JP4370603B2

JP4370603B2 - プレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法

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Publication number: JP4370603B2
Application number: JP2008034251A
Authority: JP
Inventors: 真石井
Original assignee: Hokuto Corp
Current assignee: Hokuto Corp
Priority date: 2008-02-15
Filing date: 2008-02-15
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2024-03-16
Also published as: JP2008167761A

Description

本発明は、プレロータスエリンギの品種識別のために特定のマイクロサテライト領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーからなるマーカーを製造するプレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法に関する。

従来、ＤＮＡの塩基配列の違いによって植物の品種を識別する方法が多く開発されている（例えば特許文献１，２）。これらの方法は、必要とする品種を特定するために、必要とする品種の遺伝子の配列の例えば指紋領域といわれる識別部分を予め特定し、この部分の領域を増幅させるプライマーを開発し、開発されたプライマーを使用して多数の対象種の遺伝子の増幅行い、所定の遺伝子の増幅がなされているか否かによって、目的とする品種か否かの判別を行っている。

一方、プレロータス属きのこの品種識別に関しては、従来遺伝子を利用する方法は殆ど開発されてなく、試験栽培による判別や対峙培養による反応を調べることによってなされていた。

また、近年エリンギの生産量が急速に増加し、単価も他のきのこ類に比べて高値で推移していることから、多くのきのこ栽培業者から注目されている。しかし、エリンギ栽培が日本国内に導入されてから日が浅く、また国内に自生していないことから、種菌の入手が困難であるため、市販品から分離して利用する場合が多い。

このような市販品からの菌を使用する場合、種苗法によって保護されている新品種か否かの判別が必要となる。
特開平８−８９２９８号公報特許第２６９７７８３号公報

しかし、従来の試験栽培や対峙培養による識別方法では、栽培又は培養中における外的要因によって影響を受けやすく正確な識別ができない。また、これらの方法では栽培又は菌の培養に長時間を要するという問題があった。

本発明はこのような従来の問題に鑑み、迅速かつ正確にプレロータス属きのこの品種識別を可能とする遺伝子増幅用プライマーからなるマーカーを製造するプレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法の提供を目的としてなされたものである。

上述の如き従来の問題を解決し、所期の目的を達成するための請求項１に記載された発明の特徴は、試料とするプレロータスエリンギの全ＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩによって遺伝子を切り出し、その切り出された全断片の外側にアダプターをつけてプラスミドベクターに挿入し、大腸菌に形質転換してプラスミドを増幅させ、コロニーハイブリダイゼーションによってＣＴマイクロサテライト領域を含むプラスミドをもつコロニーを特定し、該コロニーからＣＴマイクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を取り出し、
該ＤＮＡ断片でＴ７プライマーとＳＰ６プライマーを使用してＣＴマイクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、ＣＴマイクロサテライト領域の両側のＤＮＡの塩基配列をシークエンスして得た後に、その塩基配列からＣＴマイクロサテライト領域を特異的に増幅できるプライマーを設計し、その設計されたプライマーを数品種のプレロータスエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行うことで多型を確認し、プレロータスエリンギの品種間で多型が得られるプライマーを選択することによって作成することを特徴としてなるプレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法。
にある。
請求項２に記載された発明の特徴は、請求項１の構成に加え、別添の配列表における配列番号１と２のプライマーからなる第１マーカー、同３と４のプライマーからなる第２マーカー、同５と６のプライマーからなる第３マーカー、同７と８のプライマーからなる第４マーカー、同９と１０のプライマーからなる第５マーカー、同１１と１２のプライマーからなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーから選択されるマーカーからなるプレロータスエリンギの品種識別用マーカーを製造することにある。

本発明においては、上述した方法によって製造した第１〜第７のマーカーの内の複数又は全部を使用してＰＣＲによる識別対象品種の遺伝子の増幅を行うことで現存する殆ど全てのエリンギの品種識別が可能となり、従来の試験栽培や対峙培養に比べて外的要因によって影響を受けることが無くなり、正確な品種識別が可能となり、またこれらの従来の方法に比べて短時間で識別判定結果を得ることができる。また、エリンギの栽培に際し、優良品種の識別データーを保存しておき、これと比較することによって優良品種のみの栽培に寄与することができる。

次に本発明の実施の形態を図面について説明する。

本発明に係るプレロータ属きのこの遺伝子増幅用プライマーは、後述の配列表における配列番号１と２からなる第１マーカー、同３と４からなる第２マーカー、同５と６からなる第３マーカー、同７と８からなる第４マーカー、同９と１０からなる第５マーカー、同１１と１２からなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーの７種類であり、これらの複数マーカーを使用し、対象となるエリンギの菌についてＰＣＲ分析を行うことで品種を識別する。

上記遺伝子増幅用プライマーの作成は、先ず特定のエリンギの全ＤＮＡから制限酵素によって遺伝子を切り出し、その全断片の内からストレプトアビジーンマグネティクビーズ法により、図１に示すようにマイクロサテライト領域Ａを含む断片、即ちマイクロサテライト領域に外側に各種の遺伝子配列Ｂを有する断片Ｃを単離するとともに、その外側すなわち断片Ｃの両側の遺伝子配列Ｂの外側にアダプターＤをつける（図１（１））。これをベクターに挿入し、大腸菌を使用してプラスミド増幅させる。次いでコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のベクターを含むものだけを集める。

次いでたくさん集められたマイクロサテライト領域を含む配列Ｃ＋Ｄの外側にプライマーＥをつけて増幅させる（図1（２））。これによって増幅された配列Ｃ＋Ｄの内、配列ＡとＢについてシーケンスをして配列を決定し、反復のＣＴマイクロサテライト領域両側の配列Ｂの領域の配列を用いて該マイクロサテライト領域を特異的に増幅できるプライマーをデザインする。

このようにして得られた多種類のプライマーをマーカーとして多種のエリンギに対して特定のマイクロサテライト領域の遺伝子の増幅を行い、それらのエリンギの品種識別に利用ができるもののみを選定して前記第１〜第７のマーカーを決定した。

次に上記各工程の具体的な実施例について説明する。

マーカーの作成
１．資料からのＤＮＡ抽出
試料としてホクト株式会社製の「エリンギ菌株」（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託７生寄文第１７７６号（ＦＥＲＭＰ−１５２９２））を使用した。

このエリンギの凍結乾燥試料５ｍｇに対してＴＥ溶液（１０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ）１ｍＬと１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて懸濁し６５℃で３０分間なじませる。プロテナーゼＫ１ｍｇ／ｍＬを加え３７℃で４時間反応させた。

反応終了後、遠心機で遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、２０分間）を行って上清を採取し、１／５量の５ＭＮａＣｌと１０％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）を加え６５℃で１０分間抽出し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加えて転倒混和した。

次いで、遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、１０分間）を行って上清を採取した。上清に等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加えて転倒混和を３回繰り返して得た上清に１／１０量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、さらに冷却したエタノール２．５倍量を加えた。遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液５００μＬに溶解した。

溶解後、ＲＮａｓｅ１ｍｇを加え３７℃で２時間反応させた。反応後、遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、１０分間）を行って上清を採取した。上清に等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加えて転倒混和を３回繰り返し繰り返して得た上清に１／１０量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、さらに冷却したエタノール２．５倍量を加えた。遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液２５０μＬに溶解してＤＮＡ試料とした。
２．ＤＮＡ断片へのアダプターの修飾
市販のアダプター修飾キット（インビトロジェン社製）を用いて、ＤＮＡ試料（１μg／１０μＬ）に対し制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩを１μＬ加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、等量のアダプターとＴ４リガーゼ１Ｕ／μＬを加え、４℃で一晩反応させＤＮＡを断片化させた。反応後、断片化されたＤＮＡ溶液２．５μＬにＥｃｏＲＩプライマー（５０ｐｍｏｌ／１μＬ）１μ、ＭｓｅＩプライマー（１０ｐｍｏｌ／１μＬ）１μ、２．５ユニットのＥＸＴａｇポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）２μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２．５μＬ、滅菌水１５．５μＬを加えた反応液を調製した。

調製した反応液の増幅は、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の条件で２０サイクル行い、アダプターを修飾したＤＮＡ断片を獲得した。
３．マグネティクビーズを利用したモチーフ配列を持つＤＮＡ断片の濃縮
獲得したアダプターを修飾したＤＮＡ断片の濃縮法は、Ｋｉｊａｓら（１９９４. Circle Reader Service No.193.P657-662）の方法を参考にして行った。モチーフ配列にビオチンを修飾した標識物３μＬ（１μg／μＬ）をマグネティクビーズに結合させた溶液と、アダプターを修飾したＤＮＡ断片を熱変性させた溶液とを混合し、モチーフ配列を持ちアダプターを修飾したＤＮＡ断片をマグネティクビーズに結合している標識物に結合させた。マグネティクビーズの洗浄後、結合しているＤＮＡ断片を回収し濃縮ＤＮＡ断片とした。
４．ＤＮＡ断片のプラスミドベクターへの挿入
濃縮ＤＮＡ断片５μＬ、ＥｃｏＲＩプライマー（５０ｐｍｏｌ／１μＬ）０．５μＬ、ＭｓｅＩプライマー（１０ｐｍｏｌ／１μＬ）０．５μＬ、２．５ユニットのＥＸＴａｇポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１．２μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）１．５μＬ、滅菌水５．８μＬを加えた反応液を調製した。

調製した反応液の増幅は、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の条件で２０サイクル行い、増幅した濃縮ＤＮＡ断片を得た。増幅した濃縮ＤＮＡ断片５μＬ、ライゲイション緩衝液（プロメガ社製）１０μＬ、プラスミドベクター（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（プロメガ社製））２μＬ、T４リガーゼ２μＬ（１Ｕ／μＬ）、滅菌水１μＬを加えた反応液を調製し、一晩反応させて濃縮ＤＮＡ断片をプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（プロメガ社製））に挿入させた。
５．形質転換とゲノムライブラリー
濃縮ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（プロメガ社製））とコンピテントセル(Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５α（東洋紡績株式会社製）)を氷中で４０分間反応させた後、４２℃で４５秒の反応を行い、プラスミドベクターをコンピテントセルへ形質転換させた。

形質転換した細胞は、ＳＯＣ培地（東洋紡績株式会社製）９００μＬ加え３７℃で１時間培養し、Ｘ−ｇａｌ４０ｍＬ（４０mg／ｍｌ）を染み込ませたＬＢ（１％ＢａｃｔｏＴｒｉｐｔｏｎ、０．５％ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ））平面培地に塗布して３７℃で一晩培養し、挿入断片を含む白色コロニーをＬＢ寒天培地に単離した。
６．ハイブリダイゼイションと検出
単離したコロニーからモチーフ配列を持ったプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（プロメガ社製））が存在するコロニーを検出する。単離したコロニーをメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に付着させ、アルカリ変性液（０．５ＮＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ）で反応させ、さらに中和液（１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍトリス／塩酸、ｐＨ７．４）処理を行った後、メンブレンをオーブンで８０℃、２時間の処理でプラスミドをメンブレンの表面に固定する。

固定したメンブレンに、モチーフ配列を持つＤＩＧ（ジゴキシゲニン）化標識物３μＬ（１μg／μＬ）をプラスミドとハイブリダイゼイションさせた。ＤＩＧ化標識物の検出は、ＤＩＧ発光検出キット（ロシュ社）を使用した。結合しなかったＤＩＧ化標識物を洗浄し、結合しているＤＩＧ化標識物にアルカリ性フォスファターゼを結合した特異的抗ＤＩＧ抗体を結合させた後、発光検出試薬と反応させた。反応させたメンブレンをX線フィルムに露光させ、モチーフ配列を持つコロニーを特定した。
７．シークエンスとプライマーの設計および確認
特定したコロニーに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解読する。まず特定したコロニーを一晩、ＬＢ（１％ＢａｃｔｏＴｒｉｐｔｏｎ、０．５％ＶｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ）液体培地で培養し、挿入されたＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。

増幅は、培養体を３μＬ、Ｔ７プライマー（２０ｐｍｏｌ）１μＬ、ＳＰ６プライマー（２０ｐｍｏｌ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｇポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）８μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）１０μＬ、滅菌水７６μＬの反応液を、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の条件で２５サイクル行った。増幅産物は、一部を１．０％アガロースゲル電気泳動で増幅を確認し、残りを精製した。

精製した産物は、Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒキット（アプライドバイオシステム社製）を用いてシークエンスサンプルを調製した。シークエンスは、ＡＢＩＰｒｉｓｍＭｏｄｅｌ３１０（アプライドバイオシステム社製）を用いて断片の塩基配列を解読した。

解読した塩基配列からモチーフ配列のマイクロサテライト領域を見いだし、モチーフ配列のマイクロサテライト領域を確実に増幅できる一組のプライマー（Ｆ側／Ｒ側）を定法に従って設計した。

設計したプライマーは、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認した。反応溶液は、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）２μＬ、Ｆ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｒ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｇポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２μＬ、滅菌水１４．５μＬを加えた反応液を調製し、９２℃で１分間、使用するプライマーのアニール温度により４６〜６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３３サイクル行った。

増幅産物は、１３％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡの染色と撮影は、常法に従って行った。分離の結果、品種間で多型が得られるプライマーを選択し、増幅される領域を識別マーカーとし第１マーカー〜第７マーカーと記した。

このようにして第１表のＦ側及びＲ側のプライマーを１組とした第１〜第７マーカーを作成した。

マーカーを使用したエリンギの品種識別
数品種のエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認する。反応溶液は、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）２μＬ、Ｆ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｒ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｇポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２μＬ、滅菌水１４．５μＬを加えた反応液を調製し、９２℃で１分間、使用するプライマーのアニール温度により４６〜６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３３サイクル行った。プライマーは２組以上の組み合わせを使用し、増幅を行う。増幅産物は、１３％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡの染色と撮影は、常法に従って行い、ＤＮＡの多型を確認することでエリンギの品種を識別する。

第１〜第７のマーカーを使用して８種類のエリンギサンプルの品種識別を行った結果、第２表の如くであった。

第２表は、第１〜第７の各マーカー１〜７を、各識別対象エリンギサンプルに使用して増幅を行った結果が同じであった場合には同じアルファベットを記入し、異なっている場合には異なったアルファベットを記入している。

即ち、マーカー１を使用した品種識別では、識別対象エリンギサンプルＮｏ．１とＮｏ．５〜７は識別、即ち異なるものであるとの判別ができず、また、Ｎｏ．２〜４及びＮｏ．８は識別ができないが、Ｎｏ．１、とＮｏ．２とは識別ができたことを意味している。

また、マーカー２を使用した品種識別では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．５は識別できず、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７は識別できず、Ｎ．４及びＮｏ．８は識別できないが、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．４は識別できた。

このように、例えばエリンギサンプルＮｏ．２とＮｏ．３は、マーカー１では識別ができないが、マーカー２では識別ができ、両エリンギサンプルは異なった品種であることが分かる。

実験によれば、上述した第１〜第７マーカーを全て使用することによって、現存する品種の異なる１５種類のエリンギ全てについて判別が可能であった。

尚、上述の実施例においては、識別対象としてプレロータスエリンギの品種識別について説明しているが、上述した第１マーカー〜第７マーカーの１又は２以上を使用し、上記１５種類以外のプレロータスエリンギ及びその近縁種の識別も可能である。

本発明におけるマーカーの製造工程における遺伝子断片の状態を示す説明図である。

符号の説明

Ａマイクロサテライト領域
Ｂマイクロサテライト領域両側の塩基配列
Ｃ断片
Ｄアダプター
Ｅプライマー

Claims

試料とするプレロータスエリンギの全ＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩによって遺伝子を切り出し、
その切り出された全断片の外側にアダプターをつけてプラスミドベクターに挿入し、大腸菌に形質転換してプラスミドを増幅させ、
コロニーハイブリダイゼーションによってＣＴマイクロサテライト領域を含むプラスミドをもつコロニーを特定し、
該コロニーからＣＴマイクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を取り出し、
該ＤＮＡ断片でＴ７プライマーとＳＰ６プライマーを使用してＣＴマイクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、
ＣＴマイクロサテライト領域の両側のＤＮＡの塩基配列をシークエンスして得た後に、
その塩基配列からＣＴマイクロサテライト領域を特異的に増幅できるプライマーを設計し、
その設計されたプライマーを数品種のプレロータスエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行うことで多型を確認し、プレロータスエリンギの品種間で多型が得られるプライマーを選択することによって作成すること
を特徴としてなるプレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法。
別添の配列表における配列番号１と２のプライマーからなる第１マーカー、同３と４のプライマーからなる第２マーカー、同５と６のプライマーからなる第３マーカー、同７と８のプライマーからなる第４マーカー、同９と１０のプライマーからなる第５マーカー、同１１と１２のプライマーからなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーから選択されるマーカーからなるプレロータスエリンギの品種識別用マーカーを製造する請求項１に記載のプレロータスエリンギの品種識別用マーカーの製造方法。