JP4313847B2 - 免疫賦活性イノシン一リン酸の５’−ヌクレオチダーゼ抵抗性誘導体およびその使用 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、一般的には免疫賦活剤、即ちイノシン-5’-一リン酸の有効性を高めることによって、免疫応答性を高める方法並びに該増強剤の使用に関するものである。より詳しくは、本発明は、腫瘍、ウイルスおよび細胞内バクテリア病原体に冒された患者の治療およびワクチンアジュバントに関する。
発明の背景
続発性免疫不全症は癌、老化、自己免疫、AIDS、およびその他のウイルス性およびバクテリア性諸疾患において一般的である。これら続発性免疫不全症の治療は、長い間、これら諸疾患における改善された予後をもたらすであろうと考えられていた。多くの実験的努力にも拘らず、僅かにレバミソールおよびイソプリノシンのみが、広範に認可されかつこのような治療において臨床的に使用されているに過ぎない。この種のより効果的な薬物に対する需要がある。
免疫機能は、該免疫系の体液性および細胞性部分を含み、並びにこれらの局面はマクロファージおよび顆粒球に依存している。免疫機能の、これら種々の局面を、一般的に免疫賦活剤と呼ぶことのできる、種々の薬剤によって増進または改善することができる。薬剤および生物学的物質を包含する免疫賦活剤は、ヒトの諸疾患の予防および治療において広く利用されている。
しかしながら、最近の研究（サッド＆モスマン(Sad and Mosmann)，1994;シーリング(Sieling)等，1994;チャカラス＆ティスタ(Chakkalath and Titus)，1994;トリップ(Tripp)等，1994;ボグダン(Bogdan)等，1991;フィオレンチノ(Fiorentino)等，1989）は、免疫応答の適当でない刺激が、実際には該疾患の過程を容易にしている可能性があることを示唆している。マウスおよびヒトモデル両者において、免疫応答のサイトカインプロフィールが、調節され、それによってＴヘルパー(Th)細胞のサブクラスの一方、TH1またはTh2が該病原体に対する応答に際して活性化されることが明らかとなっている。Th1細胞は、一般にIL-2、IFN-γおよびリンホトキシン分泌のあるパターンを有し、一方該Th2の一般的な分泌パターンはIL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10およびIL-13である。該Th1細胞サイトカインプロフィールは、一般的に疾患に対する抵抗性に関連し、またTh2サイトカインプロフィールは、疾患の進行に関与している。特に、細胞内病原体、例えばマイコバクテリウムレプラエ(Mycobacterium leprae)、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)およびライシュマニアメジャー(Leishmania major)に関連して、Th1細胞由来のサイトカインプロフィールが、該病原体の成長を制限するのに必要であることが示された。多くの因子が、T-細胞の何れのサブセットが該免疫応答中に活性化されるかを決定し、またTh1応答に導くのが、活性化されたマクロファージ由来のIL-12を含む、因子の組み合わせであることも明らかとなっている。これら疾患において、このTh1応答を増大し、あるいはこれを刺激する手段をもつことは有用であろう。例えば、癩病患者はこのタイプ１応答を示さず、寧ろその病巣は該タイプ２のサイトカインを発現し、該サイトカインは、細胞内病原体に抵抗するのに必要な、該細胞媒介免疫の、典型的な体液性応答およ免疫抑制である。
免疫賦活剤の一つの群は、イノシンまたはハイポキサンチン等のプリン構造を由来とし、例えばイソプリノシン（モル比1:3でイノシンと、N,N-ジメチルアミノ-2-プロパノールのp-アセタミド−ベンゾエート塩、即ちDIP塩とを含む合成薬剤）を包含する。
およびNPT 15392（9-エリスロ-2-ヒドロキシ-3-ノニル−ハイポキサンチン）:
これらの化合物は、これらが主として胸腺−由来の（T）リンパ球に作用することにより免疫系を刺激することから、「胸腺模倣性(thymomimetic)薬物」（ハッデン(Hadden)，1985）として分類されているが、これらは免疫応答に関与する他の細胞にも作用する。イソプリノシン(isoprinosine)は、医学的に有用な胸腺模倣性薬物の一例であって、該薬物は世界中の多くの国々において、ヒトに使用することが認可されているものである。インビトロでのイソプリノシンの作用は、イノシンの作用と類似し、DIP塩との錯化により賦活される（ハッデン(Hadden)，1978）。インビボでのイソプリノシンの作用は、イノシンまたはDIP塩のみによっては達成されず（ワイブラン(Wybran)等，1982）、このことは錯体形成およびイノシン塩基の保護が、インビボでの活性について決定的であることを示唆している。
臨床用途用の、より免疫学的に活性なこの種の分子の探索は、莫大な文献を蓄積した。
ゴードン(Godon)に付与された米国特許第3,728,450号は、イノシンとアミノ−アルコールとによって形成された錯体を開示しており、該錯体はインフルエンザおよびヘルペスウイルスに対する防禦における薬理活性を有している。
ハッデン(Hadden)等に付与された米国特許第4,221,794号は、プリン誘導体（9-（ヒドロキシアルキル）プリン類）と、p-アセタミド安息香酸のアミノ−アルコール塩との錯体を開示しており、これらは免疫調節および抗−ウイルス活性を有している。
ハッデン(Hadden)等に付与された米国特許第4,221,909号は、抗−ウイルス因子、免疫調節剤および抗−白血病薬として有用な、9-（ヒドロキシアルキル）プリン類の、p-アセタミド安息香酸塩を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,340,726号は、免疫調節、抗−ウイルス、抗−腫瘍および酵素阻害剤活性をもつエステル（プリン化合物）を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla）等に付与された米国特許第4,221,910号は、免疫賦活剤、抗−ウイルス因子および抗−白血病薬として有用な、9-（ヒドロキシアルキル）プリン類を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,457,919号は、免疫調節、抗−ウイルスおよび抗−腫瘍活性を有するプリン誘導体を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,510,144号および同第4,387,226号は、免疫調節活性を有するジヒドロチアゾロプリン誘導体を開示している。
特開昭58-140100号は、（ヘプタミン-1-オール）-5’-アデノシン一リン酸を開示している。サハ(Saha)等(1988)は、Ｔ細胞−依存抗原（ヒツジ赤血球）に対して、インビトロで一次体液性免疫応答を賦活化する際の、脾細胞培養物の初期段階に存在する場合の、その活性を開示している。サハ(Saha)等(1987)は、ICR雄マウスにおける抗−SRBC PFC活性および抗体力価を高める際の、HAAの活性を記載している。彼等は、また一時的に高血圧症とされたラットにおける抗−SRBC PFC活性および抗体力価を高める際の、HAAの活性をも開示している。
ハッデン(Hadden)等(1983)は、プリン、特にイノシン−含有またはイノシン−様の化合物が、実験により、一般的に細胞内病原体の感染に応答して、プリカーサT-細胞分裂を誘発するおよび成熟T-細胞、特にTh1細胞の機能的応答を賦活する、胸腺ホルモンの作用を模倣する能力を有していることを示した。これら分子の一例である伝達因子は、最も綿密に調べられた構造（ウイルソンおよびフーデンベルグ(Wilson and Fudenberg)，1983）において、イノシン-5’-一リン酸(IMP)を含むものと想定された。
以下に、本明細書で論ずるのに使用するために、これら免疫調節／免疫賦活化合物が利用できることは、有益であろう。
ウイルス感染および細胞内バクテリア病原体は、一般的に主な公共衛生上の関心事である。これら両カテゴリーにおいて、該バクテリアおよびウイルス病原体は宿主免疫系を回避する。というのは、これらは該宿主細胞内で成育しているからである。マクロファージにより開始されるTh1細胞による細胞−媒介免疫(CMI)応答は、一旦感染が生じた場合には、細胞内病原体に対する宿主防禦または抵抗性の一般的な様式である。免疫性付与に応答する効果的な抗体応答は、免疫性を付与する可能性がある。
抗生物質によるバクテリア関連疾患の治療を利用することができるが、バクテリアの薬物耐性の増大により、治療の他の方法を考察することが必要となっている。感染した個体の治療法の一つは、患者免疫系の有効性を高めることである。これら疾患において、感作されたＴリンパ球および活性化されたマクロファージは、免疫性におけるキーファクタである。従って、これら疾患に対する効果的な治療は、マクロファージを活性化し、また適当なＴリンパ球を感作するものである必要がある（ライアンインスタイツ＆テール(Ryan in Stites and Terr)，pp.637-645およびミルスインスタイツ＆テール(Mills in Stites and Terr)，pp.646-656）。
細胞内バクテリア病原体は、サルモネラ(Salmonella)、レジオネラ(Legionella)、リステリア(Listeria)、マイコバクテリア(Mycobacteria)およびブルセラ(Brucella)を含む。サルモネラ種は、腸内細菌の一員であり、チフス様熱病を含む腸疾患の大部分を引き起こす。S.ティフィ(typhi)のカプセルは表面カプセル抗原を有し、かつこのカプセル抗原に対する抗体は防禦性ではない。事実、チフス様疾患の多くの保菌者は、この病原体に対する高レベルの抗体を有する。
レジオネラ(Legionella)の研究は、これがマクロファージの絶対細胞内寄生体であることを示している。リステリア(Listeria)は、髄膜感染および成人の敗血症並びに新生児における種々の感染を引き起こすグラム−陽性菌である。これらの病原体に対する防禦の主な役割は、T-リンパ細胞関連マクロファージの活性化であることが明らかにされている。ブルセラ(Brucella)関連疾患の研究も、抗体が防禦をもたらさず、かつ特異的に感作されたT-リンパ細胞により生成される、活性化されたマクロファージが防禦を行うことを明らかにした。
これら疾患に対して有効な、マクロファージを活性化し、また該病原体に対する適当なＴリンパ細胞を感作する、薬剤を得ることは有用であろう。
一般的に、効果的な抗−ウイルス薬は殆どまたは全く存在しないので、ウイルス病原体からの防禦もまた、公共衛生に係わる主な目的として残されている。免疫性付与は、ウイルス疾患における最良の防禦源として残されている。しかしながら、ワクチンはしばしば以下の理由から免疫性を付与しない。即ち、（1）乏しい免疫原性ウイルス抗原、（2）免疫性付与とウイルスに対する暴露との間の時間の少なさ、または（3）免疫付与された個体の応答不能性。
例えば、インフルエンザワクチンは、該ウイルスが抗原性における変化を行うために、定期的に更新する必要がある。最も一般的なワクチンは、しばしば入手不能であるか、あるいは流行のピーク月間である冬季月間の開始前に、十分に生産されていない。従って、該ワクチンを付与したものが、抗体力価を獲得する前に、該ウイルスに暴露されてしまう可能性がある。更に、より高い感染の危険性のある患者、即ち高齢者および若年者においては、流行が開始するまで、ワクチン接種の応諾率が低い。その上、インフルエンザは、特に高齢者および若年者層を酷く苦しめ、また心臓−呼吸系に疾患をもつ個体をも酷く苦しめる。これらの特定の群は、しばしばこのワクチンに対する低い免疫応答をもつ。
インフルエンザウイルス感染は、正常な肺の抗−バクテリア防禦を抑制して、インフルエンザに罹った患者は、バクテリア性肺炎を発症する極めて高い危険性をもつ。インフルエンザウイルス感染中には、肺胞マクロファージまたは好中球が阻害されることが分かっている。
従って、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答性またはバクテリア性肺炎に対する抵抗性を増強する手段が、この疾患を治療する上で有用であろう。この治療の有効性を高める可能な方法の一つは、免疫賦活特性をもつ物質で治療することである（ハッデン(Hadden)等，1976;ハッデン(Hadden)，1987）。
慢性肝炎Ｂ感染は、主な公共衛生の関心事の一つである。この肝炎Ｂウイルスは急性および慢性肝炎並びに肝臓癌の原因である。この急性疾患は限られた進行経過を辿るが、その慢性感染はその宿主の生存中持続する。慢性の保菌者はその生存中感染性を維持する。世界中で１億人を越える保菌者が存在するものと推定されている。
この疾患に対する一般的な有効性をもつ治療は存在しない。免疫性付与による予防が、唯一の解決策として残されている。これらの危険率の高いものに対する免疫付与が決定的である（ジェームズ(James）等，1991;マイルズ(Mills)，1991）。しかしながら、肝炎Ｂウイルスの表面抗原により免疫付与する場合、ワクチン付与されたものの殆ど２〜15％が、この肝炎Ｂウイルスの表面抗原(anti-HBs)に対する抗体を生成せず、従ってこの感染に対して防禦されないことが分かっている。換言すれば、これら患者は非応答性患者である（デインハート(Deinhardt)，1983）。肝炎Ｂに対する強力な免疫性を誘発するために、該抗原処方物の多重投与の種々のスキームが推奨されている（グロッスマン＆コーエン(Grossman and Cohen)，1991）。しかしながら、依然として一群の非応答性患者が存在する。従って、この重大な公共衛生上の要求を解決するためには、ワクチン処方物の肝炎Ｂに対する免疫原性を高める別の手段が必要となる。
感染の高い危険率をもつ人々は、継続的に血液透析治療を受けている患者（ファーガソン(Ferguson)，1990;バルツ(Walz)等，1989）、HIV-感染および他の免疫寛容化された患者（ヘス(Hess)等，1989）中に最も高い頻度で見出される。これら群と接触した人々および過去に肝炎Ｂウイルスと接触したことのない人々が感染の最大の危険性をもち、感染からの迅速かつ最大の防禦を必要とする。これは、健康管理供給者において特に重大である（グロッスマン＆コーエン(Grossman and Cohen)，1991）。従って、これらの群中の、肝炎Ｂに対する一般的に入手できるワクチンに対して非応答性の患者は、より一層高い感染の危険性に曝されている。
この非応答性の患者群における免疫付与の有効性を高め得ることが有用であろう。予防の有効性を高める一つの可能な方法は、入手可能なワクチンの免疫原性を、アジュバント特性をもつ生物学的に活性な物質を使用することにより増強することである。
アジュバントが、異種抗原に応答して、抗体の形成を刺激することは周知である。アジュバントは、免疫応答を賦活できる化合物として定義され、従って一群の免疫賦活剤として定義されている（スタイツ＆テール(Stites and Terr)，1991）。アジュバントは、免疫付与における免疫応答性を高めるのに使用される（シーマン(Seaman)，1991）。例えば、肝炎Ｂに対するワクチン製剤では、HBsAgが一般的に水酸化アルミニウム上に吸収され、かくして免疫原性効果が高められ、感染を予防する、抗-HBsの防禦力価(>10 IU/l)を達成している。
しかしながら、上記のように、この増強されたワクチンに対してさえも応答しない非応答性患者が存在する（セリス(Celis)等，1987;ミューアー(Meuer)等，1989）。この免疫付与による防禦免疫性の欠乏は、一部には、主要組織適合性錯体(MHC)のレベルで測定された、免疫応答性をもつ成分によるものと考えられる（アルパー(Alper)等，1989;ウォーカー(Walker)等，1981）。「非応答性患者」は該MHC中の免疫応答の支配的な遺伝子に欠けており、結果として抗-HBsの合成が、多くとも、一般的に適用される検出法によっては殆ど検出し得ない程の低濃度で生ずることが示唆されている（トムソン(Thomson)等，1997）。同様にマウス主要組織適合性錯体(H-2)と関連した免疫応答遺伝子が、HBsAgを包含する、多数のT-細胞−依存性抗原上の決定基に対する、細胞性および体液性応答を制御することが、明らかにされている。
肝炎Ｂワクチンと、種々の免疫調節剤との組み合わせによる適用で得られた結果は、この方法の便宜性を示唆する。というのは、この組み合わせによる治療は完全に応答しないか、あるいは低濃度のHBsで応答する人々の数を減じることができるからである（セリス(Celis)等，1987;ミューア(Meuer)等，1989）。しかしながら、これらのデータには勇気づけられるが、これらの治療に応答しない人々が依然として存在する。彼等に対しては、アジュバントで強化した肝炎Ｂワクチンを使用することが有用であり、該アジュバントは、特定の抗体の最大濃度での迅速な誘発を促進し、かつ該非応答性患者集団における防禦性を高めるであろう。
ハッデン(Hadden)等(1983)は、検討されたプリン特にイノシン−含有またはイノシン様化合物が、一般的にプリカーサT-細胞分裂を誘発し、かつ成熟T-細胞の機能性の応答を賦活する、胸腺ホルモン作用を模倣する能力をもつことを明らかにした。
イソプリノシンは、マウスにおける致死性のインフルエンザ感染の治療において幾分かの有効性を示し、また非−感染性用量のウイルスを投与した場合には、ウイルスによる後の感染における致死性を阻害した。イソプリノシンは、そのヒトにおける臨床的活性に基づいて、インフルエンザの治療におけるヒトでの使用が、幾つかの国において承認されている（グラスキー(Glasky)，1985）。しかしながら、ヒト内でのイソプリノシンの半減期は、４時間未満であり、従ってインビボ治療に対して極めて有効という訳ではない。イソプリノシンは、迅速に加水分解され、結果としてインビボでの短い半減期をもたらす。インビトロでのイノシン（ハッデン，1978）は、イソプリノシンと同様な特性をもつが、インビボでは、迅速に異化作用を受けて、その半減期はイソプリノシンの半減期よりも更に短縮され、かくしてこれはインビボでは活性をもたない（ワイブラン(Wybran)等，1982）。より大きな免疫賦活性能力をもつ、より安定なイノシン−様化合物を得ることは有用であろう。
発明の概要
本発明によれば、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の製法が提供され、該方法は以下の式：
で表されるイノシン-5’-一リン酸を化学的に修飾することからなり、上記式において、置換基Ｒはアルキル基、アルコキシ基および２級アミノ化合物由来の基からなる群から選ばれ、その結果イノシン-5’-一リン酸の生物学的活性が、インビボで保持される。
本発明は、さらに免疫賦活性組成物をも提供し、該組成物は免疫賦活に有効な量で、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性の、以下の式で表されるイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体を含む：
ここで、Ｒは該化合物の5’-ヌクレオチダーゼによる異化作用を阻害する部分であり、アルキル、アルコキシおよび２級アミノ化合物からなる群から選ばれる。一態様において、該免疫賦活作用は、T-細胞免疫賦活組成物を導き、またより具体的な態様においては、Ｔヘルパー細胞サブセット１(Th1)細胞に導く。
本発明は、また以下の式で表される、ワクチン用のアジュバントをも提供するものである：
ここで、Ｒは該化合物の、5’-ヌクレオチダーゼによる加水分解を阻害する部分であって、アルキル、アルコキシおよび２級アミノ化合物からなる群から選ばれる。
好ましい態様においては、本発明は肝炎Ｂ用のワクチンに関わり、これは精製されたウイルス抗原（好ましくは、組み換え）および以下の式で表される、肝炎Ｂ用のアジュバントを含有する：
ここで、Ｒは該化合物の、5’-ヌクレオチダーゼによる加水分解を阻害する部分であって、アルキル、アルコキシおよび２級アミノ化合物からなる群から選ばれる。
本発明は、また以下の式で表される、細胞内バクテリア病原体およびウイルスに対する、免疫刺激剤5’-ヌクレオチダーゼ耐性イノシン-5’-一リン酸誘導体を提供することにある：
ここで、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、または式：-OR1（ここで、R1は炭素原子数約１〜６のアルキル基である）で表されるアルコキシ基の何れかから選択される。
本発明は、更に哺乳動物中のウイルスおよび細胞内バクテリア病原体を処理する方法を提供し、該方法は、細胞内バクテリアおよびウイルス病原体からなる群から選ばれる病原体により引き起こされる、感染性疾患をもつ患者を診断する工程を含む。次いで、この方法によれば、同定された患者に、有効量の、以下の式で表される、免疫刺激剤5’-ヌクレオチダーゼ耐性イノシン-5’-一リン酸誘導体を投与する：
ここで、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、または式：-OR1（ここで、R1は炭素原子数約１〜６のアルキル基である）で表されるアルコキシ基の何れかから選択される。好ましい態様においては、有効量のスクアランも投与することができる。
【図面の簡単な説明】
本発明のその他の利点は、以下の詳細な説明を添付図と共に参照することにより、容易に理解され、また本発明はより一層十分に理解されよう。
第１図は、ヒト末梢血リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェン植物凝集素に対する、コントロール応答を基準とする割合で表した応答（即ち、ヒト末梢血リンパ細胞の増殖）を、該培養培地中に存在するMp-IMP(---▲---)、Me-IMP(---△---)、IMP(--◇--)、E-IMP(--◆--)、Arg-IMP(--□--)およびHa-IMP(---●---)の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第２図は、0.5μg/mlのPHAの存在下での、１〜1000μg/mlのMIMP(---○---)およびIMP(--●---)に対して、正常なヒトリンパ細胞の投与量応答曲線をプロットしたグラフであり、結果は２名のドナーからなるコントロールに対する比として表されている、
第３図は、３名のドナー由来の、CD4+(---○---)およびCD8+(---●---)に富むコントロールヒトリンパ細胞の投与量応答曲線を、PHAの存在下での、MIMP（1-200μg/ml）に対してプロットしたグラフであり、
第４図は、種々の濃度のMIMP(0.1-100μg/ml)の存在下での、12.5μM（白抜きの棒）、25μM（あや目陰影を施した棒）、50μM（黒塗りの棒）および100μM（点描の最も短い棒）でのペプチドgp41に対する、コントロールヒトリンパ細胞の投与量応答を示す棒グラフであり、ペプチドを含まないコントロールの値は、水平の−−線で示され、また結果はテストした５名のドナーのうちの代表的な１名のCPM±SEMを表す、
第５図は、MIMP１-100μg/mlの存在下での、10（あや目陰影を施した棒）、100（斜線を施した棒）、および1000（実線）単位／mlの、組み換えインターフェロンαの抑制的影響に対する、コントロールヒトリンパ細胞の投与量応答の棒グラフであり、コントロール（白抜き棒）は、PHAのみに対する応答であり、結果はCPM±SEMで示されている、
第６図は、コントロールヒトリンパ細胞の増殖応答を阻害する（黒塗りの棒）PGE2(10-5M)の作用、および濃度１、１０および100μg/mlのMIMPの、この阻害を逆転する（あや目陰影を施した棒）作用を表すグラフであり、コントロール（白抜きの棒）はMIMPの不在下でのPHA応答であり、データはCPM±SEMで示されている、
第７図は、コントロール（c）、15名の正常な老齢個体（Ag+）、９名の抑制されたPHA応答をもつ老齢個体（Ag-）、８名のARC患者および８名のAIDS患者の、PHA応答（白抜きの棒）に及ぼす、濃度100μg/mlのMIMP（黒塗りの棒）の作用を示すグラフであり、
第８図は、マウス脾臓リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェンコンカナバリンＡに対する、コントロール応答に関する割合で表した応答（即ち、マウス脾臓リンパ細胞の増殖）対、該培養培地中に存在するIMP(--□--)、Me-IMP(---△---)、E-IMP(--●---)、Arg-IMP(--◆--)、Ha-IMP(---◇--)およびMp-IMP(---▲---)の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第９図は、ヒツジ赤血球(SRBC)に対して免疫付与されているマウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される（平均±SEM）脾臓プラーク抗体形成細胞（PFC）の数をプロットした棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、Ha-IMP、Arg-IMP、Me-IMPの腹腔内投与と組み合わせて実施した、
第10図A-C図は、SRBCに対して免疫付与されている、マウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される脾臓PFCの数（平均±SEM）をプロットした投与量応答棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、種々の投与量の（A）へプタミン-1-オール)-5’-イノシン一リン酸、（B）アルギニン-5’-イノシン一リン酸および（C）メチル-5’-イノシン一リン酸の腹腔内投与と組み合わせて実施した、
第11図は、SRBCに対して免疫付与されている、マウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される脾臓PFCの数（平均±SEM）をプロットした投与量応答棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、種々の投与量のメチル-5’-イノシン一リン酸の経口投与と組み合わせて実施した、
第12図は、マウス脾臓リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェン植物凝集素(---■---)およびコンカナバリンＡ(---●---)に関するコントロール応答に対する割合で表した応答（即ち、マウス脾臓リンパ細胞の増殖）を、メチル-5’-イノシン一リン酸の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第13図は、刺激した際の遅延型過敏性応答（即ち、平均肉趾厚みの増加±SEM）を、免疫付与時点で投与したメチル-5’-イノシン一リン酸の投与量レベルに対してプロットした、投与量応答グラフであり、
第14図は、刺激の際にコントロールおよびMe-IMPの投与によって免疫化するに際して、コントロールまたはメチル-5’-イノシン一リン酸の投与による刺激における、該遅延型過敏性応答（即ち、平均肉趾厚みの増加±SEM）を比較した棒グラフであり、
第15図は、フレンド白血病ウイルス(FLV)に感染したマウスを、コントロール（−）およびMe-IMP（---）処理した際の生存性を比較した線グラフであり、
第16図は、エーロゾルインフルエンザ感染させ、かつコントロール（１日前にPBSを投与，--●--）、MIMP（１日前に100μｇを投与，--△--）、MIMP（１時間前に100μｇを投与，--○--）、MIMP（１時間後に100μｇを投与，--◆--）、MIMP（１日前に200μｇを投与，--□--）、MIMP（１時間前に200μｇを投与，--◇--）、およびMIMP（１時間に200μｇを投与，--▽--）で処理した後の生存率（%）を比較した線グラフであり、および
第17図は、エーロゾルインフルエンザ感染させ、かつコントロール（１日前にPBSを投与，--●--）、コントロール（１時間後にPBSを投与，--○--）、MIMP（１日前に200μｇを投与，--▽--）、MIMP（１時間後に200μｇを投与，--△--）、MIMP（１日前に200μｇ＋スクアランを投与，--◇--）、MIMP（１時間後に200μｇ＋スクアランを投与，--◆--）で処理した後の生存率（%）を比較した線グラフである。
好ましい態様の詳細な説明
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性（保護-IMP）であり、免疫賦活剤として使用するための、イノシン-5’-一リン酸の製法を提供することにある。この方法は、イノシン-5’-一リン酸またはその誘導体を化学的に修飾して、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性であるが、イソビトロでのその生物学的活性／イノシン-5’-一リン酸のプロフィールを維持し、かつ免疫賦活／免疫刺激を要するインビボ用途に対する生物学的活性を拡張する。この製法は以下の製造例１〜５に示される。一般的に、この化学的方法は、イノシン-5’-一リン酸またはその誘導体とアルコール、エーテルまたは２級アミン化合物との間で縮合反応を行って、インビボで活性な該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性化合物を形成する。
本発明は、T-細胞を刺激する手段を与える。更に、該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性イノシン-5’-一リン酸誘導体は、ワクチン内でアジュバントとして機能して、他のワクチン成分に対する応答性を高める。好ましい態様において、該ワクチンは肝炎Ｂ用のワクチンである。
本発明の他のもう一つの用途においては、該保護-IMPは腫瘍、ウイルス感染症および細胞内バクテリア病原体の処置に利用できる。予想外のことに、感染個体内で、腫瘍、病原体の治療に対する免疫応答性を高めるように作用し、かつまた免疫投与においてアジュバントとして機能する一化合物が見出された。（かくして、本明細書で使用する、「治療」なる用語は、治療および／または予防を包含する）。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性化合物、保護-IMPを提供することにより、本発明は該化合物に、治療において該免疫応答性を高めるのに効果的であるインビボ半減期をもたせることを可能とする。
本発明は、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸の製法を提供し、該方法は以下の式で表されるイノシン-5’-一リン酸を、以下に説明するように化学的に修飾することにより、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を製造する方法を提供する：
ここで、Ｒはアルキル、アルコキシおよび２級アミン化合物からなる群から選ばれる。該アルキルまたはアルコキシは、１〜６個の炭素原子をもつものであり、一態様ではメチルまたはメチルエステルである。
本発明の基本は、イノシン-5’-一リン酸(IMP)を、5’-ヌクレオチダーゼによる加水分解から保護して、IMPをインビボで効果的に利用することを可能とする。好ましい態様においては、この保護されたIMPはメチル-5’-イノシン−一リン酸であるか（メチル-IMP，Me-IMP，MIMP）あるいはメチル-5’-イノシン−ホスホネート(Mp-IMP)である。議論の明確化のために、本発明はこれら２つの態様の一方により、主として説明されるであろう。しかしながら、本発明は同様にして、任意の他の5’-ヌクレオチダーゼに対して保護された、生物学的に活性なIMPにも適用できる。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸における該アルコキシ基は式：-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基であり、特定の態様においてはメチルまたはエチル基である）で表される。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸における該２級アミン化合物は以下の式で表されるものである：
-NH-R2
ここで、R2は全体として約16個の炭素原子を有する置換ノルマルアルキル基である。このR2はヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、２級アルキル、アルキル置換ヒドロキシメチル、-NHC(NH)NH2、-CONH2、
からなる群から選ばれる。好ましくは、R2は以下の式で表される：
-CH(R3)-(CH2)n-R4
ここでR3は、水素原子、低級C1〜C9アルキルおよびカルボキシル基からなる群から選ばれ、一態様においてR3はメチル基である。
R4はヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、２級アルキル、アルキル置換ヒドロキシメチル、-NHC(NH)NH2、-CONH2、
からなる群から選ばれ、ｎは０〜４、好ましくは１〜３および最も好ましくは３の整数を表す。
R4が２級アルキル基である態様においては、R4は好ましくは式：-CH(R5)R6で表されるものであり、ここでR5およびR6は、同一でも異なっていてもよく、独立に１〜３個の炭素原子をもつアルキル基から選ばれる。好ましくは、該２級アルキル基は全体で４個の炭素原子をもつ。
R4がアルキル置換ヒドロキシメチル基である態様においては、該基は好ましくは式：-C(R7)(R8)OHで表されるものであり、ここでR7およびR8は同一でも異なっていてもよく、独立に水素原子および１〜３個の炭素原子をもつアルキル基から選ばれ、その少なくとも一方は水素原子以外の基である。一態様においては、R7およびR8は両者共にメチル基である。
該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸において、該２級アミン化合物は、N-末端を介して燐原子に結合したペプチドであり得る。一態様においては、該ペプチドはARG-PRO、ARG-PRO-LYSおよびARG-PRO-LYS-THRからなる群から選ばれる。この式は、偶発的な加水分解が活性ペプチド、例えばタフツシン(tuftsin)(ARG-PRO-LYS-THR)を放出する、薬理的にまたは免疫薬理的に活性なペプチドに関する好ましい態様の一つである。
他の適当な活性ペプチドはFK565（ヘプタノイル−γ-D-グルタミル-L-メソジアミノピネリル-D-アラニン）、ベスタチン(Bestatin)（[(2S,3R)-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニルブチリル]-L-ロイシン）、イムレグ(Imreg)(TYR-GLY)、Imreg(TYR-GLY-GLY)、IL1 163-171(GLN-GLY-GLU-GLU-SER-ASN-ASP-LYS-ILE)、チムリン(Thymulin)(Zn:GLU-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN)、チモペンチン(Thymopentin)(ARG-LYS-ASP-VAL-TYR，ARG-LYS-ASPおよびARG-LYS-ASP-VAL)、スプレニン(Splenin)(ARG-LYS-GLU-VAL-TYRおよび／またはLYS-HIS-GLY)を包含する。
上記のような、イノシン-5’-一リン酸の保護誘導体は、所定のアルコール、または一級アミンまたはペプチドと、イノシン-5’-一リン酸との、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤の存在下で、縮合することにより容易に調製できる。製造例１〜５は、このような処方の例を与える。適当なアルコールは、１〜20個の炭素原子、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、n-プロピルアルコール、n-ブチルアルコール、n-ヘキシルアルコール、n-オクチルアルコールおよびn-デシルアルコールを包含する。
適当な一級アミンまたはペプチドは6-アミノ-2-メチル-2-ヘプタノール（ヘプタミノール）、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、バリン、およびARG-PRO、ARG-PRO-LYSおよびARG-PRO-LYS-THR並びにその類似体を包含する。ポリアミド−オリゴヌクレオチド複合体を製造する適当な方法は、ハラランビディス(Haralambidis)等(1990)の文献に記載されている。
本発明は、また免疫原性刺激剤による治療を必要とする哺乳動物の免疫応答を賦活する方法をも提供する。この方法は、該哺乳動物に、免疫賦活に有効な量の以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物を投与する工程を含む：
ここで、Ｒは5’-ヌクレオチダーゼによる該化合物の加水分解を阻止する部分であり、アルキル、アルコキシおよび二級アミン化合物からなる群から選ばれるものである。
より特定的には、本発明は免疫応答を賦活する方法を提供し、ここで該T-細胞は、免疫賦活に有効な量の以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体で刺激される：
ここで、Ｒは5’-ヌクレオチダーゼによる該化合物の加水分解を阻止する部分であり、アルキル、アルコキシおよび二級アミン化合物からなる群から選ばれるものである。好ましい態様の一つにおいては、該Th1 T-細胞サブセットが優先的に刺激される。
本発明は、更に免疫賦活組成物を提供し、該組成物は免疫賦活に有効な量の、以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体を含む：
ここで、Ｒは5’-ヌクレオチダーゼによる該化合物の加水分解を阻止する部分であり、アルキル、アルコキシおよび二級アミン化合物からなる群から選ばれるものである。一態様において、この免疫賦活はT-細胞免疫賦活組成物に導き、またより具体的な態様では、Ｔヘルパー細胞サブセット１(Th1)細胞に導く。
本発明は、またワクチン用のアジュバントが以下の式で表されるような、免疫賦活組成物をも提供する：
ここで、Ｒは5’-ヌクレオチダーゼによる該化合物の加水分解を阻止する部分であり、アルキル、アルコキシおよび二級アミン化合物からなる群から選ばれるものである。好ましい態様において、該アルコキシ基は式:-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基およびより具体的にはメチルおよびエチル基である）で示される。
一態様において、本発明は肝炎Ｂ用のワクチンに関わり、該ワクチンは精製されたウイルス抗原（好ましくは、組み換え）および以下の式で表される肝炎Ｂ用のアジュバントを含む：
ここで、Ｒは5’-ヌクレオチダーゼによる該化合物の加水分解を阻止する部分であり、アルキル、アルコキシおよび二級アミン化合物からなる群から選ばれるものである。好ましい態様において、該アルコキシ基は式:-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基およびより具体的にはメチルおよびエチル基である）で示される。
同様に、本発明は、細胞内バクテリア病原体およびウイルスに対する、免疫系刺激剤として機能する、以下の式で示される、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸およびその誘導体の使用法を提供する：
ここで、Ｒは１〜６個の炭素原子をもつアルキル基または式:-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基である）で示されるアルコキシ基から選択される。選択された態様では、ＲおよびR1はメチル基である。
本発明は、更に哺乳動物におけるウイルスおよび細胞内バクテリア病原体を処置する方法をも提供し、該方法は、ウイルスおよび細胞内バクテリア病原体からなる群から選ばれる病原体により生じた、感染性疾患に冒された患者を診断する工程を含む。この方法では、次に以下の式で表される免疫系刺激剤として機能する有効量の保護-IMP（5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸およびその誘導体）を、該同定された患者に投与する工程を含む：
ここで、Ｒは１〜６個の炭素原子をもつアルキル基または式:-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基である）で示されるアルコキシ基から選択される。選択された態様では、ＲおよびR1はメチル基である。好ましい態様においては、有効量のスクアランをも投与することができ、投与すべき該スクアランの量は少なくとも１日当たり１〜５mlである。
本発明は、腫瘍に罹った患者の治療方法を提供する。この方法は、本明細書に記載するような免疫刺激剤として、有効量の5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を投与する工程、および有効量の内毒素、例えばリポポリサッカライド(LPS)を投与する工程を含み、あるいは好ましい態様においてはFDAガイドラインに従って投与される、サルモネラワクチンを投与する工程を含む。白血病においては、有効量の5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を、本明細書にFLV白血病につき記載されたような、免疫刺激剤として、治療の目的で投与することが可能であることに注意すべきである。
本発明は、また5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸による治療の利点を享受するであろう患者を決定する方法をも提供する。この方法は、当分野で公知のようにして末梢血リンパ細胞を単離し、マイトジェンおよび保護-IMPの存在下で、インビトロでのリンパ細胞刺激アッセイを実施する工程を含む。該保護-IMPに対して、低下されたインビトロ応答を示す患者は、この保護-IMPによる治療の候補ではない。
本明細書で使用するような「免疫刺激剤」および／または「免疫賦活剤」なる用語は、個体に投与した場合、あるいはインビトロでテストした場合に、これが投与される個体またはテスト系内の抗原および／または化合物に対する該免疫応答を増大する化合物を意味する。幾つかの抗原は、単独で投与した場合には弱い免疫原性をもつか、該個体に免疫応答を引き起こす濃度において、該個体に対して有害である。該免疫刺激剤または免疫賦活剤は、該抗原をより一層免疫原性とすることにより、該抗原または化合物に対する、該個体の免疫応答性を高めることを可能とするか、あるいはまた該免疫系をより応答性の高いものとすることが可能である。この免疫刺激剤／免疫賦活剤は、また該抗原／化合物のより低い用量が、該個体における免疫応答を達成するのに必要とされるように、該免疫系に影響を与えることができる。
細胞内バクテリア病原体はサルモネラ、レジオネラ、リステリアおよびブルセラを包含する。サルモネラ種は腸内細菌の構成員である。本発明で治療を意図するウイルス病原体は、インフルエンザ、フレンド白血病ウイルス、肝炎、ヘルペスおよびHIVを包含するがこれらに制限されない。
上で論じた疾患の治療については、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体から選ばれる免疫刺激剤は、癌性腫瘍、ウイルス感染または細胞内バクテリア感染に関する、二次免疫不全の診断後に与えられるであろう。この免疫刺激剤は、有効量で使用され、一般的には１日当たり１〜50 mg/kg体重、好ましい態様では１日当たり１〜10 mg/kg体重で使用されるであろう。この免疫刺激剤は、最初の診断の時点で投与されるか、毎日または良好な医療実務に従って決定された時点で、個々の患者の臨床状態、投与部位並びに方法、投与のスケジュールおよび医療関係者には公知の他の因子を考慮して与えられるであろう。
本発明の目的にとって、「有効量」とは、従って二次免疫不全の治療分野において公知の考察により決定される。ここでは、改善された生存率、より迅速な回復、症状の改善または排除または感染後合併症の軽減等（これらを包含するが、これらに制限されない）の改善の発現等の、治療された個体の測定可能な軽減を達成するのに効果的である必要があり、また該感染物質に対する適当な抗体力価または高い力価、腫瘍質量の減少あるいは医療における当業者にとって適当であり、かつ公知である他の測定を使用できるものである必要がある。
本発明の方法において、本発明の免疫刺激剤、即ちイノシン-5’-一リン酸の誘導体（保護-IMP）は、種々の方法で投与できる。この免疫刺激剤は、該化合物自体として、製薬上許容される塩として投与でき、また単独であるいは製薬上許容される担体との組み合わせで投与できる。これらの化合物は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および経鼻投与を包含する、経口、皮下または非経口経路で投与できる。該化合物の移植片を使用することも可能である。治療される患者は、温血動物および特にヒトを含む哺乳動物である。
ヒトの治療は、ここに例示するマウスの場合よりも一般的に長期間に渡ることに注意すべきであり、該治療は該疾患過程の長さおよび薬物の有効性に比例する長さをもつ。一般的に、用量は体重に比例し、また代謝と投与量は、当分野で公知の上記のような因子を考慮して、ここに例示した動物モデルから、ヒトに変換される。
該用量は、単一投与量であっても、また好ましい態様における数日に及ぶ期間に渡る多重投与であってもよい。
保護-IMP誘導体を非経口経路で投与する場合、該誘導体は一般的に単位投薬量の、注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルション）に処方されるであろう。注射に適した製薬上の処方は、滅菌水性溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液に再現するための滅菌粉剤を包含する。該担体は溶媒または分散媒、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、液状ポリエチレングリコール等）、適当なその混合物、および植物油であり得る。
例えば、レシチン等の被膜の利用により、分散体の場合には所定の粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。非水ビヒクル、例えばスクアラン、綿実油、胡麻油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、およびエステル例えばイソプロピルミリステートを、該化合物の組成物用の溶媒系として使用することも可能である。更に、組成物の安定性、無菌性および等張性を高める種々の添加剤、例えば抗生物保存剤、酸化防止剤、キレート剤、およびバッファー等を添加できる。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって保証し得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含めることが望ましいであろう。注射可能な剤形の長期に渡る吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばアルミニウムモノステアレート、およびゼラチン等の使用によって可能となる。しかしながら、本発明によれば、使用するあらゆるビヒクル、希釈剤または添加剤が該化合物と相容性である必要がある。
適当な注射可能な溶液は、本発明の実施において使用される該化合物を、所望ならば種々の他の成分と共に、適当な溶媒の所定量中に配合することにより調製できる。
該保護-IMP誘導体の薬理処方物を、任意の相容性の担体、例えば種々のビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤を含有する注射可能な処方で、該患者に投与でき、あるいは本発明で使用する該化合物を、徐放性皮下移植片または特定部位をターゲットとする放出系、例えばポリマーマトリックス、リポソーム、および微小球等の形状で、該患者に非経口的に投与できる。本発明で使用するのに適した移植片は、移植後に徐々に溶解するペレット形状、あるいは当業者には周知の生体適合性放出単位をとることができる。このような周知の投与形および単位は、該活性成分が、数日乃至数週間の期間に渡って徐放されるように設計される。
本発明において有用な、周知の移植片および単位の例は、制御された速度で薬物を分配するための、移植可能な微量注入ポンプを開示している、米国特許第4,487,603号、皮膚を通して薬物を投与するための治療装置を開示している米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で薬物を放出するための、薬物注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号、連続的薬物放出のための、可変流量の、移植可能な注入装置を開示している米国特許第4,447,224号、多重チャンバー区画をもつ、浸透圧薬物放出装置を開示する米国特許第4,439,196号、および浸透圧薬物放出装置を開示する米国特許第4,475,196号に記載されている。これらの特許を本発明の参考文献とする。多くの他のこのような移植片、放出装置、および単位が当業者には周知である。
本発明で使用する該保護-IMP誘導体の薬理的処方物は、該患者に経口的に投与できる。公知の方法、例えば錠剤、懸濁液、溶液、エマルション、カプセル剤、粉剤、シロップ等の投与が利用可能である。
該保護-IMPおよびその誘導体を、経口、静脈内または経鼻的に放出し、かつ生物学的活性を維持する公知の技術が好ましい。
一態様においては、該保護-IMPは、まず静脈内投与して、該保護-IMPの血中濃度を適当なレベルに上げることができる。次いで、該患者内のレベルを経口投与剤形により維持する。但し、上記のような患者の状態に依存して、経鼻を包含する他の投与経路を利用することも可能である。該保護-IMPおよびその誘導体の投与すべき量は、治療すべき患者毎に変化し、１日当たり10μg/kg体重乃至１日当たり100mg/kg体重なる範囲で、また好ましくは１〜10mg/kg体重なる範囲で変動するであろう。
市販品として入手可能なFDA承認ワクチンが、本発明のワクチン−アジュバントの組み合わせを調製するのに使用できる。また、ワクチンは、それ自体ワクチン調製分野で公知の如く調製できる。一例として、肝炎ワクチンを使用する。例えば、市販品として入手できる肝炎ワクチンを使用できるか、あるいはFDAのガイドラインに従って、肝炎表面抗原の投与量を使用して調製できる。該アジュバントは、有効量を与える濃度で使用され、該濃度は一般的には0.01〜100mg/kg体重の範囲であろう。好ましい態様において、該アジュバントは0.01〜10 mg/kg体重なる濃度で使用されるであろう（ソーサ(Sosa)等，1992）。
また、ワクチン処方物を投与し、かつ5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体、例えばMp-IMPの一定服用量を同時に投与するであろう。
更にまた、該ワクチン自体、該ワクチンとアジュバントとの同時投与あるいはアジュバント−ワクチン複合体の初期投与に引き続き、該アジュバントを後投与することができる。該アジュバントは有効量で使用され、一般的には0.01〜100mg/kg体重なる量を与える濃度であろう。好ましい態様においては、該アジュバントは、0.01〜10 mg/kg体重なる量を与える濃度で使用されるであろう（ソーサ(Sosa)等，1992）。このアジュバントは、該初期投与から７日以内に、毎日あるいは良好な医療実務に従って決定された時点にて、各患者の臨床状態、投与部位および方法、投与スケジュールおよび医療実行者には公知の他の因子を考慮して、投与される。
本発明の目的にとって「有効量」とは、免疫付与技術において公知の如き考察により、このようにして決定される。ここで、該アジュバントおよびワクチンを投与したヒトにおける、および好ましい態様においては、標準的なワクチンに対して非−応答性であるヒトにおける、測定可能な抗−ウイルス力価を与えるのに効果的である必要がある。
該アジュバントおよびワクチンは、一緒に単位用量の注射可能な形状に、あるいは単独で、皮下および筋肉内および腹腔内投与を包含する、非−経口注入並びに経口および経鼻投与製剤として処方できる。注入に適した薬理処方物は、無菌水性溶液または分散液、無菌注射用溶液または分散液に再現するための無菌粉剤を包含する。公知の方法、例えば錠剤、懸濁剤、溶液剤、エマルション剤、カプセル剤、粉剤、シロップ等としての、アジュバント−ワクチンの組み合わせの投与等を利用できる。本発明の処方物を、その生物学的活性を維持しつつ、経口、経鼻または注射を介して放出する公知の技術が、好ましい。
公知のワクチンに対して非−応答性であるヒト、および本発明によって免疫付与されているヒトが、首尾よく免疫付与されるか否かを決定するために、力価を決定でき、またウイルス抗原に対する応答における増殖性のテストを、当分野で周知の如く行うことができる。
イソプリノシンは、マウスの致死的なインフルエンザ誘発処理において幾分かの有効性をもつことが示され、またウイルスの準感染的投与量で投与した場合には、ウイルスによる後の攻撃の際の、致死性が阻害された（グラスキー(Glasky)，1985）。この防禦活性は、恐らくイソプリノシンのアジュバント活性により説明される。
実施例に示すように、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の活性は、生存率を増大し、かつインフルエンザ誘発における平均生存時間は、イソプリノシンのそれに勝る活性を表す。致死的なインフルエンザ誘発において100%防禦を与える、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体とスクアランとの使用は、如何なる免疫刺激剤／免疫賦活剤についても、公知技術には報告されていない。サルモネラおよびインフルエンザによる攻撃の後の、保護-IMP誘導体の、生存率および平均生存時間を増大する作用（即ち、治療効率）は、5’-ヌクレオチダーゼに対して保護された任意のIMPに固有の作用である。これらの感染性の攻撃において、死は突然生じ、該保護-IMP誘導体が作用するメカニズムは、全体的な免疫薬理学的プロフィールからは予想されない。5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の延命並びにリステリアにおける成分率の増大作用は、如何なる他のプリン免疫調節剤については報告されていない。
5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の免疫刺激効果の該メカニズムに関して、ある仮定をなすことができるが、この作用形式により何等本発明は制限されるものではないと理解すべきである。感染誘発に伴う生存率に関与する重要なメカニズムについての最近の洞察は、任意の細胞内病原体、例えばトキソプラズマ(Toxoplasma)、ライシュマニア(Leishmania)およびリステリア(Listeria)を使用した研究には含まれていない（モスマン＆コフマン(Mossman and Coffman)，1989;スコット(Scott)，1991;ハークーフレンドチョ(Haak-Frendocho)等，1992;トリンチエリ(Trinchieri)，1993;トリップ(Tripp)等，1994;スコット(Scott)，1994;ボグダン(Bogdan)等，1991; フィオレンチノ(Fiorentino)等，1989）。このモデルにおいて、TH1細胞応答はIL-12により促進され、IL-2およびγ-IMPにより媒介され、かつIL-4により妨害され、またIL-10はリステリア等の感染に対して動物を保護する。IL-4〜IL-10によって媒介されるTh2応答は、リステリア等の感染による致死性と関連している。このモデルはマイコバクテリアレプラエ(Mycobacteria leprae)によるヒトの感染に対して適用されることが明らかにされている（セイリング(Seiling)等，1994）。かくして、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体が、Th2応答を越えるTh1の促進により機能するものと予想された。この予測は、更に5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の、抗体媒介応答を凌駕する、遅延型の過敏性応答に及ぼす選択的作用によって支持されている（ソーサ(Sosa)等，1992）。
本出願人は、以下に与える実施例において、MIMPが広い濃度範囲に渡り活性であって、PHA等のＴ細胞マイトジェンに対して、およびより可変性の度合いで、LPS およびヨウシュヤマゴボウ等のＢ細胞マイトジェンに対する、マウスおよびヒトのリンパ細胞の応答を刺激することを示す。MIMPの作用は、更に豊富化されたヒトCD4+およびCD8+リンパ細胞の応答について確認された。その上、これらの結果、HIVペプチド、IFN α、およびPGE2の、正常なリンパ細胞の該PHA応答に及ぼす抑制作用が、この抑制が温和乃至中程度であって、極端ではなくあるいは毒性でない場合には、逆転される可能性のあることを示している。これらの結果は、また高齢者およびHIV-感染個体のリンパ細胞が、該応答が過度に抑制されない場合には、PHAの存在下で、該保護-IMPによる刺激に応答できることを示している。これら研究における、例示したMe-IMPの作用はIMPの作用であると考えられる。というのは、Me-IMPおよびIMPの作用は、インビトロにおいて類似するからである。
Ｔリンパ細胞に及ぼす、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸の選択的作用は、レセプタに基づく相互作用であることを暗示している。Me-IMPは、成熟Ｔリンパ細胞に及ぼす、ここに記載した作用の他に、前胸腺細胞の分裂マーカーを誘発することが明らかにされている（ツーレーン(Touraine)等，1991）。
該プリンの引上げ路(salvage pathway)は、Ｔリンパ細胞の発達および機能に関する重要な関連性をもつ。アデノシンデアミナーゼおよびヌクレオシドホスホリラーゼ両者の欠乏は、機能性のＴリンパ細胞の不足した、免疫不全症候群をもたらす。幾つかのイノシン含有分子が、Ｔリンパ細胞の発達および機能にとって必須であるものと示唆できる。これを予測する基礎は、伝達因子との関連で存在している（ウイルソン＆フーデンバーグ(Wilson and Fudenberg)，1983）。IMPが伝達因子現象の一部である場合には、該保護-IMPは伝達因子機能の非−特異的局面を、多分Ｔリンパ細胞上のレセプタを介して、模倣できる。本出願人は、伝達因子調製が、前胸腺細胞中の分裂マーカーを誘発する、即ちMe-IMPを模倣することを確認した（ハッデン(Hadden)等，1986）。
保護-IMPがIL-2作用に関して調節性であることは、Th1型Ｔヘルパー細胞により媒介される、細胞性免疫応答を統括する上で、IL-2により演じられる中心的役割において重要な意味をもつ。この点に関連して、保護-IMPを使用した本出願人の研究で使用した主なマイトジェンPHAが、サイトカインのTh1-パターン、即ちIL-1、IL-2、γ-IFNおよびIL-12を選択的に誘導することに注目すべきである。本出願人はPHAがIL-10を誘発するが、IL-3またはIL-4を誘発しないことを見出した。初期のデータは、Me-IMPが増大するPHA-誘発IL-2またはγ-IFNに対して僅かな効果しか及ぼさず、しかも強力にIL-10産生を阻害することを示している。これらの観測は、保護-IMPがTh1応答に影響を及ぼすことを示唆している。Th1応答は、HIV、癌、および病原体感染、即ちトキソプラズマ、リステリア、およびライシュマニアに対する抵抗性において重大であることが明らかにされている（クレリシ＆シェアラー(Clerici and Shearer)，1995;テップラー(Teppler)，1993;スコット＆トリンチエリ(Scott and Trinchieri)，1989）。かくして、保護-IMPの、これら応答を好ましいものとする作用は、このような条件における臨床的有用性を示している。
この分析は、保護-IMPを用いたインビボでの研究により支持されており、該研究においてはDTHが、PFC応答を越えて選択的に刺激され、かつAIDS、腫瘍、および感染誘発（リステリアおよびサルモネラ）における生存率が増大している。これらの研究において、Me-IMPは、１mg/kgまたはそれ以下の投与量で、経口経路で活性であることが立証されており、また無毒であった（経口LD50>5000 mg/kg）。
従って、保護-IMP化合物、例えばMe-IMPの臨床的応用は、二次免疫不全における免疫回復と関連しており、該二次免疫不全では、Ｔリンパ細胞機能が弱体化され、かつＴリンパ細胞数は妥当に保存されている。このような不全症状は、HIV感染(ARC)および癌両者の比較的初期の段階において報告されている。
初期のHIV感染において、Ｔリンパ細胞応答は、AIDSへの進行を阻止する上で必須であると考えられている。Ｔリンパ細胞応答は、gp160、gp41およびTATを含むHIVの生成物により抑制される（論評については、グッド(Good)等，1991を参照のこと）。最近の研究は、P-15Eと関連したレトロウイルスペプチド、CKS-17が、IL-2およびγ-IFNの生産を阻害し、しかもIL-10産生を促進することにより、Th1からTh2へのシフトを誘発し得ることを示唆している（ハラグチ(Haraguchi)等，1995）。本出願人はMe-IMPの、CKS-17との相同性をもつgp41の17アミノ酸ペプチドの免疫抑制作用を逆転させる作用をテストし、該抑制が温和乃至中程度である場合に、反転性であることが分かった。Me-IMPも、HIV-感染した個体のPHA応答を増大した。これらの結果は、保護-IMPが、HIV-感染した患者のAIDSへの進行を阻止するのに使用できることを示している。
他のウイルス感染における保護-IMPの使用も、本発明により開示される。というのは、免疫抑制が研究されたあらゆる型のウイルス感染に関与しているからである（ルース＆ホロホフ(Rouse and Horohov)，1986）。高齢者におけるインフルエンザの高い致死率および高い罹患率の原因となる免疫抑制は、二次的バクテリア感染によるものである。インターフェロン生産は、ウイルスが免疫性を抑制する可能性のあるメカニズムの一つを表す。保護-IMPの、PHA応答におけるIFN αの抑制を逆転する作用は、この点に関するその応用を推奨している。
炎症および肉体的外傷は、部分的にプロスタグランジンにより媒介される、細胞性免疫応答を抑制することが知られている（デービス＆シーアズ(Davis and Shires)，1986）。MIMPの、PHA応答におけるPGE2の抑制作用を、逆転させる能力は、これら形態の二次免疫不全症におけるその有用性を支持している。
上記議論は、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の利用に関する事実上のおよび理論的な基礎を与える。本発明と共に使用される方法およびその利用性は、以下の実施例により明らかにすることができる。
実施例
一般的方法：
特に断らない限り、以下の物質および手順を使用した。
物質：
メチル-5’-イノシン−一リン酸（メチル-IMPまたはMe-IMP）、メチル-5’-イノシン−リン酸(Mp-IMP)、エチル-5’-イノシン−一リン酸（エチル-IMPまたはE-IMP）、アルギニン-5’-イノシン−一リン酸（アルギニン-IMPまたはArg-IMP）および（ヘプタミン-1-オール）-5’-イノシン−一リン酸(Ha-IMP)を、それぞれ製造例１、２、３、４および５に従って調製した。細胞培養で使用するためのMIMP処方物は、リムラス（カブトガニ）溶解物アッセイ（MD州、ウォーカーズビルのウイッタカーバイオプローダクツ(Whittaker Bioproducts)）により、内毒素を含まないことを確認した。
イノシン-5’-一リン酸（IMP）およびアデノシン-5’-一リン酸は、シグマケミカル社(Sigma Chemical CO.)（MO州、セントルイス）から入手した。
リンパ細胞マイトジェン植物凝集素（PHA）、コンカナバリンＡ(Con A) およびヨウシュヤマゴボウマイトジェン(PWM)は指示のごとく、バローズウエルカム(Burroughs Wellcome)（NC州、リサーチトライアングルパーク）、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)（MO州、セントルイス）、ギブコ(Gibco)（NY州、グランドアイランド）およびミューレックスダイアグノスティックス(Murex Diagnostics)（GA州、アトランタ）から入手した。
ヒツジ赤血球(SRBC)はダイアメディックス社(Diamedix Corp.)（FL州、マイアミ）から入手した。ハンクス平衡塩類溶液およびモルモット補体はギブコから入手した。アガロースはバクト(Bacto)（MI州、デトロイト）から入手し、DEAE−デキストラム(DEAE-Dextram)はシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)（MO州、セントルイス）から入手した。細胞培養プレート（96ウエルおよび６ウエル）は、ファルコン(Falcon)社から入手した。フィコールハイパック(FICOLL-HYPAQUE)はファルマーシア社(Pharmacia，Inc.)（NJ州、ピスカタウエイ）から入手し、E.コリリポポリサッカライド（LPS）はシグマ社から入手した。
組み換えIL-2（rIL-2）は、ヘキストファーマシューティカルズ(Hoechst Pharmaceuticals)（FRG州、フランクフルト）社のG.カスプリッツ(Caspritz)から贈呈された。
M.ストランド(Strand)（MD州、バルチモアのジョーンズホプキンス大学）は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のgp160ペプチドのgp41部分を由来とする17アミノ酸をもつ配列を合成し（ロイグ＆ストランド(Reugg and Strand)，1990）、親切にも我々に提供してくれた。
プロスタグランジンE2はシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から入手し、また組み換えインターフェロンα（IFNα，イントロン(Intoron)Ａ）はシェーリング社(Schering Corp.)（NJ州、ケニルワース）から入手した。
ヒトドナーは22名の健康なコントロール（年齢構成20-50）、24名の高齢者（平均年齢84±1）、８名のHIV-感染プレ−AIDS患者（CDCクラスII-CD4カウント544）および８名のAIDS患者（平均CD4カウント40）を含む。
ヒトCD4+およびCD8+リンパ細胞サブセットは、工業的パンニング技術を利用して、正常なコントロールから得た（CA州、サンタクララのアプライドイムノサイエンスズ(Applied Immune Sciences)）。
細胞培養
細胞培養に係わる全工程は無菌条件下で実施した。ここに記載されていない細胞性免疫学の一般的方法は、細胞性免疫学技術に関する参考文献、例えばミッシェル＆シーギ(Mishell and Shiigi)，細胞性免疫学における選ばれた方法(Selected Methods in Cellular Immunology)，W.H．フリーマン社(Freeman & Co.)(NY,1981)およびスタイツ＆テール(Stites and Terr),基本および臨床的免疫学(Basic and Clinical Immunology),第７版，アップルトン＆レンジ(Appleton & Lange)（コネチカット州、ノアウォーク，1991）に記載されている。
リンパ細胞形質転換
インビトロ：ヒト末梢血リンパ細胞(HPBL)およびマウス脾臓リンパ細胞(MSL)両者を使用した。増殖は、ハッデン(Hadden)等(1975)およびハッデン等(1986)に記載されているように、トリチウム化したチミジンの取り込みによりアッセイした。HPBL形質転換については、PHAおよびPWMを0.5 μg/mlで使用した。MSL形質転換については、Con Ａを0.5 μg/mlで、植物凝集素(PHA，ミューレックスダイアグノスティックス(Murex Diagnostics)（GA州、アトランタ）を0.5 μg/mlでおよびリポポサッカライド内毒素（LPS，MO州、セントルイスのシグマ社）を10μg/mlで使用した。保護-IMP誘導体を添加する場合には、これらは培養の開始時点において、0.1 μg/ml〜100 μg/mlの範囲内の種々の濃度で添加した。
マウス脾細胞を、標準的な手順（ハッデン(Hadden)等，1975）で、4-12月齢のBALB/cマウスから得た。これら細胞は、5%のウシ胎児血清（FCS，UT州、ローガンのハイクロンラブス(Hyclone Labs)）を補充した最小必須培地（MEM，NY州、グランドアイランドのギブコラブス(Gibco Labs)）１ml当たり1.5×106細胞／mlにて、マイクロウエルプレート内で培養し、最終パルスにおける、(3H)トリチウム化チミジン（DE州、ウイルミントンのニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear)，6.7Ci/mM; 2.5Ci/ml）の取り込みにより測定される、マイトジェンに対する該細胞の増殖応答についてテストし、次いで液体シンチレーションスペクトル法を実施した。ヒト細胞を104/mlにて播種し、3H−チミジンによる18時間パルスを使用して、48時間培養した。
インビボ：化合物をガバージュによって経口的に、または腹腔内投与した。終了時点において、フローレンチン(Florentin)等(1982)に記載されたようにして脾臓を得、かつ細胞を、Con A = 0.5 μg/ml、PHA = 0.5 μg/mlまたはLPS = 0.5 μg/mlを使用した増殖応答を調べるために調製した。
抗体−産生細胞
直接マウス脾臓抗体−産生細胞(PFC)を、幾分改善したジェーン(Jerne)等(1963)の技術に従ってアッセイした。簡単に言えば、一群のマウスを、腹腔内経路でSRBCにより免疫付与し、対象とする化合物を、結果において示した如く、経口または腹腔内経路で投与した。５日後に、脾臓細胞の懸濁液を調製し、その生存性を、トリパンブルー排除テストにより測定した。細胞は3x106/mlで懸濁した。0.2mlの脾細胞懸濁液を、0.8 mlの0.7%アガロースおよび0.2 mlの新たに洗浄したSRBC(6x105/ml)と混合した。この混合物を、即座に該プレートに注ぎ、固化させた。5%CO2含有湿潤空気雰囲気下で37℃にて60分間インキュベートした後、該プレートを、ハンクス平衡塩水で1:5に希釈した、モルモット補体１mlで満たした。溶血プラークを、倍率4xの倒立スコープで計数した。
統計的解析
各実験は、示した如く２〜10回行った。各濃度点において、各ドナーから４つのサンプルを使用した。データは、個々の代表的な実験についての、平均±平均の標準誤差(SEM)として、あるいはプールしたデータについて、コントロールとの比±SEMとして表した。特に断らない限り、データはスチューデンツｔ−テストを利用して、統計的有意性につき解析した。
イムノアッセイ手順
一般的に、イムノアッセイEIAsまたはRIAsは、表示した如く市販品として入手できるキットを使用して実施した。また、EIAは当業者には公知の如く発展させ得る。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体両者を作成し、かつ該アッセイで使用することができる。標準的抗体産生技術は、当業者には周知であり、一般的にはハーロウ＆レーン(Harlow and Lane),アンチボディーズ(Antibodies): アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、コールドスプリングハーバー，NY，1988に記載されている。適当な場合には、当業者には周知の如く、他のイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)を利用することも可能である。利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に広く記載されている。例えば米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号および同第5,011,771号、並びにサムブルック(Sambrook)等，モレキュラークローニング(Molecular Cloning):アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)，NY，1988を参照のこと。
細胞内病原体を用いた研究用の一般的方法
テストした病原体に依存して、マウスの種々の菌株を使用した。サルモネラおよびリステリアをテストするために、体重14-16gのBALB/cマウスを使用した。インフルエンザウイルスに対する応答については、マウスのNMRI系を使用した。これらのマウスはロシア、アカデミーオブメジカルサイエンス(Academy of Medical Science)のアニマルラボラトリー(Animal Laboratory)から入手し、本明細書に記載の実施例11-13で使用した。
肺炎ワクチンを使用した研究用の一般的方法：動物
タンパクに対する免疫応答のための、Pre-S2ゾーンS-遺伝子HBVによりコード化された、種々の系のマウスを、以下のハプロタイプ順に配置する（ベナセラフ＆マックデービット(Benaceraf and McDevitt)，1972）: H-2b>H-2d>H-2s>H-2k>H-2f。DBA/2マウスは、抗原のみで処理した場合には、高いレベルでHBsAgに対する抗体を生産しない（ウォーカー(Wakler)等，1981）。従って、体重16-18gの雄マウスは、ロシア、アカデミーオブメジカルサイエンス(Academy of Medical Science)のアニマルラボラトリー(Animal Laboratory)から入手し、本明細書で記載する実施例で使用した。このマウス系は、これらが肝炎Ｂウイルスに対する貧弱な応答体であることから、選択された。
照射プロトコール
実験用のマウスを、60Coγビーム源を使用して、25rad/min(1 rad = 0.01 Gy)なる照射線量で４分間照射した。データは、各群における10匹の動物の平均値を表す。
イムノアッセイ手順
免疫付与したマウス由来の血清検体を、酵素イムノアッセイ(EIA)において抗-HBsの存在に対してテストした。このテストは、ロッシュダイアグノスティカ(Roche Diagnostica)製の診断キットを、製造業者等の指示に従って使用して実施した。この抗-HBs EIAキット（ロッシュ製）の感度は<10 IU/lである。
抗体濃度は、以下のような濃度：10 IU/L、50 IU/L、100 IU/Lおよび150 IU/Lをもつ標準血清パネル（ロッシュダイアグノスティカ）で検出した抗-HBsの結果に基づいて工夫した検量線の助けを借りて測定した。これら２種の実験の結果は平均値の計算のために使用した。
保護-IMPおよびHBsAg 投与のためのプロトコール
HBsAgは、注射間２週間間隔で、２度、0.2 ml PBS(pH 7.4)中、16mg/マウスなる投与量で投与した。
保護-IMP、MIMPは、50 mg/kgなる投与量にて、経口または腹腔内量経路で導入した。
MIMP投与について３つのスキームを使用した。即ち、
スキーム#1: MIMPを、HBsAG導入の30分前に、ガバージュによって経口経路で投与した。
スキーム#2: HBsAgおよびMIMPを腹腔内投与した。
スキーム#3: HBsAgおよびMIMPを、一度腹腔内投与し、次いで４日間MIMPをを経口投与した。
製造例１：メチル-5’-イノシン−一リン酸
縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、イノシン-5’-一リン酸とメタノールとを反応させることにより、メチル-5’-イノシン−一リン酸を調製した。
イノシン-5’-一リン酸(2.2g，6 mM)のメタノール(300 ml)溶液に、トリブチルアミン(1.4ml，12 mM)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(6.56g，30 mM)を添加した。この溶液を４日間25℃に維持し、減圧下で蒸発乾固した。2.3%NaOH溶液(20ml，11.4mM)を、得られた残渣に添加し、生成した懸濁液を濾過した。得られた沈殿を水(20ml)で洗浄し、捨てた。濾液を３回エーテルで抽出し、50ｇのアンバーライト(Amberlite)IR/20 PLUS(NH4 +型)を充填したカラム内に配置し、水で溶出させた。UV吸収画分を減圧下で蒸発させ、得られたシロップをメタノール(20ml)に溶解した。この溶液をアセトン(300 ml)に注ぎ、得られた懸濁液をアセトンおよびエーテルで洗浄し、真空下でP2O5上にて乾燥して、粉末生成物を収量1.4g(68%)で得た。この生成物の融点m.p.は145℃であり、またUVλmaxは249 nm(pH 5.5，H2O)および253 nm(pH 10)であった。
元素分析(C11H20N5O9P(M.W．397.24)として計算)
計算値： C，33.25; H，5.07; N，17.63
実測値： C，33.36; H，5.13; N，17.34
NMR データDMSO-d6：3.50（s，3H，CH3OP），3.20-4.70（m，7H，リボース），5.95（d，1H，アノマーJ-6Hz），8.12（s，1H，C-2），8.40（s，1H，C-8），8.20（br.s，5H，NH(CO)およびNH4）
製造例２：メチル-5’-イノシン−一リン酸
2’,3’-イソプロピリデンイノシンと、メチルホスホン酸ジクロリドとを反応させ、次いで該ヌクレオチドを脱保護することにより、メチル-5’-イノシン−一リン酸を調製した。
2’,3’-イソプロピリデンイノシン(2g，6.49mM)と50mlの乾燥ピリジンとの10℃の低温混合物に、メチルホスホン酸ジクロリド(0.86g，6.49 mM)を滴下した。この混合物を18時間攪拌した後、氷および水を添加して、保護されたヌクレオチドを得た。該保護されたヌクレオチドの加水分解を、蟻酸を使用して実施した。HPLCを、H2O/メタノールを使用して実施した。適当な画分を減圧下で蒸発させて、メチル-5’-イノシン−一リン酸を生成した。
製造例３：エチル-5’-イノシン−一リン酸
製造例１と同様にしてエチル-5’-イノシン−一リン酸を調製した。但し、イノシン-5’-一リン酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミドを縮合剤として使用して、エタノールと反応させた。
製造例４：アルギニン-5’-イノシン−一リン酸
縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、イノシン-5’-一リン酸とアルギニンとを反応させることにより、アルギニン-5’-イノシン−一リン酸を調製した。
イノシン-5’-一リン酸(0.55g，0.15 mM)のホルムアミド(3 ml)に溶液に、L-アルギニン(1.04g，6mM)を添加した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.6g，7.5 mM)のt-ブチルアルコール(10ml)溶液を該混合物に添加し、得られた懸濁液を80℃にて８時間加熱した。
生成した沈殿を濾別し、３回水洗し、、併合した濾液を蒸発させて、t-ブチルアルコールを除去した。この溶液を３回等体積のエーテルで抽出し、真空下で蒸発させて、シロップを得た。エタノール(30ml)を添加して、生成する沈殿を濾別し、極めて吸湿性のガム状物質を得た。10日間放置した後、該ガム状物質は固体となった。mp 130℃、UVmax 249 nm(H2O)。
製造例５：（ヘプタミン-1- オール）-5’-イノシン−一リン酸
縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、イノシン-5’-一リン酸と6-アミノ-2- メチル-2- ヘプタノールとを反応させることにより、（ヘプタミン-1- オール）-5’-イノシン−一リン酸を調製した。
イノシン-5’-一リン酸(1.045g，3 mM)のホルムアミド(5 ml)溶液に、6-アミノ-2- メチル-2- ヘプタノール塩酸塩を添加した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(6.22g，30 mM)のブチルアルコール(25ml)溶液を該混合物に添加した。得られた反応混合物を、攪拌下で80−90℃にて８時間加熱した。生成した沈殿を濾別し、5mlの水で３回洗浄した。ジシクロヘキシル尿素の沈殿を捨て、併合した濾液を蒸発させて、ブチルアルコールを除去した。この溶液を３回エーテル抽出し、真空下で蒸発乾固させた。得られた油状残渣をアセトンに懸濁して、白色の吸湿性物質を生成した。これは、水に溶解し、活性炭素で処理し、次いでアセトン中で沈殿させることにより精製して、白色の吸湿性物質を得た。UVmax 249 nm（H2O）。
精製した物質の収量：0.7 g (53.4%); mp 95℃；実験式：C18H28N5O8P:
%P 計算値 7.03; 実測値 5.81
製造例６
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（HBsAg）
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（HBsAg;サブタイプad及びay）を以下のスキームに従って抗原キャリヤーの血漿から精製した。
（１）初めに２倍量の生理的塩類溶液で希釈したHBsAgを含む血漿を８０℃において６０分間水浴中で加熱した。生成した擬血塊を除去し、機械的に崩壊させ、変性タンパク質を遠心分離により除去した。
（２）次いでHBsAgを、ポリエチレングリコールM 6000を用い、１５％(wt/vol)の最終濃度で再び沈殿させた。HBsAgを含む沈殿物を0.9 M NaClに対して透析し、ペプシン（100 mg/ml）及びTween-80（最終濃度 2%）で処理した。
（３）得られたHBsAg溶液を線形蔗糖勾配で２回超遠心分離した。精製したHBsAg試料を0.9 M NaClに対して透析し、１mlを分取し、−６０℃で凍結させた。
（４）５０乃至１００倍に濃縮した後、得られた試料は以下の特性を有した。試料は直径が１８乃至２５nmの球状粒子のみからなり、DANE粒子もHBsAgの糸状粒子もなかった。HBeAg（Abbott laboratoriesからのEIA kit）;DNA-ポリメラーゼ;有向増幅方法によるHBV-DNA;及び正常なヒトの血漿を特徴とするタンパク質の存在に関する試験においては、負の結果が得られた。
得られた試料は、Ｂ型肝炎ワクチンの実験のロットの加工の基礎として使用した（Alper et al.,1989）。
あるいは、Ｂ型肝炎ワクチンはSmithKline Beecham Biologicalsから入手でき、HBsAgはSigmaから購入できる。
実施例１
5′-ヌクレオチダーゼ活性からの保護に関する試験
5′-ヌクレオチダーゼ（ミズーリ州セント・ルイスのCrotalus atrox venom,Sigma Chemical Co．から入手）のIMPを加水分解する能力を、Amesらの方法（1960）に従って無機リン酸塩の遊離を測定することにより調べた。ヌクレオチド試料（４０乃至６０nmole）を、１００μlの総容量中に５０mmoleのpHが7.3のHEPES及び５mmoleのMgCl2を含む０．０２単位の5′-ヌクレオチダーゼを用いて３７℃で１０分間インキュベートした。モリブデン酸ナトリウムの０．４２％1N H2SO4:10% アスコルビン酸（6:1,v/v）溶液８００μl、次いで０．３mlのH2O・KH2PO4を添加することにより反応を停止した。標準（２乃至８０nmole）は同様に処理し、試料及び標準を４５℃で２０分間インキュベートした。リン酸塩は８２０nmの吸収により決定した。ヌクレオチドは含むが酵素を含まないブランクは、非酵素的加水分解に関して補正するために平行して試験した。加水分解された百分率を、２４９nmにおける吸光係数ｅ＝１２．２を用い、紫外線吸収により決定したヌクレオチド基質の正確な量から計算した。４つの実験結果を表１Ａにまとめる。
試験した物質は、5′-ヌクレオチダーゼによる分解作用に対して種々の耐性があることが見出された。Ha-IMP及びArg-IMPは、それぞれ加水分解に対して軽度及び中程度の耐性を示すが、Me-IMP及びMp-IMPの両方は、E-IMPと同様に加水分解に対して非常に耐性があった。5′-IMP誘導体はいずれもIMPの加水分解を阻害することが見出されず、化合物はそれ自体では5′-ヌクレオチダーゼの阻害剤ではないことを示した。
IMP、MIMP及びアデノシン-5’-モノホスフェート（AMP）について、5’-ヌクレオチダーゼによる分解作用に対する感受性を調べるという更なる組合わせの実験を企画した。第一のインキュベーションが、２００μlの総容量中に０．１mMのHEPES 及び１０mMのMgCl2を含む２０分間のそれであること以外は前述のような実験記録であった。ヌクレオチドの加水分解％は、各定量について二重に実施した。結果を表１Ｂに示す。
これらのデータは、5′-IMP誘導体の免疫刺激効果が、特定の置換基の種類よりむしろ置換5′-IMPの加水分解に対する耐性の作用であることを示す。
実施例２
ヒトの末梢血リンパ球を用いた研究
分裂促進因子による刺激に対する正常なHPBLの応答
正常なヒトの末梢血リンパ球（HPBL）を、分裂促進剤PHA又はPWMで刺激した。一連の実験においては、０．１、１、１０、及び１００μg/mlの濃度範囲で、これらの応答を刺激する効果について、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びイノシン-5′-モノホスフェート(IMP)について分析した。個々の血液ドナーは、これらの分裂促進因子及び化合物に対する応答において変化するが、５種類の全てのIMP誘導体は図１に示すように一貫してPHAに対してHPBL応答を刺激した。IMP自体はMe-IMPに匹敵する活性を示した。Arg-IMP、Me-IMP及びE-IMPは更に活性であったが、Ha-IMPの活性は低く、Mp-IMPは最も活性な化合物であった。試験した化合物はPWM応答に対してほとんど又は全く影響を示さなかった。化合物はいずれも分裂促進因子の不在下ではHPBLを刺激しなかった。PHA応答はＴリンパ球増殖に反映し、PWM応答はＢリンパ球増殖に反映するので、結果は5′-置換IMP誘導体が優先的にＴリンパ球応答を高めることを示す。代表例として、Me-IMP(MIMP)を以下の実験に使用した。
図２には、IMP 及びMIMPの存在下における２人のドナーのインビトロにおけるPHAに対するHPBL応答の結果を示す。３人の正常なドナーに関するPHAを用いた刺激に対する対照リンパ球の応答は、一連の濃度範囲にわたってMIMPにより影響されなかった。
ヒトの末梢血リンパ球は、平均して約８０％がＴリンパ球で２０％がＢリンパ球であり、Ｔリンパ球のうち２／３は、CD4＋ヘルパー／インデューサ表現型であり、１／３は、CD8＋抑圧遺伝子／細胞毒表現型である。CD4＋Ｔ細胞及びCD8＋Ｔ細胞の濃縮は、単クローン抗体をコーティングしたフラスコへの粘着性を用いてその他の表現型を除去して減少させる（＞９８％）ことによりなしうる（パニング）。そのような濃縮は３つの正常な対照（共同利用データ）とともに使用され、図３はこれらの２種の細胞の集団に及ぼすMIMPの影響を示す。CD4 ＋及びCD8 ＋リンパ球のPHA応答はMIMPにより有意に増大される（３人の各々の応答についてｐ＜０．０１）。
HIV-誘導ペプチド、インターフェロンα及びPGE 2 による抑圧現象に対するHPBLの応答
ヒトの免疫欠損ウィルス(HIV)の膜内gp41部分の免疫抑制サイトを表す合成17アミノ酸ペプチドを、対照からのリンパ球について試験した。このペプチドが、１００mMの最大抑圧供与量でPHA-誘導リンパ球増殖の漸進的な抑制を誘導する５つの実験の内代表的な実験が図４に示されている。種々の程度のペプチドによる抑制を組み合わせて、０．１乃至１００μg/mlのMIMPの効果を調べた。ペプチド-誘導抑制が５０％未満の場合には、MIMPは増殖応答を正常に近い範囲に回復させた。しかしながら、抑制が更に過酷（＞５０％）である場合には、MIMPの効果は有意ではなかった。これらのデータは、効果が軽度乃至中程度であるが、過酷ではない場合には、MIMPがHIV-関連ペプチドの免疫抑制を逆転しうることを示す。
ウィルス感染はリンパ増殖低下応答と関連する。図５は、リンパ球のインビトロPHA-応答を対照から抑制するウィルス-誘導媒介物質、rIFN- αの効果、及び効果が中程度である場合、すなわち１０及び１００単位/mlのIFN-α濃度において抑制を逆転させる１、１０、１００μg/mlのMIMPの効果を示す。
リウマチ様動脈炎にみられるような炎症はリンパ増殖低下応答と関連する。図６は、通常のリンパ球のPHA-応答を抑制する炎症伝達物質の一であるPGE2（１０-5M）の効果、及び抑制を逆転させるMIMP（１乃至１００μg/ml）の効果を示す。
高齢者及びHIV-感染者のHPBLの応答
図７は、高齢者及びHIV-感染者のPHA応答、及び正常の対照（Ｃ）と比較した１００μg/mlのMIMPによる刺激の効果を表す。対照患者（２２）は正常のPHA及びMIMP応答を示した。１５人の高齢患者（Ag＋）は正常のPHA応答及びMIMPに対する応答を示した。９人の高齢患者（Ag−）は著しく低下したPHAに対する応答及びMIMPに対する応答を示した。PHAに対する応答が不十分な９人の外見上健康な高齢患者のうち、５人につてリンパ球の数を調べると平均して正常であった。
８人のHIV-感染者(ARC)は平均して、平均的な正常のPHA応答の５０％を示し、MIMPに対しては有意に応答した。８人のエイズ患者は応答を示さなかった。これらのデータは、MIMP治療の臨床被検者は、治療前にインビトロで薬剤に対する感受性の予備テストをすべきであることを示唆する。
１０及び１００μg/mlのMp-IMPを用いて前述の実験記録を繰り返すと、１００μg/mlのMIMPに関して得られた結果と同一の結果が得られた。
実施例３
マウスの脾臓のリンパ球を用いた研究
MSLを分裂促進剤Con A及びLPSで刺激した。０．１、１、１０、及び１００μg/mlの濃度範囲の、これらの応答を刺激する効果に関する一連の実験において、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びIMPについて分析した。図８に示されるように、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びIMPはCon Aに対するMSLの増殖応答を刺激した。
マウス（図８）及びヒトのリンパ球（図１）のデータを比較すると、ヒトのリンパ球のほうがマウスのリンパ球よりこれらの化合物に対して敏感である。
更なる実験において、マウスの脾臓細胞を、PHA又はLPS及びMIMP（１乃至１００μg/ml）を用いてインキュベートした。MIMPは、分裂促進剤の存在下では脾臓細胞応答に影響を及ぼさなかった。分裂促進剤の存在下では、以下に示すように、MIMPはトリチウム標識チミジンの添加により測定されるリンパ球の増殖応答を漸進的かつ有意に増大させた。PHAに対する脾臓細胞の応答は優先的にＴリンパ球応答に反映するので、Con Aを用いた場合に見られる応答を確認した。LPS応答も又前記の実験に平行して応答する。
データは４匹の異なる動物から得られ、各濃度について４倍の試料を表す。それらは平均したCPN±SEMとして表され、*はｐ＜０．０５の有意性を示し、**はｐ＜０．０１の有意性を示す。
実施例４
PFC応答のインビボ刺激
腹腔内(ip)投与
化合物がインビボでリンパ球を刺激するか否かを決定するために、マウスに１×１０8細胞のヒツジの赤血球(SRBC)及び体重１kg当たり５０mgのHa-IMP、Arg-IMP、Me-IMP又はIMPを腹腔内投与して免疫性を与え、脾臓のプラーク抗体形成細胞（PFC）を５日後に測定した。Ha-IMP、Arg-IMP及びMe-IMPは、（図９に示されるように）PFC応答を有意に刺激した。体重１kg当たり５０mgの３つの実験においてIMPを対照と比較したところ、有意な効果はなかった（IMP:平均PFCが１９７±２１の１２試料；対照：平均PFCが２１０±１７の１５試料）。このことは、5′-ヌクレオチダーゼ活性から保護された場合にはIMP単独でインビボ活性を有することを示す。
PFC応答に及ぼすHa-IMP、Arg-IMP及びMe-IMPの投与量応答のデータは、それぞれ図１０Ａ、１０Ｂ及び１０に示されるように表された。３つの全ての化合物は、体重１kg当たり５０mgで最適に刺激したが、Me-IMPは低投与量で活性であった。
これに対し、マウスのリンパ球増殖に関するインビトロデータにおいては、試験した化合物の中でMe-IMPが最も影響力があると思われた。
経口投与
経口投与時に活性があるか否かを決定するために、マウスに１×１０8細胞のヒツジの赤血球(SRBC)を腹腔内投与し、Me-IMPを経口投与して免疫性を与えた。Me-IMPは、SRBC抗原で免疫化するとき及びその後５日間毎日投与した。脾臓のプラーク抗体形成細胞(PFC)は５日の終了時に測定した。図１１は、種々の投与量のMe-IMPに関する結果を示す。
SRBC抗原とともに、及び５日間毎日経口的に投与されたMe-IMPは、体重１kg当たり５０mgのときにピークとなりPFC応答を刺激した。
実施例５
Me-IMPのインビボ投与後の分裂促進物質に対するインビトロ応答
実施例４の実験に平行した実験により、脾臓のリンパ球のPHA及びCon A応答の両方がMe-IMPの経口投与により刺激されることを確認する。
脾臓のリンパ球は、５日間体重１kg当たり０乃至１００mgの範囲でMe-IMPを経口投与し、次いで犠牲したマウスから得た。脾臓のリンパ球をPHA（０．５μg/ml）又はCon A（０．５μg/ml）とともに４８時間インキュベートした。培養は、最後の１８時間はトリチウム標識チミジンでパルスした。図１２は、種々の経口投与量のMe-IMPに関する結果を示す。
これらのデータは、IMPと比較して、5′-IMP誘導体がＴ細胞依存性抗体応答の有力な補助薬であり、Me-IMPの場合には、Ｔリンパ球増殖応答の有力な刺激剤であることを示す。
使用した投与量においては、Me-IMPは非経口及び経口投与の両方において活性であり、外見上非毒性であった。Me-IMPの急性毒性(LD50)は、腹腔内投与では体重１kg当たり５００mg以上であり、経口投与では体重１kg当たり５０００mg以上であった。
実施例６
遅延型のインビボ過敏性の刺激
１０6乃至１０9細胞の勾配のある投与量でSRBCを腹腔内投与することによりマウスに免疫性を付与した。予備的な実験では、遅延型の過敏症に対するSRBCの最適免疫化投与量は１０7乃至１０8細胞であることが示された。この研究においては、動物を免疫化するのに１０7の投与量が選択された。
免疫化の４日後に、５０μlの食塩加リン酸緩衝液（PBS）中の１０8のSRBCを各マウスの左後ろ足に皮下注射することにより抗原投与した。賦形剤（５０μl）を対照として右後ろ足に皮下注射した。試験する化合物は、免疫化時又は誘発時のいずれかに腹腔内に注入した。抗原投与の２４時間後に、技術者のカリパスを用いて足の太さの増加（左−右）として足の膨潤を測定した。
結果は、足の太さの増加として０．１mm単位で表す。このようにして測定した遅延型の過敏症の特性決定は、MacDonaldらにより既に記載されている(1979)。図１３及び１４はこの試験の結果を示す。特に、図１３は、免疫化時に投与された場合の、Me-IMPに関する投与量応答プロットを示す。図１４は、免疫化時(Immunization)に投与された場合及び抗原投与時(Challenge)に投与された場合の、Me-IMPに関する応答を示す。
免疫化時に１回でMe-IMPを投与した場合には、遅延型の過敏症が有意に刺激された。抗原投与時に１回でMe-IMPを投与した場合には、その効果は有意ではなかった。これらのデータは、おそらく免疫応答の導入肢(afferent limb)、Ｔヘルパー細胞における作用によりMe-IMPが細胞免疫を促進することを示す。このことは、増大する抗体産生の投与量より少ない投与量においてもそうであり、DTH及びこれらの応答を媒介するTh1細胞に及ぼす優先的な効果を示す。
実施例７
保護された-IMP誘導体によるインビボ治療
フレンド白血病ウィルス(FLV)
保護された-IMP誘導体の臨床治療の有用性を示すために、BALB/cマウスにフレンド白血病ウィルス(FLV)を感染させた。対照マウスは、感染後３日乃至１３日に塩類液で腹腔内的に治療し、Me-IMPで治療するマウスは、３日乃至１３日に１mg/kg/日で治療し、死んだ日を記録した。図１５は、Me-IMPで治療したマウスのほうが平均生存時間(MST)が長いことを示す。それは、Wilcoxon試験により満足に有意である（ｐ＜０．０４）
腫瘍の発生
癌の発生した動物に及ぼすMe-IMPの効果を試験するために、スイスマウス（６）のグループに、Carswellらの方法(1975)に従ってMeth A腫瘍を皮下に接種した。８日後、腫瘍が約８mmの大きさになった時に、動物に初回免疫投与量の種々の量のMe-IMP又は等量の塩類液で静脈内に治療した。５時間後、動物に１０μgのリポ多糖類エンドトキシン(LPS)で静脈内的に治療した。腫瘍壊死因子(TNF)の量は治療の２４時間後に血清を分析し、腫瘍の壊死（−乃至＋＋＋）は４８時間後に評価した。完全な腫瘍の退縮は２０日後に評価した。結果を表２に示す。
表２は、Me-IMP(100)単独、又はLSP(10)単独では腫瘍壊死（全て＋又は−）、腫瘍の退縮（０／１２）又は２０日経過後の生存（０／６）に有意な効果はなかったが、Me-IMP(100)及びLSP(10)の場合には、有意な腫瘍壊死（２／３は＋＋又は＋＋＋）、完全な腫瘍の退縮（２／１２）及び２０日における生存の増加（６／６）を誘導した。これらの条件下では、TNFの量は、塩類溶液及びLPS（４匹のマウス）の対照標準よりMe-IMP治療及びLSP（４匹のマウス）のほうが２４時間で多かった（４２４０対＜２００）。これらのデータは、単独でなくLSP とともに使用する場合には、Me-IMPは、たぶんTNF及び関連リンフォカインの誘導により媒介された有意な抗癌活性を有することを示す。
実施例８
リステリア感染に及ぼす保護された-IMPの効果
実験記録：
感染 マウス適応細菌菌株 L．単球遺伝子 EGD（ロシアのGamaleya Resesarch Institute Academy Medical Science）を、感染日（０日）に０．５mlのPBS(pH＝７．４)中１．７×１０4細胞／マウスの投与量でマウスの腹腔内からオスのBALB/cマウス（１４乃至１６gm）に投与した。
治療 種々の濃度のMIMP（AGS-36-217）の溶液を、表３に示すように感染５日前（−５日）から経口的又は非経口的に投与した。
結果：
表４に示されるように、経口により１０mg/kg体重及び腹腔内注入により１及び１０mg/kgのMIMPを、抗原投与の５日前に投与した場合には、平均生存時間(MST)及び生存物の絶対数が増大した。０．１乃至１０mg/kgのMIMPを、腹腔内及び経口の両方を組み合わせて抗原投与の５日前から投与した場合には、MST及び生存物が増大した。
実施例９
サルモネラ感染に及ぼす保護された-IMPの効果
実験記録：
感染 マウス適応ネズミチフス菌菌株 415（ロシアのGamaleya Research Institute,Academy Medical Science）を、０．５mlのPBS(pH＝７．４)中５×１０4細胞の投与量でマウスの腹腔内から注入した。投与量は、平均生存時間が２．５日で６日目の死亡率が１００％になるように決定した。
治療 種々の濃度のMIMP（AGS-36-217）の溶液を、表５に示すように非経口的に投与し、治療の結果を以下の表６に示す。
表６に示されるように、対照の動物は全て約２．５日の平均生存時間で５日間で死んだ。MIMPの種々の治療により、MSTは約４日間（ｐ＜０．０１）に増大し、長期間の生存物も出現した。N3の治療の場合が最も明らかである。
実施例１０
インフルエンザウィルス誘導死亡率に及ぼすMIMPの効果
このモデルにおいては、NMRIマウスにエアゾール法によりインフルエンザウィルスを抗原投与した。インフルエンザウィルスの投与量は、対照動物において平均生存時間が８乃至１１日で８０乃至１００％の死亡率であるように決定した。対照(PBS)、MIMP（１００又は２００μg/マウス）及びスクアラン（１％）＋MIMP（２００μg/マウス）による治療を、感染１日前、感染１時間前及び感染１時間後に開始した。
結果を以下の表７及び８に示す。抗原投与２４時間（１日）前又は１時間前後に鼻腔内に２００μg/マウス（５mg/kg）のMIMPを投与した場合には、生存物の数及び平均生存時間(MST)が増大した（表７）。感染１時間前にMIMPを１００μg/マウスだけ投与した場合にも、生存物及びMSTが増大した（図１６）。
第二の実験においては、感染１日前又は感染１時間後にスクアラン（１％）とともに２００μg/マウスのMIMPを鼻腔内に投与した場合に生存物及びMSTが増大した。図１７に示されるように、これらの治療をしたグループ中のマウスは１００％生存した。スクアランのみでは効果はなかった。
実施例１１
HBsAgに対する抗体応答の刺激
前の研究を使用して、HBsAg（Walker et al.,1981）に対する抗体産生における不十分な応答動物としてDBA/2マウスを選択した。
正常な（対照）DBA/2 マウス
HBsAgのみで治療した対照グループ及び、実施例で調製したような、HBsAgとMIMPの組合わせで治療したグループにおける抗-HBs検出結果を表９に示す。以下の表に種々の接種計画を提供する。
スキーム 治療
１ HBsAg のみ
２ HBsAg+MIMPを経口投与（接種３０分前）
３ HBsAg+MIMPを同時に腹腔内投与、次いで４日毎にMIMPを経口投与
４ HBsAg+MIMPを同時に腹腔内投与
５ 照射＋HBsAg
６ 照射＋スキームN2
７ 照射＋スキームN3
８ 対照
種々のスキームに従ってHBsAg及びMIMPを組み合わせて投与した場合に得られた抗体応答は、対照グループの動物の抗体量を上回った。
免疫無防備状態のDBA/2マウス
第二組の実験においては、電離放射線を受けた免疫無防備状態のDBA/2マウスにおいて、HBsAgに対する特異的な免疫応答の誘導に及ぼすMIMPの効果を、対照DBA/2について示したものと同一の接種スキームを用いて分析した。
対照グループ（HBsAgのみを投与）の照射マウス及び組合わせ（スキーム２及び３を用いHBsAg及びMIMP）で治療したマウスにおける抗-HBs検出結果を表１０に示す。
データから、スキーム２及び３の場合には、２１日目には抗-HBsが有意に増大して、これらの照射動物の免疫欠乏系に及ぼすMIMPの回復効果を示すことが分かる。
実施例１１に示された結果は、保護された-IMP誘導体がHBsAgに対する体液性免疫応答の発現に影響を及ぼしうることを示す。腹腔内投与単独、並びに経口投与単独として５０mg/kgのMIMPを投与すると、HBsAgに対する抗体の量が有意に増大しうることが示された。抗原を腹腔内投与した後、MIMPを更に経口投与してもその活性は増大しなかった。
5′-ヌクレオチダーゼに耐性のあるイノシン-5′-モノホスフェート誘導体の補助薬効果のメカニズムに関する仮説は作成しうるが、本発明がこの作用様式に限定されるとみなされるべきではない。血液透析患者及び免疫無防備状態の個体において、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫不応答が観察された（それぞれ、Walz et al.,1989;Hess et al.,1989）。ワクチン投与量を増大させたり投与回数を増大させてセロコンバージョン(seroconversion)となることもある（Walker et al.,1981）。これらの患者においては可溶性のインターロイキン-2-受容体が観察され、入手しうるIL-2の結合によるインターロイキン-2作用の機能障害が、Ｂ型肝炎ワクチンに対する応答に影響した（Walz et al.,1989;Meuer et al.,1989）。Meuerらは、４０mgのワクチン、次いで１．２×１０5単位の天然インターロイキン-2を、免疫不応答の１０人の血液透析患者に注射した。４週間後、１０人のうち６人の患者は、抗体量が正常以下であったけれどもセロコンバーションを示した。タンパク質又はペプチド抗原に対するMHC-結合免疫不応答は、IL-2の投与により克服されうる。これらの実施例の結果は、保護された-IMP誘導体が補助薬としてＴ細胞により実現され、インターロイキン-2を含みうることを示唆する。
この出願中の種々の刊行物は引用又は番号により参照される。本明細書中に十分に引用していない参考文献は以下に挙げる。これらの刊行物の完全な形での開示は、本発明の関連する技術の状態を更に十分に記載するために本出願に参考として導入されている。
本発明は説明的に記載されており、使用されている専門用語は限定する用語ではなく記述する用語であることは理解されるべきである。
明らかに、前述の数示を考慮して本発明の多くの修正及び変化が可能である。従って、請求の範囲以内で、本発明は明細書に記述された以外にも実施しうる。
本発明は、一般的には免疫賦活剤、即ちイノシン-5’-一リン酸の有効性を高めることによって、免疫応答性を高める方法並びに該増強剤の使用に関するものである。より詳しくは、本発明は、腫瘍、ウイルスおよび細胞内バクテリア病原体に冒された患者の治療およびワクチンアジュバントに関する。
発明の背景
続発性免疫不全症は癌、老化、自己免疫、AIDS、およびその他のウイルス性およびバクテリア性諸疾患において一般的である。これら続発性免疫不全症の治療は、長い間、これら諸疾患における改善された予後をもたらすであろうと考えられていた。多くの実験的努力にも拘らず、僅かにレバミソールおよびイソプリノシンのみが、広範に認可されかつこのような治療において臨床的に使用されているに過ぎない。この種のより効果的な薬物に対する需要がある。
免疫機能は、該免疫系の体液性および細胞性部分を含み、並びにこれらの局面はマクロファージおよび顆粒球に依存している。免疫機能の、これら種々の局面を、一般的に免疫賦活剤と呼ぶことのできる、種々の薬剤によって増進または改善することができる。薬剤および生物学的物質を包含する免疫賦活剤は、ヒトの諸疾患の予防および治療において広く利用されている。
しかしながら、最近の研究（サッド＆モスマン(Sad and Mosmann)，1994;シーリング(Sieling)等，1994;チャカラス＆ティスタ(Chakkalath and Titus)，1994;トリップ(Tripp)等，1994;ボグダン(Bogdan)等，1991;フィオレンチノ(Fiorentino)等，1989）は、免疫応答の適当でない刺激が、実際には該疾患の過程を容易にしている可能性があることを示唆している。マウスおよびヒトモデル両者において、免疫応答のサイトカインプロフィールが、調節され、それによってＴヘルパー(Th)細胞のサブクラスの一方、TH1またはTh2が該病原体に対する応答に際して活性化されることが明らかとなっている。Th1細胞は、一般にIL-2、IFN-γおよびリンホトキシン分泌のあるパターンを有し、一方該Th2の一般的な分泌パターンはIL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10およびIL-13である。該Th1細胞サイトカインプロフィールは、一般的に疾患に対する抵抗性に関連し、またTh2サイトカインプロフィールは、疾患の進行に関与している。特に、細胞内病原体、例えばマイコバクテリウムレプラエ(Mycobacterium leprae)、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)およびライシュマニアメジャー(Leishmania major)に関連して、Th1細胞由来のサイトカインプロフィールが、該病原体の成長を制限するのに必要であることが示された。多くの因子が、T-細胞の何れのサブセットが該免疫応答中に活性化されるかを決定し、またTh1応答に導くのが、活性化されたマクロファージ由来のIL-12を含む、因子の組み合わせであることも明らかとなっている。これら疾患において、このTh1応答を増大し、あるいはこれを刺激する手段をもつことは有用であろう。例えば、癩病患者はこのタイプ１応答を示さず、寧ろその病巣は該タイプ２のサイトカインを発現し、該サイトカインは、細胞内病原体に抵抗するのに必要な、該細胞媒介免疫の、典型的な体液性応答およ免疫抑制である。
免疫賦活剤の一つの群は、イノシンまたはハイポキサンチン等のプリン構造を由来とし、例えばイソプリノシン（モル比1:3でイノシンと、N,N-ジメチルアミノ-2-プロパノールのp-アセタミド−ベンゾエート塩、即ちDIP塩とを含む合成薬剤）を包含する。
臨床用途用の、より免疫学的に活性なこの種の分子の探索は、莫大な文献を蓄積した。
ゴードン(Godon)に付与された米国特許第3,728,450号は、イノシンとアミノ−アルコールとによって形成された錯体を開示しており、該錯体はインフルエンザおよびヘルペスウイルスに対する防禦における薬理活性を有している。
ハッデン(Hadden)等に付与された米国特許第4,221,794号は、プリン誘導体（9-（ヒドロキシアルキル）プリン類）と、p-アセタミド安息香酸のアミノ−アルコール塩との錯体を開示しており、これらは免疫調節および抗−ウイルス活性を有している。
ハッデン(Hadden)等に付与された米国特許第4,221,909号は、抗−ウイルス因子、免疫調節剤および抗−白血病薬として有用な、9-（ヒドロキシアルキル）プリン類の、p-アセタミド安息香酸塩を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,340,726号は、免疫調節、抗−ウイルス、抗−腫瘍および酵素阻害剤活性をもつエステル（プリン化合物）を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla）等に付与された米国特許第4,221,910号は、免疫賦活剤、抗−ウイルス因子および抗−白血病薬として有用な、9-（ヒドロキシアルキル）プリン類を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,457,919号は、免疫調節、抗−ウイルスおよび抗−腫瘍活性を有するプリン誘導体を開示している。
ギナー−ソロラ(Giner-Sorolla)等に付与された米国特許第4,510,144号および同第4,387,226号は、免疫調節活性を有するジヒドロチアゾロプリン誘導体を開示している。
特開昭58-140100号は、（ヘプタミン-1-オール）-5’-アデノシン一リン酸を開示している。サハ(Saha)等(1988)は、Ｔ細胞−依存抗原（ヒツジ赤血球）に対して、インビトロで一次体液性免疫応答を賦活化する際の、脾細胞培養物の初期段階に存在する場合の、その活性を開示している。サハ(Saha)等(1987)は、ICR雄マウスにおける抗−SRBC PFC活性および抗体力価を高める際の、HAAの活性を記載している。彼等は、また一時的に高血圧症とされたラットにおける抗−SRBC PFC活性および抗体力価を高める際の、HAAの活性をも開示している。
ハッデン(Hadden)等(1983)は、プリン、特にイノシン−含有またはイノシン−様の化合物が、実験により、一般的に細胞内病原体の感染に応答して、プリカーサT-細胞分裂を誘発するおよび成熟T-細胞、特にTh1細胞の機能的応答を賦活する、胸腺ホルモンの作用を模倣する能力を有していることを示した。これら分子の一例である伝達因子は、最も綿密に調べられた構造（ウイルソンおよびフーデンベルグ(Wilson and Fudenberg)，1983）において、イノシン-5’-一リン酸(IMP)を含むものと想定された。
以下に、本明細書で論ずるのに使用するために、これら免疫調節／免疫賦活化合物が利用できることは、有益であろう。
ウイルス感染および細胞内バクテリア病原体は、一般的に主な公共衛生上の関心事である。これら両カテゴリーにおいて、該バクテリアおよびウイルス病原体は宿主免疫系を回避する。というのは、これらは該宿主細胞内で成育しているからである。マクロファージにより開始されるTh1細胞による細胞−媒介免疫(CMI)応答は、一旦感染が生じた場合には、細胞内病原体に対する宿主防禦または抵抗性の一般的な様式である。免疫性付与に応答する効果的な抗体応答は、免疫性を付与する可能性がある。
抗生物質によるバクテリア関連疾患の治療を利用することができるが、バクテリアの薬物耐性の増大により、治療の他の方法を考察することが必要となっている。感染した個体の治療法の一つは、患者免疫系の有効性を高めることである。これら疾患において、感作されたＴリンパ球および活性化されたマクロファージは、免疫性におけるキーファクタである。従って、これら疾患に対する効果的な治療は、マクロファージを活性化し、また適当なＴリンパ球を感作するものである必要がある（ライアンインスタイツ＆テール(Ryan in Stites and Terr)，pp.637-645およびミルスインスタイツ＆テール(Mills in Stites and Terr)，pp.646-656）。
細胞内バクテリア病原体は、サルモネラ(Salmonella)、レジオネラ(Legionella)、リステリア(Listeria)、マイコバクテリア(Mycobacteria)およびブルセラ(Brucella)を含む。サルモネラ種は、腸内細菌の一員であり、チフス様熱病を含む腸疾患の大部分を引き起こす。S.ティフィ(typhi)のカプセルは表面カプセル抗原を有し、かつこのカプセル抗原に対する抗体は防禦性ではない。事実、チフス様疾患の多くの保菌者は、この病原体に対する高レベルの抗体を有する。
レジオネラ(Legionella)の研究は、これがマクロファージの絶対細胞内寄生体であることを示している。リステリア(Listeria)は、髄膜感染および成人の敗血症並びに新生児における種々の感染を引き起こすグラム−陽性菌である。これらの病原体に対する防禦の主な役割は、T-リンパ細胞関連マクロファージの活性化であることが明らかにされている。ブルセラ(Brucella)関連疾患の研究も、抗体が防禦をもたらさず、かつ特異的に感作されたT-リンパ細胞により生成される、活性化されたマクロファージが防禦を行うことを明らかにした。
これら疾患に対して有効な、マクロファージを活性化し、また該病原体に対する適当なＴリンパ細胞を感作する、薬剤を得ることは有用であろう。
一般的に、効果的な抗−ウイルス薬は殆どまたは全く存在しないので、ウイルス病原体からの防禦もまた、公共衛生に係わる主な目的として残されている。免疫性付与は、ウイルス疾患における最良の防禦源として残されている。しかしながら、ワクチンはしばしば以下の理由から免疫性を付与しない。即ち、（1）乏しい免疫原性ウイルス抗原、（2）免疫性付与とウイルスに対する暴露との間の時間の少なさ、または（3）免疫付与された個体の応答不能性。
例えば、インフルエンザワクチンは、該ウイルスが抗原性における変化を行うために、定期的に更新する必要がある。最も一般的なワクチンは、しばしば入手不能であるか、あるいは流行のピーク月間である冬季月間の開始前に、十分に生産されていない。従って、該ワクチンを付与したものが、抗体力価を獲得する前に、該ウイルスに暴露されてしまう可能性がある。更に、より高い感染の危険性のある患者、即ち高齢者および若年者においては、流行が開始するまで、ワクチン接種の応諾率が低い。その上、インフルエンザは、特に高齢者および若年者層を酷く苦しめ、また心臓−呼吸系に疾患をもつ個体をも酷く苦しめる。これらの特定の群は、しばしばこのワクチンに対する低い免疫応答をもつ。
インフルエンザウイルス感染は、正常な肺の抗−バクテリア防禦を抑制して、インフルエンザに罹った患者は、バクテリア性肺炎を発症する極めて高い危険性をもつ。インフルエンザウイルス感染中には、肺胞マクロファージまたは好中球が阻害されることが分かっている。
従って、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答性またはバクテリア性肺炎に対する抵抗性を増強する手段が、この疾患を治療する上で有用であろう。この治療の有効性を高める可能な方法の一つは、免疫賦活特性をもつ物質で治療することである（ハッデン(Hadden)等，1976;ハッデン(Hadden)，1987）。
慢性肝炎Ｂ感染は、主な公共衛生の関心事の一つである。この肝炎Ｂウイルスは急性および慢性肝炎並びに肝臓癌の原因である。この急性疾患は限られた進行経過を辿るが、その慢性感染はその宿主の生存中持続する。慢性の保菌者はその生存中感染性を維持する。世界中で１億人を越える保菌者が存在するものと推定されている。
この疾患に対する一般的な有効性をもつ治療は存在しない。免疫性付与による予防が、唯一の解決策として残されている。これらの危険率の高いものに対する免疫付与が決定的である（ジェームズ(James）等，1991;マイルズ(Mills)，1991）。しかしながら、肝炎Ｂウイルスの表面抗原により免疫付与する場合、ワクチン付与されたものの殆ど２〜15％が、この肝炎Ｂウイルスの表面抗原(anti-HBs)に対する抗体を生成せず、従ってこの感染に対して防禦されないことが分かっている。換言すれば、これら患者は非応答性患者である（デインハート(Deinhardt)，1983）。肝炎Ｂに対する強力な免疫性を誘発するために、該抗原処方物の多重投与の種々のスキームが推奨されている（グロッスマン＆コーエン(Grossman and Cohen)，1991）。しかしながら、依然として一群の非応答性患者が存在する。従って、この重大な公共衛生上の要求を解決するためには、ワクチン処方物の肝炎Ｂに対する免疫原性を高める別の手段が必要となる。
感染の高い危険率をもつ人々は、継続的に血液透析治療を受けている患者（ファーガソン(Ferguson)，1990;バルツ(Walz)等，1989）、HIV-感染および他の免疫寛容化された患者（ヘス(Hess)等，1989）中に最も高い頻度で見出される。これら群と接触した人々および過去に肝炎Ｂウイルスと接触したことのない人々が感染の最大の危険性をもち、感染からの迅速かつ最大の防禦を必要とする。これは、健康管理供給者において特に重大である（グロッスマン＆コーエン(Grossman and Cohen)，1991）。従って、これらの群中の、肝炎Ｂに対する一般的に入手できるワクチンに対して非応答性の患者は、より一層高い感染の危険性に曝されている。
この非応答性の患者群における免疫付与の有効性を高め得ることが有用であろう。予防の有効性を高める一つの可能な方法は、入手可能なワクチンの免疫原性を、アジュバント特性をもつ生物学的に活性な物質を使用することにより増強することである。
アジュバントが、異種抗原に応答して、抗体の形成を刺激することは周知である。アジュバントは、免疫応答を賦活できる化合物として定義され、従って一群の免疫賦活剤として定義されている（スタイツ＆テール(Stites and Terr)，1991）。アジュバントは、免疫付与における免疫応答性を高めるのに使用される（シーマン(Seaman)，1991）。例えば、肝炎Ｂに対するワクチン製剤では、HBsAgが一般的に水酸化アルミニウム上に吸収され、かくして免疫原性効果が高められ、感染を予防する、抗-HBsの防禦力価(>10 IU/l)を達成している。
しかしながら、上記のように、この増強されたワクチンに対してさえも応答しない非応答性患者が存在する（セリス(Celis)等，1987;ミューアー(Meuer)等，1989）。この免疫付与による防禦免疫性の欠乏は、一部には、主要組織適合性錯体(MHC)のレベルで測定された、免疫応答性をもつ成分によるものと考えられる（アルパー(Alper)等，1989;ウォーカー(Walker)等，1981）。「非応答性患者」は該MHC中の免疫応答の支配的な遺伝子に欠けており、結果として抗-HBsの合成が、多くとも、一般的に適用される検出法によっては殆ど検出し得ない程の低濃度で生ずることが示唆されている（トムソン(Thomson)等，1997）。同様にマウス主要組織適合性錯体(H-2)と関連した免疫応答遺伝子が、HBsAgを包含する、多数のT-細胞−依存性抗原上の決定基に対する、細胞性および体液性応答を制御することが、明らかにされている。
肝炎Ｂワクチンと、種々の免疫調節剤との組み合わせによる適用で得られた結果は、この方法の便宜性を示唆する。というのは、この組み合わせによる治療は完全に応答しないか、あるいは低濃度のHBsで応答する人々の数を減じることができるからである（セリス(Celis)等，1987;ミューア(Meuer)等，1989）。しかしながら、これらのデータには勇気づけられるが、これらの治療に応答しない人々が依然として存在する。彼等に対しては、アジュバントで強化した肝炎Ｂワクチンを使用することが有用であり、該アジュバントは、特定の抗体の最大濃度での迅速な誘発を促進し、かつ該非応答性患者集団における防禦性を高めるであろう。
ハッデン(Hadden)等(1983)は、検討されたプリン特にイノシン−含有またはイノシン様化合物が、一般的にプリカーサT-細胞分裂を誘発し、かつ成熟T-細胞の機能性の応答を賦活する、胸腺ホルモン作用を模倣する能力をもつことを明らかにした。
イソプリノシンは、マウスにおける致死性のインフルエンザ感染の治療において幾分かの有効性を示し、また非−感染性用量のウイルスを投与した場合には、ウイルスによる後の感染における致死性を阻害した。イソプリノシンは、そのヒトにおける臨床的活性に基づいて、インフルエンザの治療におけるヒトでの使用が、幾つかの国において承認されている（グラスキー(Glasky)，1985）。しかしながら、ヒト内でのイソプリノシンの半減期は、４時間未満であり、従ってインビボ治療に対して極めて有効という訳ではない。イソプリノシンは、迅速に加水分解され、結果としてインビボでの短い半減期をもたらす。インビトロでのイノシン（ハッデン，1978）は、イソプリノシンと同様な特性をもつが、インビボでは、迅速に異化作用を受けて、その半減期はイソプリノシンの半減期よりも更に短縮され、かくしてこれはインビボでは活性をもたない（ワイブラン(Wybran)等，1982）。より大きな免疫賦活性能力をもつ、より安定なイノシン−様化合物を得ることは有用であろう。
発明の概要
本発明によれば、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の製法が提供され、該方法は以下の式：
本発明は、さらに免疫賦活性組成物をも提供し、該組成物は免疫賦活に有効な量で、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性の、以下の式で表されるイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体を含む：
本発明は、また以下の式で表される、ワクチン用のアジュバントをも提供するものである：
好ましい態様においては、本発明は肝炎Ｂ用のワクチンに関わり、これは精製されたウイルス抗原（好ましくは、組み換え）および以下の式で表される、肝炎Ｂ用のアジュバントを含有する：
本発明は、また以下の式で表される、細胞内バクテリア病原体およびウイルスに対する、免疫刺激剤5’-ヌクレオチダーゼ耐性イノシン-5’-一リン酸誘導体を提供することにある：
本発明は、更に哺乳動物中のウイルスおよび細胞内バクテリア病原体を処理する方法を提供し、該方法は、細胞内バクテリアおよびウイルス病原体からなる群から選ばれる病原体により引き起こされる、感染性疾患をもつ患者を診断する工程を含む。次いで、この方法によれば、同定された患者に、有効量の、以下の式で表される、免疫刺激剤5’-ヌクレオチダーゼ耐性イノシン-5’-一リン酸誘導体を投与する：
【図面の簡単な説明】
本発明のその他の利点は、以下の詳細な説明を添付図と共に参照することにより、容易に理解され、また本発明はより一層十分に理解されよう。
第１図は、ヒト末梢血リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェン植物凝集素に対する、コントロール応答を基準とする割合で表した応答（即ち、ヒト末梢血リンパ細胞の増殖）を、該培養培地中に存在するMp-IMP(---▲---)、Me-IMP(---△---)、IMP(--◇--)、E-IMP(--◆--)、Arg-IMP(--□--)およびHa-IMP(---●---)の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第２図は、0.5μg/mlのPHAの存在下での、１〜1000μg/mlのMIMP(---○---)およびIMP(--●---)に対して、正常なヒトリンパ細胞の投与量応答曲線をプロットしたグラフであり、結果は２名のドナーからなるコントロールに対する比として表されている、
第３図は、３名のドナー由来の、CD4+(---○---)およびCD8+(---●---)に富むコントロールヒトリンパ細胞の投与量応答曲線を、PHAの存在下での、MIMP（1-200μg/ml）に対してプロットしたグラフであり、
第４図は、種々の濃度のMIMP(0.1-100μg/ml)の存在下での、12.5μM（白抜きの棒）、25μM（あや目陰影を施した棒）、50μM（黒塗りの棒）および100μM（点描の最も短い棒）でのペプチドgp41に対する、コントロールヒトリンパ細胞の投与量応答を示す棒グラフであり、ペプチドを含まないコントロールの値は、水平の−−線で示され、また結果はテストした５名のドナーのうちの代表的な１名のCPM±SEMを表す、
第５図は、MIMP１-100μg/mlの存在下での、10（あや目陰影を施した棒）、100（斜線を施した棒）、および1000（実線）単位／mlの、組み換えインターフェロンαの抑制的影響に対する、コントロールヒトリンパ細胞の投与量応答の棒グラフであり、コントロール（白抜き棒）は、PHAのみに対する応答であり、結果はCPM±SEMで示されている、
第６図は、コントロールヒトリンパ細胞の増殖応答を阻害する（黒塗りの棒）PGE2(10-5M)の作用、および濃度１、１０および100μg/mlのMIMPの、この阻害を逆転する（あや目陰影を施した棒）作用を表すグラフであり、コントロール（白抜きの棒）はMIMPの不在下でのPHA応答であり、データはCPM±SEMで示されている、
第７図は、コントロール（c）、15名の正常な老齢個体（Ag+）、９名の抑制されたPHA応答をもつ老齢個体（Ag-）、８名のARC患者および８名のAIDS患者の、PHA応答（白抜きの棒）に及ぼす、濃度100μg/mlのMIMP（黒塗りの棒）の作用を示すグラフであり、
第８図は、マウス脾臓リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェンコンカナバリンＡに対する、コントロール応答に関する割合で表した応答（即ち、マウス脾臓リンパ細胞の増殖）対、該培養培地中に存在するIMP(--□--)、Me-IMP(---△---)、E-IMP(--●---)、Arg-IMP(--◆--)、Ha-IMP(---◇--)およびMp-IMP(---▲---)の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第９図は、ヒツジ赤血球(SRBC)に対して免疫付与されているマウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される（平均±SEM）脾臓プラーク抗体形成細胞（PFC）の数をプロットした棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、Ha-IMP、Arg-IMP、Me-IMPの腹腔内投与と組み合わせて実施した、
第10図A-C図は、SRBCに対して免疫付与されている、マウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される脾臓PFCの数（平均±SEM）をプロットした投与量応答棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、種々の投与量の（A）へプタミン-1-オール)-5’-イノシン一リン酸、（B）アルギニン-5’-イノシン一リン酸および（C）メチル-5’-イノシン一リン酸の腹腔内投与と組み合わせて実施した、
第11図は、SRBCに対して免疫付与されている、マウスから収穫した脾細胞を、SRBCで刺激した場合に形成される脾臓PFCの数（平均±SEM）をプロットした投与量応答棒グラフであり、ここで該マウスの免疫化は、種々の投与量のメチル-5’-イノシン一リン酸の経口投与と組み合わせて実施した、
第12図は、マウス脾臓リンパ細胞の、該リンパ細胞マイトジェン植物凝集素(---■---)およびコンカナバリンＡ(---●---)に関するコントロール応答に対する割合で表した応答（即ち、マウス脾臓リンパ細胞の増殖）を、メチル-5’-イノシン一リン酸の投与量レベルに対してプロットしたグラフであり、
第13図は、刺激した際の遅延型過敏性応答（即ち、平均肉趾厚みの増加±SEM）を、免疫付与時点で投与したメチル-5’-イノシン一リン酸の投与量レベルに対してプロットした、投与量応答グラフであり、
第14図は、刺激の際にコントロールおよびMe-IMPの投与によって免疫化するに際して、コントロールまたはメチル-5’-イノシン一リン酸の投与による刺激における、該遅延型過敏性応答（即ち、平均肉趾厚みの増加±SEM）を比較した棒グラフであり、
第15図は、フレンド白血病ウイルス(FLV)に感染したマウスを、コントロール（−）およびMe-IMP（---）処理した際の生存性を比較した線グラフであり、
第16図は、エーロゾルインフルエンザ感染させ、かつコントロール（１日前にPBSを投与，--●--）、MIMP（１日前に100μｇを投与，--△--）、MIMP（１時間前に100μｇを投与，--○--）、MIMP（１時間後に100μｇを投与，--◆--）、MIMP（１日前に200μｇを投与，--□--）、MIMP（１時間前に200μｇを投与，--◇--）、およびMIMP（１時間に200μｇを投与，--▽--）で処理した後の生存率（%）を比較した線グラフであり、および
第17図は、エーロゾルインフルエンザ感染させ、かつコントロール（１日前にPBSを投与，--●--）、コントロール（１時間後にPBSを投与，--○--）、MIMP（１日前に200μｇを投与，--▽--）、MIMP（１時間後に200μｇを投与，--△--）、MIMP（１日前に200μｇ＋スクアランを投与，--◇--）、MIMP（１時間後に200μｇ＋スクアランを投与，--◆--）で処理した後の生存率（%）を比較した線グラフである。
好ましい態様の詳細な説明
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性（保護-IMP）であり、免疫賦活剤として使用するための、イノシン-5’-一リン酸の製法を提供することにある。この方法は、イノシン-5’-一リン酸またはその誘導体を化学的に修飾して、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性であるが、イソビトロでのその生物学的活性／イノシン-5’-一リン酸のプロフィールを維持し、かつ免疫賦活／免疫刺激を要するインビボ用途に対する生物学的活性を拡張する。この製法は以下の製造例１〜５に示される。一般的に、この化学的方法は、イノシン-5’-一リン酸またはその誘導体とアルコール、エーテルまたは２級アミン化合物との間で縮合反応を行って、インビボで活性な該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性化合物を形成する。
本発明は、T-細胞を刺激する手段を与える。更に、該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性イノシン-5’-一リン酸誘導体は、ワクチン内でアジュバントとして機能して、他のワクチン成分に対する応答性を高める。好ましい態様において、該ワクチンは肝炎Ｂ用のワクチンである。
本発明の他のもう一つの用途においては、該保護-IMPは腫瘍、ウイルス感染症および細胞内バクテリア病原体の処置に利用できる。予想外のことに、感染個体内で、腫瘍、病原体の治療に対する免疫応答性を高めるように作用し、かつまた免疫投与においてアジュバントとして機能する一化合物が見出された。（かくして、本明細書で使用する、「治療」なる用語は、治療および／または予防を包含する）。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性化合物、保護-IMPを提供することにより、本発明は該化合物に、治療において該免疫応答性を高めるのに効果的であるインビボ半減期をもたせることを可能とする。
本発明は、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸の製法を提供し、該方法は以下の式で表されるイノシン-5’-一リン酸を、以下に説明するように化学的に修飾することにより、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を製造する方法を提供する：
本発明の基本は、イノシン-5’-一リン酸(IMP)を、5’-ヌクレオチダーゼによる加水分解から保護して、IMPをインビボで効果的に利用することを可能とする。好ましい態様においては、この保護されたIMPはメチル-5’-イノシン−一リン酸であるか（メチル-IMP，Me-IMP，MIMP）あるいはメチル-5’-イノシン−ホスホネート(Mp-IMP)である。議論の明確化のために、本発明はこれら２つの態様の一方により、主として説明されるであろう。しかしながら、本発明は同様にして、任意の他の5’-ヌクレオチダーゼに対して保護された、生物学的に活性なIMPにも適用できる。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸における該アルコキシ基は式：-OR1（ここで、R1は約１〜６個の炭素原子をもつアルキル基であり、特定の態様においてはメチルまたはエチル基である）で表される。
5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸における該２級アミン化合物は以下の式で表されるものである：
-NH-R2
ここで、R2は全体として約16個の炭素原子を有する置換ノルマルアルキル基である。このR2はヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、２級アルキル、アルキル置換ヒドロキシメチル、-NHC(NH)NH2、-CONH2、
-CH(R3)-(CH2)n-R4
ここでR3は、水素原子、低級C1〜C9アルキルおよびカルボキシル基からなる群から選ばれ、一態様においてR3はメチル基である。
R4はヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、２級アルキル、アルキル置換ヒドロキシメチル、-NHC(NH)NH2、-CONH2、
R4が２級アルキル基である態様においては、R4は好ましくは式：-CH(R5)R6で表されるものであり、ここでR5およびR6は、同一でも異なっていてもよく、独立に１〜３個の炭素原子をもつアルキル基から選ばれる。好ましくは、該２級アルキル基は全体で４個の炭素原子をもつ。
R4がアルキル置換ヒドロキシメチル基である態様においては、該基は好ましくは式：-C(R7)(R8)OHで表されるものであり、ここでR7およびR8は同一でも異なっていてもよく、独立に水素原子および１〜３個の炭素原子をもつアルキル基から選ばれ、その少なくとも一方は水素原子以外の基である。一態様においては、R7およびR8は両者共にメチル基である。
該5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸において、該２級アミン化合物は、N-末端を介して燐原子に結合したペプチドであり得る。一態様においては、該ペプチドはARG-PRO、ARG-PRO-LYSおよびARG-PRO-LYS-THRからなる群から選ばれる。この式は、偶発的な加水分解が活性ペプチド、例えばタフツシン(tuftsin)(ARG-PRO-LYS-THR)を放出する、薬理的にまたは免疫薬理的に活性なペプチドに関する好ましい態様の一つである。
他の適当な活性ペプチドはFK565（ヘプタノイル−γ-D-グルタミル-L-メソジアミノピネリル-D-アラニン）、ベスタチン(Bestatin)（[(2S,3R)-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニルブチリル]-L-ロイシン）、イムレグ(Imreg)(TYR-GLY)、Imreg(TYR-GLY-GLY)、IL1 163-171(GLN-GLY-GLU-GLU-SER-ASN-ASP-LYS-ILE)、チムリン(Thymulin)(Zn:GLU-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN)、チモペンチン(Thymopentin)(ARG-LYS-ASP-VAL-TYR，ARG-LYS-ASPおよびARG-LYS-ASP-VAL)、スプレニン(Splenin)(ARG-LYS-GLU-VAL-TYRおよび／またはLYS-HIS-GLY)を包含する。
上記のような、イノシン-5’-一リン酸の保護誘導体は、所定のアルコール、または一級アミンまたはペプチドと、イノシン-5’-一リン酸との、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤の存在下で、縮合することにより容易に調製できる。製造例１〜５は、このような処方の例を与える。適当なアルコールは、１〜20個の炭素原子、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、n-プロピルアルコール、n-ブチルアルコール、n-ヘキシルアルコール、n-オクチルアルコールおよびn-デシルアルコールを包含する。
適当な一級アミンまたはペプチドは6-アミノ-2-メチル-2-ヘプタノール（ヘプタミノール）、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、バリン、およびARG-PRO、ARG-PRO-LYSおよびARG-PRO-LYS-THR並びにその類似体を包含する。ポリアミド−オリゴヌクレオチド複合体を製造する適当な方法は、ハラランビディス(Haralambidis)等(1990)の文献に記載されている。
本発明は、また免疫原性刺激剤による治療を必要とする哺乳動物の免疫応答を賦活する方法をも提供する。この方法は、該哺乳動物に、免疫賦活に有効な量の以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物を投与する工程を含む：
より特定的には、本発明は免疫応答を賦活する方法を提供し、ここで該T-細胞は、免疫賦活に有効な量の以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体で刺激される：
本発明は、更に免疫賦活組成物を提供し、該組成物は免疫賦活に有効な量の、以下の式で表される、5’-ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン-5’-一リン酸化合物および製薬上許容される担体を含む：
本発明は、またワクチン用のアジュバントが以下の式で表されるような、免疫賦活組成物をも提供する：
一態様において、本発明は肝炎Ｂ用のワクチンに関わり、該ワクチンは精製されたウイルス抗原（好ましくは、組み換え）および以下の式で表される肝炎Ｂ用のアジュバントを含む：
同様に、本発明は、細胞内バクテリア病原体およびウイルスに対する、免疫系刺激剤として機能する、以下の式で示される、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸およびその誘導体の使用法を提供する：
本発明は、更に哺乳動物におけるウイルスおよび細胞内バクテリア病原体を処置する方法をも提供し、該方法は、ウイルスおよび細胞内バクテリア病原体からなる群から選ばれる病原体により生じた、感染性疾患に冒された患者を診断する工程を含む。この方法では、次に以下の式で表される免疫系刺激剤として機能する有効量の保護-IMP（5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸およびその誘導体）を、該同定された患者に投与する工程を含む：
本発明は、腫瘍に罹った患者の治療方法を提供する。この方法は、本明細書に記載するような免疫刺激剤として、有効量の5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を投与する工程、および有効量の内毒素、例えばリポポリサッカライド(LPS)を投与する工程を含み、あるいは好ましい態様においてはFDAガイドラインに従って投与される、サルモネラワクチンを投与する工程を含む。白血病においては、有効量の5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸を、本明細書にFLV白血病につき記載されたような、免疫刺激剤として、治療の目的で投与することが可能であることに注意すべきである。
本発明は、また5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸による治療の利点を享受するであろう患者を決定する方法をも提供する。この方法は、当分野で公知のようにして末梢血リンパ細胞を単離し、マイトジェンおよび保護-IMPの存在下で、インビトロでのリンパ細胞刺激アッセイを実施する工程を含む。該保護-IMPに対して、低下されたインビトロ応答を示す患者は、この保護-IMPによる治療の候補ではない。
本明細書で使用するような「免疫刺激剤」および／または「免疫賦活剤」なる用語は、個体に投与した場合、あるいはインビトロでテストした場合に、これが投与される個体またはテスト系内の抗原および／または化合物に対する該免疫応答を増大する化合物を意味する。幾つかの抗原は、単独で投与した場合には弱い免疫原性をもつか、該個体に免疫応答を引き起こす濃度において、該個体に対して有害である。該免疫刺激剤または免疫賦活剤は、該抗原をより一層免疫原性とすることにより、該抗原または化合物に対する、該個体の免疫応答性を高めることを可能とするか、あるいはまた該免疫系をより応答性の高いものとすることが可能である。この免疫刺激剤／免疫賦活剤は、また該抗原／化合物のより低い用量が、該個体における免疫応答を達成するのに必要とされるように、該免疫系に影響を与えることができる。
細胞内バクテリア病原体はサルモネラ、レジオネラ、リステリアおよびブルセラを包含する。サルモネラ種は腸内細菌の構成員である。本発明で治療を意図するウイルス病原体は、インフルエンザ、フレンド白血病ウイルス、肝炎、ヘルペスおよびHIVを包含するがこれらに制限されない。
上で論じた疾患の治療については、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体から選ばれる免疫刺激剤は、癌性腫瘍、ウイルス感染または細胞内バクテリア感染に関する、二次免疫不全の診断後に与えられるであろう。この免疫刺激剤は、有効量で使用され、一般的には１日当たり１〜50 mg/kg体重、好ましい態様では１日当たり１〜10 mg/kg体重で使用されるであろう。この免疫刺激剤は、最初の診断の時点で投与されるか、毎日または良好な医療実務に従って決定された時点で、個々の患者の臨床状態、投与部位並びに方法、投与のスケジュールおよび医療関係者には公知の他の因子を考慮して与えられるであろう。
本発明の目的にとって、「有効量」とは、従って二次免疫不全の治療分野において公知の考察により決定される。ここでは、改善された生存率、より迅速な回復、症状の改善または排除または感染後合併症の軽減等（これらを包含するが、これらに制限されない）の改善の発現等の、治療された個体の測定可能な軽減を達成するのに効果的である必要があり、また該感染物質に対する適当な抗体力価または高い力価、腫瘍質量の減少あるいは医療における当業者にとって適当であり、かつ公知である他の測定を使用できるものである必要がある。
本発明の方法において、本発明の免疫刺激剤、即ちイノシン-5’-一リン酸の誘導体（保護-IMP）は、種々の方法で投与できる。この免疫刺激剤は、該化合物自体として、製薬上許容される塩として投与でき、また単独であるいは製薬上許容される担体との組み合わせで投与できる。これらの化合物は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および経鼻投与を包含する、経口、皮下または非経口経路で投与できる。該化合物の移植片を使用することも可能である。治療される患者は、温血動物および特にヒトを含む哺乳動物である。
ヒトの治療は、ここに例示するマウスの場合よりも一般的に長期間に渡ることに注意すべきであり、該治療は該疾患過程の長さおよび薬物の有効性に比例する長さをもつ。一般的に、用量は体重に比例し、また代謝と投与量は、当分野で公知の上記のような因子を考慮して、ここに例示した動物モデルから、ヒトに変換される。
該用量は、単一投与量であっても、また好ましい態様における数日に及ぶ期間に渡る多重投与であってもよい。
保護-IMP誘導体を非経口経路で投与する場合、該誘導体は一般的に単位投薬量の、注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルション）に処方されるであろう。注射に適した製薬上の処方は、滅菌水性溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液に再現するための滅菌粉剤を包含する。該担体は溶媒または分散媒、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、液状ポリエチレングリコール等）、適当なその混合物、および植物油であり得る。
例えば、レシチン等の被膜の利用により、分散体の場合には所定の粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。非水ビヒクル、例えばスクアラン、綿実油、胡麻油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、およびエステル例えばイソプロピルミリステートを、該化合物の組成物用の溶媒系として使用することも可能である。更に、組成物の安定性、無菌性および等張性を高める種々の添加剤、例えば抗生物保存剤、酸化防止剤、キレート剤、およびバッファー等を添加できる。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって保証し得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含めることが望ましいであろう。注射可能な剤形の長期に渡る吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばアルミニウムモノステアレート、およびゼラチン等の使用によって可能となる。しかしながら、本発明によれば、使用するあらゆるビヒクル、希釈剤または添加剤が該化合物と相容性である必要がある。
適当な注射可能な溶液は、本発明の実施において使用される該化合物を、所望ならば種々の他の成分と共に、適当な溶媒の所定量中に配合することにより調製できる。
該保護-IMP誘導体の薬理処方物を、任意の相容性の担体、例えば種々のビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤を含有する注射可能な処方で、該患者に投与でき、あるいは本発明で使用する該化合物を、徐放性皮下移植片または特定部位をターゲットとする放出系、例えばポリマーマトリックス、リポソーム、および微小球等の形状で、該患者に非経口的に投与できる。本発明で使用するのに適した移植片は、移植後に徐々に溶解するペレット形状、あるいは当業者には周知の生体適合性放出単位をとることができる。このような周知の投与形および単位は、該活性成分が、数日乃至数週間の期間に渡って徐放されるように設計される。
本発明において有用な、周知の移植片および単位の例は、制御された速度で薬物を分配するための、移植可能な微量注入ポンプを開示している、米国特許第4,487,603号、皮膚を通して薬物を投与するための治療装置を開示している米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で薬物を放出するための、薬物注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号、連続的薬物放出のための、可変流量の、移植可能な注入装置を開示している米国特許第4,447,224号、多重チャンバー区画をもつ、浸透圧薬物放出装置を開示する米国特許第4,439,196号、および浸透圧薬物放出装置を開示する米国特許第4,475,196号に記載されている。これらの特許を本発明の参考文献とする。多くの他のこのような移植片、放出装置、および単位が当業者には周知である。
本発明で使用する該保護-IMP誘導体の薬理的処方物は、該患者に経口的に投与できる。公知の方法、例えば錠剤、懸濁液、溶液、エマルション、カプセル剤、粉剤、シロップ等の投与が利用可能である。
該保護-IMPおよびその誘導体を、経口、静脈内または経鼻的に放出し、かつ生物学的活性を維持する公知の技術が好ましい。
一態様においては、該保護-IMPは、まず静脈内投与して、該保護-IMPの血中濃度を適当なレベルに上げることができる。次いで、該患者内のレベルを経口投与剤形により維持する。但し、上記のような患者の状態に依存して、経鼻を包含する他の投与経路を利用することも可能である。該保護-IMPおよびその誘導体の投与すべき量は、治療すべき患者毎に変化し、１日当たり10μg/kg体重乃至１日当たり100mg/kg体重なる範囲で、また好ましくは１〜10mg/kg体重なる範囲で変動するであろう。
市販品として入手可能なFDA承認ワクチンが、本発明のワクチン−アジュバントの組み合わせを調製するのに使用できる。また、ワクチンは、それ自体ワクチン調製分野で公知の如く調製できる。一例として、肝炎ワクチンを使用する。例えば、市販品として入手できる肝炎ワクチンを使用できるか、あるいはFDAのガイドラインに従って、肝炎表面抗原の投与量を使用して調製できる。該アジュバントは、有効量を与える濃度で使用され、該濃度は一般的には0.01〜100mg/kg体重の範囲であろう。好ましい態様において、該アジュバントは0.01〜10 mg/kg体重なる濃度で使用されるであろう（ソーサ(Sosa)等，1992）。
また、ワクチン処方物を投与し、かつ5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体、例えばMp-IMPの一定服用量を同時に投与するであろう。
更にまた、該ワクチン自体、該ワクチンとアジュバントとの同時投与あるいはアジュバント−ワクチン複合体の初期投与に引き続き、該アジュバントを後投与することができる。該アジュバントは有効量で使用され、一般的には0.01〜100mg/kg体重なる量を与える濃度であろう。好ましい態様においては、該アジュバントは、0.01〜10 mg/kg体重なる量を与える濃度で使用されるであろう（ソーサ(Sosa)等，1992）。このアジュバントは、該初期投与から７日以内に、毎日あるいは良好な医療実務に従って決定された時点にて、各患者の臨床状態、投与部位および方法、投与スケジュールおよび医療実行者には公知の他の因子を考慮して、投与される。
本発明の目的にとって「有効量」とは、免疫付与技術において公知の如き考察により、このようにして決定される。ここで、該アジュバントおよびワクチンを投与したヒトにおける、および好ましい態様においては、標準的なワクチンに対して非−応答性であるヒトにおける、測定可能な抗−ウイルス力価を与えるのに効果的である必要がある。
該アジュバントおよびワクチンは、一緒に単位用量の注射可能な形状に、あるいは単独で、皮下および筋肉内および腹腔内投与を包含する、非−経口注入並びに経口および経鼻投与製剤として処方できる。注入に適した薬理処方物は、無菌水性溶液または分散液、無菌注射用溶液または分散液に再現するための無菌粉剤を包含する。公知の方法、例えば錠剤、懸濁剤、溶液剤、エマルション剤、カプセル剤、粉剤、シロップ等としての、アジュバント−ワクチンの組み合わせの投与等を利用できる。本発明の処方物を、その生物学的活性を維持しつつ、経口、経鼻または注射を介して放出する公知の技術が、好ましい。
公知のワクチンに対して非−応答性であるヒト、および本発明によって免疫付与されているヒトが、首尾よく免疫付与されるか否かを決定するために、力価を決定でき、またウイルス抗原に対する応答における増殖性のテストを、当分野で周知の如く行うことができる。
イソプリノシンは、マウスの致死的なインフルエンザ誘発処理において幾分かの有効性をもつことが示され、またウイルスの準感染的投与量で投与した場合には、ウイルスによる後の攻撃の際の、致死性が阻害された（グラスキー(Glasky)，1985）。この防禦活性は、恐らくイソプリノシンのアジュバント活性により説明される。
実施例に示すように、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の活性は、生存率を増大し、かつインフルエンザ誘発における平均生存時間は、イソプリノシンのそれに勝る活性を表す。致死的なインフルエンザ誘発において100%防禦を与える、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体とスクアランとの使用は、如何なる免疫刺激剤／免疫賦活剤についても、公知技術には報告されていない。サルモネラおよびインフルエンザによる攻撃の後の、保護-IMP誘導体の、生存率および平均生存時間を増大する作用（即ち、治療効率）は、5’-ヌクレオチダーゼに対して保護された任意のIMPに固有の作用である。これらの感染性の攻撃において、死は突然生じ、該保護-IMP誘導体が作用するメカニズムは、全体的な免疫薬理学的プロフィールからは予想されない。5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の延命並びにリステリアにおける成分率の増大作用は、如何なる他のプリン免疫調節剤については報告されていない。
5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の免疫刺激効果の該メカニズムに関して、ある仮定をなすことができるが、この作用形式により何等本発明は制限されるものではないと理解すべきである。感染誘発に伴う生存率に関与する重要なメカニズムについての最近の洞察は、任意の細胞内病原体、例えばトキソプラズマ(Toxoplasma)、ライシュマニア(Leishmania)およびリステリア(Listeria)を使用した研究には含まれていない（モスマン＆コフマン(Mossman and Coffman)，1989;スコット(Scott)，1991;ハークーフレンドチョ(Haak-Frendocho)等，1992;トリンチエリ(Trinchieri)，1993;トリップ(Tripp)等，1994;スコット(Scott)，1994;ボグダン(Bogdan)等，1991; フィオレンチノ(Fiorentino)等，1989）。このモデルにおいて、TH1細胞応答はIL-12により促進され、IL-2およびγ-IMPにより媒介され、かつIL-4により妨害され、またIL-10はリステリア等の感染に対して動物を保護する。IL-4〜IL-10によって媒介されるTh2応答は、リステリア等の感染による致死性と関連している。このモデルはマイコバクテリアレプラエ(Mycobacteria leprae)によるヒトの感染に対して適用されることが明らかにされている（セイリング(Seiling)等，1994）。かくして、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体が、Th2応答を越えるTh1の促進により機能するものと予想された。この予測は、更に5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の、抗体媒介応答を凌駕する、遅延型の過敏性応答に及ぼす選択的作用によって支持されている（ソーサ(Sosa)等，1992）。
本出願人は、以下に与える実施例において、MIMPが広い濃度範囲に渡り活性であって、PHA等のＴ細胞マイトジェンに対して、およびより可変性の度合いで、LPS およびヨウシュヤマゴボウ等のＢ細胞マイトジェンに対する、マウスおよびヒトのリンパ細胞の応答を刺激することを示す。MIMPの作用は、更に豊富化されたヒトCD4+およびCD8+リンパ細胞の応答について確認された。その上、これらの結果、HIVペプチド、IFN α、およびPGE2の、正常なリンパ細胞の該PHA応答に及ぼす抑制作用が、この抑制が温和乃至中程度であって、極端ではなくあるいは毒性でない場合には、逆転される可能性のあることを示している。これらの結果は、また高齢者およびHIV-感染個体のリンパ細胞が、該応答が過度に抑制されない場合には、PHAの存在下で、該保護-IMPによる刺激に応答できることを示している。これら研究における、例示したMe-IMPの作用はIMPの作用であると考えられる。というのは、Me-IMPおよびIMPの作用は、インビトロにおいて類似するからである。
Ｔリンパ細胞に及ぼす、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸の選択的作用は、レセプタに基づく相互作用であることを暗示している。Me-IMPは、成熟Ｔリンパ細胞に及ぼす、ここに記載した作用の他に、前胸腺細胞の分裂マーカーを誘発することが明らかにされている（ツーレーン(Touraine)等，1991）。
該プリンの引上げ路(salvage pathway)は、Ｔリンパ細胞の発達および機能に関する重要な関連性をもつ。アデノシンデアミナーゼおよびヌクレオシドホスホリラーゼ両者の欠乏は、機能性のＴリンパ細胞の不足した、免疫不全症候群をもたらす。幾つかのイノシン含有分子が、Ｔリンパ細胞の発達および機能にとって必須であるものと示唆できる。これを予測する基礎は、伝達因子との関連で存在している（ウイルソン＆フーデンバーグ(Wilson and Fudenberg)，1983）。IMPが伝達因子現象の一部である場合には、該保護-IMPは伝達因子機能の非−特異的局面を、多分Ｔリンパ細胞上のレセプタを介して、模倣できる。本出願人は、伝達因子調製が、前胸腺細胞中の分裂マーカーを誘発する、即ちMe-IMPを模倣することを確認した（ハッデン(Hadden)等，1986）。
保護-IMPがIL-2作用に関して調節性であることは、Th1型Ｔヘルパー細胞により媒介される、細胞性免疫応答を統括する上で、IL-2により演じられる中心的役割において重要な意味をもつ。この点に関連して、保護-IMPを使用した本出願人の研究で使用した主なマイトジェンPHAが、サイトカインのTh1-パターン、即ちIL-1、IL-2、γ-IFNおよびIL-12を選択的に誘導することに注目すべきである。本出願人はPHAがIL-10を誘発するが、IL-3またはIL-4を誘発しないことを見出した。初期のデータは、Me-IMPが増大するPHA-誘発IL-2またはγ-IFNに対して僅かな効果しか及ぼさず、しかも強力にIL-10産生を阻害することを示している。これらの観測は、保護-IMPがTh1応答に影響を及ぼすことを示唆している。Th1応答は、HIV、癌、および病原体感染、即ちトキソプラズマ、リステリア、およびライシュマニアに対する抵抗性において重大であることが明らかにされている（クレリシ＆シェアラー(Clerici and Shearer)，1995;テップラー(Teppler)，1993;スコット＆トリンチエリ(Scott and Trinchieri)，1989）。かくして、保護-IMPの、これら応答を好ましいものとする作用は、このような条件における臨床的有用性を示している。
この分析は、保護-IMPを用いたインビボでの研究により支持されており、該研究においてはDTHが、PFC応答を越えて選択的に刺激され、かつAIDS、腫瘍、および感染誘発（リステリアおよびサルモネラ）における生存率が増大している。これらの研究において、Me-IMPは、１mg/kgまたはそれ以下の投与量で、経口経路で活性であることが立証されており、また無毒であった（経口LD50>5000 mg/kg）。
従って、保護-IMP化合物、例えばMe-IMPの臨床的応用は、二次免疫不全における免疫回復と関連しており、該二次免疫不全では、Ｔリンパ細胞機能が弱体化され、かつＴリンパ細胞数は妥当に保存されている。このような不全症状は、HIV感染(ARC)および癌両者の比較的初期の段階において報告されている。
初期のHIV感染において、Ｔリンパ細胞応答は、AIDSへの進行を阻止する上で必須であると考えられている。Ｔリンパ細胞応答は、gp160、gp41およびTATを含むHIVの生成物により抑制される（論評については、グッド(Good)等，1991を参照のこと）。最近の研究は、P-15Eと関連したレトロウイルスペプチド、CKS-17が、IL-2およびγ-IFNの生産を阻害し、しかもIL-10産生を促進することにより、Th1からTh2へのシフトを誘発し得ることを示唆している（ハラグチ(Haraguchi)等，1995）。本出願人はMe-IMPの、CKS-17との相同性をもつgp41の17アミノ酸ペプチドの免疫抑制作用を逆転させる作用をテストし、該抑制が温和乃至中程度である場合に、反転性であることが分かった。Me-IMPも、HIV-感染した個体のPHA応答を増大した。これらの結果は、保護-IMPが、HIV-感染した患者のAIDSへの進行を阻止するのに使用できることを示している。
他のウイルス感染における保護-IMPの使用も、本発明により開示される。というのは、免疫抑制が研究されたあらゆる型のウイルス感染に関与しているからである（ルース＆ホロホフ(Rouse and Horohov)，1986）。高齢者におけるインフルエンザの高い致死率および高い罹患率の原因となる免疫抑制は、二次的バクテリア感染によるものである。インターフェロン生産は、ウイルスが免疫性を抑制する可能性のあるメカニズムの一つを表す。保護-IMPの、PHA応答におけるIFN αの抑制を逆転する作用は、この点に関するその応用を推奨している。
炎症および肉体的外傷は、部分的にプロスタグランジンにより媒介される、細胞性免疫応答を抑制することが知られている（デービス＆シーアズ(Davis and Shires)，1986）。MIMPの、PHA応答におけるPGE2の抑制作用を、逆転させる能力は、これら形態の二次免疫不全症におけるその有用性を支持している。
上記議論は、5’-ヌクレオチダーゼに対して抵抗性のイノシン-5’-一リン酸誘導体の利用に関する事実上のおよび理論的な基礎を与える。本発明と共に使用される方法およびその利用性は、以下の実施例により明らかにすることができる。
実施例
一般的方法：
特に断らない限り、以下の物質および手順を使用した。
物質：
メチル-5’-イノシン−一リン酸（メチル-IMPまたはMe-IMP）、メチル-5’-イノシン−リン酸(Mp-IMP)、エチル-5’-イノシン−一リン酸（エチル-IMPまたはE-IMP）、アルギニン-5’-イノシン−一リン酸（アルギニン-IMPまたはArg-IMP）および（ヘプタミン-1-オール）-5’-イノシン−一リン酸(Ha-IMP)を、それぞれ製造例１、２、３、４および５に従って調製した。細胞培養で使用するためのMIMP処方物は、リムラス（カブトガニ）溶解物アッセイ（MD州、ウォーカーズビルのウイッタカーバイオプローダクツ(Whittaker Bioproducts)）により、内毒素を含まないことを確認した。
イノシン-5’-一リン酸（IMP）およびアデノシン-5’-一リン酸は、シグマケミカル社(Sigma Chemical CO.)（MO州、セントルイス）から入手した。
リンパ細胞マイトジェン植物凝集素（PHA）、コンカナバリンＡ(Con A) およびヨウシュヤマゴボウマイトジェン(PWM)は指示のごとく、バローズウエルカム(Burroughs Wellcome)（NC州、リサーチトライアングルパーク）、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)（MO州、セントルイス）、ギブコ(Gibco)（NY州、グランドアイランド）およびミューレックスダイアグノスティックス(Murex Diagnostics)（GA州、アトランタ）から入手した。
ヒツジ赤血球(SRBC)はダイアメディックス社(Diamedix Corp.)（FL州、マイアミ）から入手した。ハンクス平衡塩類溶液およびモルモット補体はギブコから入手した。アガロースはバクト(Bacto)（MI州、デトロイト）から入手し、DEAE−デキストラム(DEAE-Dextram)はシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)（MO州、セントルイス）から入手した。細胞培養プレート（96ウエルおよび６ウエル）は、ファルコン(Falcon)社から入手した。フィコールハイパック(FICOLL-HYPAQUE)はファルマーシア社(Pharmacia，Inc.)（NJ州、ピスカタウエイ）から入手し、E.コリリポポリサッカライド（LPS）はシグマ社から入手した。
組み換えIL-2（rIL-2）は、ヘキストファーマシューティカルズ(Hoechst Pharmaceuticals)（FRG州、フランクフルト）社のG.カスプリッツ(Caspritz)から贈呈された。
M.ストランド(Strand)（MD州、バルチモアのジョーンズホプキンス大学）は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のgp160ペプチドのgp41部分を由来とする17アミノ酸をもつ配列を合成し（ロイグ＆ストランド(Reugg and Strand)，1990）、親切にも我々に提供してくれた。
プロスタグランジンE2はシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から入手し、また組み換えインターフェロンα（IFNα，イントロン(Intoron)Ａ）はシェーリング社(Schering Corp.)（NJ州、ケニルワース）から入手した。
ヒトドナーは22名の健康なコントロール（年齢構成20-50）、24名の高齢者（平均年齢84±1）、８名のHIV-感染プレ−AIDS患者（CDCクラスII-CD4カウント544）および８名のAIDS患者（平均CD4カウント40）を含む。
ヒトCD4+およびCD8+リンパ細胞サブセットは、工業的パンニング技術を利用して、正常なコントロールから得た（CA州、サンタクララのアプライドイムノサイエンスズ(Applied Immune Sciences)）。
細胞培養
細胞培養に係わる全工程は無菌条件下で実施した。ここに記載されていない細胞性免疫学の一般的方法は、細胞性免疫学技術に関する参考文献、例えばミッシェル＆シーギ(Mishell and Shiigi)，細胞性免疫学における選ばれた方法(Selected Methods in Cellular Immunology)，W.H．フリーマン社(Freeman & Co.)(NY,1981)およびスタイツ＆テール(Stites and Terr),基本および臨床的免疫学(Basic and Clinical Immunology),第７版，アップルトン＆レンジ(Appleton & Lange)（コネチカット州、ノアウォーク，1991）に記載されている。
リンパ細胞形質転換
インビトロ：ヒト末梢血リンパ細胞(HPBL)およびマウス脾臓リンパ細胞(MSL)両者を使用した。増殖は、ハッデン(Hadden)等(1975)およびハッデン等(1986)に記載されているように、トリチウム化したチミジンの取り込みによりアッセイした。HPBL形質転換については、PHAおよびPWMを0.5 μg/mlで使用した。MSL形質転換については、Con Ａを0.5 μg/mlで、植物凝集素(PHA，ミューレックスダイアグノスティックス(Murex Diagnostics)（GA州、アトランタ）を0.5 μg/mlでおよびリポポサッカライド内毒素（LPS，MO州、セントルイスのシグマ社）を10μg/mlで使用した。保護-IMP誘導体を添加する場合には、これらは培養の開始時点において、0.1 μg/ml〜100 μg/mlの範囲内の種々の濃度で添加した。
マウス脾細胞を、標準的な手順（ハッデン(Hadden)等，1975）で、4-12月齢のBALB/cマウスから得た。これら細胞は、5%のウシ胎児血清（FCS，UT州、ローガンのハイクロンラブス(Hyclone Labs)）を補充した最小必須培地（MEM，NY州、グランドアイランドのギブコラブス(Gibco Labs)）１ml当たり1.5×106細胞／mlにて、マイクロウエルプレート内で培養し、最終パルスにおける、(3H)トリチウム化チミジン（DE州、ウイルミントンのニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear)，6.7Ci/mM; 2.5Ci/ml）の取り込みにより測定される、マイトジェンに対する該細胞の増殖応答についてテストし、次いで液体シンチレーションスペクトル法を実施した。ヒト細胞を104/mlにて播種し、3H−チミジンによる18時間パルスを使用して、48時間培養した。
インビボ：化合物をガバージュによって経口的に、または腹腔内投与した。終了時点において、フローレンチン(Florentin)等(1982)に記載されたようにして脾臓を得、かつ細胞を、Con A = 0.5 μg/ml、PHA = 0.5 μg/mlまたはLPS = 0.5 μg/mlを使用した増殖応答を調べるために調製した。
抗体−産生細胞
直接マウス脾臓抗体−産生細胞(PFC)を、幾分改善したジェーン(Jerne)等(1963)の技術に従ってアッセイした。簡単に言えば、一群のマウスを、腹腔内経路でSRBCにより免疫付与し、対象とする化合物を、結果において示した如く、経口または腹腔内経路で投与した。５日後に、脾臓細胞の懸濁液を調製し、その生存性を、トリパンブルー排除テストにより測定した。細胞は3x106/mlで懸濁した。0.2mlの脾細胞懸濁液を、0.8 mlの0.7%アガロースおよび0.2 mlの新たに洗浄したSRBC(6x105/ml)と混合した。この混合物を、即座に該プレートに注ぎ、固化させた。5%CO2含有湿潤空気雰囲気下で37℃にて60分間インキュベートした後、該プレートを、ハンクス平衡塩水で1:5に希釈した、モルモット補体１mlで満たした。溶血プラークを、倍率4xの倒立スコープで計数した。
統計的解析
各実験は、示した如く２〜10回行った。各濃度点において、各ドナーから４つのサンプルを使用した。データは、個々の代表的な実験についての、平均±平均の標準誤差(SEM)として、あるいはプールしたデータについて、コントロールとの比±SEMとして表した。特に断らない限り、データはスチューデンツｔ−テストを利用して、統計的有意性につき解析した。
イムノアッセイ手順
一般的に、イムノアッセイEIAsまたはRIAsは、表示した如く市販品として入手できるキットを使用して実施した。また、EIAは当業者には公知の如く発展させ得る。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体両者を作成し、かつ該アッセイで使用することができる。標準的抗体産生技術は、当業者には周知であり、一般的にはハーロウ＆レーン(Harlow and Lane),アンチボディーズ(Antibodies): アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、コールドスプリングハーバー，NY，1988に記載されている。適当な場合には、当業者には周知の如く、他のイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)を利用することも可能である。利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に広く記載されている。例えば米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号および同第5,011,771号、並びにサムブルック(Sambrook)等，モレキュラークローニング(Molecular Cloning):アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)，NY，1988を参照のこと。
細胞内病原体を用いた研究用の一般的方法
テストした病原体に依存して、マウスの種々の菌株を使用した。サルモネラおよびリステリアをテストするために、体重14-16gのBALB/cマウスを使用した。インフルエンザウイルスに対する応答については、マウスのNMRI系を使用した。これらのマウスはロシア、アカデミーオブメジカルサイエンス(Academy of Medical Science)のアニマルラボラトリー(Animal Laboratory)から入手し、本明細書に記載の実施例11-13で使用した。
肺炎ワクチンを使用した研究用の一般的方法：動物
タンパクに対する免疫応答のための、Pre-S2ゾーンS-遺伝子HBVによりコード化された、種々の系のマウスを、以下のハプロタイプ順に配置する（ベナセラフ＆マックデービット(Benaceraf and McDevitt)，1972）: H-2b>H-2d>H-2s>H-2k>H-2f。DBA/2マウスは、抗原のみで処理した場合には、高いレベルでHBsAgに対する抗体を生産しない（ウォーカー(Wakler)等，1981）。従って、体重16-18gの雄マウスは、ロシア、アカデミーオブメジカルサイエンス(Academy of Medical Science)のアニマルラボラトリー(Animal Laboratory)から入手し、本明細書で記載する実施例で使用した。このマウス系は、これらが肝炎Ｂウイルスに対する貧弱な応答体であることから、選択された。
照射プロトコール
実験用のマウスを、60Coγビーム源を使用して、25rad/min(1 rad = 0.01 Gy)なる照射線量で４分間照射した。データは、各群における10匹の動物の平均値を表す。
イムノアッセイ手順
免疫付与したマウス由来の血清検体を、酵素イムノアッセイ(EIA)において抗-HBsの存在に対してテストした。このテストは、ロッシュダイアグノスティカ(Roche Diagnostica)製の診断キットを、製造業者等の指示に従って使用して実施した。この抗-HBs EIAキット（ロッシュ製）の感度は<10 IU/lである。
抗体濃度は、以下のような濃度：10 IU/L、50 IU/L、100 IU/Lおよび150 IU/Lをもつ標準血清パネル（ロッシュダイアグノスティカ）で検出した抗-HBsの結果に基づいて工夫した検量線の助けを借りて測定した。これら２種の実験の結果は平均値の計算のために使用した。
保護-IMPおよびHBsAg 投与のためのプロトコール
HBsAgは、注射間２週間間隔で、２度、0.2 ml PBS(pH 7.4)中、16mg/マウスなる投与量で投与した。
保護-IMP、MIMPは、50 mg/kgなる投与量にて、経口または腹腔内量経路で導入した。
MIMP投与について３つのスキームを使用した。即ち、
スキーム#1: MIMPを、HBsAG導入の30分前に、ガバージュによって経口経路で投与した。
スキーム#2: HBsAgおよびMIMPを腹腔内投与した。
スキーム#3: HBsAgおよびMIMPを、一度腹腔内投与し、次いで４日間MIMPをを経口投与した。
製造例１：メチル-5’-イノシン−一リン酸
イノシン-5’-一リン酸(2.2g，6 mM)のメタノール(300 ml)溶液に、トリブチルアミン(1.4ml，12 mM)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(6.56g，30 mM)を添加した。この溶液を４日間25℃に維持し、減圧下で蒸発乾固した。2.3%NaOH溶液(20ml，11.4mM)を、得られた残渣に添加し、生成した懸濁液を濾過した。得られた沈殿を水(20ml)で洗浄し、捨てた。濾液を３回エーテルで抽出し、50ｇのアンバーライト(Amberlite)IR/20 PLUS(NH4 +型)を充填したカラム内に配置し、水で溶出させた。UV吸収画分を減圧下で蒸発させ、得られたシロップをメタノール(20ml)に溶解した。この溶液をアセトン(300 ml)に注ぎ、得られた懸濁液をアセトンおよびエーテルで洗浄し、真空下でP2O5上にて乾燥して、粉末生成物を収量1.4g(68%)で得た。この生成物の融点m.p.は145℃であり、またUVλmaxは249 nm(pH 5.5，H2O)および253 nm(pH 10)であった。
元素分析(C11H20N5O9P(M.W．397.24)として計算)
計算値： C，33.25; H，5.07; N，17.63
実測値： C，33.36; H，5.13; N，17.34
NMR データDMSO-d6：3.50（s，3H，CH3OP），3.20-4.70（m，7H，リボース），5.95（d，1H，アノマーJ-6Hz），8.12（s，1H，C-2），8.40（s，1H，C-8），8.20（br.s，5H，NH(CO)およびNH4）
製造例２：メチル-5’-イノシン−一リン酸
2’,3’-イソプロピリデンイノシン(2g，6.49mM)と50mlの乾燥ピリジンとの10℃の低温混合物に、メチルホスホン酸ジクロリド(0.86g，6.49 mM)を滴下した。この混合物を18時間攪拌した後、氷および水を添加して、保護されたヌクレオチドを得た。該保護されたヌクレオチドの加水分解を、蟻酸を使用して実施した。HPLCを、H2O/メタノールを使用して実施した。適当な画分を減圧下で蒸発させて、メチル-5’-イノシン−一リン酸を生成した。
製造例３：エチル-5’-イノシン−一リン酸
製造例４：アルギニン-5’-イノシン−一リン酸
イノシン-5’-一リン酸(0.55g，0.15 mM)のホルムアミド(3 ml)に溶液に、L-アルギニン(1.04g，6mM)を添加した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.6g，7.5 mM)のt-ブチルアルコール(10ml)溶液を該混合物に添加し、得られた懸濁液を80℃にて８時間加熱した。
生成した沈殿を濾別し、３回水洗し、、併合した濾液を蒸発させて、t-ブチルアルコールを除去した。この溶液を３回等体積のエーテルで抽出し、真空下で蒸発させて、シロップを得た。エタノール(30ml)を添加して、生成する沈殿を濾別し、極めて吸湿性のガム状物質を得た。10日間放置した後、該ガム状物質は固体となった。mp 130℃、UVmax 249 nm(H2O)。
製造例５：（ヘプタミン-1- オール）-5’-イノシン−一リン酸
イノシン-5’-一リン酸(1.045g，3 mM)のホルムアミド(5 ml)溶液に、6-アミノ-2- メチル-2- ヘプタノール塩酸塩を添加した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(6.22g，30 mM)のブチルアルコール(25ml)溶液を該混合物に添加した。得られた反応混合物を、攪拌下で80−90℃にて８時間加熱した。生成した沈殿を濾別し、5mlの水で３回洗浄した。ジシクロヘキシル尿素の沈殿を捨て、併合した濾液を蒸発させて、ブチルアルコールを除去した。この溶液を３回エーテル抽出し、真空下で蒸発乾固させた。得られた油状残渣をアセトンに懸濁して、白色の吸湿性物質を生成した。これは、水に溶解し、活性炭素で処理し、次いでアセトン中で沈殿させることにより精製して、白色の吸湿性物質を得た。UVmax 249 nm（H2O）。
精製した物質の収量：0.7 g (53.4%); mp 95℃；実験式：C18H28N5O8P:
%P 計算値 7.03; 実測値 5.81
製造例６
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（HBsAg）
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（HBsAg;サブタイプad及びay）を以下のスキームに従って抗原キャリヤーの血漿から精製した。
（１）初めに２倍量の生理的塩類溶液で希釈したHBsAgを含む血漿を８０℃において６０分間水浴中で加熱した。生成した擬血塊を除去し、機械的に崩壊させ、変性タンパク質を遠心分離により除去した。
（２）次いでHBsAgを、ポリエチレングリコールM 6000を用い、１５％(wt/vol)の最終濃度で再び沈殿させた。HBsAgを含む沈殿物を0.9 M NaClに対して透析し、ペプシン（100 mg/ml）及びTween-80（最終濃度 2%）で処理した。
（３）得られたHBsAg溶液を線形蔗糖勾配で２回超遠心分離した。精製したHBsAg試料を0.9 M NaClに対して透析し、１mlを分取し、−６０℃で凍結させた。
（４）５０乃至１００倍に濃縮した後、得られた試料は以下の特性を有した。試料は直径が１８乃至２５nmの球状粒子のみからなり、DANE粒子もHBsAgの糸状粒子もなかった。HBeAg（Abbott laboratoriesからのEIA kit）;DNA-ポリメラーゼ;有向増幅方法によるHBV-DNA;及び正常なヒトの血漿を特徴とするタンパク質の存在に関する試験においては、負の結果が得られた。
得られた試料は、Ｂ型肝炎ワクチンの実験のロットの加工の基礎として使用した（Alper et al.,1989）。
あるいは、Ｂ型肝炎ワクチンはSmithKline Beecham Biologicalsから入手でき、HBsAgはSigmaから購入できる。
実施例１
5′-ヌクレオチダーゼ活性からの保護に関する試験
5′-ヌクレオチダーゼ（ミズーリ州セント・ルイスのCrotalus atrox venom,Sigma Chemical Co．から入手）のIMPを加水分解する能力を、Amesらの方法（1960）に従って無機リン酸塩の遊離を測定することにより調べた。ヌクレオチド試料（４０乃至６０nmole）を、１００μlの総容量中に５０mmoleのpHが7.3のHEPES及び５mmoleのMgCl2を含む０．０２単位の5′-ヌクレオチダーゼを用いて３７℃で１０分間インキュベートした。モリブデン酸ナトリウムの０．４２％1N H2SO4:10% アスコルビン酸（6:1,v/v）溶液８００μl、次いで０．３mlのH2O・KH2PO4を添加することにより反応を停止した。標準（２乃至８０nmole）は同様に処理し、試料及び標準を４５℃で２０分間インキュベートした。リン酸塩は８２０nmの吸収により決定した。ヌクレオチドは含むが酵素を含まないブランクは、非酵素的加水分解に関して補正するために平行して試験した。加水分解された百分率を、２４９nmにおける吸光係数ｅ＝１２．２を用い、紫外線吸収により決定したヌクレオチド基質の正確な量から計算した。４つの実験結果を表１Ａにまとめる。
IMP、MIMP及びアデノシン-5’-モノホスフェート（AMP）について、5’-ヌクレオチダーゼによる分解作用に対する感受性を調べるという更なる組合わせの実験を企画した。第一のインキュベーションが、２００μlの総容量中に０．１mMのHEPES 及び１０mMのMgCl2を含む２０分間のそれであること以外は前述のような実験記録であった。ヌクレオチドの加水分解％は、各定量について二重に実施した。結果を表１Ｂに示す。
実施例２
ヒトの末梢血リンパ球を用いた研究
分裂促進因子による刺激に対する正常なHPBLの応答
正常なヒトの末梢血リンパ球（HPBL）を、分裂促進剤PHA又はPWMで刺激した。一連の実験においては、０．１、１、１０、及び１００μg/mlの濃度範囲で、これらの応答を刺激する効果について、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びイノシン-5′-モノホスフェート(IMP)について分析した。個々の血液ドナーは、これらの分裂促進因子及び化合物に対する応答において変化するが、５種類の全てのIMP誘導体は図１に示すように一貫してPHAに対してHPBL応答を刺激した。IMP自体はMe-IMPに匹敵する活性を示した。Arg-IMP、Me-IMP及びE-IMPは更に活性であったが、Ha-IMPの活性は低く、Mp-IMPは最も活性な化合物であった。試験した化合物はPWM応答に対してほとんど又は全く影響を示さなかった。化合物はいずれも分裂促進因子の不在下ではHPBLを刺激しなかった。PHA応答はＴリンパ球増殖に反映し、PWM応答はＢリンパ球増殖に反映するので、結果は5′-置換IMP誘導体が優先的にＴリンパ球応答を高めることを示す。代表例として、Me-IMP(MIMP)を以下の実験に使用した。
図２には、IMP 及びMIMPの存在下における２人のドナーのインビトロにおけるPHAに対するHPBL応答の結果を示す。３人の正常なドナーに関するPHAを用いた刺激に対する対照リンパ球の応答は、一連の濃度範囲にわたってMIMPにより影響されなかった。
ヒトの末梢血リンパ球は、平均して約８０％がＴリンパ球で２０％がＢリンパ球であり、Ｔリンパ球のうち２／３は、CD4＋ヘルパー／インデューサ表現型であり、１／３は、CD8＋抑圧遺伝子／細胞毒表現型である。CD4＋Ｔ細胞及びCD8＋Ｔ細胞の濃縮は、単クローン抗体をコーティングしたフラスコへの粘着性を用いてその他の表現型を除去して減少させる（＞９８％）ことによりなしうる（パニング）。そのような濃縮は３つの正常な対照（共同利用データ）とともに使用され、図３はこれらの２種の細胞の集団に及ぼすMIMPの影響を示す。CD4 ＋及びCD8 ＋リンパ球のPHA応答はMIMPにより有意に増大される（３人の各々の応答についてｐ＜０．０１）。
HIV-誘導ペプチド、インターフェロンα及びPGE 2 による抑圧現象に対するHPBLの応答
ヒトの免疫欠損ウィルス(HIV)の膜内gp41部分の免疫抑制サイトを表す合成17アミノ酸ペプチドを、対照からのリンパ球について試験した。このペプチドが、１００mMの最大抑圧供与量でPHA-誘導リンパ球増殖の漸進的な抑制を誘導する５つの実験の内代表的な実験が図４に示されている。種々の程度のペプチドによる抑制を組み合わせて、０．１乃至１００μg/mlのMIMPの効果を調べた。ペプチド-誘導抑制が５０％未満の場合には、MIMPは増殖応答を正常に近い範囲に回復させた。しかしながら、抑制が更に過酷（＞５０％）である場合には、MIMPの効果は有意ではなかった。これらのデータは、効果が軽度乃至中程度であるが、過酷ではない場合には、MIMPがHIV-関連ペプチドの免疫抑制を逆転しうることを示す。
ウィルス感染はリンパ増殖低下応答と関連する。図５は、リンパ球のインビトロPHA-応答を対照から抑制するウィルス-誘導媒介物質、rIFN- αの効果、及び効果が中程度である場合、すなわち１０及び１００単位/mlのIFN-α濃度において抑制を逆転させる１、１０、１００μg/mlのMIMPの効果を示す。
リウマチ様動脈炎にみられるような炎症はリンパ増殖低下応答と関連する。図６は、通常のリンパ球のPHA-応答を抑制する炎症伝達物質の一であるPGE2（１０-5M）の効果、及び抑制を逆転させるMIMP（１乃至１００μg/ml）の効果を示す。
高齢者及びHIV-感染者のHPBLの応答
図７は、高齢者及びHIV-感染者のPHA応答、及び正常の対照（Ｃ）と比較した１００μg/mlのMIMPによる刺激の効果を表す。対照患者（２２）は正常のPHA及びMIMP応答を示した。１５人の高齢患者（Ag＋）は正常のPHA応答及びMIMPに対する応答を示した。９人の高齢患者（Ag−）は著しく低下したPHAに対する応答及びMIMPに対する応答を示した。PHAに対する応答が不十分な９人の外見上健康な高齢患者のうち、５人につてリンパ球の数を調べると平均して正常であった。
８人のHIV-感染者(ARC)は平均して、平均的な正常のPHA応答の５０％を示し、MIMPに対しては有意に応答した。８人のエイズ患者は応答を示さなかった。これらのデータは、MIMP治療の臨床被検者は、治療前にインビトロで薬剤に対する感受性の予備テストをすべきであることを示唆する。
１０及び１００μg/mlのMp-IMPを用いて前述の実験記録を繰り返すと、１００μg/mlのMIMPに関して得られた結果と同一の結果が得られた。
実施例３
マウスの脾臓のリンパ球を用いた研究
MSLを分裂促進剤Con A及びLPSで刺激した。０．１、１、１０、及び１００μg/mlの濃度範囲の、これらの応答を刺激する効果に関する一連の実験において、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びIMPについて分析した。図８に示されるように、Ha-IMP、Arg-IMP、E-IMP、Me-IMP、Mp-IMP及びIMPはCon Aに対するMSLの増殖応答を刺激した。
マウス（図８）及びヒトのリンパ球（図１）のデータを比較すると、ヒトのリンパ球のほうがマウスのリンパ球よりこれらの化合物に対して敏感である。
更なる実験において、マウスの脾臓細胞を、PHA又はLPS及びMIMP（１乃至１００μg/ml）を用いてインキュベートした。MIMPは、分裂促進剤の存在下では脾臓細胞応答に影響を及ぼさなかった。分裂促進剤の存在下では、以下に示すように、MIMPはトリチウム標識チミジンの添加により測定されるリンパ球の増殖応答を漸進的かつ有意に増大させた。PHAに対する脾臓細胞の応答は優先的にＴリンパ球応答に反映するので、Con Aを用いた場合に見られる応答を確認した。LPS応答も又前記の実験に平行して応答する。
実施例４
PFC応答のインビボ刺激
腹腔内(ip)投与
化合物がインビボでリンパ球を刺激するか否かを決定するために、マウスに１×１０8細胞のヒツジの赤血球(SRBC)及び体重１kg当たり５０mgのHa-IMP、Arg-IMP、Me-IMP又はIMPを腹腔内投与して免疫性を与え、脾臓のプラーク抗体形成細胞（PFC）を５日後に測定した。Ha-IMP、Arg-IMP及びMe-IMPは、（図９に示されるように）PFC応答を有意に刺激した。体重１kg当たり５０mgの３つの実験においてIMPを対照と比較したところ、有意な効果はなかった（IMP:平均PFCが１９７±２１の１２試料；対照：平均PFCが２１０±１７の１５試料）。このことは、5′-ヌクレオチダーゼ活性から保護された場合にはIMP単独でインビボ活性を有することを示す。
PFC応答に及ぼすHa-IMP、Arg-IMP及びMe-IMPの投与量応答のデータは、それぞれ図１０Ａ、１０Ｂ及び１０に示されるように表された。３つの全ての化合物は、体重１kg当たり５０mgで最適に刺激したが、Me-IMPは低投与量で活性であった。
これに対し、マウスのリンパ球増殖に関するインビトロデータにおいては、試験した化合物の中でMe-IMPが最も影響力があると思われた。
経口投与
経口投与時に活性があるか否かを決定するために、マウスに１×１０8細胞のヒツジの赤血球(SRBC)を腹腔内投与し、Me-IMPを経口投与して免疫性を与えた。Me-IMPは、SRBC抗原で免疫化するとき及びその後５日間毎日投与した。脾臓のプラーク抗体形成細胞(PFC)は５日の終了時に測定した。図１１は、種々の投与量のMe-IMPに関する結果を示す。
SRBC抗原とともに、及び５日間毎日経口的に投与されたMe-IMPは、体重１kg当たり５０mgのときにピークとなりPFC応答を刺激した。
実施例５
Me-IMPのインビボ投与後の分裂促進物質に対するインビトロ応答
実施例４の実験に平行した実験により、脾臓のリンパ球のPHA及びCon A応答の両方がMe-IMPの経口投与により刺激されることを確認する。
脾臓のリンパ球は、５日間体重１kg当たり０乃至１００mgの範囲でMe-IMPを経口投与し、次いで犠牲したマウスから得た。脾臓のリンパ球をPHA（０．５μg/ml）又はCon A（０．５μg/ml）とともに４８時間インキュベートした。培養は、最後の１８時間はトリチウム標識チミジンでパルスした。図１２は、種々の経口投与量のMe-IMPに関する結果を示す。
これらのデータは、IMPと比較して、5′-IMP誘導体がＴ細胞依存性抗体応答の有力な補助薬であり、Me-IMPの場合には、Ｔリンパ球増殖応答の有力な刺激剤であることを示す。
使用した投与量においては、Me-IMPは非経口及び経口投与の両方において活性であり、外見上非毒性であった。Me-IMPの急性毒性(LD50)は、腹腔内投与では体重１kg当たり５００mg以上であり、経口投与では体重１kg当たり５０００mg以上であった。
実施例６
遅延型のインビボ過敏性の刺激
１０6乃至１０9細胞の勾配のある投与量でSRBCを腹腔内投与することによりマウスに免疫性を付与した。予備的な実験では、遅延型の過敏症に対するSRBCの最適免疫化投与量は１０7乃至１０8細胞であることが示された。この研究においては、動物を免疫化するのに１０7の投与量が選択された。
免疫化の４日後に、５０μlの食塩加リン酸緩衝液（PBS）中の１０8のSRBCを各マウスの左後ろ足に皮下注射することにより抗原投与した。賦形剤（５０μl）を対照として右後ろ足に皮下注射した。試験する化合物は、免疫化時又は誘発時のいずれかに腹腔内に注入した。抗原投与の２４時間後に、技術者のカリパスを用いて足の太さの増加（左−右）として足の膨潤を測定した。
結果は、足の太さの増加として０．１mm単位で表す。このようにして測定した遅延型の過敏症の特性決定は、MacDonaldらにより既に記載されている(1979)。図１３及び１４はこの試験の結果を示す。特に、図１３は、免疫化時に投与された場合の、Me-IMPに関する投与量応答プロットを示す。図１４は、免疫化時(Immunization)に投与された場合及び抗原投与時(Challenge)に投与された場合の、Me-IMPに関する応答を示す。
免疫化時に１回でMe-IMPを投与した場合には、遅延型の過敏症が有意に刺激された。抗原投与時に１回でMe-IMPを投与した場合には、その効果は有意ではなかった。これらのデータは、おそらく免疫応答の導入肢(afferent limb)、Ｔヘルパー細胞における作用によりMe-IMPが細胞免疫を促進することを示す。このことは、増大する抗体産生の投与量より少ない投与量においてもそうであり、DTH及びこれらの応答を媒介するTh1細胞に及ぼす優先的な効果を示す。
実施例７
保護された-IMP誘導体によるインビボ治療
フレンド白血病ウィルス(FLV)
保護された-IMP誘導体の臨床治療の有用性を示すために、BALB/cマウスにフレンド白血病ウィルス(FLV)を感染させた。対照マウスは、感染後３日乃至１３日に塩類液で腹腔内的に治療し、Me-IMPで治療するマウスは、３日乃至１３日に１mg/kg/日で治療し、死んだ日を記録した。図１５は、Me-IMPで治療したマウスのほうが平均生存時間(MST)が長いことを示す。それは、Wilcoxon試験により満足に有意である（ｐ＜０．０４）
腫瘍の発生
癌の発生した動物に及ぼすMe-IMPの効果を試験するために、スイスマウス（６）のグループに、Carswellらの方法(1975)に従ってMeth A腫瘍を皮下に接種した。８日後、腫瘍が約８mmの大きさになった時に、動物に初回免疫投与量の種々の量のMe-IMP又は等量の塩類液で静脈内に治療した。５時間後、動物に１０μgのリポ多糖類エンドトキシン(LPS)で静脈内的に治療した。腫瘍壊死因子(TNF)の量は治療の２４時間後に血清を分析し、腫瘍の壊死（−乃至＋＋＋）は４８時間後に評価した。完全な腫瘍の退縮は２０日後に評価した。結果を表２に示す。
実施例８
リステリア感染に及ぼす保護された-IMPの効果
実験記録：
感染 マウス適応細菌菌株 L．単球遺伝子 EGD（ロシアのGamaleya Resesarch Institute Academy Medical Science）を、感染日（０日）に０．５mlのPBS(pH＝７．４)中１．７×１０4細胞／マウスの投与量でマウスの腹腔内からオスのBALB/cマウス（１４乃至１６gm）に投与した。
治療 種々の濃度のMIMP（AGS-36-217）の溶液を、表３に示すように感染５日前（−５日）から経口的又は非経口的に投与した。
実施例９
サルモネラ感染に及ぼす保護された-IMPの効果
実験記録：
感染 マウス適応ネズミチフス菌菌株 415（ロシアのGamaleya Research Institute,Academy Medical Science）を、０．５mlのPBS(pH＝７．４)中５×１０4細胞の投与量でマウスの腹腔内から注入した。投与量は、平均生存時間が２．５日で６日目の死亡率が１００％になるように決定した。
治療 種々の濃度のMIMP（AGS-36-217）の溶液を、表５に示すように非経口的に投与し、治療の結果を以下の表６に示す。
実施例１０
インフルエンザウィルス誘導死亡率に及ぼすMIMPの効果
このモデルにおいては、NMRIマウスにエアゾール法によりインフルエンザウィルスを抗原投与した。インフルエンザウィルスの投与量は、対照動物において平均生存時間が８乃至１１日で８０乃至１００％の死亡率であるように決定した。対照(PBS)、MIMP（１００又は２００μg/マウス）及びスクアラン（１％）＋MIMP（２００μg/マウス）による治療を、感染１日前、感染１時間前及び感染１時間後に開始した。
結果を以下の表７及び８に示す。抗原投与２４時間（１日）前又は１時間前後に鼻腔内に２００μg/マウス（５mg/kg）のMIMPを投与した場合には、生存物の数及び平均生存時間(MST)が増大した（表７）。感染１時間前にMIMPを１００μg/マウスだけ投与した場合にも、生存物及びMSTが増大した（図１６）。
第二の実験においては、感染１日前又は感染１時間後にスクアラン（１％）とともに２００μg/マウスのMIMPを鼻腔内に投与した場合に生存物及びMSTが増大した。図１７に示されるように、これらの治療をしたグループ中のマウスは１００％生存した。スクアランのみでは効果はなかった。
HBsAgに対する抗体応答の刺激
前の研究を使用して、HBsAg（Walker et al.,1981）に対する抗体産生における不十分な応答動物としてDBA/2マウスを選択した。
正常な（対照）DBA/2 マウス
HBsAgのみで治療した対照グループ及び、実施例で調製したような、HBsAgとMIMPの組合わせで治療したグループにおける抗-HBs検出結果を表９に示す。以下の表に種々の接種計画を提供する。
スキーム 治療
１ HBsAg のみ
２ HBsAg+MIMPを経口投与（接種３０分前）
３ HBsAg+MIMPを同時に腹腔内投与、次いで４日毎にMIMPを経口投与
４ HBsAg+MIMPを同時に腹腔内投与
５ 照射＋HBsAg
６ 照射＋スキームN2
７ 照射＋スキームN3
８ 対照
免疫無防備状態のDBA/2マウス
第二組の実験においては、電離放射線を受けた免疫無防備状態のDBA/2マウスにおいて、HBsAgに対する特異的な免疫応答の誘導に及ぼすMIMPの効果を、対照DBA/2について示したものと同一の接種スキームを用いて分析した。
対照グループ（HBsAgのみを投与）の照射マウス及び組合わせ（スキーム２及び３を用いHBsAg及びMIMP）で治療したマウスにおける抗-HBs検出結果を表１０に示す。
実施例１１に示された結果は、保護された-IMP誘導体がHBsAgに対する体液性免疫応答の発現に影響を及ぼしうることを示す。腹腔内投与単独、並びに経口投与単独として５０mg/kgのMIMPを投与すると、HBsAgに対する抗体の量が有意に増大しうることが示された。抗原を腹腔内投与した後、MIMPを更に経口投与してもその活性は増大しなかった。
5′-ヌクレオチダーゼに耐性のあるイノシン-5′-モノホスフェート誘導体の補助薬効果のメカニズムに関する仮説は作成しうるが、本発明がこの作用様式に限定されるとみなされるべきではない。血液透析患者及び免疫無防備状態の個体において、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫不応答が観察された（それぞれ、Walz et al.,1989;Hess et al.,1989）。ワクチン投与量を増大させたり投与回数を増大させてセロコンバージョン(seroconversion)となることもある（Walker et al.,1981）。これらの患者においては可溶性のインターロイキン-2-受容体が観察され、入手しうるIL-2の結合によるインターロイキン-2作用の機能障害が、Ｂ型肝炎ワクチンに対する応答に影響した（Walz et al.,1989;Meuer et al.,1989）。Meuerらは、４０mgのワクチン、次いで１．２×１０5単位の天然インターロイキン-2を、免疫不応答の１０人の血液透析患者に注射した。４週間後、１０人のうち６人の患者は、抗体量が正常以下であったけれどもセロコンバーションを示した。タンパク質又はペプチド抗原に対するMHC-結合免疫不応答は、IL-2の投与により克服されうる。これらの実施例の結果は、保護された-IMP誘導体が補助薬としてＴ細胞により実現され、インターロイキン-2を含みうることを示唆する。
この出願中の種々の刊行物は引用又は番号により参照される。本明細書中に十分に引用していない参考文献は以下に挙げる。これらの刊行物の完全な形での開示は、本発明の関連する技術の状態を更に十分に記載するために本出願に参考として導入されている。
本発明は説明的に記載されており、使用されている専門用語は限定する用語ではなく記述する用語であることは理解されるべきである。
明らかに、前述の数示を考慮して本発明の多くの修正及び変化が可能である。従って、請求の範囲以内で、本発明は明細書に記述された以外にも実施しうる。
Claims (9)
- 5’−ヌクレオチダーゼに抵抗性のイノシン−5’−一リン酸の製造方法であって、以下の工程：
（１）2’,3’-イソプロピリデンイノシンのヌクレオチドを保護する工程、
（２）保護した2’,3’-イソプロピリデンイノシンをメチルホスホン酸ジクロライドと反応させる工程、
（３）前記ヌクレオチドを脱保護して、メチル−5’−イノシン一リン酸を生成させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 次式で示される5’−ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン−5’−一リン酸化合物の免疫強化効果量と、製薬上許容されるキャリヤーとを含有する免疫強化用組成物。
（式中、Ｒは、5’−ヌクレオチダーゼによる化合物の加水分解を阻害する部分であり、メチルである。） - 次式で示される5’−ヌクレオチダーゼ抵抗性のイノシン−5’−一リン酸化合物の免疫強化効果量と、製薬上許容されるキャリヤーとを含有するＴ細胞免疫強化用組成物。
（式中、Ｒは、5’−ヌクレオチダーゼによる化合物の加水分解を阻害する部分であり、メチルである。） - 前記Ｔ細胞が、Th1細胞である請求項３に記載の組成物。
- 前記Ｔ細胞が、HIV感染患者からのものである請求項３項に記載の組成物。
- 次式を有するワクチン用のアジュバンド組成物。
（式中、Ｒは、5’−ヌクレオチダーゼによる化合物の加水分解を阻害する部分であり、メチルである。） - 前記ワクチンが、Ｂ型肝炎用である請求項６に記載のアジュバント組成物。
- 精製Ｂ型肝炎抗原及び次式で示されるアジュバント組成物を含有することを特徴とするＢ型肝炎に対するワクチン。
（式中、Ｒは、5’−ヌクレオチダーゼによる化合物の加水分解を阻害する部分であり、メチルである。） - 細胞内細菌性病原体及びウィルスに対する免疫系刺激剤として使用される組成物であって、以下の式で示される5’−ヌクレオチダーゼ抵抗性イノシン−5’−一リン酸を含有する組成物。
（式中、Ｒは、メチルである。）
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