JP4338320B2 - ヌクレオシドジホスフェート及びトリホスフェートのためのアッセイ - Google Patents
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Description
【０００１】
本明細書で引用されるすべての文書の内容は、その全体がここに組み込まれるものとする。
発明の分野
本発明は、ヌクレオシドジホスフェート、特にADP及びGDPのためのアッセイ、及びヌクレオシドトリホスフェート、特にATP及びGTPのためのアッセイに関する。
背景技術
ヌクレオシドジホスフェート及びトリホスフェートは、生物学において重要な役割を演じる。ADPは、ATPを形成するための直接の前駆物質であり、細胞エネルギーの一般的な流通物である（the universal currency of cellular energy）。GDPは、スクシニルCoAシンセターゼのための基質であり、クレブスサイクルのキー酵素であり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによる糖新生の際に形成される。また、それは、Ｇタンパク質シグナル伝達、微小管増殖及び視覚励起においても必須である。UDPは、ガラクトースのグルコースへのエピマー化、スクロースの形成及びグリコーゲンの増殖に関係する。CDPは、ホスホグリセリドの合成において重要な基である。また、ヌクレオシドジホスフェートは、トリホスファターゼ及びキナーゼ等の酵素の幾つかの主要なクラスによって触媒される反応の産物であり、従って、運動性、筋収縮、DNA合成、転写、翻訳及び窒素固定を含む多くの細胞プロセスによって産生される。
【０００２】
このように、ヌクレオシドジホスフェート及びトリホスフェートの検出及び測定は、生物学及び代謝の研究、特に生体エネルギー論において、重要である。
ルシフェラーゼに基づく生物学的サンプルのADP及びATPのアッセイは、20年以上もの間知られている［例えば、参考文献１、２、３、４］。ADP及びATPの生物発光アッセイは、筋肉及び脂肪組織バイオプシーにおける使用の目的で記載され［５］、ルシフェラーゼを利用する三酵素生物発光システムは、細菌細胞抽出における使用の目的で報告されている［６］。高いATP:ADP比での使用のために最適化された生物発光ADPアッセイが報告されているが［７］、これはATPの酵素除去を必要とする。一般に、ADPの存在下でATPを測定することはATPの存在下でADPを測定することよりも容易である。
また、酵素分光光度法アッセイも記載されている［例えば８］。
また、生物学的サンプルのGDP及びGTPのアッセイもよく知られている［例えば参考文献９及び１０］。
参考文献１１は、ADP、GDP、CDP及びUDPのカラムベースクロマトグラフィーアッセイを開示する。
また、GDP及びGTPの放射性アッセイも記載されている［１２、１３］。in vivo ADPレベルの測定用NMRベースアッセイは、イーストについて知られ［１４］、またNMRはADP及びATP及び赤血球を測定するために使用されている［１５］。
【０００３】
発明の開示
本発明によれば、ヌクレオシドジホスフェートは、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（NDPK）のリン酸化酵素の形態の脱リン酸化反応によって検出又は測定され、ヌクレオチドトリホスフェートは、そのリン酸化酵素の形態へのNDPKのリン酸化反応によって検出又は測定される。
このように、本発明は、（a）ヌクレオシドジホスフェートキナーゼのリン酸化酵素の形態の脱リン酸化反応を検出する工程を含む、サンプル中のヌクレオシドジホスフェートの存在の検出方法、及び（b）ヌクレオシドジホスフェートキナーゼのリン酸化酵素の形態へのリン酸化反応を検出する工程を含む、サンプル中のヌクレオシドトリホスフェートの存在の検出方法を提供する。
本方法は、典型的には以下の工程を含む。
- サンプル中のヌクレオシドジホスフェートをNDPKリン酸化酵素と結合させ、又はサンプル中のヌクレオシドトリホスフェートにNDPKをリン酸化させる工程、及び
- そのリン酸化した、及び脱リン酸化した形態間で異なる酵素の特徴の変化を検出する工程。
【０００４】
用語“NDPK”は、EC 2.7.4.6として分類される酵素の活性、すなわちピンポンメカニズムによるヌクレオシドトリホスフェート（N1TP）のγ-リン酸基のヌクレオシドジホスフェート（N2DP）への転移を有する酵素を意味する。
N1TP＋N2DP→N1DP＋N2TP
この反応スキームに基づいて、NDPKの系統名は、“ATP:ヌクレオシドジホスフェートホスホトランスフェラーゼ”であるが、慣用名は、“ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ”である。また、その酵素は、キナーゼ（リン酸化）、ヌクレオシドジホスフェート、ヌクレオシド5'ジホスフェートキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェート（UDP）キナーゼ、ヌクレオシドジホスホキナーゼ、ヌクレオチドホスフェートキナーゼ、NM23と多様に記述されている。
【０００５】
NDPKは、多くの生物（原核生物及び真核生物の両方）、例えば、ヒト、雌ウシ、サル、マウス、アフリカツメガエル、カラスムギ、エンドウマメ、ジャガイモ、イースト、枯草菌、大腸菌、Myxococcus xanthus、トリの骨髄芽球症ウイルス等について記載されている。細胞部位、分子量、オリゴマー構造、等電点、反応速度論、基質優先度（substrate preference）、最適pH、pH範囲、最適温度、カチオン要求性（Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+等）及び種々のアイソフォームによるこれらの相違が記載されている。入手可能な種々の適した酵素を考慮すれば、当業者は、ある特定の状況に適したNDPKを容易に選択でき、精製できる。NDPK酵素は、γ-ホスフェートをヌクレオシドトリホスフェート（N1TP）から活性部位ヒスチジンへ移動させるピンポンメカニズムを利用して、リン酸化酵素中間体を形成し、次いでヌクレオシドジホスフェート（N2DP）を形成する。本発明は、リン酸化酵素中間体がその検出及び測定を与える時間スケールにわたって安定であるとの発見に基づく。リン酸化酵素中間体によって、好ましくはヌクレオチドの一重結合部位によって、ヌクレオシドジホスフェートをリン酸化するその他の酵素も、本発明で使用してもよい。
【０００６】
リン酸化酵素は、そのリン酸基をサンプル中のN2DPに移動して、対応するN2TPを形成することができる。従って、この移動の検出は、ヌクレオシドジホスフェートの検出に使用することができる。従って、本発明に従ってヌクレオシドジホスフェートを検出するために、リン酸化酵素が試薬として要求される。これは、例えばNDPKを過剰のNTP、典型的にはATPとともにインキュベートすることによって容易に形成することができる。この方法において、リン酸化酵素の形成は、例えばEDTAを用いてMg2+を除去することによって促進される［１６］。また、リン酸化試薬としてホスホラミデート（phosphoramidate）を用いてヒスチジンの化学的リン酸化を利用してもよい［１７］。
リン酸化酵素は試薬として使用するために単離することができる。リン酸化酵素は、脱リン酸化しないで48時間よりも長く氷で貯蔵でき、-80℃で長期間（少なくとも5ヶ月）貯蔵できることがわかった（たとえ繰り返された凍結融解が脱リン酸化を生じたとしても）。その調製のために必要な時間範囲よりも長いリン酸化酵素の安定性は、その後にATPアーゼ由来のADPの放出等の動力学的現象をモニターするために、特に有利である。
【０００７】
NDPを含むサンプルに加えた場合、リン酸化酵素は、そのリン酸基のNDPへの移動によって脱リン酸化される。NTPを含むサンプルに加えた場合、リン酸化酵素は、NTPγ-リン酸基のその酵素への移動によって形成される。本発明は、NDPKのリン酸化及び脱リン酸化の形態間を識別する能力に頼る。
NDPKのリン酸化及び脱リン酸化の形態を識別するために、任意の好適な測定可能な変化を利用することができる。
例えば、酵素の固有の特性が利用できる。感度の異なるレベルによって選択される特定のNDPKに依存して、以下の方法は、どのようにして脱リン酸化／リン酸化を検出するかを示した例である。
- ホスフェートの位置（すなわち、NDPKとの結合又はNTPのγ-ホスフェートとして）は、31P NMRスペクトルによって確認できる。
- その環境が脱リン酸化によって変化するプロトンは、例えばNMRによって検出できる。
- 脱リン酸化は、タンパク質のトリプトファン残基の蛍光の変化を生じる場合がある［例えば、参考文献１８］。
- 脱リン酸化は、放射標識したリン酸化酵素由来の32Pの減少によって検出できる。放射性同位元素は、[γ-32P]ATPを用いてNDPKに都合よく組み込むことができる。
- 円偏光二色性又は任意のその他の好適な分光測定方法は、脱リン酸化で起こるコンホメーション変化を検出できる。
- 脱リン酸化は、結果として表面プラズモン共鳴特性の変化を生じる場合がある。
【０００８】
野生型酵素に固有な性質を利用するよりも、とにかく酵素を修飾することが望ましい。また、これは、選ばれたNDPKの脱リン酸化が容易に行われる固有の測定可能な変化を示さない場合重要である。
1つの特に好ましい修飾は、典型的にはシステイン残基による蛍光標識の酵素への付加である。野生型タンパク質に好適なシステイン残基がない場合（例えば、Myxococcus xanthusのNDPK）、これは変異原性によって容易に導入できる［例えば１９］。当業者は、突然変異のための好適な位置を容易に決定でき、その上突然変異が酵素の活性を乱さないことを保証する［例えば２０］。任意の与えられたアミノ酸残基で、特定の標識はその他よりもよい結果を与える場合がある。標識及び残基の好適な組み合わせは、ルーチン実験によって決定できる。
【０００９】
好ましい蛍光性標識は、クマリン含有化合物（around coumarin）をベースとする。特に好ましくは、N-[2-(ヨードアセトアミド)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）であり［２１；図１］、以降簡単に‘IDCC’と呼ぶ。これは、システイン残基と結合するのが好ましく、NDPKがリン酸化される場合、強い蛍光を、NDPKが脱リン酸化される場合、弱い蛍光を示すのが好ましい。好適にNDPKに結合した場合、この標識は、リン酸化酵素がはるかに高い濃度のATPの存在下で少量のADPを検出できる利点を提供する。これは、例えば単一の筋繊維でATPレベルが高い状況において、実験のために非常に需要である。また、それは、ADPレベルの変化に対して非常に素早く反応することができ、数百マイクロモルの範囲を超える大きなシグナル変化を与える。
同様の方法で導入できるその他の標識としては、ESR標識、発光標識、燐光標識及びその他の好適な発色団が挙げられる。
当業者が入手可能な種々のオプションの幾つかは、リアルタイムに酵素のリン酸化／脱リン酸化を検出するためのその他のものよりも適していることは理解されるであろう。蛍光は、リアルタイム検出にかなり適しているが、放射標識を用いるような方法は、終点を測定するのにより適している。
【００１０】
アッセイされるヌクレオシドジホスフェート／トリホスフェートは、利用されるNDPKの基質でなければならない。種々のNDP基質としては、ADP、CDP、GDP、UDP、IDP、XDP、それらのデオキシ誘導体（例えば、dADP、dCDP、dGDP、dTDP、dUDP）、6-アザ-UDP、8-ブロモ-IDP、8-アザ-GDP、及び8-アザ-UDP、及びアデノシン5'-メチレンジホスホネートが記載されている［例えば、２２、２３、２４］。これらの各化合物は、リン酸化酵素によってリン酸化され（利用されるNDPK及び基質に依存して、種々の反応親和性及び反応速度論によって）、このように本発明に従ってアッセイできる。
本発明は、好ましくはADP又はGDPを検出し、測定するために使用される。従って、これらの基質の1つに対して選択性を示すNDPKが選択される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様において、この検出方法は定量的データを与え、すなわち本発明は、サンプル中のヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの定量化方法を与える。これは、典型的には、NDP又はNTPの濃度に対してNDPKの検出可能な特徴の変化に関係する工程を含む。これは、行われるべき較正（例えばIDDC等の蛍光性標識による脱リン酸化の測定について）又は標準との比較を要求してもよいことは理解されるであろう。較正は、典型的には測定される濃度の所望する範囲で行われる。
第一の定量的局面において、ヌクレオシドジホスフェート又はヌクレオシドトリホスフェートの量は、サンプルへのリン酸化酵素（NDP）又は非リン酸化酵素（NTP）の添加後、リン酸化酵素のレベルにおける減少（NDP）又は増加（NTP）を測定することによって決定される。
第二の定量的局面において、ヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの産生速度は、時間に対するリン酸化酵素のレベルにおける減少（NDP）又は増加（NTP）によって決定できる。測定値を好適な数学的モデル（例えば、一次指数関数的減少に基づく単純モデル）とフィッティングすることによって、ヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの産生速度を決定することができる。この局面において、リン酸化酵素（NDP）の脱リン酸化又は酵素（NTP）のリン酸化は、リアルタイム検出法を用いて測定されるのが好ましい。
【００１２】
本発明の方法は、in vivo又はin vitroの使用に適しているのが好ましい。この方法は、筋繊維のインサイツの使用に適しているのが好ましく、アクトミオシンからのADP放出速度を計算するのに適しているデータを与えるのが好ましい。
リン酸化酵素の脱リン酸化を検出する工程（NDP関連局面）と同様に、本方法はNDPKリン酸化酵素を興味のあるサンプルに添加する初期工程を通常含でいる。これは非リン酸化NDPKからリン酸化酵素を調製することに先行してもよい。
また、本方法は、定量的な値を導くためにデータを式に当てはめる等の方法の際に、得られる任意のデータを分析する工程を含んでもよい。
好ましくは、本方法は、NDPK活性を阻害する場合があるテオフィリン、デスダミン（desdanine）及びAg+等の試薬の使用を回避する。
【００１３】
上述の方法と同様に、本発明は本方法における使用のための試薬を提供する。
本発明は、酵素がリン酸化される場合と非リン酸化される場合とで異なる検出可能なシグナルを与える標識を有するように修飾されるNDPKを提供する。
修飾されたNDPKの標識は蛍光性基であってもよく、好ましくはIDCCである。標識は、典型的には酵素のアミノ酸残基に結合している。標識をシステイン残基に結合することが好ましい。
特に好ましい試薬は、Asp112→Cys突然変異を有し、この突然変異した残基にIDCC標識を有するM.xanthusのNDPKである。リン酸化酵素としてのこの試薬は、ATPよりもADPに約3オーダーの大きさでより感受性が高い。
また、本発明は、ヌクレオシドジホスフェートの結合に感受性がある少なくとも1つの検出可能な標識の結合によって修飾されるNDPKを提供する。
また、本発明は、そこに固定化されたこれらのNDPK試薬を有する支持体を提供する。これらはカラム又はビーズを含む。これは32P-リン酸化酵素と組み合わせて使用してもよく、固定化されたNDPKと共にインキュベートされるサンプル中のADPはATPへのその変換に放射標識される。従って、遊離溶液（free solution）中で放射能は最初のサンプル中のADPの量を示す。
また、本発明はこれらのNDPK試薬の産生方法を提供する。
さらに、本発明は、in vivo又はin vitro診断上の試薬としての使用のために、これらのNDPK試薬を提供する。
【００１４】
実施例
一般的な分子生物学的技法はSambrookら［２５］に従って行った。
NDPK の調製
M.XanthusのNDPKは、大腸菌においてクローン化され、発現されるndk遺伝子によってコードされる［２６］。タンパク質は16kDaサブユニットのホモテトラマーであり、特徴付けられており、結晶構造が決定されている［１６、２７］。野生型配列は任意のシステインを含んでいないため、遺伝子は、ホスホチオエートベース法［２８、アマシャムによるキットの形態で産生される］又はPCRベースクイックチェンジキット［ストラタジーン］を用いて大腸菌株TG1及びDH5αの部位特異的変異誘発によってシステイン残基を導入するために操作される。
アマシャムキットを用いて、M.xanthus由来のndk遺伝子を含むpJM5C2Aの0.8kb HindIII-EcoRIフラグメント［２９］をM13mp19と結合し、得られた組換えクローンを使用して、変異原性のために一本鎖DNAテンプレートを提供した。クローン化のために、突然変異させたndk遺伝子をpJM5C2Aにもどってクローン化した（cloned back into）。別のものとして、M13ndk構築物の0.7kb BstXI-EcoRI フラグメントをインビトロゲン（商標）pRSetA発現ベクターの修飾された形態に結合し、NDPKのN末端と融合したヒスチジンタグのための配列のそのコード化は除去されていた。これはプラスミドの3.5kb pRSndkX系列を生じ、ここで最後の“X”は一連のndk突然変異の数である。
また、pRSndkはクイックチェンジ法のテンプレートとして使用した。
【００１５】
D112C（すなわちAsp-112をCysに突然変異した）及びD62Cを含むシステイン残基を含む種々のミュータントタンパク質を調製した。突然変異のための位置は、典型的には結晶構造中に見られるヌクレオチド結合間隙の近接部に基づいて選択された［１６］。ミュータントD112C遺伝子をプラスミドpRSndk4で産生し、また発現のためにそれを使用した。最もよい結果について、新たにトランスフォームした細胞をスターター培養のために使用した。200μlカルシウムコンピテントBL21細胞［Novagen］を2ngのpRSndk4プラスミドDNAにより、30分間氷上でインキュベートした。次いで、この混合物の半分を0.1mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレートにまき、37℃で一晩インキュベートした。プレートは、典型的には50から100の群体を含んだ。0.1mg/mlのアンピシリンを含む100mlのLB培地にプレートから2から3の群体を接種し、37℃で9時間増殖して、ユニット細胞は定常期に入った。主培養のために、8×500mlのLB＋アンピシリンを10mlの開始培養に接種し、37℃で6時間インキュベートし、その時間後細胞は、典型的には0.38のOD595に達した。この時点で、0.5mg/mlのIPTGを各フラスコに添加し、細胞を更に16時間増殖した。細胞をベックマンL2遠心機で、3800rpmで、20℃で20分間遠心分離することにより回収した。ペレットを100mlの緩衝液Ａ（20mMのトリス-HCl, pH 8.2, 1mM EDTA）に再懸濁し、−80℃で貯蔵した。
約35mlの凍結した細胞懸濁液をゆっくり解凍し、次いで超音波処理することによって溶解した。その上澄み（すなわち粗製抽出物）を保持した。発現レベルをSDS-PAGEにより決定した。NDPKD112Cは50％よりも多いサイトゾルタンパク質を産生した。
NDPK精製は2つのカラムクロマトグラフィーの工程を含む。最初にpH及び緩衝液Ａ＋10mMのDTTを用いたイオン強度の調整した後、粗製抽出物（約200ml）を120mlのQ-セファロースイオン交換カラムに4℃及び2.0ml/minの流速で入れた。カラムを1体積の緩衝液で洗浄し、1ml/minの流速で0から0.3MのNaClの連続線形勾配（500ml）で溶出した。NDPKのバルク（約80％）はこれらの条件下で樹脂に結合しない。
【００１６】
Amicon YM10限外濾過膜を用いた濃縮後、溶出物を緩衝液ＡのG-100セファロースゲル濾過カラムに入れた。1.0ml/minの流速で、溶出プロファイルは2つのピークを示した。第1はDNAを含み、第二はタンパク質を含んでいた。NDPKを含む画分を貯蔵し、前と同様に濃縮した。
同様の配列を有し、テトラマーでもある大腸菌NDPKによる混入のないことが確認された［３０］。質量分析データは、精製したタンパク質がミュータントタンパク質−N末端メチオシンの計算したMWと適合するMW 15993±1Daを有する単一種であることを示し、大腸菌内で発現した場合、それが欠落していることが示された［１６］。4リットルの培養からの純粋なNDPKD112Cの収量は約300mgであった。
【００１７】
NDPK の蛍光性標識
NDPKD112Cを50mMのトリス/HCl（pH 8.1）中で2.5倍過剰量のIDCC（図１）で、1時間37℃でインキュベートした。典型的な実験において、標識溶液の体積は3mlであり、NDPKD112Cの濃度は150μMであった。インキュベーション後、この溶液を0.2μMのAcrodiscフィルター（Gelman）により濾過し、緩衝液Ｂ（10mMのトリス-HCl, pH 8.0, 1mMのEDTA）で平衡にしたPD10脱塩カラム（ファルマシア）に入れた。標識したタンパク質を含む溶出物（約6ml）をすぐに緩衝液Ｂで平衡にした25mlのQ-セファロースカラムに入れ、次いで0から0.1Mの20mlのNaClの線形勾配にした。勾配を適用した後標識したタンパク質を完全に溶出し、標識していないタンパク質と同様の方法で濃縮した。タンパク質の濃度は、フルオロフォアの吸光度スペクトルは不変であると仮定して（ε430nm 46800M-1cm-1）、吸光度分光法を用いて測定した。この濃度の値は、ウシ血清アルブミン検量線を用いる比色アッセイによって測定されたものと一致する。276nmのIDCCの吸光度（ジチオスレイトール付加物中に430nMで0.198の吸光度）で補正した後、NDPKのモル吸光係数はε276nm 7600M-1cm-1と計算された。
【００１８】
標識及び精製後の収率は典型的には65％であった。この高い収率は、Cys-112のチオール基が容易に利用できることを示している。質量分析は、1つの分子IDCCがタンパク質分子毎に組み込まれ、二番目の部位の標識を示さないことを明らかにし、質量はIDCC-NDPKで予想されるものであった。
突然変異及び標識化はオリゴマー形成に作用しないことを確認して、複合体のMWを沈降平衡遠心分離によって測定した。結果は、IDCC-NDPKがMW 62.7kDa（質量分析データからテトラマーについて計算されるよりも4％低い）のテトラマーであることを示す。
新しいミュータント／フルオロフォアの組み合わせの蛍光特性の素早い分析が要求される場合、標識化は、典型的には100から200μlのNDPK濃度を用いて、限外濾過及びQ-セファロース工程を避けて、より小さいスケールで行った。
試験したその他のチオール反応性環境感受性蛍光標識は、MDCC（N-[2-(1-マレイミジル)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）を含んでいた［２１］。
【００１９】
リン酸化
IDCC-NPDKを典型的には5倍過剰であるが1mM以下のATPと共にインキュベートした。インキュベーションは30から45分間37℃で10mMのトリス/HCl, pH 8.0, 1mMのEDTA又は10mMのPIPES, pH 7.0, 1mMのEDTA中であった。タンパク質を同じ緩衝液で平衡化したPD10カラムを用いて分離した。典型的には溶出したタンパク質の90％より多くがリン酸化酵素であった。溶液は、直ぐに又は48時間まで氷上で貯蔵した後使用した。必要な場合、溶液はマイクロ遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。
【００２０】
蛍光特性
リン酸化酵素（IDCC-NDPK〜P）の分光学的特性を非リン酸化形態の酵素と比較した。データはキセノンランプ及び2.5又は5nmに設定したモノクロメータースリット幅を有するPerkin-Elmer LS50B発光分光器で記録した。IDCC-NDPKの蛍光は50μMのADPの存在下よりも50μMのATPの存在下で4倍大きかった（図２Ａ）。同様の結果は100μMのGDP/GTPで得られた（図２Ｂ）。両方の場合に、スペクトルは20mMのPIPES, pH 7.2, 2mMのMgCl2中に2μMのタンパク質を含む200μlの溶液から20℃で記録した。励起は441nm、スリット幅5nmで行った。小さなの体積変化（1％）のための補正は行わなかった。これらの結果は、IDCC-NDPK〜Pが非リン酸化形態と比較して強い蛍光を有することを示す。
【００２１】
ADPを有する2μMのIDCC-NDPK〜Pの溶液の滴定は蛍光シグナルの大きな減少を示したが（図３Ａ）、ATPでは同じ濃度範囲（＜100μM）で変化はなかった。同様のデータをGDP/GTPで得た（図３Ｂ）。ADP/ATPアッセイは10mMのトリス/HCl, pH 8.0, 5mMのMgCl2中で、21℃で行った。励起は432nm（5nmのスリット幅）であり、発光は478nm（2.5nmのスリット幅）で記録した。GDP/GTPアッセイは20mMのPIPES, pH 7.0, 2mMのMgCl2中で、20℃で行った。励起は441nm（5nmのスリット幅）であり、発光は475nm（5nmのスリット幅）で記録した。両方の場合に、データは小さな体積増加のために補正した。図３ＢにおいてGTPの最初の添加での小さな減少は希釈した200μMの保存液におけるGTPの部分的な加水分解によるものであり、その後のGTP添加は2mMの保存液からであった。
【００２２】
非リン酸化酵素のデータと共に（図４Ａ及び４Ｂ）、これはほとんどの蛍光変化が酵素のリン酸化／脱リン酸化によるためであるということを示唆する。
50μMを超えるADPの増加は小さな蛍光の増加を生じる。これは、標識化しない野生型酵素について示唆されるように［１８］、おそらくADPとNDPKとの非特異的な相互作用によるものである。蛍光シグナルの変化は少なくとも50％のタンパク質濃度まで［ADP］に対して線形である。
蛍光測定から定量的データを導くために、図５に示される較正曲線をプロットした。較正したデータは10μMのIDCC-NDPK〜Pと0、2.5、5.0、7.5又は10.0μMのADPを含む50μMのATPとを混合することによってストップフロー実験で得た（10mMのPIPES緩衝剤, pH 7.0, 1mMのMgCl2, 20℃）。蛍光変化の大きさ（ΔF）は各濃度で2つの実験を平均し、ADP濃度に対してプロットした。
IDCC-NDPKとIDCC-NDPK〜Pとの間のフルオロフォアの吸収最大で6nmのシフトがあるが、発光最大では2nmのみである。標識した酵素の2つの形態について蛍光量子収量はエタノール中のクマリン314について既知の値0.83［３１］をリファレンスとして用いて測定した。リン酸化した酵素（0.22）から非リン酸化の酵素（0.054）まで行った量子収量は4倍減少し、発光強度の観測された変化によく一致したが（図２）、リン酸化酵素の量子収量は緩衝剤中のクマリン314（0.52）よりもまだ明らかに低かった。
【００２３】
過渡的動力学
3つの異なる過渡的動力学測定はストップフロー装置で行った。
第一に、IDCC-NDPK〜Pの脱リン酸化速度をADP濃度の範囲で測定した。図６Ａは20mMのPIPES, pH 7.0, 2mMのMgCl2中に1μMのタンパク質を有する50μMのADP（a）及び250μMのADP（b）の混合についての発光データを示す。観測された速度定数（a: 11.1±0.01s-1; b: 57.2±0.07s-1）は、ADP濃度の増加に比例して線形に増加し、二次速度定数は線形フィットの傾きから計算され、0.21×106M-1s-1を得た（図６Ｃ）。
第二の実験において、リン酸化酵素産生速度はIDCC-NDPK〜P酵素とATPとを混合することによって測定した（図６Ｂ）。再度、ATP増加により速度は線形増加し（50μMのATPで5.57±0.01s-1; 250μMのATPで18.4±0.03s-1）、導出される二次速度定数は0.072×106M-1s-1であった（図６Ｃ）。
第三の実験において、脱リン酸化速度は種々の濃度のATPの存在下で測定した。観測された速度はその非存在下よりもATPの存在下でより大きかったが、強度変化はより小さかった。図６Ｃの断続線（■）の傾きから、二次速度定数はATPの存在下で0.135×106M-1s-1と計算される。ATPによって生じる速度の増加は酵素の平衡状態を考慮することによって以下のように表される。
観測される速度はk+[ADP]＋k-[ATP]であり、従って[ADP]及び[ATP]と共に増加する。
この速度促進は、筋繊維において、例えばATPレベルが通常少なくとも1mMである場合、有利である。リン酸化酵素の脱リン酸化は、たとえ初期に低いADP濃度であっても非常に早い必要がある。
【００２４】
単一の筋繊維における測定
実験はCa2+の存在下で単一のウサギの腰筋繊維で、以下の変更を伴って本質的に参考文献３２に記載される通りに行った。バックグラウンドADPを除去するために8U/mlのアピラーゼを含む硬直溶液（rigor solution）に10分間の繊維のインキュベーションは380μMのIDCC-NDPK〜P及び5mMのNPEケージ化ATP（ATPのP3-1-(2-ニトロフェニル)エチルエステル）を含む添加液における10分間のインキュベーションを伴った。繊維をシリコーンオイルに移し、ATP（約1mM）をゼロ時間でレーザーフラッシュ光分解（347nm）によって放出した。実験の際の温度は18℃であり、水溶液はpH 7.1及びpCa 4.5であった。蛍光励起は425nmであり、発光はロングパスフィルター（450から650nm）を通して検出した。
時間ゼロの後、蛍光トレース（図７の底の曲線）は3つの部分からなり、第1はフラッシュアーチファクト、次いで最初のATPアーゼサイクルがADPに関して生じる時間の遅れ、最後にIDCC-NDPK〜PとADPとの反応を表す蛍光が緩やかに減衰する相。この曲線の初期の傾きは、11s-1のアクトミオシンからのADP放出速度を与える。
ミオシンATPアーゼとは無関係にADP産生を測定するためのNPEケージ化ADPを用いる筋繊維の同様の実験は、（i）リン酸化酵素が、筋繊維内にある場合ADPについてその感受性及び反応性を維持することができ、（ii）シグナルがミオシンATPアーゼから放出されるADPを検出可能であり、（iii）筋繊維が期待される様式で発達中の張力（developing tension）であることを示す。
【００２５】
ヒトの Rho タンパク質由来のヌクレオチド交換
小さなGタンパク質、rho（GTPアーゼ活性をも有する）由来のヌクレオチド交換の速度は溶液中で測定した。また、加水分解の速度は間接的に得た。
ヒトのrhoタンパク質は密接に接合したGDPを含む形態で調製した。過剰に加えたGTPの存在下で、ヌクレオチド交換は、本発明に従って測定される場合、GDPが遊離溶液（free solution）に放出されるように生じる。一度GTPがrhoと結合すると、その加水分解はタンパク質によって定常状態の速度でゆっくり触媒される。これはより多くのGDPを産生し、それが一度放出されれば測定される。
蛍光発光は20mMのトリス/HCl, pH 7.6, 1mMのMgCl2, 100mMの(NH4)2SO4, 10μMのGTP及び2μMのIDCC-NDPK〜Pを含む200μlの溶液で記録した。反応は2μMのRho.GDPを添加することによってt=0で開始した。励起は475nmに設定した発光モノクロメーターにより440nmであった。温度は30℃であった。データは異なるGTP/GDP比によるIDCC-NDPK〜Pの滴定から得られる1μMのGDPについて蛍光変化を用いて規格化した。データ（図８）は対数期で0.196min-1の速度定数及び線形期で41.2nM GDP min-1の傾き（[Rho]による分割後、3.43×10-4s-1）を有するシングル指数関数＋一次関数にフィットさせた。指数関数“バースト”はrhoに結合したGDPとGTPとの交換を表す。線形期は定常状態を表し、さらにrho上へのGTPの交換はGDPへの加水分解によって制限される。
また、速度は‘標準’方法によっても測定し、同様の結果を得た。
本発明は上記で実施例のみによって記載され、改良は本発明の範囲及び意図に含まれる限りにおいて行ってもよいことは理解されるであろう。
【００２６】
参考文献（その内容は全体として本明細書に組み込まれるものとする）
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【図面の簡単な説明】
【図１】 好ましい蛍光性標識、IDCCの構造を示す。
【図２】 （Ａ）ADP/ATP及び（Ｂ）GDP/GTPの存在下でIDCC-NDPKの発光スペクトルを示す。
【図３】 ADP/GDP（白抜き記号○及び□）及びATP/GTP（黒塗り記号●及び■）によるIDCC標識リン酸化酵素の滴定を示す。
【図４】 非リン酸化酵素を用いた同じ実験を示す。
【図５】 蛍光変化がADP濃度に対してどのように変化するかを示す、ストップフロー実験で得られる較正曲線を示す。
【図６】 ストップフロー蛍光を用いて得られた過渡的動力学的データを示す。破線はシングル指数関数のベストフィットを表す。６Ａ及び６ＢはADP及びATPで得られたデータを示す。６ＣはADP（○）又はATP（●）濃度に対して得られた速度定数のプロットを示す。実線は導出した二次速度定数を有する一次方程式のベストフィットを示す。破線及び四角（■）は、ADP滴定が1mMのATPの存在下で繰り返された場合に得られた観測された速度定数を示す。
【図７】 筋肉張力の増加及びIDCC-NDPK〜Pの脱リン酸化のための蛍光の付随的な減少を示す、シングルラビット腰筋筋繊維（single rabbit psoas muscle fibre）（除膜した）から得られるプロットを示す。
【図８】 溶液中へのGDPの放出を示す、ヒトのロータンパク質（rho protein）を用いて得られたプロットを示す。データは、実線で示されるようにシングル指数関数＋一次方程式にフィットさせた。
本明細書で引用されるすべての文書の内容は、その全体がここに組み込まれるものとする。
発明の分野
本発明は、ヌクレオシドジホスフェート、特にADP及びGDPのためのアッセイ、及びヌクレオシドトリホスフェート、特にATP及びGTPのためのアッセイに関する。
背景技術
ヌクレオシドジホスフェート及びトリホスフェートは、生物学において重要な役割を演じる。ADPは、ATPを形成するための直接の前駆物質であり、細胞エネルギーの一般的な流通物である（the universal currency of cellular energy）。GDPは、スクシニルCoAシンセターゼのための基質であり、クレブスサイクルのキー酵素であり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによる糖新生の際に形成される。また、それは、Ｇタンパク質シグナル伝達、微小管増殖及び視覚励起においても必須である。UDPは、ガラクトースのグルコースへのエピマー化、スクロースの形成及びグリコーゲンの増殖に関係する。CDPは、ホスホグリセリドの合成において重要な基である。また、ヌクレオシドジホスフェートは、トリホスファターゼ及びキナーゼ等の酵素の幾つかの主要なクラスによって触媒される反応の産物であり、従って、運動性、筋収縮、DNA合成、転写、翻訳及び窒素固定を含む多くの細胞プロセスによって産生される。
【０００２】
このように、ヌクレオシドジホスフェート及びトリホスフェートの検出及び測定は、生物学及び代謝の研究、特に生体エネルギー論において、重要である。
ルシフェラーゼに基づく生物学的サンプルのADP及びATPのアッセイは、20年以上もの間知られている［例えば、参考文献１、２、３、４］。ADP及びATPの生物発光アッセイは、筋肉及び脂肪組織バイオプシーにおける使用の目的で記載され［５］、ルシフェラーゼを利用する三酵素生物発光システムは、細菌細胞抽出における使用の目的で報告されている［６］。高いATP:ADP比での使用のために最適化された生物発光ADPアッセイが報告されているが［７］、これはATPの酵素除去を必要とする。一般に、ADPの存在下でATPを測定することはATPの存在下でADPを測定することよりも容易である。
また、酵素分光光度法アッセイも記載されている［例えば８］。
また、生物学的サンプルのGDP及びGTPのアッセイもよく知られている［例えば参考文献９及び１０］。
参考文献１１は、ADP、GDP、CDP及びUDPのカラムベースクロマトグラフィーアッセイを開示する。
また、GDP及びGTPの放射性アッセイも記載されている［１２、１３］。in vivo ADPレベルの測定用NMRベースアッセイは、イーストについて知られ［１４］、またNMRはADP及びATP及び赤血球を測定するために使用されている［１５］。
【０００３】
発明の開示
本発明によれば、ヌクレオシドジホスフェートは、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（NDPK）のリン酸化酵素の形態の脱リン酸化反応によって検出又は測定され、ヌクレオチドトリホスフェートは、そのリン酸化酵素の形態へのNDPKのリン酸化反応によって検出又は測定される。
このように、本発明は、（a）ヌクレオシドジホスフェートキナーゼのリン酸化酵素の形態の脱リン酸化反応を検出する工程を含む、サンプル中のヌクレオシドジホスフェートの存在の検出方法、及び（b）ヌクレオシドジホスフェートキナーゼのリン酸化酵素の形態へのリン酸化反応を検出する工程を含む、サンプル中のヌクレオシドトリホスフェートの存在の検出方法を提供する。
本方法は、典型的には以下の工程を含む。
- サンプル中のヌクレオシドジホスフェートをNDPKリン酸化酵素と結合させ、又はサンプル中のヌクレオシドトリホスフェートにNDPKをリン酸化させる工程、及び
- そのリン酸化した、及び脱リン酸化した形態間で異なる酵素の特徴の変化を検出する工程。
【０００４】
用語“NDPK”は、EC 2.7.4.6として分類される酵素の活性、すなわちピンポンメカニズムによるヌクレオシドトリホスフェート（N1TP）のγ-リン酸基のヌクレオシドジホスフェート（N2DP）への転移を有する酵素を意味する。
N1TP＋N2DP→N1DP＋N2TP
この反応スキームに基づいて、NDPKの系統名は、“ATP:ヌクレオシドジホスフェートホスホトランスフェラーゼ”であるが、慣用名は、“ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ”である。また、その酵素は、キナーゼ（リン酸化）、ヌクレオシドジホスフェート、ヌクレオシド5'ジホスフェートキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェート（UDP）キナーゼ、ヌクレオシドジホスホキナーゼ、ヌクレオチドホスフェートキナーゼ、NM23と多様に記述されている。
【０００５】
NDPKは、多くの生物（原核生物及び真核生物の両方）、例えば、ヒト、雌ウシ、サル、マウス、アフリカツメガエル、カラスムギ、エンドウマメ、ジャガイモ、イースト、枯草菌、大腸菌、Myxococcus xanthus、トリの骨髄芽球症ウイルス等について記載されている。細胞部位、分子量、オリゴマー構造、等電点、反応速度論、基質優先度（substrate preference）、最適pH、pH範囲、最適温度、カチオン要求性（Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+等）及び種々のアイソフォームによるこれらの相違が記載されている。入手可能な種々の適した酵素を考慮すれば、当業者は、ある特定の状況に適したNDPKを容易に選択でき、精製できる。NDPK酵素は、γ-ホスフェートをヌクレオシドトリホスフェート（N1TP）から活性部位ヒスチジンへ移動させるピンポンメカニズムを利用して、リン酸化酵素中間体を形成し、次いでヌクレオシドジホスフェート（N2DP）を形成する。本発明は、リン酸化酵素中間体がその検出及び測定を与える時間スケールにわたって安定であるとの発見に基づく。リン酸化酵素中間体によって、好ましくはヌクレオチドの一重結合部位によって、ヌクレオシドジホスフェートをリン酸化するその他の酵素も、本発明で使用してもよい。
【０００６】
リン酸化酵素は、そのリン酸基をサンプル中のN2DPに移動して、対応するN2TPを形成することができる。従って、この移動の検出は、ヌクレオシドジホスフェートの検出に使用することができる。従って、本発明に従ってヌクレオシドジホスフェートを検出するために、リン酸化酵素が試薬として要求される。これは、例えばNDPKを過剰のNTP、典型的にはATPとともにインキュベートすることによって容易に形成することができる。この方法において、リン酸化酵素の形成は、例えばEDTAを用いてMg2+を除去することによって促進される［１６］。また、リン酸化試薬としてホスホラミデート（phosphoramidate）を用いてヒスチジンの化学的リン酸化を利用してもよい［１７］。
リン酸化酵素は試薬として使用するために単離することができる。リン酸化酵素は、脱リン酸化しないで48時間よりも長く氷で貯蔵でき、-80℃で長期間（少なくとも5ヶ月）貯蔵できることがわかった（たとえ繰り返された凍結融解が脱リン酸化を生じたとしても）。その調製のために必要な時間範囲よりも長いリン酸化酵素の安定性は、その後にATPアーゼ由来のADPの放出等の動力学的現象をモニターするために、特に有利である。
【０００７】
NDPを含むサンプルに加えた場合、リン酸化酵素は、そのリン酸基のNDPへの移動によって脱リン酸化される。NTPを含むサンプルに加えた場合、リン酸化酵素は、NTPγ-リン酸基のその酵素への移動によって形成される。本発明は、NDPKのリン酸化及び脱リン酸化の形態間を識別する能力に頼る。
NDPKのリン酸化及び脱リン酸化の形態を識別するために、任意の好適な測定可能な変化を利用することができる。
例えば、酵素の固有の特性が利用できる。感度の異なるレベルによって選択される特定のNDPKに依存して、以下の方法は、どのようにして脱リン酸化／リン酸化を検出するかを示した例である。
- ホスフェートの位置（すなわち、NDPKとの結合又はNTPのγ-ホスフェートとして）は、31P NMRスペクトルによって確認できる。
- その環境が脱リン酸化によって変化するプロトンは、例えばNMRによって検出できる。
- 脱リン酸化は、タンパク質のトリプトファン残基の蛍光の変化を生じる場合がある［例えば、参考文献１８］。
- 脱リン酸化は、放射標識したリン酸化酵素由来の32Pの減少によって検出できる。放射性同位元素は、[γ-32P]ATPを用いてNDPKに都合よく組み込むことができる。
- 円偏光二色性又は任意のその他の好適な分光測定方法は、脱リン酸化で起こるコンホメーション変化を検出できる。
- 脱リン酸化は、結果として表面プラズモン共鳴特性の変化を生じる場合がある。
【０００８】
野生型酵素に固有な性質を利用するよりも、とにかく酵素を修飾することが望ましい。また、これは、選ばれたNDPKの脱リン酸化が容易に行われる固有の測定可能な変化を示さない場合重要である。
1つの特に好ましい修飾は、典型的にはシステイン残基による蛍光標識の酵素への付加である。野生型タンパク質に好適なシステイン残基がない場合（例えば、Myxococcus xanthusのNDPK）、これは変異原性によって容易に導入できる［例えば１９］。当業者は、突然変異のための好適な位置を容易に決定でき、その上突然変異が酵素の活性を乱さないことを保証する［例えば２０］。任意の与えられたアミノ酸残基で、特定の標識はその他よりもよい結果を与える場合がある。標識及び残基の好適な組み合わせは、ルーチン実験によって決定できる。
【０００９】
好ましい蛍光性標識は、クマリン含有化合物（around coumarin）をベースとする。特に好ましくは、N-[2-(ヨードアセトアミド)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）であり［２１；図１］、以降簡単に‘IDCC’と呼ぶ。これは、システイン残基と結合するのが好ましく、NDPKがリン酸化される場合、強い蛍光を、NDPKが脱リン酸化される場合、弱い蛍光を示すのが好ましい。好適にNDPKに結合した場合、この標識は、リン酸化酵素がはるかに高い濃度のATPの存在下で少量のADPを検出できる利点を提供する。これは、例えば単一の筋繊維でATPレベルが高い状況において、実験のために非常に需要である。また、それは、ADPレベルの変化に対して非常に素早く反応することができ、数百マイクロモルの範囲を超える大きなシグナル変化を与える。
同様の方法で導入できるその他の標識としては、ESR標識、発光標識、燐光標識及びその他の好適な発色団が挙げられる。
当業者が入手可能な種々のオプションの幾つかは、リアルタイムに酵素のリン酸化／脱リン酸化を検出するためのその他のものよりも適していることは理解されるであろう。蛍光は、リアルタイム検出にかなり適しているが、放射標識を用いるような方法は、終点を測定するのにより適している。
【００１０】
アッセイされるヌクレオシドジホスフェート／トリホスフェートは、利用されるNDPKの基質でなければならない。種々のNDP基質としては、ADP、CDP、GDP、UDP、IDP、XDP、それらのデオキシ誘導体（例えば、dADP、dCDP、dGDP、dTDP、dUDP）、6-アザ-UDP、8-ブロモ-IDP、8-アザ-GDP、及び8-アザ-UDP、及びアデノシン5'-メチレンジホスホネートが記載されている［例えば、２２、２３、２４］。これらの各化合物は、リン酸化酵素によってリン酸化され（利用されるNDPK及び基質に依存して、種々の反応親和性及び反応速度論によって）、このように本発明に従ってアッセイできる。
本発明は、好ましくはADP又はGDPを検出し、測定するために使用される。従って、これらの基質の1つに対して選択性を示すNDPKが選択される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様において、この検出方法は定量的データを与え、すなわち本発明は、サンプル中のヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの定量化方法を与える。これは、典型的には、NDP又はNTPの濃度に対してNDPKの検出可能な特徴の変化に関係する工程を含む。これは、行われるべき較正（例えばIDDC等の蛍光性標識による脱リン酸化の測定について）又は標準との比較を要求してもよいことは理解されるであろう。較正は、典型的には測定される濃度の所望する範囲で行われる。
第一の定量的局面において、ヌクレオシドジホスフェート又はヌクレオシドトリホスフェートの量は、サンプルへのリン酸化酵素（NDP）又は非リン酸化酵素（NTP）の添加後、リン酸化酵素のレベルにおける減少（NDP）又は増加（NTP）を測定することによって決定される。
第二の定量的局面において、ヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの産生速度は、時間に対するリン酸化酵素のレベルにおける減少（NDP）又は増加（NTP）によって決定できる。測定値を好適な数学的モデル（例えば、一次指数関数的減少に基づく単純モデル）とフィッティングすることによって、ヌクレオシドジホスフェート又はトリホスフェートの産生速度を決定することができる。この局面において、リン酸化酵素（NDP）の脱リン酸化又は酵素（NTP）のリン酸化は、リアルタイム検出法を用いて測定されるのが好ましい。
【００１２】
本発明の方法は、in vivo又はin vitroの使用に適しているのが好ましい。この方法は、筋繊維のインサイツの使用に適しているのが好ましく、アクトミオシンからのADP放出速度を計算するのに適しているデータを与えるのが好ましい。
リン酸化酵素の脱リン酸化を検出する工程（NDP関連局面）と同様に、本方法はNDPKリン酸化酵素を興味のあるサンプルに添加する初期工程を通常含でいる。これは非リン酸化NDPKからリン酸化酵素を調製することに先行してもよい。
また、本方法は、定量的な値を導くためにデータを式に当てはめる等の方法の際に、得られる任意のデータを分析する工程を含んでもよい。
好ましくは、本方法は、NDPK活性を阻害する場合があるテオフィリン、デスダミン（desdanine）及びAg+等の試薬の使用を回避する。
【００１３】
上述の方法と同様に、本発明は本方法における使用のための試薬を提供する。
本発明は、酵素がリン酸化される場合と非リン酸化される場合とで異なる検出可能なシグナルを与える標識を有するように修飾されるNDPKを提供する。
修飾されたNDPKの標識は蛍光性基であってもよく、好ましくはIDCCである。標識は、典型的には酵素のアミノ酸残基に結合している。標識をシステイン残基に結合することが好ましい。
特に好ましい試薬は、Asp112→Cys突然変異を有し、この突然変異した残基にIDCC標識を有するM.xanthusのNDPKである。リン酸化酵素としてのこの試薬は、ATPよりもADPに約3オーダーの大きさでより感受性が高い。
また、本発明は、ヌクレオシドジホスフェートの結合に感受性がある少なくとも1つの検出可能な標識の結合によって修飾されるNDPKを提供する。
また、本発明は、そこに固定化されたこれらのNDPK試薬を有する支持体を提供する。これらはカラム又はビーズを含む。これは32P-リン酸化酵素と組み合わせて使用してもよく、固定化されたNDPKと共にインキュベートされるサンプル中のADPはATPへのその変換に放射標識される。従って、遊離溶液（free solution）中で放射能は最初のサンプル中のADPの量を示す。
また、本発明はこれらのNDPK試薬の産生方法を提供する。
さらに、本発明は、in vivo又はin vitro診断上の試薬としての使用のために、これらのNDPK試薬を提供する。
【００１４】
実施例
一般的な分子生物学的技法はSambrookら［２５］に従って行った。
NDPK の調製
M.XanthusのNDPKは、大腸菌においてクローン化され、発現されるndk遺伝子によってコードされる［２６］。タンパク質は16kDaサブユニットのホモテトラマーであり、特徴付けられており、結晶構造が決定されている［１６、２７］。野生型配列は任意のシステインを含んでいないため、遺伝子は、ホスホチオエートベース法［２８、アマシャムによるキットの形態で産生される］又はPCRベースクイックチェンジキット［ストラタジーン］を用いて大腸菌株TG1及びDH5αの部位特異的変異誘発によってシステイン残基を導入するために操作される。
アマシャムキットを用いて、M.xanthus由来のndk遺伝子を含むpJM5C2Aの0.8kb HindIII-EcoRIフラグメント［２９］をM13mp19と結合し、得られた組換えクローンを使用して、変異原性のために一本鎖DNAテンプレートを提供した。クローン化のために、突然変異させたndk遺伝子をpJM5C2Aにもどってクローン化した（cloned back into）。別のものとして、M13ndk構築物の0.7kb BstXI-EcoRI フラグメントをインビトロゲン（商標）pRSetA発現ベクターの修飾された形態に結合し、NDPKのN末端と融合したヒスチジンタグのための配列のそのコード化は除去されていた。これはプラスミドの3.5kb pRSndkX系列を生じ、ここで最後の“X”は一連のndk突然変異の数である。
また、pRSndkはクイックチェンジ法のテンプレートとして使用した。
【００１５】
D112C（すなわちAsp-112をCysに突然変異した）及びD62Cを含むシステイン残基を含む種々のミュータントタンパク質を調製した。突然変異のための位置は、典型的には結晶構造中に見られるヌクレオチド結合間隙の近接部に基づいて選択された［１６］。ミュータントD112C遺伝子をプラスミドpRSndk4で産生し、また発現のためにそれを使用した。最もよい結果について、新たにトランスフォームした細胞をスターター培養のために使用した。200μlカルシウムコンピテントBL21細胞［Novagen］を2ngのpRSndk4プラスミドDNAにより、30分間氷上でインキュベートした。次いで、この混合物の半分を0.1mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレートにまき、37℃で一晩インキュベートした。プレートは、典型的には50から100の群体を含んだ。0.1mg/mlのアンピシリンを含む100mlのLB培地にプレートから2から3の群体を接種し、37℃で9時間増殖して、ユニット細胞は定常期に入った。主培養のために、8×500mlのLB＋アンピシリンを10mlの開始培養に接種し、37℃で6時間インキュベートし、その時間後細胞は、典型的には0.38のOD595に達した。この時点で、0.5mg/mlのIPTGを各フラスコに添加し、細胞を更に16時間増殖した。細胞をベックマンL2遠心機で、3800rpmで、20℃で20分間遠心分離することにより回収した。ペレットを100mlの緩衝液Ａ（20mMのトリス-HCl, pH 8.2, 1mM EDTA）に再懸濁し、−80℃で貯蔵した。
約35mlの凍結した細胞懸濁液をゆっくり解凍し、次いで超音波処理することによって溶解した。その上澄み（すなわち粗製抽出物）を保持した。発現レベルをSDS-PAGEにより決定した。NDPKD112Cは50％よりも多いサイトゾルタンパク質を産生した。
NDPK精製は2つのカラムクロマトグラフィーの工程を含む。最初にpH及び緩衝液Ａ＋10mMのDTTを用いたイオン強度の調整した後、粗製抽出物（約200ml）を120mlのQ-セファロースイオン交換カラムに4℃及び2.0ml/minの流速で入れた。カラムを1体積の緩衝液で洗浄し、1ml/minの流速で0から0.3MのNaClの連続線形勾配（500ml）で溶出した。NDPKのバルク（約80％）はこれらの条件下で樹脂に結合しない。
【００１６】
Amicon YM10限外濾過膜を用いた濃縮後、溶出物を緩衝液ＡのG-100セファロースゲル濾過カラムに入れた。1.0ml/minの流速で、溶出プロファイルは2つのピークを示した。第1はDNAを含み、第二はタンパク質を含んでいた。NDPKを含む画分を貯蔵し、前と同様に濃縮した。
同様の配列を有し、テトラマーでもある大腸菌NDPKによる混入のないことが確認された［３０］。質量分析データは、精製したタンパク質がミュータントタンパク質−N末端メチオシンの計算したMWと適合するMW 15993±1Daを有する単一種であることを示し、大腸菌内で発現した場合、それが欠落していることが示された［１６］。4リットルの培養からの純粋なNDPKD112Cの収量は約300mgであった。
【００１７】
NDPK の蛍光性標識
NDPKD112Cを50mMのトリス/HCl（pH 8.1）中で2.5倍過剰量のIDCC（図１）で、1時間37℃でインキュベートした。典型的な実験において、標識溶液の体積は3mlであり、NDPKD112Cの濃度は150μMであった。インキュベーション後、この溶液を0.2μMのAcrodiscフィルター（Gelman）により濾過し、緩衝液Ｂ（10mMのトリス-HCl, pH 8.0, 1mMのEDTA）で平衡にしたPD10脱塩カラム（ファルマシア）に入れた。標識したタンパク質を含む溶出物（約6ml）をすぐに緩衝液Ｂで平衡にした25mlのQ-セファロースカラムに入れ、次いで0から0.1Mの20mlのNaClの線形勾配にした。勾配を適用した後標識したタンパク質を完全に溶出し、標識していないタンパク質と同様の方法で濃縮した。タンパク質の濃度は、フルオロフォアの吸光度スペクトルは不変であると仮定して（ε430nm 46800M-1cm-1）、吸光度分光法を用いて測定した。この濃度の値は、ウシ血清アルブミン検量線を用いる比色アッセイによって測定されたものと一致する。276nmのIDCCの吸光度（ジチオスレイトール付加物中に430nMで0.198の吸光度）で補正した後、NDPKのモル吸光係数はε276nm 7600M-1cm-1と計算された。
【００１８】
標識及び精製後の収率は典型的には65％であった。この高い収率は、Cys-112のチオール基が容易に利用できることを示している。質量分析は、1つの分子IDCCがタンパク質分子毎に組み込まれ、二番目の部位の標識を示さないことを明らかにし、質量はIDCC-NDPKで予想されるものであった。
突然変異及び標識化はオリゴマー形成に作用しないことを確認して、複合体のMWを沈降平衡遠心分離によって測定した。結果は、IDCC-NDPKがMW 62.7kDa（質量分析データからテトラマーについて計算されるよりも4％低い）のテトラマーであることを示す。
新しいミュータント／フルオロフォアの組み合わせの蛍光特性の素早い分析が要求される場合、標識化は、典型的には100から200μlのNDPK濃度を用いて、限外濾過及びQ-セファロース工程を避けて、より小さいスケールで行った。
試験したその他のチオール反応性環境感受性蛍光標識は、MDCC（N-[2-(1-マレイミジル)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）を含んでいた［２１］。
【００１９】
リン酸化
IDCC-NPDKを典型的には5倍過剰であるが1mM以下のATPと共にインキュベートした。インキュベーションは30から45分間37℃で10mMのトリス/HCl, pH 8.0, 1mMのEDTA又は10mMのPIPES, pH 7.0, 1mMのEDTA中であった。タンパク質を同じ緩衝液で平衡化したPD10カラムを用いて分離した。典型的には溶出したタンパク質の90％より多くがリン酸化酵素であった。溶液は、直ぐに又は48時間まで氷上で貯蔵した後使用した。必要な場合、溶液はマイクロ遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。
【００２０】
蛍光特性
リン酸化酵素（IDCC-NDPK〜P）の分光学的特性を非リン酸化形態の酵素と比較した。データはキセノンランプ及び2.5又は5nmに設定したモノクロメータースリット幅を有するPerkin-Elmer LS50B発光分光器で記録した。IDCC-NDPKの蛍光は50μMのADPの存在下よりも50μMのATPの存在下で4倍大きかった（図２Ａ）。同様の結果は100μMのGDP/GTPで得られた（図２Ｂ）。両方の場合に、スペクトルは20mMのPIPES, pH 7.2, 2mMのMgCl2中に2μMのタンパク質を含む200μlの溶液から20℃で記録した。励起は441nm、スリット幅5nmで行った。小さなの体積変化（1％）のための補正は行わなかった。これらの結果は、IDCC-NDPK〜Pが非リン酸化形態と比較して強い蛍光を有することを示す。
【００２１】
ADPを有する2μMのIDCC-NDPK〜Pの溶液の滴定は蛍光シグナルの大きな減少を示したが（図３Ａ）、ATPでは同じ濃度範囲（＜100μM）で変化はなかった。同様のデータをGDP/GTPで得た（図３Ｂ）。ADP/ATPアッセイは10mMのトリス/HCl, pH 8.0, 5mMのMgCl2中で、21℃で行った。励起は432nm（5nmのスリット幅）であり、発光は478nm（2.5nmのスリット幅）で記録した。GDP/GTPアッセイは20mMのPIPES, pH 7.0, 2mMのMgCl2中で、20℃で行った。励起は441nm（5nmのスリット幅）であり、発光は475nm（5nmのスリット幅）で記録した。両方の場合に、データは小さな体積増加のために補正した。図３ＢにおいてGTPの最初の添加での小さな減少は希釈した200μMの保存液におけるGTPの部分的な加水分解によるものであり、その後のGTP添加は2mMの保存液からであった。
【００２２】
非リン酸化酵素のデータと共に（図４Ａ及び４Ｂ）、これはほとんどの蛍光変化が酵素のリン酸化／脱リン酸化によるためであるということを示唆する。
50μMを超えるADPの増加は小さな蛍光の増加を生じる。これは、標識化しない野生型酵素について示唆されるように［１８］、おそらくADPとNDPKとの非特異的な相互作用によるものである。蛍光シグナルの変化は少なくとも50％のタンパク質濃度まで［ADP］に対して線形である。
蛍光測定から定量的データを導くために、図５に示される較正曲線をプロットした。較正したデータは10μMのIDCC-NDPK〜Pと0、2.5、5.0、7.5又は10.0μMのADPを含む50μMのATPとを混合することによってストップフロー実験で得た（10mMのPIPES緩衝剤, pH 7.0, 1mMのMgCl2, 20℃）。蛍光変化の大きさ（ΔF）は各濃度で2つの実験を平均し、ADP濃度に対してプロットした。
IDCC-NDPKとIDCC-NDPK〜Pとの間のフルオロフォアの吸収最大で6nmのシフトがあるが、発光最大では2nmのみである。標識した酵素の2つの形態について蛍光量子収量はエタノール中のクマリン314について既知の値0.83［３１］をリファレンスとして用いて測定した。リン酸化した酵素（0.22）から非リン酸化の酵素（0.054）まで行った量子収量は4倍減少し、発光強度の観測された変化によく一致したが（図２）、リン酸化酵素の量子収量は緩衝剤中のクマリン314（0.52）よりもまだ明らかに低かった。
【００２３】
過渡的動力学
3つの異なる過渡的動力学測定はストップフロー装置で行った。
第一に、IDCC-NDPK〜Pの脱リン酸化速度をADP濃度の範囲で測定した。図６Ａは20mMのPIPES, pH 7.0, 2mMのMgCl2中に1μMのタンパク質を有する50μMのADP（a）及び250μMのADP（b）の混合についての発光データを示す。観測された速度定数（a: 11.1±0.01s-1; b: 57.2±0.07s-1）は、ADP濃度の増加に比例して線形に増加し、二次速度定数は線形フィットの傾きから計算され、0.21×106M-1s-1を得た（図６Ｃ）。
第二の実験において、リン酸化酵素産生速度はIDCC-NDPK〜P酵素とATPとを混合することによって測定した（図６Ｂ）。再度、ATP増加により速度は線形増加し（50μMのATPで5.57±0.01s-1; 250μMのATPで18.4±0.03s-1）、導出される二次速度定数は0.072×106M-1s-1であった（図６Ｃ）。
第三の実験において、脱リン酸化速度は種々の濃度のATPの存在下で測定した。観測された速度はその非存在下よりもATPの存在下でより大きかったが、強度変化はより小さかった。図６Ｃの断続線（■）の傾きから、二次速度定数はATPの存在下で0.135×106M-1s-1と計算される。ATPによって生じる速度の増加は酵素の平衡状態を考慮することによって以下のように表される。
この速度促進は、筋繊維において、例えばATPレベルが通常少なくとも1mMである場合、有利である。リン酸化酵素の脱リン酸化は、たとえ初期に低いADP濃度であっても非常に早い必要がある。
【００２４】
単一の筋繊維における測定
実験はCa2+の存在下で単一のウサギの腰筋繊維で、以下の変更を伴って本質的に参考文献３２に記載される通りに行った。バックグラウンドADPを除去するために8U/mlのアピラーゼを含む硬直溶液（rigor solution）に10分間の繊維のインキュベーションは380μMのIDCC-NDPK〜P及び5mMのNPEケージ化ATP（ATPのP3-1-(2-ニトロフェニル)エチルエステル）を含む添加液における10分間のインキュベーションを伴った。繊維をシリコーンオイルに移し、ATP（約1mM）をゼロ時間でレーザーフラッシュ光分解（347nm）によって放出した。実験の際の温度は18℃であり、水溶液はpH 7.1及びpCa 4.5であった。蛍光励起は425nmであり、発光はロングパスフィルター（450から650nm）を通して検出した。
時間ゼロの後、蛍光トレース（図７の底の曲線）は3つの部分からなり、第1はフラッシュアーチファクト、次いで最初のATPアーゼサイクルがADPに関して生じる時間の遅れ、最後にIDCC-NDPK〜PとADPとの反応を表す蛍光が緩やかに減衰する相。この曲線の初期の傾きは、11s-1のアクトミオシンからのADP放出速度を与える。
ミオシンATPアーゼとは無関係にADP産生を測定するためのNPEケージ化ADPを用いる筋繊維の同様の実験は、（i）リン酸化酵素が、筋繊維内にある場合ADPについてその感受性及び反応性を維持することができ、（ii）シグナルがミオシンATPアーゼから放出されるADPを検出可能であり、（iii）筋繊維が期待される様式で発達中の張力（developing tension）であることを示す。
【００２５】
ヒトの Rho タンパク質由来のヌクレオチド交換
小さなGタンパク質、rho（GTPアーゼ活性をも有する）由来のヌクレオチド交換の速度は溶液中で測定した。また、加水分解の速度は間接的に得た。
ヒトのrhoタンパク質は密接に接合したGDPを含む形態で調製した。過剰に加えたGTPの存在下で、ヌクレオチド交換は、本発明に従って測定される場合、GDPが遊離溶液（free solution）に放出されるように生じる。一度GTPがrhoと結合すると、その加水分解はタンパク質によって定常状態の速度でゆっくり触媒される。これはより多くのGDPを産生し、それが一度放出されれば測定される。
蛍光発光は20mMのトリス/HCl, pH 7.6, 1mMのMgCl2, 100mMの(NH4)2SO4, 10μMのGTP及び2μMのIDCC-NDPK〜Pを含む200μlの溶液で記録した。反応は2μMのRho.GDPを添加することによってt=0で開始した。励起は475nmに設定した発光モノクロメーターにより440nmであった。温度は30℃であった。データは異なるGTP/GDP比によるIDCC-NDPK〜Pの滴定から得られる1μMのGDPについて蛍光変化を用いて規格化した。データ（図８）は対数期で0.196min-1の速度定数及び線形期で41.2nM GDP min-1の傾き（[Rho]による分割後、3.43×10-4s-1）を有するシングル指数関数＋一次関数にフィットさせた。指数関数“バースト”はrhoに結合したGDPとGTPとの交換を表す。線形期は定常状態を表し、さらにrho上へのGTPの交換はGDPへの加水分解によって制限される。
また、速度は‘標準’方法によっても測定し、同様の結果を得た。
本発明は上記で実施例のみによって記載され、改良は本発明の範囲及び意図に含まれる限りにおいて行ってもよいことは理解されるであろう。
【００２６】
参考文献（その内容は全体として本明細書に組み込まれるものとする）
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【図面の簡単な説明】
【図１】 好ましい蛍光性標識、IDCCの構造を示す。
【図２】 （Ａ）ADP/ATP及び（Ｂ）GDP/GTPの存在下でIDCC-NDPKの発光スペクトルを示す。
【図３】 ADP/GDP（白抜き記号○及び□）及びATP/GTP（黒塗り記号●及び■）によるIDCC標識リン酸化酵素の滴定を示す。
【図４】 非リン酸化酵素を用いた同じ実験を示す。
【図５】 蛍光変化がADP濃度に対してどのように変化するかを示す、ストップフロー実験で得られる較正曲線を示す。
【図６】 ストップフロー蛍光を用いて得られた過渡的動力学的データを示す。破線はシングル指数関数のベストフィットを表す。６Ａ及び６ＢはADP及びATPで得られたデータを示す。６ＣはADP（○）又はATP（●）濃度に対して得られた速度定数のプロットを示す。実線は導出した二次速度定数を有する一次方程式のベストフィットを示す。破線及び四角（■）は、ADP滴定が1mMのATPの存在下で繰り返された場合に得られた観測された速度定数を示す。
【図７】 筋肉張力の増加及びIDCC-NDPK〜Pの脱リン酸化のための蛍光の付随的な減少を示す、シングルラビット腰筋筋繊維（single rabbit psoas muscle fibre）（除膜した）から得られるプロットを示す。
【図８】 溶液中へのGDPの放出を示す、ヒトのロータンパク質（rho protein）を用いて得られたプロットを示す。データは、実線で示されるようにシングル指数関数＋一次方程式にフィットさせた。
Claims (8)
- サンプル中のヌクレオシドジホスフェートの存在を検出する方法であって、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（NDPK）のリン酸化酵素形態の脱リン酸化を、該リン酸化酵素がそのリン酸基のヌクレオシドジホスフェートへの移動によって脱リン酸化される際に起こる、そのリン酸化形態と脱リン酸化形態とで異なるNDPKの特性の変化を検出することによって検出する工程を含み、前記NDPKがAsp112→Cys突然変異を有しこの突然変異した残基にIDCC（N-[2-(ヨードアセトアミド)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）標識を有するMyxococcus xanthusのNDPKである、前記検出方法。
- サンプル中のヌクレオシドトリホスフェートの存在を検出する方法であって、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（NDPK）のリン酸化酵素形態へのリン酸化を、該リン酸化酵素がヌクレオシドトリホスフェートのγ-リン酸基の該酵素への移動によって形成される際に起こる、そのリン酸化形態と脱リン酸化形態とで異なるNDPKの特性の変化を検出することによって検出する工程を含み、前記NDPKがAsp112→Cys突然変異を有しこの突然変異した残基にIDCC（N-[2-(ヨードアセトアミド)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）標識を有するMyxococcus xanthusのNDPKである、前記検出方法。
- ヌクレオシドジホスフェートがADP又はGDPである請求項１記載の方法。
- ヌクレオシドトリホスフェートがATP又はGTPである請求項２記載の方法。
- 定量的方法である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- Asp112→Cys突然変異を有し、この突然変異した残基にIDCC（N-[2-(ヨードアセトアミド)エチル]-7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボキサミド）標識を有するMyxococcus xanthusのNDPK。
- 請求項６記載のNDPKが固定化された支持体。
- in vivo又はin vitro診断試薬として使用するための請求項６記載のNDPK。
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