JP4331601B2 - 分析物を分離及び測定する方法及び装置 - Google Patents

Description

この発明は一般に、分析物の分離に関する。

「分離する」又は「分離」との用語は一般的に、分析物を分離する、またあるいは分析物を含むあらゆる液体の中又は該液体と接触しているあらゆる固体支持体の中で前記分析物を濃縮又は凝縮させる、あらゆる技術を意味する。しかしながら当該用語はまた、できる限り前の定義と連係して、分析物を検出及び／又は定量化するという意味で、分析物を含む液体培地から分析物を測定するあらゆる技術をも意味する。

「分析物」とは、分離すべきあらゆる存在、特に化学的、生化学的、又は生物学的な存在を意味する。この発明で以下で考慮される分析物のうち、細胞、細胞器官、ウイルス及びバクテリア、抗体、抗体断片（antibody fragment）、抗原、付着体、レクチン、糖、核酸、タンパク質、特にＡ又はＧ、ホルモン、ホルモン受容体、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン（streptavidin）について言及され、一般には、測定すべき、つまり検出及び／又は定量化すべきあらゆる天然の又は合成の分子、又は高分子、又は類似のものについて言及される。

より詳細には、この発明は、初期液体サンプルがタンパク質又は核酸のような生物学的高分子型の分析物である又は生物学的高分子型の分析物を含む、生物学的分析物、特に分子分析物に関して紹介されかつ論ぜられる。

ＥＬＩＳＡと称されるような様々な不均一型の生物学的分析形態は、いわゆる培養段階を含み、培養段階の間、初期サンプルから得られた分析物が分配されている中間液体培地は、反応表面、すなわち基板から得られた表面と、該表面に分配及び固定された特定の分析物結合試薬と、に接触するようになる。

分析物を捕らえることが目的であるそのような段階の成果は、特殊性、感度、正確さ、又は速度の点で、採用する分析方法の成果を決定づける。

同様にこの実施は、分子生物学の分野で現在使用されている分析方法（例えば核酸分析）及び免疫アッセイの限界をはっきりと理解するために試験されるべきある数の要因に依存する。

一つの要因は、液体培地内に分配されたあらゆる分析物に対して活性表面を実際に暴露することに関する。特に、独力での（熱しょう乱による）分子拡散は、分析分子が数百ミクロンよりも長い距離だけ表面から隔てられているので、分析分子を反応表面に運ぶのに不十分である。簡単な拡散が用いられる場合には、限られた量の分析物のみが反応表面に結果として到達する。

一般の分子拡散の限界を克服するために、様々な溶液が提案されてきた：
ａ）反応表面と接触している液体培地を攪拌することが提案されてきた。そのような溶液は、要素体積がウェル当たり２００μｌより多くはないであろう３８４又はそれ以上のウェルを有するマイクロタイトレーションプレート（microtitration plate）のウェルのときには、液体培地の体積が比較的小さいか又はウェルが深すぎる場合にもはや機能しない。
ｂ）反応表面と接触した液体培地の流れ、一般には層流を生成することも提案されてきた。この溶液は、機械的ポンプを使用する必要及び比較的大きな体積を動かす必要があり、このことにより反応表面と分析物との間の特定の結合の速度が減少する。
ｃ）分離された状態の中間試薬、例えば磁性支持体と該支持体に結合された分析物捕獲剤とを含む磁性粒子を使用すると同時に、液体培地の量を減少させることも提案されてきた。この中間試薬は、分析物を捕らえ、続いて、磁場を用いて閉じ込めることができる。この閉じ込めは、分析物を取ることなく、過剰な液体培地を除去することを可能にする。例えば熱を用いて中間試薬と分析物との間の結合を切ることによって、分析物は次いで、ずっと小さな体積の液体培地に解放される。

この溶液は、余分な試薬及びいくつかの付加的な処理段階を要求するという欠点を有する。

ｄ）粒子の形態に分割されかつ特定の分析物結合試薬を用いて機能的なものにされた磁性支持体を用いて、液体培地の内部で反応表面を分割しかつ分配することも提案されてきた。これらの粒子は５０ｎｍから数ミクロンの間のサイズを有する。ひとたび分析物と反応すれば、これら粒子は続いて以前のように磁気閉じ込めによって分割され得る。

特定の結合試薬は至る所又はほとんどに存在するので、この溶液は、必要な分析物捕獲領域を増加させるという利点を有する。しかしながら、問題は、試験を実施する間に分析物が検出試薬を用いて解放されているときに起こる。この検出試薬はまた、分析物が存在するか否かにかかわらず、小さいがゼロではないレベルで反応領域に固定されるようになる。分析物に特に結合していない、反応領域に比例した検出分析物の量は暗騒音を生成し、これにより培養段階の感度及びしたがって分析方法の感度が減少する。

他の要因は、分析物との接触がもたらされた（特定の結合試薬を用いて機能的なものとされていないので）非反応である表面のサイズに正確に関係する。これらの表面は一般にいくつかの分析物を、例えば吸収によって保持し、もちろんこれにより、適切な反応表面によって実際に捕らえられる分析物の量が減少し、したがって培養段階、及びしたがって分析方法の感度が制限される。

したがって、適切な反応表面以外に、液体培地と接触している表面のサイズを制限することが有益である。

この発明は、反応表面に接触している分析物を運ぶときの運動を加速する方法に関する。

本発明に係る溶液は、少なくとも以下の段階を含む方法、特に培養のための方法を与えることによって、従来の分析方法、特に生物学的分析方法を捨てる：
１）前記段階の間、前記初期サンプルのいくつか又は全てから得られた前記分析物が分配されたいわゆる内部液体培地のみからなる、基準軸線について対称な形状を有する反応容積単位を形成及び／又は維持する段階であって、前記反応単位は、前記内部培地と異なる任意に限られた外部培地との界面と、該外部培地に対する表面張力と、を有し、前記界面は、前記基準軸線の周りに閉じた展開表面を有する、反応容積単位を形成及び／又は維持する段階、
２）高温領域及び低温領域が形成され、前記基準軸線と平行に前記界面の表面張力に変化が誘起され、かつ前記内部培地が強制微小対流の閉じた経路に沿って動くように、前記基準軸線に沿って前記反応単位を通じて温度勾配を生成する段階であって、前記低温領域から前記高温領域への軸流前方循環と前記高温領域から前記低温領域への周辺戻り循環とを備えた、温度勾配を生成する段階、
３）前記内部培地の強制微小対流経路に反応単位の内部培地と接触した反応表面を配置する段階。

本発明によれば、液体培地の内部に事実上使われなくなった体積がなくなり、内部培地を構成するほとんど全ての液体は、活性表面と接触するようになる。

したがって本発明に係る溶液は、分析物を測定する方法の感度を直接増加させること、したがって核酸型の分析物を含む増幅のような技術の効率をさらに改善することを可能にする。

特定の結合試薬は好ましくはリガンド（ligand）である。

「リガンド」とは、物理的な結合によって分析物との複合体（complex）を形成することのできる構成要素を意味する。

リガンドの例としては、抗体、抗体断片、抗原、付着体、レクチン、糖、核酸、タンパク質、特にＡ又はＧ、ホルモン、ホルモン受容体、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、及び天然又は合成のリガンド全般、及びリガンドとは競合するかも知れない修飾リガンド類（modified ligand analog）を挙げることができる。

上で定義されたようないずれのリガンドも、吸着、共有結合、キレート化、分子識別のようなある手段によって支持体に固定され、独力で又は他のリガンドと共役して分析物を保持することができる。

「支持体」とは、あらゆる種類の高分子支持体、無機支持体、又は金属支持体を意味する。言及され得る高分子支持体の例は、個々に又は共重合体の形態での、ポリスチレン、ポリ（メチル）アクリレート（poly(meth)acrylate）、ポリブタジエン、ポリプロピレン、又は同様のものをベースとしたプラスチック支持体である。言及され得る無機支持体の例は、シリコン酸化物、シリコン、雲母、ガラス、石英、酸化チタン、酸化バナジウムである。言及され得る金属支持体の例は、金、銀である。

支持体上のリガンドの固定は、自然の又は変更された支持体への簡単な吸着によって、又は支持体の表面を変更するための、したがって共有結合、又は当業者に良く知られた他の従来の手段によって受容体を固定することを可能とするための化学的機能化又は物理的反応によって、実施することができる。

以下の記述において、「粒子」とは、リガンドが接合され得る高分子支持体、無機支持体、又は金属支持体のあらゆる粒子を意味する。特に、例えば磁気的又は電気的な外部の物理的手段の作用によって、又は重力の影響の下で、又は遠心機にかけることによって、分離され得る粒子は、この発明の範囲内に属するものとみなされる。前の記述は、小さなサイズの粒子、特に超常磁性粒子を含み、重力の影響の下での該粒子の沈降速度は、熱攪拌よりも小さいが、粒子は、これら粒子を一緒に接合するか、又はあらゆる物理的手段によって分離可能なより大きなサイズの粒子に集合させるあらゆる方法によって、集合体を形成し得る。

言及され得る高分子粒子の例は、ラテックスのような乳化重合によって得られた粒子、又は磁性又は非磁性どちらかのより大きなサイズの粒子である。

言及され得る金属粒子の例は、任意に天然の又は合成のポリマーで覆われた、コロイド性の金、強磁性粒子、フェリ磁性粒子、常磁性粒子、超常磁性粒子であり、これら粒子の組成は、鉄、又はコバルト、ニッケルのような他の金属を、個別に、又は磁性又は非磁性どちらかの合金の形態で含む。

言及され得る無機粒子の例は、磁性又は非磁性どちらかの、シリカ又はケイ素をベースにした粒子である。

「測定」とは、反応表面に結合された分析物の存在を実証するための、及び／又は分析物を定量化するためのあらゆる方法を意味する。

言及され得る測定方法の例は、例えば標識の助け、特に蛍光性を用いたあらゆる従来の方法と、一般にここでは言及されていない同等の技術全て、例えば比色方法、酵素的方法、又は時間生成（chronogenic）方法と、である。

この発明は、以下添付の図面を参照して説明される：
−図１は、拡大された縮尺でこの発明に係る装置を概略的に示し；図２及び図３はそれぞれ、図１の装置のＩＩ−ＩＩ線視及びＩＩＩ−ＩＩＩ線視断面図を示し；本発明に係る方法とその原理とは、これら図１〜３を基にして説明され、
−一方で図２及び図４、他方で図５及び図６はそれぞれ、本発明にかかる装置の２つの他の実施例を概略的に示し；図６によって表現された又は図式化された詳細は、この発明においてここで考慮されるような、分析物捕獲剤と結合された粒子又は微小粒子を示し、
−図７〜１１はそれぞれ、本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示し、
−図１２は、本発明に係る装置の他の代替実施例を同様に概略的に、側面から及び部分的に断面で示し；図１３は、図１２に示された装置のＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ線視断面図であり、
−図１４は、この発明の他の代替実施例を概略的に示し、
−図１５は、図１〜１４に係る微小分析装置のいずれか一つを用いて使用されるような、本発明に係る方法の妥当性を実証することを可能とする実験装置を概略的に示す。

図１を参照すると、本発明に係る装置は、
ａ）少なくとも一つの基準軸線（３）について対称な形状を有する反応容積単位（２）、例えば一滴を形成及び／又は維持する手段（１３）であって、前記一滴は、分析物が（溶液及び／又は懸濁液中に）分配された以下で内部培地（４）と称される液体培地のみからなり、前記反応単位は、前記内部培地と異なる外部培地（６）との全体が凸状のプロファイルの界面（５）を有し、その結果、内部培地（４）及び外部培地（６）はこれら培地の間に表面張力を有し；かつ界面（５）は、前記基準軸線（３）の周りに閉じた展開表面（closed developed surface）を有する、反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）と、
ｂ）前記反応単位（２）を通じて温度勾配（６６）が前記基準軸線（３）に揃えられ、かつ前記基準軸線（３）の両側にいわゆる高温領域（７）といわゆる低温領域（８）とが形成されるように、前記反応単位（２）を形成する手段（１３）と関連して配置された、温度差を与える手段（１４，１５）であって、前記温度勾配は、前記基準軸線（３）と平行に前記界面（５）の表面張力に変化を誘起し、前記内部培地（４）を強制微小対流の閉じた経路（１２）に沿って動かし、前記低温領域（８）から前記高温領域（７）への軸流前方循環（１２ａ）と前記高温領域（７）から前記低温領域（８）への周辺戻り循環（１２ｂ）とを備えた、温度差を与える手段（１４，１５）と、
ｃ）前記分析物（１）と特別に結合する試薬（１１）が固定された基板（１０）から得られる反応表面（９）であって、前記結合試薬は前記基板に（共有化学結合及び／又は吸着によって）分配かつ固定され；前記反応表面（９）は、前記内部培地（４）の強制微小対流経路（１２）内の前記内部培地（４）と接触して配置されるように、前記反応単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）と関連して配置されている；反応表面（９）と、
を備える。

前記反応単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）は、開口自由端部（１６ａ）が前記反応単位（２）、すなわち一滴の内部培地（４）を形成及び懸架するよう構成されたチューブ（１６）、例えばキャピラリチューブを備える。前記チューブ（１６）の内側には、親水性材料層（１７）が並べられ、該内側は、長さ又は高さが前記自由端部（１６ａ）に制限されており、疎水性材料層が前記チューブ（１６）の内部表面の残部に沿って任意に並べられている。

前記温度勾配（６６）を生成する手段は、前記反応単位の内部培地（４）と熱を交換する加熱手段（１４）を前記高温領域（７）と同じ側に、前記内部培地（４）から熱を抽出する冷却手段（１５）を前記低温領域（８）と同じ側に備える。

例として、あらゆる限定を意味することなく、前記加熱手段１４及び／又は前記冷却手段１５は、基準軸線３と同軸に配置されかつ自由端部で反応単位２の内部培地４に浸漬された金属要素１８を含み、該金属要素の自由端部は先端を細くされかつ斜角をつけられている。この金属要素は、他端部で加熱源１９又は適切に冷却源２０に熱的に接続されている。これら源のそれぞれは、サーモスタットで調節された液体浴、又はペルチェ効果熱モジュール（PELTIER-effect thermal module）からなってもよい。

例として、前記加熱手段１４又は前記冷却手段１５は、外部培地からなり；あるいは、前記加熱手段１４及び／又は前記冷却手段１５は、一つ又は複数の金属要素１８からなる。

述べられていないが、本発明に係る装置は、外部培地６を閉じ込めるためのエンクロージャ、例えば水蒸気で飽和した周囲の空気を含む。

上述の装置は、分析物を含む初期サンプルから分析物１を分離するあらゆる方法を実施することを可能にするか、又は該方法に統合され得る。この装置は、時間論理順序（chronological order）が絶対的な以下の段階を含む方法を実施することを可能にする。

ａ）−少なくとも一つの基準軸線３について対称な形状を有する反応容積単位２を形成及び／又は維持する段階であって、この単位は、初期サンプルのいくつか又は全てから得られた分析物１が分配された液体培地、すなわち内部培地４のみからなり；上述したように、この反応単位２は、任意に閉じ込められた外部培地６との界面５を有し、この外部培地は、内部培地４とは異なり、したがって内部培地に対する表面張力を有し；図１に示すように、界面５は、前記基準軸線３の周りに凸状のプロファイルを有する閉じた展開表面（closed developed surface）を有する、反応容積単位２を形成及び／又は維持する段階。

ｂ）−反応単位２に高温領域７と低温領域８とを形成するように、温度差を与えることによって、反応単位２を通じて基準軸線３に沿った温度勾配６６を生成する段階であって；上述したように、基準軸線３に平行に界面５に沿って表面張力に変化を誘起し、かつ内部培地４を強制微小流体（forced microconvection）の閉じた経路（closed path）１２に沿って動かすのは、この温度勾配であり、低温領域８から高温領域７へ軸流前方循環（axial forward circulation）１２ａと、高温領域７から低温領域８へ周辺戻り循環（peripheral return circulation）１２ｂとを備える、温度勾配６６を生成する段階。

ｃ）−反応表面９を任意に提供するか又は与える段階であって、基板１０と、分析物１と特別に結合する試薬１１と、を備え、この結合試薬が、表面に分配されかつ固定される、反応表面９を任意に提供するか又は与える段階。

ｄ）−内部培地４の強制微小対流経路１２に反応表面９を配置する段階。

反応容積単位２は好ましくは、３００μｌにほぼ等しい容積を有し、好ましくは０．１と１００μｌとの間、例えば数十μｌである。一滴の容積に一致することから、５μｌの容積が用いられる。

外部培地６に対する内部培地４の表面張力は、少なくとも１０Ｎ／ｍに等しく、好ましくは１０^−２Ｎ／ｍと１Ｎ／ｍとの間である。

内部液体培地は好ましくは水を備え、例えば分析物１が懸濁及び／又は溶解された水溶液である。分析物が抗体又は抗原、又は塩基配列のような生物学的受容体型（biological ligand type）である場合には、例えば、内部液体培地は、塩、有機化合物等のような、水に加えて様々な成分又は試薬を有する緩衝剤である。この場合、外部培地６は好ましくは、水蒸気が充満した空気である。

図１に示すように、基準軸線３は垂直に配置されており、温度勾配６６は底から上向きに対応して配置され得る。

この温度勾配６６はしたがって、反応単位２の低温領域８内の内部培地４から熱を抽出し、かつ例えば上述の手段を用いてこの反応単位の高温領域７内の内部培地へ熱を供給することによって生成される。しかしながら、熱は、あらゆる他の手段によって高温領域７へ供給又は低温領域８から抽出することができ；例えば、熱は赤外ビーム又はレーザビームを用いて高温領域７を照射することによって供給することができる。

図１に示すように、温度勾配６６は、反応単位２の高温領域７内の熱を内部培地４に供給することによって生成され、この熱は例えば、内部培地４の少なくとも部分的に内側に配置された金蔵ロッド１８の形態の加熱要素との伝導交換によって、高温端部７と同一の側に供給される。

反応表面９は、高温領域７と低温領域８との間、例えば基準軸線３にできる限り近い位置で内部培地４内に完全に浸漬される。

反応表面９は好ましくは、基準軸線３のできる限り近くに配置される。これは、図１〜３を考慮することによって理解できるように、強制微小対流経路１２の全てが基準軸線３を通過するからである。

反応単位２の無欠性を維持するために、特に本方法を実施するのにかかる時間との寿命の適合性を与えるために、反応単位２の高温領域７における温度は、内部培地４の沸騰温度よりも低い値に維持され、この単位の低温領域８の温度は、前記内部培地４の凝固温度よりも高い値に維持される。

本発明によれば、内部培地４の強制微小対流の速度は、温度勾配６６の変化によって制御され、通常の値は例えば３０℃に等しい。

図４によれば、反応単位２を形成及び／又は維持する手段１３は、平面支持体上に反応単位を配置する手段を備え、該手段は、図９に示すように親水性基部４１、又は図８に示すように疎水性領域４４によって取り囲まれた、支持体４３の親水性領域４２からなることができる。

「親水性基部」とは、上部表面が親水性であるが、側端縁部は親水性でない基部を意味する。

図５によれば、反応単位２と接触している外部表面で限定されかつ取り囲まれた支持体は、分析物１と特別に結合する試薬１１に対して基板を形成する。冷却手段１５は支持体４３に例えば伝導によって熱的に接続されており、その結果、反応表面９に熱的に接続されて反応表面を冷却する。

図４によれば、概略的に示された分析物１は、重要な塩基配列からなる、例えばバクテリア又はウイルスのような病原剤に属するストランドである。

上述のように、加熱手段１４は、任意に伝導によって、反応表面９に熱的に接続され得る。

それ自体公知の方法で、図５及び図６に示すように、分析物１は粒子２５に結合されている。粒子は、支持体３２と、支持体３２に結合された、分析物１を捕らえるための試薬３３と、を備える。支持体３２と捕獲剤との間及び／又は捕獲剤と分析物との間の結合は、反応単位２の高温領域の温度で不安定であり、反応単位２の高温領域７の温度と低温領域８の温度との間にあるあらゆる温度で効果的である。分析物を測定する目的のために、これら粒子２５は、反応単位の内部培地に分配かつ懸濁される。

加熱手段１４に属する金属要素１８は、反応単位２の内部培地４の内側の永久的な又は一時的な磁場を生成するように磁化され、この磁場は反応表面９から空間的に離れたままである。

経路１２に沿った強制微小対流の影響は、一方で粒子の形態の中間反応物２５と、他方で加熱手段１４に組み込まれた磁場と、の前述の特性と連係して以下の通りである：
−粒子２５は内部培地の上向き軸線循環内の分析物を捕らえ、次いで加熱手段１４、例えばロッド１８の端部と接触して閉じ込められ、
−不安定な粒子２５は加熱手段と接触して解離し、解離された部分は、反応表面９と接触するまで内部培地の下向き周辺循環内に一緒に流入され、
−分析物１は、冷却された表面９と接触して特別に結合されるようになり、
−全般に、使われなくなった容積、すなわち強制微小対流による影響を受けない容積は実質的にないので、実質的に全ての分析物１が、反応表面９と接触して収集及び流入され、容積に収集される。

この点で、図５及び図６に対して言及される。

上で定義されたようないずれの粒子も、磁石のような磁気源によって捕らえられ得る磁性粒子とすることができる。そのような磁気源は、高温領域７を生成する手段と同じ高さに配置されるか、又は該手段に属する。

図７によれば、反応単位２を形成及び／又は維持する手段１３は、２つの垂直でかつまさに正反対の位置にある平行な枝２２によって吊り下げられたリング２１からなる。

図８によれば、この手段１３は、傾斜した溝付きの固体ロッド２３からなる。

図１１によれば、熱は、反応単位２から離れて配置されたヒートシンク３０との放射性交換及び／又は対流によって、冷却端部８と同じ側で抽出される。例えばこのヒートシンク３０は、平らなペルチェ効果モジュール（PELTIER-effect module）からなる。

図１２及び図１３によれば、外部培地６は液体流体相又は気体流体相である。この目的のために、反応容積単位２を閉じ込めるためのキャビティー２４ａが形成され、該キャビティーの基準軸線３が例えば水平に配置されたプラスチック材料のプレート２４が与えられる。この閉じ込めキャビティー２４ａは、平らな又は平面の形状を有し、したがって水平に配置されている。この閉じ込めキャビティー２４ａはさらに、カバーすなわちフィルム５０によって閉じられている。

図１２及び図１３に示された装置は、あらゆる適切な技術、例えばシリコンのようなあらゆる互換性のある基板にマイクロエッチングする技術によって得ることができる。

図１３に示すように、キャビティー２４ａは、あらゆる適切な形状を有し、内部培地４は、微小対流経路１２が、あらゆる物理的な制約なしに続けられるように円形又は楕円形の形状、好ましくは基準軸線３について対称な形状を有する。

外部培地６は、キャビティー２４ａの内部に閉じ込められる。外部培地は、捕捉空気、例えばキャビティー２４ａ及びフィルム５０の底部と平行な断面に、内部培地４と同じ高さに前記外部培地６との円形又は卵形の界面を生成することからなる。

図１４によれば、反応単位２を形成及び／又は維持する手段１３は、自由端部１６ａが加熱手段１４に含まれかつ統合された円錐チューブ１６からなり、金属チューブの場合には抵抗効果によって得られる。

この図１４によれば、可動性反応要素、例えばロッド４０は、チューブ１６の内側に配置され、自由端部で流体力学的な形状、例えば穿孔器形状を有する反応表面９を備える。この反応要素は、２つの位置、すなわち反応単位２の外側の不活性位置と、反応単位２を形成する内部培地４に反応表面９が浸漬されている活性位置との間で移動させることができる。

本方法が実施された後、反応表面９に結合された分析物１はもちろん、あらゆる適切な手段によって２つの異なる方法、すなわち、
−反応表面が、測定の間、内部培地４と接触したままであるか、又は
−反応表面が、測定の時に、内部培地４から離れて配置される、
方法で測定される。

上で説明された微小分析原理の妥当性は、次の実験計画に従って実証された：
次の組成を有するいわゆるＴｅＮａＣｌ緩衝剤からなる内部液体培地４が最初に与えられる：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ０．０５％，Ｔｒｉｓ １０ ｍＭ Ｐｈ８，ＥＤＴＡ，ＮａＣｌ １Ｍ，ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ０．０５％。

MOLECULAR PROBESから入手できるいわゆるＤＩＰＦ−８８３１蛍光微小ビーズ（DIPF-8831 fluorescent microbeads）は、この液体培地に分散及び懸濁される。これら微小ビーズの濃度は、μｌ当たり５００単位のオーダーである。

これら微小ビーズの密度は、内部培地４の密度に近い、１．０５ｇ／ｍｌのオーダーである。

図１によれば、端部に２ｍｍの内径を有する金属毛管１６が与えられ、該毛管の自由端部１６ａは傾斜されている。この自由端部には、内側でウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）からなる親水性コーティング１７が並んでいる。この自由端部は、図１４を参照して記述又は説明されたように、抵抗効果によって加熱される。

上で例示された、前述の微小ビーズが懸濁されたチューブ１６及び内部培地４を用いると、直径が１〜２．５ｍｍである一滴の形状を有する反応単位２が、自由端部１６ａに形成される。

熱は、図６に示すように、平らな冷却要素３０を与えることによって、すなわち単位２の低温端部８との放射性交換及び／又は対流によって抽出される。温度勾配６６を生成する温度差は好ましくは、１０℃と６５℃との間の値に調整される。

図１５に係る実験装置によって示されたように、反応単位２は、６３３ｎｍの波長を有するＨｅ−Ｎｅレーザビームを用いて照射されるが、前述の蛍光微小ビーズは、６２５ｎｍの波長で吸収し、６４５ｎｍで再放出する。レーザ照度は、反応単位２を通過する５０μｍと１００μｍとの間の厚さを有する極度に薄い平面２７の輪郭をはっきりさせるように平行にされる。この平面は、ＣＤＤカメラ２９を用いて観察され、このようにして獲得されるイメージは、あらゆる適切な装置２８によって処理される。

この実験装置を用いると、上述の定義に従って強制微小対流の存在が確立され、該対流の速度はおおよそ８０μｍ／ｓから１９０μｍ／ｓまで変化する。

一般に、上で記述及び実証された操作段階は、初期サンプルのいくつか又は全てと接触している反応表面９に分析物を含む初期液体サンプルから分析物１を分離する方法であって、
１）前記初期サンプルのいつくか又は全てに対応する内部液体培地４を含み、外部培地６との界面５を有しかつ該外部培地に対して表面張力を有する反応容積単位２を形成及び／又は維持する段階と、
２）前記単位２の
−周辺、及び／又は
−表面、及び／又は
−内側、
にある、温度及び位置の点でそれぞれ異なる少なくとも２つの温度地点間に温度差を与える段階と、
３）前記温度差によって生成された強制対流の経路に位置する前記反応表面９に前記分析物１を固定する段階と、
を実施することからなるあらゆる方法に対して一般化することができる。

この方法はさらに、次の段階１）〜３）によって特徴付けられる：
１）前記段階の間、前記初期サンプルのいくつか又は全てから得られた前記分析物１が分配されたいわゆる内部液体培地のみからなる、基準軸線３について対称な形状を有する反応容積単位２を形成及び／又は維持する段階であって、前記反応単位は、前記内部培地と異なる任意に限られた外部培地６との界面５と、該外部培地に対する表面張力と、を有し、前記界面は、前記基準軸線３の周りに閉じた展開表面を有する、反応容積単位２を形成及び／又は維持する段階、
２）高温領域７及び低温領域８が形成され、前記基準軸線３と平行に前記界面５の表面張力に変化が誘起され、かつ前記内部培地４が強制微小対流の閉じた経路１２に沿って動くように、前記基準軸線３に沿って前記反応単位２を通じて温度勾配６６を生成する段階であって、前記低温領域８から前記高温領域７への軸流前方循環１２ａと前記高温領域から前記低温領域への周辺戻り循環１２ｂとを備えた、温度勾配６６を生成する段階、
３）前記内部培地の強制微小対流経路１２に前記反応表面９を配置する段階。

反応表面９は、温度差６を生成する熱点とは独立した表面、又は領域７又は領域８に属する表面を備えてもよい。

本発明に係る方法とその原理が説明される、拡大された縮尺でこの発明に係る装置を示す概略図である。 本発明に係る方法とその原理が説明される、図１に係る装置のＩＩ−ＩＩ線視断面図である。 本発明に係る方法とその原理が説明される、図１に係る装置のＩＩＩ−ＩＩＩ線視断面図である。 本発明に係る装置の他の実施例を概略的に示した図である。 本発明に係る装置の他の実施例を概略的に示した図である。 本発明に係る装置の他の実施例を概略的に示した図であって、図によって表現された又は図式化された詳細は、この発明においてここで考慮されるような、分析物捕獲剤と結合された粒子又は微小粒子を示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を概略的かつ部分的に示す図である。 本発明に係る装置の他の代替実施例を同様に概略的に、側面から及び部分的に示す断面図である。 図１２に示された装置のＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ線視断面図である。 この発明の他の代替実施例を概略的に示す図である。 図１〜１４に係る微小分析装置のいずれか一つを用いて使用されるような、本発明に係る方法の妥当性を実証することを可能とする実験装置を概略的に示す図である。

符号の説明

１ 分析物
２ 反応容積単位
３ 基準軸線
４ 内部液体培地
５ 界面
６ 外部培地
７ 高温領域
８ 低温領域
９ 反応表面
１０ 基板
１２ 閉じた経路
１２ａ 軸流前方循環
１２ｂ 周辺戻り循環
１３ 反応容積単位を形成及び／又は維持する手段
１４，１５ 温度差を与える手段
１４ 加熱手段
１５ 冷却手段
１６ チューブ
１６ａ 開口自由端部
１７ 親水性材料層
１８ 加熱要素
１８ 金属要素
１９ 加熱源
２０ 冷却源
２１ リング
２３ 溝付傾斜固体ロッド
２４ 液体相
２４ａ キャビティー
３２ 支持体
３３ 捕獲剤
４０ ロッド
４１ ベース領域
４２ 親水性領域
４３ 支持体
４４ 疎水性領域
６６ 温度勾配

Claims (28)

1. 初期サンプルの一部又は全てと接触している反応表面（９）に分析物を含む初期サンプルから分析物（１）を分離する方法であって、
   １）前記初期サンプルの一部又は全てに対応する内部液体培地（４）を含み、外部培地（６）との界面（５）を有しかつ該外部培地に対して表面張力を有する反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する段階と、
   ２）前記単位（２）の
   −周辺、及び／又は
   −表面、及び／又は
   −内側、
   にある、温度及び位置の点でそれぞれ異なる少なくとも２つの温度地点間に温度差を与える段階と、
   ３）前記温度差によって生成された強制対流の経路に位置する前記反応表面（９）に前記分析物（１）を固定する段階と、
   を実施することを特徴とする方法。
2. 請求項１記載の方法において、
   １）前記段階の間、前記初期サンプルの一部又は全てから得られた前記分析物（１）が分配されたいわゆる内部液体培地のみからなる、基準軸線（３）について対称な形状を有する反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する段階であって、前記反応単位は、前記内部培地と異なる限られた外部培地（６）との界面（５）と、該外部培地に対する表面張力と、を有し、前記界面は、前記基準軸線（３）の周りに閉じた展開表面を有する、反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する段階と、
   ２）高温領域（７）及び低温領域（８）が形成され、前記基準軸線（３）と平行に前記界面（５）の表面張力に変化が誘起され、かつ前記内部培地（４）が強制微小対流の閉じた経路（１２）に沿って動くように、前記基準軸線（３）に沿って前記反応単位（２）を通じて温度勾配（６６）を生成する段階であって、前記低温領域（８）から前記高温領域（７）への軸流前方循環（１２ａ）と前記高温領域から前記低温領域への周辺戻り循環（１２ｂ）とを備えた、温度勾配（６６）を生成する段階と、
   ３）前記内部培地の強制微小対流経路（１２）に前記反応表面（９）を配置する段階と、
   を備えることを特徴とする方法。
3. 請求項２記載の方法において、
   前記反応表面（９）は、前記温度差（６）を生成する温度地点とは独立した表面、又は前記領域（７又は８）の一つに属する表面、を含むことを特徴とする方法。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の方法において、
   前記反応容積単位（２）は一滴であることを特徴とする方法。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の方法において、
   前記外部培地（６）は、水蒸気を含んだ空気であることを特徴とする方法。
6. 請求項２記載の方法において、
   前記基準軸線（３）は垂直に配置されていることを特徴とする方法。
7. 請求項６記載の方法において、
   前記温度勾配（６６）は、前記反応単位（２）の高温領域（７）内の内部培地（４）に熱を供給することによって生成され；
   該熱は、前記反応単位の高温領域（７）と同じ側で、前記内部培地（４）の少なくとも部分的に内側に配置された加熱要素（１８）との伝導交換によって供給される；
   ことを特徴とする方法。
8. 請求項２から７のいずれか一項に記載の方法において、
   前記反応表面（９）は、前記高温領域（７）と前記低温領域（８）との間の前記内部培地（４）に浸漬されることを特徴とする方法。
9. 請求項７又は８記載の方法において、
   前記分析物（１）は粒子に結合されており、
   第一に前記粒子は、支持体（３２）と、前記支持体（３２）に結合された、前記分析物（１）のための捕獲剤（３３）と、を備え、前記支持体と前記捕獲剤との間及び／又は前記捕獲剤と前記分析物との間の結合は、前記反応単位（２）の高温領域（７）の温度で不安定であり、かつ前記反応単位（２）の前記高温領域（７）の温度と前記低温領域（８）の温度との間にあるいずれの温度でも有効であり、
   第二に前記粒子は、前記反応単位（２）の内部培地（４）に分配されかつ懸濁されている、
   ことを特徴とする方法。
10. 請求項９記載の方法において、
    前記粒子は、磁石のような磁気源によって捕らえられ得る磁性粒子であることを特徴とする方法。
11. 請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法において、
    前記磁性粒子を捕らえ得る磁気源は、前記高温領域（７）を生成する手段と同じ高さに配置されるか又は前記高温領域（７）を生成する手段に属することを特徴とする方法。
12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法において、
    前記分析物（１）が前記反応表面（９）に固定された後、前記内部培地から離れて内部培地（４）と接触して、読み取り及び／又は検出の段階が実施されることを特徴とする方法。
13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法において、
    前記反応単位（２）の高温領域（７）の温度は、前記内部培地（４）の沸騰温度よりも低い値に維持され、
    前記単位の低温領域（８）の温度は、前記内部培地（４）の凝固温度よりも高い値に維持される、
    ことを特徴とする方法。
14. 請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法において、
    前記内部培地（４）の強制微小対流（１２）の速度は、前記高温領域（７）と低温領域（８）との間の温度差の変化によって制御されることを特徴とする方法。
15. 反応表面（９）上の分析物を、該分析物を含む初期液体サンプルから分離する装置であって、
    ａ）分析物（１）が分配されたいわゆる内部液体培地（４）のみからなる、少なくとも一つの基準軸線（３）について対称な形状を有する反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）であって、前記反応単位は、前記内部培地と異なる外部培地（６）との界面（５）と、前記内部培地に対する表面張力と、を有し、前記界面は、前記基準軸線（３）の周りに閉じた展開表面を有する、反応容積単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）と、
    ｂ）前記反応単位（２）を通じて温度勾配（６６）が前記基準軸線（３）に揃えられ、かつ前記基準軸線の両側に高温領域（７）及び低温領域（８）が形成されるように、前記基準軸線（３）と平行に前記界面（５）の表面張力に変化を誘起し、かつ前記内部培地（４）を強制微小対流の閉じた経路（１２）に沿って動かすために、前記反応単位（２）を形成する手段（１３）と関連して配置された、温度差を与える手段（１４，１５）であって、前記低温領域（８）から前記高温領域（７）への軸流前方循環（１２ａ）と前記高温領域から前記低温領域への周辺戻り循環（１２ｂ）とを備えた、温度差を与える手段（１４，１５）と、
    ｃ）前記分析物（１）と特別に結合する試薬（１４）が固定された基板（１０）から得られる反応表面（９）であって、前記結合試薬は前記基板に分配かつ固定され；前記反応表面（９）は、前記内部培地の強制微小対流経路（１２）内の前記内部培地（４）と接触して配置されるように、前記反応単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）と関連して配置されている；反応表面（９）と、
    を備えることを特徴とする装置。
16. 請求項１５記載の装置において、
    前記反応単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）は、開口自由端部（１６ａ）が前記反応単位（２）を形成及び懸架するよう構成されたチューブ（１６）と、リング（２１）と、溝付傾斜固体ロッド（２３）と、からなる群より選択された、前記反応単位を吊り下げる手段を備えることを特徴とする装置。
17. 請求項１６記載の装置において、
    前記チューブ（１６）の内側は、親水性材料層（１７）で覆われ、該親水性材料層（１７）で覆われた内側は、長さ又は高さが前記自由端部（１６ａ）までに制限されており、疎水性材料層が前記チューブ（１６）の内部表面の残部を覆っていることを特徴とする装置。
18. 請求項１５から１７のいずれか一項に記載の装置において、
    前記温度勾配（６６）を生成する手段は、前記反応単位の内部培地（４）と熱を交換する加熱手段（１４）を前記高温領域（７）と同じ側に、前記内部培地（４）を冷却する冷却手段（１５）を前記低温領域（８）と同じ側に備えることを特徴とする装置。
19. 請求項１８記載の装置において、
    前記加熱手段（１４）及び／又は前記冷却手段（１５）は、前記基準軸線（３）と同軸に配置され、一端部で前記反応単位（２）の内部培地（４）に浸漬され、かつ他端部で加熱源（１９）又は冷却源（２０）に熱的に接続された金属要素（１８）を備えることを特徴とする装置。
20. 請求項１５から１９のいずれか一項に記載の装置において、
    前記加熱手段（１４）又は前記冷却手段（１５）は、外部培地からなることを特徴とする装置。
21. 請求項１５から１９のいずれか一項に記載の装置において、
    前記加熱手段（１４）及び／又は前記冷却手段（１５）は、一つ又は複数の金属要素（１８）からなることを特徴とする装置。
22. 請求項１５から２１のいずれか一項に記載の装置において、
    前記反応表面（９）から空間的に離れて、前記反応単位（２）の内部培地（４）の内側に永久磁場又は一時磁場を生成するように、磁化要素が存在することを特徴とする装置。
23. 請求項２２記載の装置において、
    前記磁化要素は、金属要素（１８）からなることを特徴とする装置。
24. 請求項１５から２３のいずれか一項に記載の装置において、
    前記外部培地（６）は、前記内部培地（４）に対して不活性な気体又は液体相（２４）であり、かつ前記反応容積単位（２）を閉じ込めるためのキャビティー（２４ａ）の内側に配置されていることを特徴とする装置。
25. 請求項２４記載の装置において、
    前記閉じ込めキャビティー（２４ａ）は、平らな形状又は平面の形状を有することを特徴とする装置。
26. 請求項１８から２１のいずれか一項に記載の装置において、
    前記冷却手段（１５）及び／又は前記加熱手段（１４）は、前記反応表面（９）に、熱的に接続されていることを特徴とする装置。
27. 請求項１５記載の装置において、
    ２つの位置、すなわち前記反応表面（９）が前記反応単位（２）の外側に存続する不活性位置と前記反応表面（９）が前記内部培地（４）に浸漬される活性位置と、の間を移動させることができる、前記反応表面（９）を自由端部に含む反応要素を備えることを特徴とする装置。
28. 請求項１５記載の装置において、
    前記反応単位（２）を形成及び／又は維持する手段（１３）は、疎水性領域（４４）によって取り囲まれた、ベース領域（４１）及び／又は支持体（４３）の親水性領域（４２）からなる群より選択された、前記反応単位を配置する手段を備えることを特徴とする装置。

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