JP4356086B2 - Ｆｔｉｒを使用しての生物学的物質についての迅速試験 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的流体のサンプルのＩＲスペクトルを記録することによって、生物学的流体のコンディションを決定するための方法に関する。この方法によって、生物学的流体はその天然形態で検査され得る。本発明の方法は、例えば、生物における病理学的コンディションを検出するために使用され得る。

種々の疾患は、現在、高価であり更に非常に時間のかかる試験を使用することによってのみ、十分な信頼性をもって検出され得る。従って、心筋梗塞（心臓梗塞（heart infarction））のイベントにおいて、診断は、可能な限り短い時間で行われなければならない。心筋壊死（myocardial necrosis）、即ち、限局性心筋領域の破壊（destruction of circumscribed heart muscle region）の突然の開始が存在し、これは、特異的酵素［ＣＫアイソエンザイム、ＣＰＫ、半特異的酵素（semispecific enzymes）、ＬＤＨ（アルファ−ｈｐｄｈ）］の増加に基づく梗塞後１日以内に診断され得る。しかし、多くの場合において、特に、中程度の心筋梗塞は診断が困難であり、その結果、必要とされる処置が提供されず、そして後に、より重篤な心筋梗塞が生じる。これは、適時かつ信頼性のある診断によって予防され得る。更に、現在まで、いくつかの疾患についての信頼性のある結果は、検死を行うことによってのみ得ることができた。

例えば、プリオン疾患を検出するため［例えば、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）またはクロイツフェルト−ヤコブ病を診断するため］の信頼性のある試験は、死後の動物またはヒトにおいてのみ、特に脳切片の顕微鏡検査によってまたは高価な組織化学的抗体試験によって、行われ得る。従って、病原体の蔓延に関する信頼性のある結果は、疾患の発生後にのみ得られ得る。更に、これらの試験は、時間を要し、そして非常に質の高い人材の相当な適用を必要とし、従って非常にコストが高い。

従って、上述の疾患（特に、プリオン疾患）の場合における信頼性のある試験について、ならびに、動物またはヒトにとって生命を脅かすであろうと分析されるサンプルを得るための手順を行うことなく、生存している生物において単純な様式で行われ得る試験［身体コンディションの多数の臨床的に関連する変化］についての早急な要求が存在する。

EP-A-0 644 412は、検査される流体または懸濁液の乾燥サンプルの赤外スペクトルの記録およびマルチパラメータ評価手順（mulitiparameter evaluation procedures）の使用によるそれらの評価を含む、臨床的に関連する流体サンプルおよびサンプル懸濁液を分析するための方法を開示している。評価手順は、分析されるサンプルをクラス（classes）へ帰属または分類する。評価手順は既知クラスに属するサンプルで較正され（calibrated）、このようにして、未知分類のサンプルをクラスへ帰属させ得る様式で、評価手順のパラメータが適応される。特に、EP-A-0 644 412によれば、赤外スペクトルは、サンプルの乾燥フィルムにおいて記録される。

しかし、この分光分析法は、サンプルが分析のために乾燥されなければならないという固有の欠点を有し、記録されるスペクトルは、天然でなく（non-native）、均質でない（non-homogenous）サンプルのスペクトルであるということを意味する。従って、サンプル調製のための追加の処理工程が必要とされ、該工程は、より時間を要し、そして該手順の自動化を遥かにより困難にさせ、そしてその天然コンディションのサンプルによってのみ提供さ得る情報が失われる。更に、この方法は、高い分類または帰属エラー率により特徴付けられる。しかし、特に、ＢＳＥのような疫学的に重大な病理学的コンディションの場合、陽性または陰性所見の結果を生じる信頼性のある分類が重要である。

従って、本発明の主題は、例えば生存している動物またはヒトにおける病理学的コンディション（pathological conditions）を検出するために好適でありそして公知のＩＲ方法の欠点を回避する、生物学的流体（例えば、生物における体液）のコンディションを測定するための新規のシステムを提供することである。特に臨床診断のために、多くのサンプルについての要求があるため、本発明に従って、良好な再現性を伴う高サンプルスループット（high sample throughput）を可能にする方法を提供することが必要である。

この課題は、特許請求の範囲において特徴付けられる本発明の実施形態によって解決される。

特に、本発明は、生物学的流体のコンディションを決定するための方法を提供し、該方法は、以下
（ａ）該生物学的流体のいくつかの天然サンプルを提供する工程［各サンプルにおける該生物学的流体のコンディションは既知である］；
（ｂ）工程（ａ）の天然サンプルのＩＲ（赤外）スペクトルを記録する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析手順（multiparameter analytical procedure）に供し、そして既知コンディションへの該サンプルの信頼性のある帰属を確実にする分類または帰属パラメータ（classification or assignment parameters）を選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた分類パラメータを保存する工程；
（ｅ）そのコンディションが未知である生物学的流体の天然サンプルを提供する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の天然サンプルの少なくとも１つのＩＲスペクトルを記録する工程；
（ｇ）工程（ｆ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析（multiparameter analysis）へ供する工程、および
（ｈ）該未知サンプルのＩＲスペクトルのコンディションパラメータを、工程（ｄ）において保存された該既知サンプルのＩＲスペクトルのコンディションパラメータと比較する工程、
［ここで、工程（ｂ）および（ｆ）におけるＩＲスペクトルは、３０μｍ以下の路長(path length)を有する測定セルの助けを借りて記録される］
を包含する。

表現“生物学的流体（biological fluid）”は、生物学的に関連する物質を含有する全ての流体を包含する。本発明の方法は、好ましくは、生物の体液に適用される。このような体液の例は、血液、血漿、血清、溶血血液、髄液、尿、リンパ液、滑液、唾液、精液、羊水、涙液、嚢胞液（cyst fluid）、汗腺分泌液および胆汁である。更に、表現“生物学的流体”はまた、培養細胞、細菌およびウイルスの懸濁液、ならびに前述の細胞、細菌またはウイルスの培養物から得られる培地上清および溶解物を包含する。前述の細胞、細菌またはウイルスに本発明の方法を適用することによって、これらの生物または病原体は分類され得る。例えば、未知のサンプルは、特定の細胞タイプ、特定の細菌株または特定のウイルス株の存在（presence）へ帰属される。この様式において、例えば、懸濁液または培地またはいくつかの他の流体中に存在する特定の細菌株が、いくつかの他の細菌株と区別され得る。

用語“生物（organism）”は、原核および真核細胞のような個々の細胞（individual cells）、ならびに多細胞生物、特に植物、動物およびヒトを含む。好ましい生物は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、Ｍａｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｏｖｉｓ ａｍｍｏｎ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｗｅｇｉｃｕｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（一般的に：ヒツジ、ニワトリ、ブタ）およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからなる群から選択される。

表現“生物学的流体のコンディション（condition of a biological fluid）”は、問題の生物学的流体のパラメータの全ての値を含む。これらの流体パラメータは、化学的または物理的性質のもの、例えば、ｐＨ、イオン濃度、酸化還元電位などであり得る。好ましい化学的パラメータは、例えば、生物学的物質（例えば、蛋白質、核酸、脂質および糖質）の濃度または存在もしくは非存在を含む。他の化学的パラメータは、問題の生物学的流体中の薬学的に活性な物質の濃度である。“薬学的に活性な物質（pharmaceutically active substances）”は、例えば、全ての医薬品（pharmaceuticals）またはそれらの薬理学的に活性な成分ならびに薬物（drugs）を意味する。本発明の方法によって測定され得る生物学的流体の他の好ましいパラメータは、病原体の存在または非存在である。病原体は、例えば、真核生物（例えば、真菌）または原核生物（例えば、細菌）であり得る。本発明に従って検出され得る他の病原体は、ウイルスおよび蛋白質様病原体（protein-like pathogens）、特にプリオンを含む。

本発明の方法は、例えば、病理学的コンディションを検出するために使用され得、これは、生物の体液サンプルが、コンディション“病気である（ill）”または“発見事項を伴う（with findings）”あるいはコンディション“病気でない（not ill）”または“発見事項を伴わない（without findings）”と帰属されることを意味する。本発明の方法の助けを借りて検出され得る病理学的コンディションの例は、糖尿病、関節炎、増加した（または、減少した）コレステロールレベル、貧血（例えば、鎌状赤血球貧血）、癌、肝疾患（例えば、肝炎）、ＡＩＤＳ、腎臓病、組織破壊（tissue destruction）（例えば、心筋梗塞）、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）（例えば、ＢＳＥ）、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー、じんま疹およびアレルギー性ぜん息を含む。病理学的コンディションはまた、動物の畜産（例えば、ブタおよびニワトリのもの）において使用される（禁止されている）食品および／または食品添加物によって生じ得る。

上述の工程（ａ）および／または（ｅ）における天然サンプルを調製するために、体液は、分析前に、例えばそれから粒状成分を除去する（free）ことによって処理される。例えば、ＩＲスペクトルを記録する前に、血液を処理して血清を得る。従って、本発明の方法の顕著な特徴は、他のものの中でも、上述の工程におけるＩＲスペクトルの記録が均質なサンプルにおいて行われるということである。粒状成分から体液を取り出すことは、例えば、遠心分離および／または好適な細孔サイズの膜を介しての濾過もしくは限外濾過（ultrafiltration）を包含し得る。

例えば、濾過（特に、限外濾過）、遠心分離および／または透析によって、例えば病理学的コンディションの検出の場合、疾患について最適化される、即ち、最大に可能な疾患特異的スペクトル変化を提供する、体液フラクションを得ることが可能となる。この様式において、全ての非常に複雑なスペクトル情報を容易に感知できるほど縮小させる（reduce）ことが可能であり、このようにして、データ分析の助けを借りて臨床像についての情報を得るという可能性が提供される。複雑性縮小（complexity reduction）の例は、電極が測定セルと一体化される、電気化学誘導差異分析（electrochemically induced difference analysis）である。この様式において、印加される電位の助けを借りて、特定の成分、特に生体分子（例えば、蛋白質（例えば、ヘム蛋白質））が、それらの中間点電位（midpoint potential）に依存して選択的に酸化または還元され得る。この様式で誘導された変化（例えば、電気的または構造的種類の変化）は、認識特徴として使用され得る。従って、印加される電位を変化させることによって、種々の成分を選択的に修飾することが可能である。従って、体液の酸化還元活性成分のみの選択に基づく電気化学誘導差異分析によっておよび電位範囲の好適な選択によって、複雑なスペクトル情報の有利な縮小を達成することが可能となり、検出感度が、生体分子の個々の官能基における変化が測定され得るという事実によって増加される。例えば、赤血球、溶血血液またはヘモグロビンフラクションの電気化学誘導差異スペクトルによって、蛋白質欠陥、例えば鎌状赤血球において遺伝的に誘導されるアミノ酸差異が、ヘモグロビンにおいて検出されそしてマルチパラメータ分析に基づく比較によって疾患として同定され得る。この検出は、ヘモグロビンについて特異的な中間点電位について最適化される。

マルチパラメータ分析手順の助けを借りて、全吸収スペクトルおよび誘導差異スペクトルは、補充的様式でまたは個々に、疾患の診断のために使用され得る。

しかし、上述の調製工程は、サンプルの“天然”特徴を変化させない。従って、本発明の方法のための分析サンプルは、そこに含まれる成分が、該サンプルが採取された生物中の体液のものと同一であるコンディション（特に、含水量、塩含量、ｐＨなど、および必要に応じて温度に関して）下に存在するということを特徴とする。これは、例えば、問題の体液中に含まれそして該コンディションの測定に必須である生体分子（蛋白質、核酸など）が変性状態にないことを意味する。これは、例えば、ＩＲ分析を行う前に流体サンプルを担体材料上で乾燥しなければならないEP-A-0 644 412に記載の方法と対照的である。

本発明の方法の好ましい実施形態において、上記に規定の工程（ｂ）および（ｆ）におけるＩＲスペクトルの記録は、スペクトルの迅速な記録および評価を可能にするフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）用に設計された分光計によって行われる。ＦＴＩＲ分光計は、例えばＩＲ顕微鏡と連結され得る。ＩＲスペクトルは、透過および／または反射技術によって記録され得る。

本発明に従って分析される体液のＩＲスペクトルの情報内容は、中央ＩＲ範囲において特に多い。このために、上記に規定の方法の工程（ｂ）および／または工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの記録は、好ましくは４００〜７，０００ｃｍ^-1そして特には７００〜１，９００ｃｍ^-1の波数で行われる。

本発明によれば、生物学的流体（例えば、生物の体液）のコンディションが公知である、工程（ｂ）において記録される天然サンプルのＩＲスペクトルは、工程（ｃ）においてマルチパラメータ分析手順へ供される。このために、問題のＩＲスペクトルを記録することによって得られた値は、先ず、デジタル化される。次いで、デジタル化されたスペクトルを、マルチパラメータ分析手順へ供する。本発明に従って使用され得るマルチパラメータ分析手順は、例えば、多変量データ分析法（multivariate data analysis methods）、例えば線形判別分析（linear discriminatory analyses）、ニューロナルネットワーク（neuronal networks）およびクラスター分析であり、これらは、ソフトウエアプログラムとして市販されている。

本発明の方法の工程（ｃ）において、マルチパラメータ分析手順は、コンディションが既知である生物の体液の天然サンプルのＩＲスペクトル中に含まれる情報を処理することによって、作成、即ち較正（calibrated）される。マルチパラメータ分析の手段によって、既知のコンディションへの問題のサンプルの信頼性のある分類または帰属を確実にする分類パラメータが、ＩＲスペクトルのデータ記録から得られる。本発明によれば、マルチパラメータ分析手順を較正するために、例えば５〜１０００および好ましくは５０〜３００の、いくつかのサンプルＩＲスペクトルを、例えばコンディションＡを示すことが既知である基礎的な（underlying）体液を用いて、マルチパラメータ分析手順によって分析する。これに対応して、基礎的な体液が例えばコンディションＢを示す同様に非常に多数のＩＲスペクトルを分析する。マルチパラメータ分析手順を較正するために必要である１コンディション当たりのスペクトル数は、特に、種々のコンディションについてのスペクトルがそれら自体の間で異なる程度に依存する。しかし、一般的に、１コンディション当たり相当に多数の（例えば１００を超える）スペクトルでマルチパラメータ手順を較正することが好ましく、何故ならば、分類エラー率は、マルチパラメータ分析手順のために利用可能なデータセットのサイズに従って減少するからである。上述のように、ＩＲスペクトルのマルチパラメータ分析は、好ましくは、ソフトウエア−制御データ処理（software-controlled data processing）の助けを借りて行われる。得られた分類パラメータを好ましくは電子データキャリアに保存することによって、次いで、該パラメータは、そのコンディションが未知である体液のサンプルのＩＲスペクトルの対応データ記録との比較に利用可能となる。

この様式で、本発明の方法によって、未知コンディションの体液の天然サンプルは、測定され、マルチパラメータ分析手順へ供され、そして、未知サンプルのＩＲスペクトルのコンディションパラメータを、既知サンプルのＩＲスペクトルの既に得られそして保存されたコンディションパラメータと比較することによって、コンディション、例えばコンディションＡまたはコンディションＢへ帰属される。当然ながら、参照コンディションの好適な選択によって、本発明の方法により、較正シリーズ（calibration series）（例えば、コンディションＡ〜Ｚに対応する０〜ｎ濃度単位の物質の濃度）をセットアップ（set up）して例えば定量的な決定を許容することもまた可能である。従って、本発明の方法はまた、マルチパラメータ分析手順の好適な較正によって、例えばコレステロールレベルがどれくらい正常値からはずれているかまたはどの段階の癌が存在するかによって、病理的コンディションの程度または段階についての情報を提供する。

上記で定義された方法を行うために好適な装置は、例えば、天然の流体サンプルのＦＴＩＲスペクトルを記録するために設計された、ＦＴＩＲ分光計、関連のポンプ（related pumps）および好適な測定セルを備える分析装置である。本発明によれば天然サンプルのＩＲスペクトルが記録されるので、上記で定義される工程（ｂ）および／または工程（ｆ）における記録は、１〜３０μｍ、特に３〜１２μｍそして最も好ましくは１０μｍを超えない路長（path length）を備える測定セルの助けを借りて行われる。水性サンプルのための透過セルについての最適路長(optimal path length)の選択は、例えば、Rahmelow, K. およびHuber, W. (1997) によってAppl. Spectrosc. 51, 160-170において記載される。本発明に従うＩＲスペクトルの記録のためには短路長(short path length)が必要とされ、特に何故ならば、光路長(optical path length)が１２μｍを超える場合には生物学的流体中に存在する水が全吸収（total absorption）の範囲を増加させるからであり、そして３０μｍを超えると情報内容が本発明の方法について非常に少なくなるからである。

本発明の方法のために好適な光学材料（optical materials）は、一般的に、示される波数範囲または部分範囲におけるＩＲに対して透過性である全ての材料、好ましくはフッ化カルシウム（ＣａＦ₂）、フッ化バリウム（ＢａＦ₂）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）、ケイ素（Ｓｉ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）および薄いポリマーフィルムである。必要に応じて、該材料は、例えば、パリレン、ＰＴＦＥまたはＰＥの、薄い水不溶性層でコーティングされ得る。この様式において、特別な性質が、短路セル（short-path cell）に付与され得る。例えば、このような材料は、窓材料またはセル材料と生物学的サンプルとの間の相互作用を減少させるため、あるいは水溶性窓材料を水含有サンプル溶液から隔離するために使用され得る。これは、光学材料の幅広い選択、そして従ってより広範囲のスペクトル範囲を提供する。従って、例えば、水溶性の臭化カリウム（ＫＢｒ）もまた、窓材料として使用され得る。

更に、電極が、例えば微細構造化ネットワーク（microstructured networks）の形態で、セルと一体化されて、電気化学誘導差異分析（差異分光分析（difference spectroscopy））が可能となり得る。このような測定セルは、例えば、Moss, A. D., Nabedryk, E., Breton, J. and Mantele, W. (1990) Eur. J. Biochem. 187, 565-572によって記載される。

流体用のワンピース短路セル（one-piece short-path cells）の以下の３実施形態が、分析方法のために使用され得る。

タイプ１：ワンピース微細構造化フロースルーセル（one-piece microstructured flow-through cell）
このようなセルは、市販されており、以下の特徴を有する：
− 高圧耐性（例えば、１０〜１００ｂａｒ）。これは、フロースルーセル（特に、１〜１５μｍの範囲の路長(path length)を有するもの）の充填の間の高フロー耐性（high flow resistance）の場合に有利である；
− 少量の充填容積（０．０５〜３μＬ）；従って、極めて非常に少量のサンプル量が好適である；
− 自動化高スループットが可能である；セルの充填およびリンスが、非常に迅速に達成され得る；
− 迅速な圧力緩和（pressure relaxation）（＜１０ｍｓ）；高サンプルスループットのために必要とされる；
− このようなセルは、変動する圧力条件にもかかわらず、サンプル分析の間、一定の路長（path length）を保持する。偏差は、ＩＲ分析の検出限界未満のままであり、従って、干渉シグナルを生成しない。従って、本発明の方法の再現性は、非常に改善される；
− 微細構造化電極（microstructured electodes）との一体化が可能である。

ＩＲ測定セルと電極との一体化、例えばワンピースマイクロフロースルーセルと微細構造化電極との一体化によって、本発明の方法に、以下の更なる利点を与えることが可能となる：
− 体液中に酸化還元活性成分を有するサンプルについての複雑性縮小（complexity reduction）が、達成され得る。全スペクトルおよび詳細な（高分解能）電気化学誘導差異スペクトルに基づくデータ分析は、新たな（更なる）スペクトル情報を提供することを可能にする。
− 微細構造化電極とセルとの一体化によって、スキャン可能な電位インターバル（scannable potential intervals）が、電位インターバルに特異的なスペクトル変化のために評価され得る。
− 特定の疾患について最適化された最大の疾患−特異的スペクトル変化を伴う電位範囲を評価することが可能である。

タイプ２：ワンピース微細構造化拡散混合セル（one-piece microstructured diffusion mixing cell）
このような測定セルは、先行技術から公知であり、そして以下の特性を有する：
− セルは使用後に破棄されるので（単回使用セル）、洗浄が必要でない；
− 一定の路長(path length)；
− 必要とされるサンプル容積が少量である（＜１μＬ、例えば５０〜２００ｎＬ）；
− 迅速な圧力緩和および高圧力耐性は、以下のために必要とされない：
− 単回使用の使い捨てセルまたはアレイが使用される（時間を要するリンスおよび洗浄が必要でない；病原性生体材料（例えば、セーフティクラスＳ２と帰属されたサンプル）を用いての作業の場合、取り扱いが容易である；
− 充填が、毛細管力（capillary force）によって生じる；
− “ポイント−オブ−ケア（point-of-care）”使用に好適である。

タイプ３：ワンピース毛細管力短路セル（one-piece capillary force short-path cell）
このタイプの測定セルは、DE 197 39 126に記載され、そして以下の特性を有する：
− 少量のサンプル容積（＜５μＬ）；
− 迅速な緩和および高圧力耐性は、以下のために必要とされない：
− セルが単回使用の使い捨てタイプである；
− 充填が、毛細管力によって生じる；
− 微細構造化電極との一体化が可能である。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、記録および評価の工程は、１機器１日当たり、数千（例えば、５０００）の記録および評価という高スループットのために完全に自動化される。この目的のために、本発明の方法は、個々の部品（components）（例えば、ポンプ、サンプリングループ（sampling loops）、コントロールバルブ、ミキサーなど）が非常に少量の容積および高圧（例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において遭遇するものの）での操作のために設計されている、測定装置の助けを借りて行われ得る。これら個々の部品の制御は、好ましくは、コンピュータによって達成される。１〜１５μｍの路長(path length)を有するマイクロフロースルーセル（microflow-through cell）と連結されたＨＰＬＣ部品の使用は、好ましくは＜２０μＬの非常に少量のサンプルを必要とする。より好ましいのは、１〜１０μＬおよび特に５μＬのサンプルを必要とするフロースルーシステムである。

上記に示される方法を実施することにおいて、特にＨＰＬＣ部品を使用する場合、１〜１００ｂａｒの高圧が、測定セルが充填される速度に依存して発生される。本発明の方法の再現性、および従って検査される生物学的流体のコンディションの信頼性のある分類を確実にするために、スペクトルの記録の間の測定セルは、セルの充填およびリンスの間に変動する高圧負荷にも関わらず、好ましくはもとの路長(path length)から１ｎｍ未満の路長偏差（path length deviation）を示す。

特に、本発明の方法は、例えば上述のフロースルー装置において、以下のように行われる。ポンプをランさせながら、サンプル（例えば、血清、血漿など）が、サンプリングループバルブを介して、輸送媒体（transport medium）（例えば、水または水性緩衝溶液）へ供給され、そして次いで、ＦＴＩＲ測定セルへ移される。一旦サンプルが測定セルに入ると、フローが停止され、そしてサンプルのＦＴＩＲスペクトルが記録される。次いで、セルが輸送媒体でリンスされる。サンプリングループバルブの使用によって、サンプリングループは、記録が行われている間でさえ、再充填され得る。この様式において、サンプルスループットは、ほとんど記録時間の持続時間（ＦＴＩＲ記録の場合、一般的に１５〜３０秒）によってのみ制限され、その結果として、システムは、多数のサンプルについての自動化のために特に十分に好適である。

上記で記載するように、上記システムは、本発明の方法の手動、半自動ならびに完全に自動な実施について好適である。自動化された高サンプルスループットの場合、上記記録システムは、好ましくは、コンピュータ制御され、そしてＨＰＬＣ−適合性部品が備えられる。このようなシステムにおいて、サンプルは、例えば、標準化マイクロタイタープレートから供給され得る。本発明の方法の自動化バージョンにおいて、ＩＲスペクトルの記録は、好ましくは、上述のワンピース微細構造化フロースルーセルの助けを借りて行われ、この中へ、必要に応じて、生物学的流体の電気化学誘導差異分析を実施するための電極が一体化され得る。

生物の体液のコンディションを測定するために本発明の方法の重要な適用は、例えば体液の濃度または組成、例えばヒト、ブタおよびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）の血液または血清に対するブタまたはウシ畜産において使用される動物飼料中の病原体または禁止されている添加物の影響を測定することからなる。この場合における具体例は、体液（例えば、例えばＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）の血液または血清のような体液）中のプリオンの、存在または非存在の影響の検出、あるいは濃度の測定である。

従って、本発明の方法の１実施形態は、病原体、物質または活性成分の直接検出にではなく、体液（例えば、血液カウント／血液組成）の組成［これは、例えば、罹患した動物／ヒトの代謝に影響を与える、自己免疫反応（例えば、多発性硬化症）、食品添加物、アミロイド（アルツハイマー病）またはプリオン（ＴＳＥ）によって変化される］の認識に基づく迅速な試験を構成する。本発明によれば、ＢＳＥ病原体の直接検出にではなく、体液組成（例えば、血液カウント）［該組成は、罹患した動物の代謝に影響を与えるプリオンの存在によって修飾される］の認識に基づくＢＳＥについての迅速な試験が、開発され得る。

死んだ動物において今まで行われていた試験とは対照的に、本発明の方法は、生存している生物において行われ得、そして更に、顕著な手順を含まない。例えば、１試験当たり概算で６〜８時間が必要とされる現在入手可能であるＢＳＥ試験と比較して、１装置１日当たり５０００測定までを含む本発明の方法は、非常に迅速に行われ得る。高い労働コストおよび大量の費用を回避することによって、かなりのコスト削減が、個々の分析について達成され得る。

サンプルを既知コンディションへ帰属させそして未知サンプルを比較するために、本発明に従って使用されるマルチパラメータ分析手順は、定期的に、修飾コンディションへ適応されそして一定コンディションについて最適化され得る。例えば、例えば従来の抗体試験（抗体は、病原体の特定の形態のみに反応し、修飾された病原性変異体には反応しない）に従順でない（not amenable）病原体の新規変異体の発生の場合、マルチパラメータ分析手順（例えば、ニューロナルネットワーク）は、修飾されたコンディションに適応され得る。これは、偽陰性試験結果を回避する。偽陰性試験結果は、非常に特異的な抗体試験において病原体の多形性の結果として頻繁に生じ、何故ならば、それによって病原体の新規のイソフォーム（isoform）が頻繁に認識されないためである。対照的に、本発明の方法は、病原体の多形によって悪影響を受けない。

その上、特にＨＰＬＣ部品が使用される場合に、極めて非常に少量のサンプル（＜２０μＬ）が必要とされる。

更に、それらの天然状態のサンプルの分析は、乾燥サンプル（例えば、サンプルの乾燥フィルム）のＩＲ分析を包含する方法を行うよりも、遥かに信頼性の高い分類、即ち、偽陽性および偽陰性試験結果の回避を生じさせる。従って、特に、ＢＳＥのような疫学的に顕著な病原性コンディションの認識において、遥かに低いエラー率を達成することが可能である。

特に、本発明の方法は、バイオフィルム（biofilms）において行われるＩＲ分析を包含する先行技術方法に対して以下の利点を有する：
− 水は、生体分子の空間構造（spatial structure）の安定化において必須の役割を果たす。天然状態において、可溶性生体分子は、コンフォーメーション安定化様式で、イオン性または極性官能基と相互作用する水和シェル（hydrate shell）によって囲まれている。該分子構造の内部においても、水は、安定化および形状化（shaping）様式で、生体分子の空間構造に対して水素結合によって作用する。乾燥バイオフィルムの形態での脱水は、この場合、隣接する分子との分子間相互作用によって重要な（critical）構造修飾を生じさせ得る。

− 体液の天然コンディションおよび従って溶解化成分の天然コンフォーメーションは、本発明の方法について効果があるが乾燥バイオフィルムの分析について効果がない。例えば、疾患または体液コンディションの変化は、蛋白質のコンフォーメーション変化によって引き起こされ得る。この場合、差異（differentiation）は、天然コンフォーメーションと病原性コンフォーメーションとを比較することによってのみ検出へと至り得る。乾燥バイオフィルムにおいて、天然または病原性コンフォーメーションは、脱水によって変化または破壊され得、これは識別（differentiation）をより困難または不可能にするであろう。

− バイオフィルムは、フィルム厚みまたは外部層からの距離に依存して、異なる脱水状態を示す。フィルム内部において、脱水は端（edge）よりもより少ない程度まで進行している。この理由は、内部からの水は、その上の層を介しての拡散によって徐々にのみ外部に到達し得るということである。

− サンプル中の異なる脱水状態は、隣接する原子または官能基との、異なる、または異なる程度の、分子内および分子間相互作用へ至り、その結果、バンドシフト（band shift）が生じる（吸収最大値が、別の波数へ向かってシフトする）。これは、官能基について特徴的な吸収ピークおよび吸光係数（extinction coefficient）が脱水の程度に依存することを意味する。従って、サンプル中の種々の脱水状態は、ラインブロード化（line broadening）を生じさせ、何故ならば、多くのピークが、互いに対して僅かにシフトするためであり、これは、不都合なことに、より少ないスペクトル情報を提供する。

− 更に、分類目的のために使用されるサンプルは、多変量データ分析の作成（較正）において使用されるデータ記録についての場合と同一程度の脱水を示さなければならず、そうでなければ、種々のバンドシフトは、明白なバンド分類（“帰属”）を妨げるであろう。
− 乾燥処理のため、バイオフィルムは、不均質な組成を有する。これは、分析再現性の低下を引き起こす。
− 良好な再現性および低い分類（“帰属”）エラー率のために、較正データ記録と一致して、以下のパラメータが、バイオフィルムの調製において最適化されなければならない：
− 乾燥持続時間
− 乾燥勾配（drying gradient）
− 乾燥温度
− 適用されるコーティング量
− 適用されるコーティングの厚み
− 担体材料（湿潤（wetting））
− フィルム表面（例えば、湾曲（curvature）、荒さ（roughness）など）（透過／反射／スキャタリング関係について重要）
− コーティング方法（例えば、適用間で、単一の厚いコーティング適用と乾燥段階を伴ういくつかの薄い適用との間での差異が存在する）。そうでなければ、劣った再現性および高い分類エラー率が生じるだろう。

− バイオフィルムの分析に関する上述の問題は、高価で、コスト集約的な（cost-intensive）調量（metering）、熱制御および調節技術によってのみ幾分制御され得る。従って、先行技術方法は、広範囲に及ぶ使用または“ポイント−オブ−ケア（point-of-care）”使用のために好適でない。

− また、より良好な再現性のために、分類されるサンプルのスペクトルの記録は、較正データ記録についてのものと同一の記録技術によって行われるべきである。しかし、乾燥バイオフィルムのスペクトルを記録するために、多くの技術が、広範囲の使用、例えば透過、反射または拡散反射技術において存在し、これは、十分な精度で比較することができないデータを提供する。

− 電気化学差異分析は、酸化還元−活性成分がそれらの天然コンフォーメーションを依然と保持する場合にのみ意味があり、酸化還元プロセスの結果として、それらは、特徴的で高度に特異的な構造変化を受ける（Moss, A. D., Nabedryk, E., Breton, J. and Mantele, W. (1990) Eur. J. Biochem. 187, 565-572を参照のこと）。しかし、バイオフィルムにおいて、分子は、脱水状態であり、その結果、ここで“天然”サンプルのことは語ることができない。

− スペクトル較正について、較正物質が、大抵の場合においてバイオフィルムに添加される。このような較正は、本発明の方法に必要でない。

本発明の方法は、上記において説明されたサンプル調製の問題によって影響を受けない。大抵の体液についての調製工程（少しでも必要な場合）は、標準化され、そして更に、関連の生物において、体液中に溶解された物質は、大抵の場合、同様の濃度で存在し、その結果、一方では体液の天然特徴は保持され、そして他方ではサンプルの直接比較が可能である。必要に応じて、参照測定セルの路長(path length)へ、使用される測定セルの路長(path length)に関するデータを標準化する必要がある。従って、本発明の方法は、分析技術の良好な再現性と組み合わされて、特定の疾患（または生物学的流体のコンディション変化）に関する多変量パラメータ記録を確立するという可能性のために、広範囲の使用に著しく好適である。

本発明の方法は、例えば、以下の通り、図１に示される装置を用いて行われ得る：
− サンプルは、手動で（半自動化システム）またはマイクロタイタープレート（１）から（完全な自動化システム）供給され得る。

− 供給から、サンプルは、注入バルブ（２）へ導入される。

− マイクロタイタープレート（１）からのサンプルは、引き続いて、ポンプ（３）を介して処理される（taken up）。

− 注入バルブ（２）を介して、サンプルが、フロースルー測定セル（flow-through measuring cell）（４）へ導入される。

− 注入バルブ（２）を切り替えることによって、サンプルは、輸送媒体（transport medium）（５）（例えば、水または緩衝水溶液）へ供給され、次いでフロースルー測定セル（４）へ導入される。

− 輸送媒体（５）は、追加のポンプ（６）（好ましくは、ＨＰＬＣポンプ）によって駆動される。

− サンプルが測定セル（４）にある場合、輸送媒体（５）の流れは、例えば廃棄容器（waste container）（８）へ、制御バルブ（７）によってコースを変えられ、従って測定セル（４）を介しての流れが停止する。

− 測定セル（４）は、ＩＲ分光計（または、ＩＲ顕微鏡）と一体化され、それによって１以上のＩＲスペクトルが記録され得る。記録の間、測定セル（４）を介しての流れは存在しない。

− ＩＲスペクトルを記録するために、ＩＲ光源（９）からの光が、サンプルを通過され、そして検出器（１０）によって検出される。

− サンプルの還元または酸化が必要に応じて行われる。異なる印加電位について、少なくとも１つのＩＲスペクトルが、各場合において記録される。

−引き続いて、制御バルブ（７）がリセットされ、そしてサンプルは、輸送媒体（５）を用いてセル（４）から廃棄容器（８）へ完全にリンスされる。

− 必要に応じて、サンプルが流される、セル（４）、サンプリングループ（sampling loop）およびラインが、洗浄溶液（cleaning solution）（１１）（例えば、ＳＤＳ／６Ｍグアニジニウムヒドロクロリド）で洗浄される。洗浄溶液（１１）は、好ましくは、追加のポンプ（１３）の使用によって、制御バルブ（７）と第１注入バルブ（２）との間の第２注入バルブ（１２）を介して導入される。

− 原則として、リンス後［セル（４）が輸送媒体（５）で完全に充填される］、停止状態での参照スペクトル（reference spectrum）が記録される。この目的のために、輸送媒体（５）は、一定のままである参照として役立つ。

− 必要に応じて、注入バルブ（２）はサンプルスペクトルの記録前、間および／または後に切り替えられ得、そしてサンプリングループは再充填され得る。好ましくは、注入バルブ（２）は、記録の前に切り替えられそして再充填される。この様式において、サンプルスループットは、記録の持続時間（一般的に、１５〜３０秒）によってほとんど独占的に制限され、従ってシステムは多数のサンプルの自動化に好適である。

− 得られたＩＲスペクトルの評価は、多変量データ分析によって行われる。

− 最後に、サンプルは、多変量データ分析の群へ帰属される。

システムは、好ましくは、ＨＰＬＣ部品から作製される。

以下において、本発明は、非限定的な実施例によってより詳細に説明される。
実施例
ヘモグロビンの電気化学誘導差異分析
正常なヒトヘモグロビン（Ｈｂ_A）および鎌状赤血球貧血ヘモグロビン（Ｈｂ_S）の溶液を調製した。その電気化学誘導スペクトルを、短路セル（short-path cell）においてＦＴＩＲ分光計の手段によって記録した。差異スペクトルを図２に示す。２つのスペクトルは、特定の吸収範囲において良好な一致（agreement）を示す。しかし、他の範囲において、鎌状赤血球貧血ヘモグロビンについて特徴的な明確な差異が認識可能である。従って、本発明の方法は、例えば臨床分野における診断目的について、迅速かつ普遍的な有用な検出方法を提供する。何故ならば、電気化学誘導差異分析は、生物学的流体において全ての酸化還元−活性物質に適用可能であるからである。

ヒト血清のＦＴＩＲ分析
全吸収スペクトルを、短路フロースルーセル(short-path flow-through cell) （路長(path length)６μｍ）の手段によって記録した（図３）。

ＩＲスペクトル（二次導関数）の再現性を、同一の測定システムを使用することによって、ヒト血清において検査した。この目的のために、同一患者由来の５つのサンプルを、測定装置へ注入し、そしてスペクトルを記録した。図４におけるスペクトルは、バイオフィルムの分析によって達成不可能である顕著な再現性を示す。

図５Ａは、また上記の短路フロースルーセル(short-path flow-through cell)を使用して記録した、５つの異なるヒト血清のＩＲスペクトル（二次導関数）を示す。理解されるように、種々の患者由来のサンプルのスペクトルは、特定範囲において明確な差異を示す。これは、スペクトルを重ねた場合（図５Ｂ）、例えば１６８０〜１８００ｃｍ^-1の範囲において特に明白である。

多発性硬化症に罹患する患者由来のヒト髄液および血清サンプルのＦＴＩＲ分析
広範なヒトデータバンクから、多発性硬化症に罹患する患者由来の髄液および血清のサンプルを、上述の方法によって分析した。凍結保存していたサンプル−新鮮なサンプルもまた使用され得る−を、短路セル(short-path cell)を備える装置中に、解凍、流体状態で分析に供した。最も単純な場合、これらのサンプルは、直接使用され得る。最適化は、サンプルの好適な前処理によって達成され得る。ケモメトリック（chemometric）方法による引き続いてのデータ評価のために、記録された吸収スペクトルは直接使用され得、またはその二次導関数が使用され得る。７００ｃｍ^-1までおよび３０００ｃｍ^-1まで記録されたスペクトルのスペクトル範囲を拡大することは、これが情報量を増加させるので、スペクトル評価のために有用であるかもしれない。

髄液の実施例についての、図６（Ａ）および６（Ｂ）は、多発性硬化症に罹患するかまたは罹患しない患者についてのスペクトルを示す。

図は以下を示す。
図１は、本発明の方法を実施するために好適な装置の概略図である。 図２は、正常なヒトヘモグロビン（Ｈｂ_A）および鎌状赤血球貧血ヘモグロビン（Ｈｂ_s）の電気化学誘導ＦＴＩＲ差異スペクトルのグラフィック図である。 図３は、ヒト血清の全ＩＲ吸収スペクトルのグラフィック図である。短路フロースルーセル(short-path flow-through cell)が使用された（路長(path length)：約６μｍ）。 図４は、ヒト患者の血清の５つのＩＲスペクトルの二次導関数のグラフィック図である。 図５（Ａ）は、５人の異なるヒト患者の血清のＩＲスペクトルの二次導関数のグラフィック図であり、そして（Ｂ）は、１６８０〜１８００ｃｍ^-1の波数範囲における互いに重ね合わされた（Ａ）のスペクトルを示す。 図６（Ａ）は、多発性硬化症を有するかまたは有さない患者由来の髄液サンプルの吸収スペクトルを示し、そして（Ｂ）は、これらの吸収スペクトルの二次導関数を示す。

Claims (24)

1. 生物学的流体の状態を決定するための方法であって、以下
   （ａ）様々な状態の該生物学的流体のいくつかの天然サンプル、各サンプルにおける該生物学的流体の状態は既知である、および輸送媒体として一定の参照サンプル供給を提供する工程；
   （ｂ）工程（ａ）の天然サンプルおよび参照サンプルのＩＲスペクトルを測定する工程；
   （ｃ）工程（ｂ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析手順に供し、そしてそれらの特定の既知の状態への該サンプルの信頼性のある帰属を確実にする帰属パラメータを選択する工程；
   （ｄ）工程（ｃ）において得られた帰属パラメータを保存する工程；
   （ｅ）その状態が未知である生物学的流体の未知の天然サンプルを提供する工程；
   （ｆ）工程（ｅ）の天然サンプルおよび参照サンプルの少なくとも１つのＩＲスペクトルを測定する工程；
   （ｇ）工程（ｆ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析へ供する工程、および
   （ｈ）該未知サンプルのＩＲスペクトルの帰属パラメータを、工程（ｄ）において保存された該既知サンプルのＩＲスペクトルの帰属パラメータと比較する工程、
   ここで、工程（ｂ）および（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定は、３０μｍ以下の路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有しそして該スペクトルの記録の間に１ｎｍ未満の光路長偏差（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示す測定セルの助けを借りて行われる、
   を包含する、方法。
2. 生物学的流体の状態のコレクションを作製するための方法であって、以下
   （ａ）様々な状態の生物学的流体のいくつかの天然サンプル、生物学的流体の各サンプルの状態は既知である、および輸送媒体として一定の参照サンプル供給を提供する工程；
   （ｂ）工程（ａ）の天然サンプルおよび参照サンプルのＩＲスペクトルを測定する工程；
   （ｃ）工程（ｂ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析手順に供し、そしてそれらの特定の既知の状態への該サンプルの信頼性のある帰属を確実にする帰属パラメータを選択する工程、および
   （ｄ）工程（ｃ）において得られた帰属パラメータを保存する工程、
   ここで、工程（ｂ）におけるＩＲスペクトルの測定は、３０μｍ以下の路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有しそして該スペクトルの記録の間に１ｎｍ未満の光路長偏差（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示す測定セルの助けを借りて行われる、
   を包含する、方法。
3. 生物学的流体の状態を決定するための方法であって、以下
   （ｅ）その状態が未知である生物学的流体の天然サンプル、および輸送媒体として一定の参照サンプル供給を提供する工程；
   （ｆ）該生物学的流体の天然サンプルおよび参照サンプルのＩＲスペクトルを測定する工程；
   （ｇ）工程（ｆ）のＩＲスペクトルをマルチパラメータ分析へ供する工程、および
   （ｈ）該未知サンプルのＩＲスペクトルの帰属パラメータを、既知サンプルのＩＲスペクトルの帰属パラメータと比較する工程、
   ここで、工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定は、３０μｍ以下の路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有しそして該スペクトルの記録の間に１ｎｍ未満の光路長偏差（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示す測定セルの助けを借りて行われる、
   を包含する、方法。
4. 工程（ａ）および／または工程（ｅ）における天然サンプルの提供が、前記生物学的流体の均質化および／または前記生物学的流体の粒状成分の除去を包含する、請求項１に記載の方法。
5. 工程（ａ）における天然サンプルの提供が、前記生物学的流体の均質化および／または前記生物学的流体の粒状成分の除去を包含する、請求項２に記載の方法。
6. 工程（ｅ）における天然サンプルの提供が、前記生物学的流体の均質化および／または前記生物学的流体の粒状成分の除去を包含する、請求項３に記載の方法。
7. 工程（ｂ）および／または工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が４００〜７０００ｃｍ^−１の波数で行われる、請求項１又は４に記載の方法。
8. 工程（ｂ）におけるＩＲスペクトルの測定が４００〜７０００ｃｍ ^−１ の波数で行われる、請求項２又は５に記載の方法。
9. 工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が４００〜７０００ｃｍ ^−１ の波数で行われる、請求項３又は６に記載の方法。
10. 工程（ｂ）および／または工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が、ＦＴＩＲ分光計および／またはＦＴＩＲ顕微鏡の助けを借りて行われる、請求項１又は４に記載の方法。
11. 工程（ｂ）におけるＩＲスペクトルの測定が、ＦＴＩＲ分光計および／またはＦＴＩＲ顕微鏡の助けを借りて行われる、請求項２又は５に記載の方法。
12. 工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が、ＦＴＩＲ分光計および／またはＦＴＩＲ顕微鏡の助けを借りて行われる、請求項３又は６に記載の方法。
13. 工程（ｂ）および／または工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が、３〜１２μｍの路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有する測定セルの助けを借りて行われる、請求項１又は４に記載の方法。
14. 工程（ｂ）におけるＩＲスペクトルの測定が、３〜１２μｍの路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有する測定セルの助けを借りて行われる、請求項２又は５に記載の方法。
15. 工程（ｆ）におけるＩＲスペクトルの測定が、３〜１２μｍの路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有する測定セルの助けを借りて行われる、請求項３又は６に記載の方法。
16. 前記マルチパラメータ分析手順が、判別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ）分析、ニューロナルネットワーク（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）またはクラスター分析である、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
17. 前記測定セルが、前記サンプル中の生体分子の還元および／または酸化のための、一体化された電極を含む、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
18. 前記生物学的流体が生物の体液である、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
19. 前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、溶血血液、髄液、尿、唾液、精液、リンパ液、滑液、羊水、涙液、嚢胞液（ｃｙｓｔ ｆｌｕｉｄ）、汗腺分泌液および胆汁からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
20. 前記生物が、ボス タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ガルス ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、マレアグリス ガロパボ（Ｍａｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ）、ムス ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、オビス アモン（Ｏｖｉｓ ａｍｍｏｎ）、ラタス ノルウェギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｗｅｇｉｃｕｓ）、サス スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）およびホモ サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記未知状態のサンプルが、病理学的もしくは非病理学的状態および／またはある段階もしくは程度の病理学的状態に帰属される、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
22. 前記病理学的状態が、糖尿病、関節炎、増加したコレステロールレベル、貧血、組織破壊、癌、肝疾患、腎臓病、心筋梗塞、ＡＩＤＳ、アレルギー、じんま疹、アレルギー性ぜん息、自己免疫疾患、神経変性疾患およびＴＳＥからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記病理学的状態が、畜産において使用される食品および／または食品添加物によって引き起こされる、請求項２１に記載の方法。
24. 前記未知状態のサンプルが、特定の細胞タイプ、特定の細菌株または特定のウイルス株の存在に帰属される、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の方法。

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