗浄した。洗浄菌体を０．７％食塩水に懸濁し、紫外線ランプ下１０ｃｍの所で３０秒間紫外線照射を行った。その後菌体を適当に希釈し、粘質物形成寒天培地（ニュートリエントブロス０．８％、イーストエキス０．１％、グルタミン酸ナトリウム１％、砂糖１％含有）にプレーティングし、４０℃で１８時間培養した。生育したコロニーの中で、培地上に形成したゲル状／ゼリー状の粘質物の量が、親株より多い菌株を変異株として分離し、ＬＢ培地の試験管スラントに取り、保存した。

納豆の製造
小粒大豆１ｋｇに３リットルの水を加え、常温で１５時間浸漬した。浸漬した大豆は水をきった後、１２０℃、４０分間オートクレーブで加熱処理した。一方、分離しておいた変異株の試験管スラントから１白金耳の菌体を取り、１０ｍｌの無菌水に懸濁し、これをさらに１００倍希釈したものを種菌とした。この種菌液３ｍｌを、上記蒸煮大豆を１２０ｇずつボールに取ったものにふりかけ、良く攪拌した後、６０ｇずつ発泡スチロールの容器に盛り込んだ。この容器を４０℃で１８時間保温して発酵を行った。
発酵終了後２℃の冷蔵庫に入れて２日間熟成させた。取得した変異株で製造した納豆の糸引きの強さ、多糖類含量、、ＰＧＡ含量を測定し、多糖類の生産割合が全粘質物の２３％以下である菌株（ＴＭ−１，ＴＭ−２，ＴＭ−３）を新規変異株として分離保存した。

実施例２
分離保存しておいた新規変異株及び親株の三浦菌を使用して、可溶性糖含量の低い劣化した丸大豆及び挽き割り大豆を用いて、実施例１に準じてそれぞれ納豆を製造した。得られた各納豆の糸引きの強さを測定した。また、５名のパネラーにより、糸引き性と風味について５点法（１：悪い ２：やや悪い ３：普通 ４：やや良い ５：良い）で官能評価を行った。結果は下記の表６及び表７に示した通りであった。

このように新規変異株ＴＭ−１，ＴＭ−２，ＴＭ−３を使用することにより、劣化しているために浸漬中に可溶性糖分の溶出が著しくて可溶性糖分の少なくなった煮豆からでも、標準レベルの納豆を作ることができた。

Claims (3)

1. 多糖類生産性の低い納豆菌であって、該納豆菌を用いて製造した納豆中に生産される全粘質物中の多糖類の割合が２３％以下であることを特徴とする納豆菌である多糖類低生産性変異株ＴＭ−１（Bacillus subtilis ＴＭ−１）ＦＥＲＭ Ｐ−２００９６。
2. 納豆を製造するに際して、請求項１に記載の納豆菌を使用することを特徴とする納豆の製造方法。
3. 請求項２に記載の製造方法により得られる、全粘質物中の多糖類の割合が２３％以下であることを特徴とする納豆。