ES2256845T3 - Inmunopotencia de derivados de inosina monofosfato resistentes a 5'-nucleotidasa y utilizacion del mismo. - Google Patents
Inmunopotencia de derivados de inosina monofosfato resistentes a 5'-nucleotidasa y utilizacion del mismo.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR INOSINA NOFOSFATO Y SUS DERIVADOS RESISTENTES A LA 5 DIANTE LA MODIFICACION QUIMICA DE LA INOSINA PARA DAR LA FORMULA (I), EN LA CUAL R SE SELECCIONA ENTRE EL GRUPO FORMADO POR COMPUESTOS DE ALQUILO, ALCOXI Y AMINO SECUNDARIO, MEDIANTE EL CUAL SE RETIENE LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA INOSINA - 5 - MONOFOSFATO IN VIVO.
Description
Inmunopotenciación de derivados de inosina
monofosfato resistentes a 5'-nucleotidasa y
utilización del mismo.
La presente invención se refiere, de modo
general, a medios y métodos para aumentar la respuesta inmune al
incrementar la efectividad de un agente inmunopotenciador,
inosina-5'-monofosfato, y a las
utilizaciones del agente mejorado. Más particularmente, la presente
invención se refiere al tratamiento de pacientes con tumores,
patógenos bacterianos víricos e intracelulares, y a un coadyuvante
en forma de vacuna.
Las inmunodeficiencias secundarias son habituales
en cáncer, envejecimiento, autoinmunidad, SIDA, y otras
enfermedades víricas y bacterianas. Se ha creído desde hace tiempo
que el tratamiento de estas inmunodeficiencias secundarias tendrían
como resultado una prognosis mejorada de estas enfermedades. A pesar
de abundantes esfuerzos experimentales, hasta el momento sólo se
han autorizado y utilizado clínicamente para estos tratamientos el
levamisol y la isoprinosina. Existe la necesidad de disponer de
medicamentos más eficaces de este tipo.
La función inmune incluye los aspectos humoral y
celular del sistema inmune, así como los aspectos que dependen de
macrófagos y de granulocitos. Los diferentes aspectos de la función
inmune pueden ser mejorados o modificados por diferentes agentes a
los que se puede hacer referencia, en general, como
inmunopotenciadores. Se han utilizado de manera extensa los
inmunopotenciadores, incluyendo medicamentos y sustancias
biológicas, en la prevención y tratamiento de enfermedades
humanas.
No obstante, trabajos recientes (Sad y Mosmann,
1994; Sieling y otros, 1994; Chakkalath y Titus, 1994; Tripp y
otros, 1994; Bogdan y otros, 1991; Fiorentino y otros, 1989) han
sugerido que una estimulación impropia de la respuesta inmune puede
facilitar en realidad el proceso de la enfermedad. Se muestra en los
modelos murino y humano que el perfil de la citoquina de la
respuesta inmune está regulado, por lo que cada una de las
subclases de células de T helper (Th), Th1 o Th2, es activada en
respuesta a los patógenos. Las células Th1 tienen, en general, un
modelo de secreción de IL-2,
IFN-\gamma y linfotoxina, mientras que el modelo
de secreción general de Th2 es IL-4,
IL-5, IL-6, IL-9,
IL-10 y Il-13. Los perfiles de
citoquina de las células Th1 se asocian, en general, con
resistencia a la enfermedad, y los perfiles de la citoquina de Th2,
con enfermedad progresiva. En particular, se ha demostrado que para
patógenos intracelulares, tales como Mycobacterium leprae,
Listeria monocytogenes y Leishmania major, el perfil
de citoquina de las células Th1 es necesario para restringir el
crecimiento de los patógenos. Muchos factores determinan cuál es el
subconjunto de células T que es activado durante la respuesta
inmune, y se muestra que se trata de una combinación de factores,
incluyendo IL-12 procedente de macrófagos
activados, que conducen a una respuesta Th1. En estas enfermedades,
sería útil tener un medio para aumentar o estimular la respuesta
Th1. Por ejemplo, los enfermos de lepra no expresan la respuesta
tipo 1, sino que sus lesiones expresan las citoquinas tipo 2, que
son típicas de respuestas humorales y de inmunosupresión de la
inmunidad mediada por células, requerida para resistencia a
patógenos intracelulares.
Una clase de inmunopotenciadores ha sido derivada
de estructuras de purina, tales como inosina o hipoxantina, por
ejemplo, isoprinosina (medicamento complejo sintético, compuesto por
inosina y la sal de
p-acetamido-benzoato de
N,N-dimetilamino-2-propanol
en una proporción molar de 1:3; sal DIP).
y NPT 15392
(9-eritro-2-hidroxi-3-nonil-hipoxantina).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos compuestos han sido clasificados como
"medicamentos timomiméticos" (Hadden, 1985) por el hecho de que
estimulan el sistema inmune por acciones principalmente sobre los
linfocitos derivados del timo (T), si bien actúan sobre otras
células involucradas en las respuestas inmunes. La isoprinosina es
un ejemplo de un medicamento timomimético útil, desde el punto de
vista médico, que está autorizado para utilización humana en una
serie de países en todo el mundo. La acción de la isoprinosina
in vitro viene acompañada por la inosina y potenciada por el
complejo con sal DIP (Hadden, 1978). La acción de la isoprinosina
in vivo no se consigue con inosina o sal DIP solas (Wybran y
otros, 1982), lo cual sugiere a los solicitantes que la formación de
complejos y la protección de la base de inosina es crítica para la
actividad in vivo.
La búsqueda de moléculas más activas
inmunológicamente de este tipo para utilización clínica ha generado
una literatura considerable.
La Patente U.S.A. 3.728.450 de Gordon da a
conocer complejos formados por inosina y aminoalcoholes que tienen
actividad farmacológica en la lucha contra el virus de la gripe o de
herpes.
La Patente U.S.A. 4.221.794 de Hadden y otros da
a conocer complejos de derivados de purina (9-(hidroxialquil)
purinas) con sales de aminoalcoholes de ácido
p-acetamidobenzoico que tienen actividad
inmunomoduladora y antivírica.
La Patente U.S.A. 4.221.909 de Hadden y otros da
a conocer sales de ácido p-acetamidobenzoico de
9-(hidroxial-
quil) purinas útiles como viricidas, inmunoreguladores y agentes antileucemia.
quil) purinas útiles como viricidas, inmunoreguladores y agentes antileucemia.
La Patente U.S.A. 4.340.726 de
Giner-Sorolla y otros da a conocer ésteres
(compuestos de purina) que tienen actividad inmunomoduladora,
antivírica, antitumoral e inhibidora de enzimas.
La Patente U.S.A. 4.221.910, de
Giner-Sorolla y otros, da a conocer
9-(hidroxialquil) purinas útiles como inmunopotenciadores,
viricidas y agentes antileucémicos.
La Patente U.S.A. 4.457.919, de
Giner-Sorolla y otros, da a conocer derivados de
purina que tienen actividad inmunomoduladora, antivírica y
antitumoral.
Las Patentes U.S.A. 4.510.144 y 4.387.226, de
Giner-Sorolla y otros, dan a conocer derivados de
dihidrotiazolo purina con actividad inmunomoduladora.
La solicitud de Patente japonesa publicada número
58-140100 da a conocer
(heptamin-1-ol)-5'-adenosina-monofosfato.
Saha y otros (1988) dan a conocer su actividad en la potenciación
de respuesta inmune humoral primaria in vitro contra un
antígeno dependiente de células T (glóbulos rojos de ovejas), cuando
se encuentran presentes en la fase previa del cultivo de células
del bazo. Saha y otros (1987) dan a conocer la actividad de HAA en
el aumento de actividad anti-SRBC PFC y valores de
titulación de anticuerpos en ratones macho ICR. También muestran la
actividad de HAA en el incremento de actividad
anti-SRBC PFC y valores de titulación de anticuerpos
en ratas espontáneamente hipertensivas.
Hadden y otros (1983) han indicado que las
purinas, particularmente compuestos que contienen inosina o
similares a inosina, en el caso en que se examinaron, comparten de
manera general la capacidad de imitar la acción de la hormona
tímica para inducir diferenciación de precursores de células T y
para potenciar las respuestas funcionales de células T maduras,
particularmente las células Th1 como respuesta a las infecciones de
patógenos intracelulares. Un ejemplo de estas moléculas, el factor
de transferencia, se supuso que contenía
inosina-5'-monofosfato (IMP) en su
estructura más elaborada (Wilson y Fudenberg, 1983).
Sería útil disponer de estos compuestos
inmunomoduladores/inmunopotenciadores para utilización tal como se
explica más adelante.
Las infecciones víricas y los patógenos
bacterianos intracelulares son una preocupación importante desde el
punto de vista de la salud pública. En estas dos categorías, los
patógenos bacterianos y víricos evitan el sistema inmune del
hospedante porque crecen dentro de las células del hospedante. Una
respuesta inmune (CMI) mediada por células, por células Th1
iniciadas por macrófagos, es la forma general de defensa del
hospedante o resistencia contra patógenos intracelulares una vez ha
tenido lugar la infección. Una respuesta de anticuerpos eficaz en
respuesta a la vacunación puede conferir inmunidad.
Si bien se dispone de tratamiento para las
enfermedades bacterianas mediante antibióticos, la resistencia
creciente a los medicamentos de las bacterias hace necesario buscar
otros caminos para el tratamiento. Una forma de tratamiento de
individuos infectados consiste en incrementar la efectividad de su
sistema inmune. En estas enfermedades, la presencia de linfocitos T
sensibilizados y macrófagos activados es el factor clave de la
inmunidad. Por lo tanto, los tratamientos efectivos para estas
enfermedades deben activar macrófagos y sensibilizar los linfocitos
T apropiados (Ryan en Stites y Terr, páginas
637-645, y Wills en Stites and Terr, pág.
646-656).
Entre los patógenos bacterianos intracelulares se
incluyen Salmonela, Legionela, Listeria, Micobacteria y Brucela.
Las especies de Salmonela son miembros de las enterobacterias y
provocan una parte significativa de las enfermedades entéricas,
incluyendo las fiebres tifoides. La cápsula de S. typhi tiene
un antígeno capsular de superficie y el anticuerpo contra el
anticuerpo capsular no es protector. En realidad, muchos portadores
de fiebres tifoides tienen elevados niveles de anticuerpos contra el
patógeno.
Los estudios de Legionela muestran que es un
parásito intracelular obligado de macrófagos. La Listeria es
gram-positiva provocando infecciones de la meníngea
y sepsis en adultos y una variedad de infecciones en neonatos. El
papel principal de la defensa contra estos patógenos se ha
demostrado que es la activación de macrófagos asociada a linfocitos
T. Los estudios de enfermedades asociadas con Brucela han demostrado
también que el anticuerpo no confiere protección y que los
macrófagos activados producidos por linfocitos T específicamente
sensibilizados generan protección.
Sería útil tener medicamentos eficaces para estas
enfermedades, que activen macrófagos y sensibilicen los linfocitos
T apropiados con respecto al patógeno.
En general, hay pocos o ningún medicamento
anti-vírico eficaz y, por lo tanto, la protección
contra patógenos víricos sigue siendo también una meta importante
de los sistemas de salud pública. La vacunación sigue siendo la
mejor base de protección en enfermedades víricas. No obstante, las
vacunas frecuentemente no confieren inmunidad a causa de: (1) un
antígeno vírico poco inmunogénico; (2) la falta de tiempo entre la
vacunación y la exposición; o (3) la incapacidad de respuesta del
individuo vacunado.
Por ejemplo, las vacunas de la gripe deben ser
actualizadas constantemente dado que el virus sufre variaciones
antigénicas. Frecuentemente, la vacuna más corriente no se encuentra
a disposición, o no en producción plena, antes del inicio de los
meses de invierno, que son los meses de máxima epidemia. Por lo
tanto, los receptores de la vacuna pueden verse expuestos al virus
del medioambiente antes de que se disponga de titulaciones del
anticuerpo. Además, entre los pacientes de riesgo elevado, es decir,
personas mayores y jóvenes, existe frecuentemente una adaptación
reducida hasta que se inicia una epidemia. Además, la gripe afecta,
de manera especialmente fuerte, a las poblaciones de jóvenes y de
personas mayores, y también a individuos con enfermedades
subyacentes cardiorespiratorias. Estos grupos específicos tienen
frecuentemente una respuesta inmune menos vigorosa a la vacuna.
La infección vírica de la gripe suprime las
defensas antibacterianas pulmonares normales, de manera que los
pacientes que se recuperan de la gripe tienen un riesgo mucho mayor
de desarrollar neumonía bacteriana. Se observa que existe una
reducción de macrófagos alveolares o neutrófilos durante la
infección vírica de la gripe.
Por lo tanto, un medio para aumentar la respuesta
inmune a la infección vírica de la gripe o de aumentar la
resistencia a la neumonía bacteriana sería útil en el tratamiento de
esta enfermedad. Una posible forma de incrementar la eficacia del
tratamiento es por tratamiento con sustancias que poseen
características inmunopotenciadoras (Hadden y otros, 1976; Hadden,
1987).
La infección por hepatitis B crónica es una
preocupación sanitaria importante. El virus de la hepatitis B es la
causa de hepatitis aguda y crónica, así como carcinoma hepático. La
enfermedad aguda es autolimitadora, mientras que las infecciones
crónicas persisten durante toda la vida del hospedante. Los
portadores crónicos permanecen con la infección toda la vida. Se
estima que hay más de 100 millones de portadores en todo el
mundo.
No hay tratamientos eficaces en la actualidad
para esta enfermedad. La prevención, mediante vacunación, sigue
siendo la única solución. La vacunación para las personas de riesgo
es crítica (James y otros, 1991; Mills, 1991). No obstante, después
de la vacunación con antígeno de superficie de virus B de la
hepatitis (HBsAg), aproximadamente de 2% a 15% de los vacunados se
ha observado que no producen anticuerpos para el antígeno de
superficie de virus de hepatitis B (anti-HBs) y por
lo tanto no están protegidos contra esta infección. En otras
palabras, son personas no reaccionantes ("nonresponders")
(Deinhardt, 1983). Se recomiendan varios enfoques de
administraciones múltiples de preparado de antígeno para inducir
inmunidad intensa contra hepatitis B (Grossman y Cohen, 1991). No
obstante, existe todavía un cierto número de personas no
reaccionantes. Por lo tanto, un medio alternativo para aumentar la
inmunogenicidad de preparados de vacuna contra la hepatitis B es
necesario para solucionar esta importante necesidad de la salud
pública.
Las personas sometidas a elevado riesgo de
infección, se encuentran muy frecuentemente entre pacientes que
están sometidos a hemodiálisis crónico (Ferguson, 1990; Walz y
otros, 1989), los que tienen infecciones por HIV y otros pacientes
con compromiso inmune (Hess y otros, 1989). Los que establecen
contacto con estos grupos y no han tenido previamente contacto con
virus de hepatitis B tienen el riesgo más elevado de infección, y
por lo tanto necesitan una protección rápida y máxima contra la
infección. Esto es particularmente agudo entre las personas que
proporcionan cuidados de salud (Grossman y Cohen, 1991). Por lo
tanto, las personas no reaccionantes a las vacunas disponibles en
la actualidad contra la hepatitis B de estos grupos se encuentran a
un riesgo todavía más elevado de infección.
Sería útil tener la capacidad de incrementar la
eficacia de vacunación dentro de los grupos de personas no
reaccionantes. Una forma posible de incrementar la eficacia de la
profilaxis es el incremento de la inmunogenicidad de vacunas
disponibles, utilizando sustancias biológicamente activas que poseen
características de coadyuvantes.
Es bien conocido que los coadyuvantes tienen
capacidad de estimular la formación de anticuerpos como respuesta a
antígenos heterólogos. Los coadyuvantes se definen como compuestos
capaces de potenciar una respuesta inmune y son, por lo tanto, una
clase de inmunopotenciadores (Stites y Terr, 1991). Los coadyuvantes
son utilizados para incrementar la respuesta inmune en la
vacunación (Seaman, 1991). Por ejemplo, en preparados de vacunas
con hepatitis B, se absorbe en general el HBsAg en hidróxido de
aluminio para aumentar el efecto inmunogémico a efectos de
conseguir una titulación protectora de anti-HBs
(>10 IU/1) que impide las infecciones.
No obstante, tal como se ha indicado
anteriormente, existe un grupo de personas no reaccionantes que no
responden incluso a esta vacuna incrementada (Celis y otros, 1987;
Meuer y otros, 1989). Esta falta de inmunidad de protección por la
vacunación parece debida, en parte, a componentes de la respuesta
inmune, determinada a nivel del complejo de histocompatibilidad
principal (MHC) (Alper y otros, 1989; Walker y otros, 1981). Se ha
sugerido que las personas "no reaccionantes" carecen de un gen
dominante de la respuesta inmune en el MHC y, como resultado, tiene
lugar la síntesis de anti-HBs, como máximo, en
niveles bajos que difícilmente se pueden detectar por los métodos
de detección actualmente aplicados (Thomson y otros, 1977). De
manera similar, los genes de respuesta inmune asociados con el
complejo de histocompatibilidad principal murino
(H-2) han demostrado controlar las respuestas
celular y humoral a determinantes en numerosos antígenos
dependientes de células T, incluyendo (HBsAg).
Los resultados obtenidos en la aplicación
combinada de vacuna de hepatitis B y varios inmunomoduladores
indican lo apropiado de este enfoque, dado que el tratamiento en
combinación puede reducir el número de personas que no reaccionan
por completo o reaccionan con bajos niveles de antiHBs (Celis y
otros, 1987; Meuer y otros, 1989). No obstante, se bien los datos
son prometedores, existen todavía personas que no reaccionan a estos
tratamientos y para los cuales sería útil tener una vacuna contra
la hepatitis B dotada de un coadyuvante, que promocione la
inducción rápida de niveles máximos de anticuerpos específicos e
incremente la protección dentro de la población no
reaccionante.
Hadden y otros (1983) indican que se examinaron
purinas, particularmente conteniendo inosina o compuestos similares
a la inosina, mostrando que comparten, en general, la capacidad para
imitar la acción de la hormona tímica para inducir diferenciación
de células T precursoras y para potenciar respuestas funcionales de
células T maduras.
La isoprinosina ha demostrado una cierta eficacia
en el tratamiento de la agresión letal de gripe en ratones y,
cuando se administra con una dosis subinfecciosa de virus, impide la
mortalidad en agresiones posteriores con virus (Glasky, 1985). La
isoprinosina está autorizada en varios países para utilización
humana en terapia de gripe, basándose en su actividad clínica en el
hombre (Glasky, 1985). No obstante, la media vida de la
isoprinosina en el hombre es menos de cuatro horas y, por lo tanto,
no es muy eficaz para tratamientos in vivo. La isoprinosina
se hidroliza con rapidez, provocando la reducida media vida in
vivo. La inosina in vitro (Hadden, 1978) tiene
propiedades similares a la isoprinosina, pero in vivo es
catabolizada con rapidez de manera que su media vida es incluso más
corta que la isoprinosina, y por lo tanto no tiene actividad in
vivo (Wybran y otros, 1982). Sería útil tener compuestos
similares a la inosina más estables, con mayores capacidades
inmunopotenciadoras.
Hadden y otros, Int. J. Immunopharmac., Vol.13,
Suppl.1, pp.49-54, 1991, describen el monofosfato de
metil inosina, un inmunomodulador de purina para infección HIV.
La presente invención da a conocer un derivado
inmunopotenciador de la
inosina-5'-monofosfato, tal como se
indica en la siguiente reivindicación 1.
En una realización, la inmunopotenciación está
dirigida a un compuesto inmunopotenciante de células T y, en una
realización más específica, a células (Th1) del subconjunto 1 de
células helper T.
Otras desventajas de la presente invención se
apreciarán fácilmente al comprender mejor la misma, haciendo
referencia a la siguiente descripción detallada, considerada en
relación con los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 es un gráfico que muestra la
respuesta (es decir, la proliferación de linfocitos de sangre
periférica humana), como porcentaje de una respuesta de control, de
linfocitos de sangre periférica humana a la fitohemaglutinina de
mitógeno de linfocito, en comparación con el nivel de dosis de
Mp-IMP (_\blacktriangle_), Me-IMP
(_\vartriangle_), IMP (- - \lozenge - -), E-IMP
(- - \blacklozenge - -), Arg-IMP (- - \square -
-), y Ha-IMP (_\bullet_) presente en el medio de
cultivo;
la figura de referencia 2 es un gráfico que
muestra la curva de respuesta a la dosis de linfocitos humanos
normales a MIMP (_\circ_) e IMP (- - \bullet- - ) desde 1 a 1000
\mug/ml, en presencia de 0,5 \mug/ml de PHA con los resultados
expresados en forma de proporción con respecto al control de dos
donantes;
la figura de referencia 3 es un gráfico que
muestra la curva de respuesta a la dosis de linfocitos humanos de
control enriquecidos con CD4^{+} (_\circ_) y CD8^{+} (- -
\bullet - -), procedentes de tres donantes a MIMP
(1-200 \mug/ml) en presencia de PHA;
la figura de referencia 4 es un gráfico de barras
de la respuesta a la dosis de linfocitos de humanos de control al
péptido gp41 a 12,5 \muM (barra abierta), 25 \muM (barra
rallada), 50 \muM (barra maciza) y 100 \muM (barra de trazos,
más corta) en presencia de varias concentraciones de MIMP
(0,1-100 \mug/ml), habiéndose indicado el valor
de control sin péptido por la línea horizontal - - -, y los
resultados representan el CPM\pmSEM de un donante representativo
de los cinco comprobados;
la figura de referencia 5 es un gráfico de barras
de la respuesta a la dosis de linfocitos humanos de control, con
respecto a la influencia supresiva de interferon recombinante
\alpha a 10 (barras con rayado cruzado), 100 (diagonal) y 1000
(macizo) unidades/ml en presencia de MIMP 1-100
\mug/ml, el control (barras abiertas) es la respuesta a PHA solo,
y los resultados se expresan en forma de CPM \pm SEM;
la figura de referencia 6 es un gráfico de barras
que muestra el efecto de PGE_{2} (10^{-5}M) en la inhibición
(barra maciza) de la respuesta proliferactiva de linfocitos humanos
de control y el efecto de MIMP a 1, 10 y 100 \mug/ml en invertir
esta inhibición (rayado cruzado), control (barra abierta) es la
respuesta PHA en ausencia de MIMP, los datos son expresados en
forma de CPM \pm SEM;
la figura de referencia 7 es un gráfico de barras
del efecto de MIMP a 100 \mug/ml (barra maciza) sobre la
respuesta PHA (barra abierta) de controles (c), 15 individuos de
edad normal (Ag+), 9 individuos de edad con respuestas PHA
reducidas (Ag-), 8 pacientes de ARC y 8 pacientes de SIDA;
la figura 8 es un gráfico que muestra la
respuesta (es decir, la proliferación de linfocitos de bazo de
ratón), como porcentaje de la respuesta de control, de linfocitos
de bazo de ratón al mitógeno de linfocitos concanavalina A con
respecto al nivel de dosis de IMP (- - \square - -),
Me-IMP (_\vartriangle_), E-IMP
(_\bullet_), Arg-IMP (- - \blacklozenge - -),
Ha-IMP (- - \lozenge - -) y Mp-IMP
(_\blacktriangle_), presentes en el medio de cultivo;
la figura 9 es un gráfico de barras que muestra
el número de células formadoras de anticuerpos de placas de bazo
(PFC) formadas (media \pm SEM) cuando células del bazo recogidas
de ratones, que han sido inmunizados contra las células de glóbulos
rojos de oveja (SRBC), son atacadas con SRBC en el caso de que la
inmunización de los ratones ha sido llevada a cabo conjuntamente
con la administración interperitoneal de Ha-IMP,
Arg-IMP, Me-IMP;
la figura 10A-C es un gráfico de
barras de respuesta a la dosis que indica el número de PFC de bazo (
media \pm SEM) formadas cuando las células de bazo recogidas de
ratones, que han sido inmunizadas contra SRBC, son atacadas con
SRBC, habiéndose llevado a cabo la inmunización de los ratones en
relación con la administración intraperitoneal de varias dosis de
(A)
(heptamina-1-ol)-5'-inosina-monofosfato
(B)
arginina-5'-inosina-monofosfato
y (C)
metil-5'-inosina-monofosfato;
la figura de referencia 11 es un gráfico de
barras de la respuesta a la dosis que muestra el número de células
de bazo PFC (media \pm SEM) formadas cuando células de bazo
recogidas de ratones, que han sido inmunizadas contra SRBC, son
atacadas con SRBC, llevándose a cabo la inmunización de los ratones
conjuntamente con la administración oral de diferentes dosis de
metil-5'-inosina-monofosfato;
la figura de referencia 12 es un gráfico que
muestra la respuesta (es decir, proliferación de linfocitos de bazo
de ratón), como porcentaje de una respuesta de control, de
linfocitos de bazo de ratón a la fitohemaglutinina de mitógenos de
linfocito (- - \blacksquare- -) y concanavalina A (- - \bullet
- -), con respecto al nivel de dosis de
metil-5'-inosina-monofosfa-
to;
to;
la figura de referencia 13 es un gráfico de
barras de respuesta a la dosis, que muestra la respuesta de
hipersensibilidad de tipo retardado (es decir, el incremento de
grosor medio de la huella del pie \pm SEM) en ataque con respecto
al nivel de dosis de
metil-5'-inosina-monofosfato,
administrado en el momento de la inmunización;
la figura de referencia 14 es un gráfico de
barras que compara la respuesta retardada de tipo de
hipersensibilidad (es decir, el incremento medio del grosor de la
huella del pie \pm SEM), en el ataque para administración de
control o de
metil-5'-inosina-monofosfato
(Me-IMP), en el momento de la inmunización con
administración de control y de Me-IMP en el momento
del ataque;
la figura de referencia 15 es un gráfico lineal
que compara la supervivencia de ratones tratados con el control (_)
y Me-IMP (- - -), infectados con virus de leucemia
de Friend (FLV);
la figura de referencia 16 es un gráfico de línea
que compara el porcentaje de supervivencia después de infección de
gripe por aerosol y tratamientos de control (PBS en el día -1,
-\bullet-), MIMP (100 \mug en el día -1, -\vartriangle-),
MIMP (100 \mug en la hora -1, -\circ-), MIMP (100 \mug en la
hora +1, -\blacklozenge-), MIMP (200 \mug en el día -1,
-\square-), MIMP (200 \mug en la hora -1, -\lozenge-), y MIMP
(200 \mug en la hora +1, -v-); y
la figura de referencia 17 es un gráfico de línea
que compara el porcentaje de supervivencia después de infección de
gripe por aerosol y tratamientos de control (PBS en el día -1,
-\bullet-), control (PBS en la hora +1, -\circ-), MIMP (200
\mug en el día -1, -v-), MIMP (200 \mug en la hora +1,
-\vartriangle-), MIMP (200 \mug más Squalane en el día -1,
-\lozenge-), MIMP (200 \mug más Squalane en la hora +1,
-\blacklozenge-).
La presente invención se refiere a un método para
la fabricación de derivados de
inosina-5'-monofosfato que son
resistentes a 5'-nucleotidasa (IMP protegido) para
su utilización como inmunopotenciadores. El método prevé la
modificación química de la
inosina-5'-monofosfato o derivados,
de manera tal que son resistentes a la
5'-nucleotidasa pero requieren todavía la actividad
biológica/perfil de
inosina-5'-monofosfato in
vitro y extiende la actividad biológica a utilizaciones in
vivo que requieren inmunopotenciación/estimulación inmune. Los
métodos de preparación se indican en los ejemplos de preparación
1-5 siguientes. En general, el método químico es
una reacción de condensación
inosina-5'-monofosfato o derivados y
un alcohol, éter o compuesto amino secundario para formar el
compuesto resistente a 5'-nucleotidasa que es activo
in vivo.
La presente invención proporciona un medio para
estimular las células T. Además, los derivados de
inosina-5'-monofosfato resistentes
a 5'-nucleotidasa pueden actuar como coadyuvante en
una vacuna para incrementar la respuesta a los otros componentes de
la vacuna. En una realización preferente, la vacuna es para la
hepatitis B.
En otra utilización de la presente invención, el
IMP protegido puede ser utilizado para el tratamiento de tumores,
infecciones víricas y patógenos bacterianos intracelulares. Ha sido
inesperado encontrar un solo compuesto que puede actuar
terapéuticamente en un individuo infectado, aumentando la respuesta
inmune a tumores, patógenos y que puede actuar, no obstante, como
coadyuvante en la vacunación. (El término "terapéutico", tal
como se utiliza en esta descripción, incluye por lo tanto el
tratamiento y/o profilaxis).
Al conseguir un compuesto resistente a
5'-nucleotidasa, IMP protegido, la presente
invención permite que el compuesto tenga una media vida in
vivo que es efectiva en los tratamientos para aumentar la
respuesta inmune.
La presente invención se refiere a un método para
la fabricación de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa al modificar químicamente, tal como
se describe a continuación, la
inosina-5-monofosfato a la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R se selecciona del grupo
que consiste en un alquilo, alcoxi y compuestos amino secundarios.
El alquilo o alcoxi pueden tener 1-6 átomos de
carbono y, en una realización, están constituidos por metilo o un
metiléster.
La base de la presente invención consiste en la
protección de inosina-5'-monofosfato
(IMP) de la hidrólisis por medio de
5'-nucleotidasas, de manera que el IMP puede ser
utilizado definitivamente in vivo. En una realización
preferente, el IMP protegido es
metil-5'-inosina-fosfonato
(Mp-IMP).
El alcoxi en una
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa tiene la forma -OR', en la que R' es
un grupo alquilo de 2-6 átomos de carbono y, en una
realización específica, es un etilo.
Los compuestos amino secundarios en una
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa tienen la fórmula:
--
\delm{N}{\delm{\para}{H}} --
R^{2},
en la que R^{2} es un grupo
alquilo normal, sustituido, que tiene un total de 16 átomos de
carbono; o bien R^{2} tiene la
fórmula:
--
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{R ^{3} }} --
(CH_{2})_{n} --
R^{4}
en la que R^{3} ha sido
seleccionado entre el grupo que consiste en hidrógeno, C_{1} a
C_{9} alquilo y carboxilo inferiores. En una realización, R^{3}
es
metilo.
El R^{4} es seleccionado del grupo que consiste
en hidroxilo, amino, carboxilo, alquilo-secundario,
hidroximetilo sustituido por alquilo,
-NHC(NH)NH_{2}, -CONH_{2}
y n es un entero de 0 a 4,
preferentemente 1-3, y más preferentemente de valor
3.
En la realización en la que R^{4} es el grupo
alquilo secundario, es preferible de la fórmula
-CH(R^{5})R^{6} en la que R^{5} y R^{6}, que
pueden ser iguales o distintos, son seleccionados independientemente
desde alquilo de 1 a 3 carbonos. Preferentemente, el grupo alquilo
secundario tiene un total de 4 átomos de carbono.
En la realización en la que R^{4} es el
hidroximetilo sustituido por alquilo, es preferiblemente de la
fórmula -C(R^{7}) (R^{8})OH en la que R^{7} y
R^{8}, que pueden ser iguales o distintos, han sido seleccionados
independientemente entre hidrógeno y alquilo de 1 a 3 átomos de
carbono, en el que por lo menos uno es distinto a hidrógeno. En una
realización, R^{7} y R^{8} son ambos metilo.
En el
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa, el compuesto amino secundario puede
ser un péptido enlazado a través de su terminal N al átomo de
fósforo, cuyo péptido es seleccionado entre el grupo que consiste
en ARG-PRO,
ARG-PRO-LYS y
ARG-PRO-LYS-THR.
Esta fórmula es una realización preferente para péptidos
farmacológica o inmunofarmacológicamente activos, en los que una
eventual hidrólisis liberará un péptido activo, por ejemplo,
tuftsina
(ARG-PRO-LYS-THR).
Los derivados protegidos de
inosina-5'-monofosfato que se han
descrito anteriormente se pueden preparar fácilmente por
condensación de un alcohol deseado, o una amina o péptido primario
con inosina-5'-monofosfato,
preferentemente en presencia de un agente de condensación, tal como
diciclohexilcarbodiimida o similar. Los ejemplos de preparación
1-5 proporcionan ejemplos de dichas preparaciones.
Los alcoholes adecuados incluyen alcoholes monohídri-
cos de 2 a 6 átomos de carbono, tales como alcohol etílico, alcohol n-propílico, alcohol n-butílico, alcohol n-hexílico.
cos de 2 a 6 átomos de carbono, tales como alcohol etílico, alcohol n-propílico, alcohol n-butílico, alcohol n-hexílico.
Entre las aminas o péptidos primarios adecuados
se incluyen
6-amino-2-metil-2-heptano
(heptaminol), arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido
glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina,
lisina, fenilalanina, serina, threonina, valina, y
ARG-PRO, ARG-PRO-LYS
y ARG-PRO-LYS-THR y
sus análogos. Se indican métodos adecuados para la fabricación de
conjugados de poliamida-oligonucleótidos en la
publicación de Haralambidis y otros (1990).
La presente invención da a conocer también un
método para la potenciación de la respuesta inmune de un mamífero
que necesita tratamiento de estímulos inmunogénicos. El método
comprende la administración al mamífero de una cantidad
inmunopotenciadora efectiva de un compuesto de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa, tal como se define a continuación
en la reivindicación 2.
En una realización preferente, el subconjunto de
células Th1 T es preferentemente estimulado.
La presente invención se refiere a un método para
tratar pacientes portadores de tumores. El método comprende las
etapas de administrar una cantidad efectiva de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa como estimulador inmune, tal como
se ha descrito, y administrar una cantidad efectiva de endotoxina,
tal como un lipopolisacárido (LPS) o, en una realización
preferente, vacuna de salmonela administrada según las normas de la
FDA. Se debe observar que, en leucemias, es posible administrar
terapéuticamente una cantidad efectiva de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa como estimulador inmune, tal como se
ha descrito con la leucemia FLV.
La presente invención se refiere asimismo a un
método para determinar los pacientes que se beneficiarán del
tratamiento con
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa. El método comprende el aislamiento
de linfocitos de sangre periférica, tal como es conocido en esta
técnica, y llevar a cabo un ensayo de estimulación de linfocitos
in vitro, en presencia de un mitógeno y un IMP protegido. Los
pacientes que presentan una respuesta in vitro deprimida al
IMP protegido no son candidatos al tratamiento con el IMP
protegido.
Los términos "estimulador inmune" y/o
"inmunopotenciador", tal como se utilizan en esta descripción,
se refieren a compuestos que, cuando se administran a un individuo
o se someten a prueba in vitro, incrementan la respuesta
inmune a un antígeno y/o a un compuesto en el individuo o sistema de
prueba al cual se administran. Algunos antígenos son débilmente
inmunogénicos cuando se administran solos o son tóxicos para el
individuo a concentraciones que evocan respuestas inmunes en el
individuo. El estimulador inmune o inmunopotenciador puede aumentar
la respuesta inmune del individuo al antígeno o compuesto, haciendo
el antígeno más inmunogénico o puede hacer el sistema inmune más
reactivo. El estimulador inmune/inmunopotenciador puede afectar
también la respuesta inmune de manera tal que se requiere una dosis
más baja del antígeno/compuesto para conseguir una respuesta inmune
en el
individuo.
individuo.
Entre los patógenos bacterianos intracelulares se
incluyen Salmonella, Legionella, Listeria y
Brucella. Las especies de Salmonella son miembros de
las enterobacteriáceas. El tratamiento de patógenos víricos
previstos por la presente invención incluyen, sin que ello sirva de
limitación, gripe, virus de leucemia de Friend, hepatitis, herpes y
HIV.
Para el tratamiento de las enfermedades que se
han explicado, se administrará un estimulador inmune seleccionado
entre derivados de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa, a continuación del diagnóstico de
una inmunodeficiencia secundaria en relación con tumores cancerosos,
infecciones víricas o infecciones bacterianas intracelulares. El
estimulador inmune se utilizará a una cantidad efectiva y, en
general, será de 1 a 50 mg/kg de peso corporal por día con una
realización preferente de 1 a 10 mg/kg de peso corporal por día. El
estimulador inmune será administrado en el momento de diagnóstico
inicial, diariamente o las veces determinadas de acuerdo con una
práctica médica satisfactoria, teniendo en cuenta el estado clínico
del individuo paciente, el lugar y método de administración,
programación de la administración y otros factores conocidos para
los médicos.
La "cantidad efectiva" para los objetivos de
la invención se determina por consideraciones conocidas en la
técnica de tratamiento de inmunodeficiencias secundarias, en las que
debe ser eficaz para proporcionar un alivio medible en individuos
sometidos al tratamiento, tales como los que muestran mejoras, que
incluyen, sin que ello sirva de limitación, tasa de supervivencia
mejorada, recuperación más rápida, mejora o eliminación de los
síntomas o reducción de complicaciones postinfecciosas y, en el caso
apropiado, titulación de anticuerpos o titulación incrementada
contra el agente infeccioso, reducción de la masa tumoral u otras
mediciones, según sea apropiado y conocido por los técnicos en esta
materia médica.
En los métodos de la presente invención, el
estimulador inmune de la presente invención, es decir, los derivados
de inosina-5'-monofosfato (IMP
protegido), se pueden administrar de diferentes maneras. Se debe
observar que el estimulador inmune puede ser administrado como
compuesto o como sal farmacéuticamente aceptable, y se puede
administrar solo o en combinación con portadores farmacéuticamente
aceptables. Los compuestos pueden ser administrados oralmente, de
forma subcutánea o parenteralmente, incluyendo administración vía
intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal o
intranasal. Los implantes de los compuestos son también útiles. El
paciente objeto de tratamiento es un animal de sangre caliente y,
en particular, mamíferos, incluyendo al hombre.
Se observará que los humanos son tratados, en
general, durante más tiempo que los ratones que se han puesto como
ejemplo, teniendo el tratamiento una duración proporcional a la
duración del proceso de la enfermedad y a la eficacia del
medicamento. En general, las dosis son proporcionales al peso
corporal y al metabolismo, y las dosificaciones son transferidas de
modelos animales, que se han indicado como ejemplo a los humanos,
teniendo en cuenta estos factores, tal como se conoce en este
sector.
Las dosis pueden ser dosis individuales o bien,
en la realización preferente, dosis múltiples durante un período de
varios días.
Cuando se administran los derivados IMP
protegidos por vía parenteral, se formularán, de manera general, en
una unidad de dosificación en forma inyectable (solución,
suspensión, emulsión). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas
para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles,
y materiales en polvo estériles para su reconstitución en
soluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede
ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo,
agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol,
polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los
mismos y aceites vegetales.
Se puede mantener la fluidez apropiada, por
ejemplo, por utilización de un recubrimiento tal como lecitina, por
mantenimiento de las dimensiones requeridas de partículas en el caso
de dispersión y por la utilización de tensoactivos. También se
pueden utilizar como sistemas y solventes para composiciones del
compuesto vehículos no acuosos tales como Squalane, aceite de
semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de
soja, aceite de maíz, aceite de girasol, o aceite de cacahuetes, y
ésteres tales como isopropil miristato. De manera adicional, se
pueden añadir varios aditivos que aumentan la estabilidad,
esterilidad, e isotonicidad de los compuestos, incluyendo
conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes, y
tampones. Se puede asegurar la prevención de la acción de
microorganismos mediante diferentes agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido
sórbico y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes
isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y similares. La
absorción prolongada de la forma farmacéuticamente inyectable se
puede conseguir por la utilización de agentes que retrasan la
absorción, por ejemplo, monoesteorato de aluminio y gelatina. No
obstante, de acuerdo con la presente invención, cualquier vehículo,
diluyente, o aditivo utilizado tendría que ser compatible con los
compuestos.
Se pueden preparar soluciones inyectables
estériles por incorporación de los compuestos utilizados en la
práctica de la presente invención, en la cantidad requerida del
disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes, según
deseo.
Una formulación farmacológica de los derivados
IMP protegidos se puede administrar al paciente en una formulación
inyectable que contiene cualquier portador compatible, tal como
diferentes vehículos, coadyuvantes, aditivos, y diluyentes; o bien
los compuestos utilizados en la presente invención pueden ser
administrados parenteralmente al paciente en forma de implantes
subcutáneos de liberación lenta o sistemas de suministro
direccionado tales como matrices de polímeros, liposomas y
microesferas. Un implante adecuado para su utilización en la
presente invención puede adoptar la forma de un gránulo o pastilla
que se disuelve lentamente después de haber sido implantado, o un
módulo de suministro biocompatible bien conocido por los técnicos en
la materia. Estas formas y módulos de dosificación bien conocidos
son diseñados de manera tal que los ingredientes activos son
liberados lentamente a lo largo de un período de varios días,
llegando a varias semanas.
Se incluyen entre los ejemplos de implantes bien
conocidos y módulos útiles en la presente invención: Patente USA nº
4.487.603, que da a conocer una bomba de microinfusión implantable
para la dispensación de agentes medicinales según una tasa
controlada; Patente USA nº 4.486.194, que da a conocer un
dispositivo terapéutico para la administración de agentes médicos a
través de la piel; Patente USA nº 4.447.233, que da a conocer una
bomba de infusión de agentes de medicación para suministrar los
mismos con una tasa de infusión precisa; Patente USA nº 4.447.224,
que da a conocer un aparato de infusión implantable de caudal
variable para suministro continuado de medicamentos; Patente USA nº
4.439.196, que da a conocer un sistema osmótico de suministro de
medicamentos que tiene compartimientos de cámaras múltiples; y la
Patente USA nº 4.475.196, que da a conocer un sistema osmótico de
suministro de medicamentos. Muchos otros implantes, sistemas de
suministro, y módulos son bien conocidos por los técnicos en la
materia.
Una formulación farmacológica de los derivados de
IMP protegidos, utilizados en la presente invención, se puede
administrar oralmente al paciente. Se pueden utilizar métodos
convencionales, tales como administración de los compuestos en
tabletas, suspensiones, soluciones, emulsiones, cápsulas, material
en polvo, jarabes y similares.
Son preferibles las técnicas conocidas que
suministran el IMP protegido y sus derivados oralmente, por vía
intravenosa o nasal, y conservan la actividad biológica.
En una realización, el IMP protegido puede ser
administrado inicialmente por inyección intravenosa para llevar los
niveles de sangre del IMP protegido a un nivel adecuado. Los niveles
de los pacientes se mantienen entonces por una forma de
dosificación oral, si bien se pueden utilizar otras formas de
administración, incluyendo la nasal, dependiendo del estado del
paciente y lo que se ha indicado anteriormente. La cantidad de IMP
protegido y sus derivados a administrar variará para cada paciente
objeto de tratamiento, y variará aproximadamente desde 10 \mug/kg
de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal por día y,
preferentemente, de 1 a 10 mg/kg por día.
Se puede utilizar una vacuna aprobada por la FDA,
disponible comercialmente, para preparar la combinación de
vacuna-coadyuvante. De manera alternativa, se puede
preparar una vacuna, tal como es conocido en el campo de
preparación de vacunas. Como ejemplo, se utiliza una vacuna de la
hepatitis. Por ejemplo, se puede utilizar una vacuna de la
hepatitis disponible comercialmente o bien se puede preparar una
vacuna con la dosificación de antígeno de superficie de hepatitis,
igual que en las directrices de la FDA. El coadyuvante será
utilizado a una concentración que proporcione una cantidad efectiva
y, en general, estar comprendida entre 0,01 y 100 mg/kg de peso
corporal. En una realización preferente, el coadyuvante se utilizará
con una concentración que proporcione de 0,01 a 10 mg/kg de peso
corporal (Sosa y otros, 1992).
De manera alternativa, un preparado de vacuna
será administrado y, al mismo tiempo, se coadministrará una dosis
de derivados de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa tal como Mp-IMP.
En otra alternativa adicional, después de la
administración inicial de la propia vacuna, la coadministración de
la vacuna y el coadyuvante o la combinación
coadyuvante-vacuna, se puede facilitar una
administración posterior del coadyuvante. El coadyuvante será
utilizado a una cantidad efectiva y, en general, se encontrará en
una concentración que proporcione de 0,01 a 100 mg/kg de peso
corporal. En una realización preferente, el coadyuvante se
utilizará a una concentración que proporcione 0,01 a 10 mg/kg de
peso corporal (Sosa y otros, 1992). El coadyuvante será
administrado dentro de los siete días de la administración inicial,
de forma diaria o las veces que se determine, de acuerdo con una
buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del
paciente individual, el lugar y método de la administración,
programación de la administración y otros factores conocidos por
los médicos que llevan a cabo el tratamiento.
La "cantidad efectiva" para los objetivos de
la invención queda, por lo tanto, determinada por las
consideraciones conocidas en el sector de la vacunación, en la que
debe ser eficaz para proporcionar una titulación
anti-vírica, medible en personas a las que se
suministra el coadyuvante y la vacuna, y, en una realización
preferente, personas que no reaccionan a una vacuna estándar.
El coadyuvante y la vacuna pueden ser formulados
conjuntamente en forma inyectable con una unidad de dosificación, o
solos, utilizando portadores conocidos en el sector de la vacunación
para inyección subcutánea o parenteral, incluyendo la vía
intramuscular e intraperitoneal, así como oral o nasal. Las
formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen
soluciones o dispersiones acuosas estériles, así como materiales en
polvo estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones
inyectable estériles. Se pueden utilizar métodos convencionales,
tales como administración de la combinación
coadyuvante-vacuna en forma de tabletas,
suspensiones, soluciones, emulsiones, cápsulas, material en polvo,
jarabes y similares. Son preferentes las técnicas conocidas que
suministran la invención por vía oral, nasal, o por inyección, en
las que la actividad biológica se conserva.
Para determinar si una persona que no reaccionaba
a vacunas de la técnica anteriormente conocida y que han sido
inmunizadas con la presente invención, se encuentran en este momento
inmunizadas satisfactoriamente, se pueden determinar titulaciones,
así como ensayos proliferactivos, como respuesta al antígeno vírico
que se pueden realizar tal como es bien conocido en esta
técnica.
La isoprinosina se ha demostrado que tiene una
fuerte eficacia en el tratamiento de ataques de gripe letales en
ratones; y, cuando se administra con una dosis de subinfección de
virus, previene la mortalidad en ataques sucesivos con virus
(Glasky, 1985). Esta actividad protectora es explicada probablemente
por la actividad coadyuvante de la isoprinosina.
La actividad de los derivados de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa, tal como se ha mostrado en los
ejemplos, que incrementan la supervivencia y el tiempo medio de
supervivencia en ataques de gripe, representa una actividad
superior a la de la isoprinosina. La utilización de un derivado de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa con Squalane para dar una protección
100% en ataques letales de gripe no se ha indicado en la técnica
anterior para ningún inmunoestimulante/inmunopotenciador. Los
efectos de un derivado IMP protegido para incrementar la
supervivencia y tiempo de supervivencia medio después de un ataque
de gripe y salmonela (es decir, eficacia terapéutica) es único para
cualquier IMP protegido contra 5'-nucleotidasa. En
estos ataques infecciosos, la muerte tiene lugar rápidamente y los
mecanismos por los que el derivado de IMP protegido no se han
deducido de su perfil inmunofarmacológico general. La acción de
derivados de inosina-5'-monofosfato
resistente a 5'-nucleotidasa para prolongar la vida
e incrementar la supervivencia en Listeria no ha sido indicada para
ningún otro inmunomodulador de purina.
Una hipótesis para el mecanismo del efecto
inmunoestimulador de los derivados de
inosina-5'-monofosfato resistentes
a 5'-nucleotidasa se puede establecer, pero no se ha
de considerar como limitador de la presente invención, a esta
modalidad de acción. Recientes descubrimientos de los mecanismos
clave involucrados en la supervivencia con ataques infecciosos han
sido realizados mediante estudios con patógenos intracelulares
facultativos, tales como Toxoplasma, Leishmania y Listeria (Mossman
y Coffman, 1989; Scott, 1991; Haak-Frendocho y
otros, 1992; Trinchieri, 1993; Tripp y otros, 1994; Scott, 1994;
Bogdan y otros, 1991; Fiorentino y otros, 1989). En este modelo,
las respuestas celulares Th1 promovidas por IL-12 y
mediadas por IL-2 y \gamma-IFN,
con la oposición de IL-4 y IL-10,
protegen animales con infecciones tales como Listeria. Las
respuestas de Th2 mediadas por IL-4 hasta
IL-10 se asocian con letalidad con infecciones tales
como Listeria. Este modelo se ha demostrado que es aplicable a
infecciones humanas con Mycobacteria leprae (Seiling y otros,
1994). Por lo tanto, se ha hecho la predicción de que los derivados
de inosina-5'-monofosfato
resistentes a 5'-nucleotidasa actúan por promoción
de la respuesta de Th1 sobre Th2. Esta suposición queda soportada,
además, por la acción preferente de los derivados de
inosina-5'-monofosfato resistentes a
5'-nucleotidasa sobre respuestas de
hipersensibilidad de tipo retardado, con respecto a respuestas
mediadas por anticuerpos (Sosa y otros, 1992).
Los solicitantes han demostrado, en el ejemplo de
referencia explicado más adelante, que el MIMP es activo sobre una
amplia gama de concentración, para estimular la respuesta de
linfocitos murinos y humanos a mitógenos de células T, tales como
PHA y, en un grado más variable, mitógenos de células B tales como
LPS y "pokeweed". La acción de MIMP es confirmada además en
respuestas de linfocitos humanos enriquecidos CD4+ y CD8+. Además,
los resultados indican que los efectos supresores de un péptido HIV,
IFN\alpha, y PGE_{2} sobre la respuesta de PHA de linfocitos
normales se pueden invertir si esta supresión es desde suave a
moderada y no es extrema o posiblemente tóxica. Los autores indican
también que los linfocitos de individuos de edad infectados por HIV
pueden responder a la estimulación por IMP protegido en presencia de
PHA, si las respuestas no se han suprimido en exceso. La acción del
Me-IMP, a título de ejemplo, en estos estudios,
parece ser el del IMP, dado que la acción de Me-IMP
y de IMP son paralelas in vitro.
La acción preferente de la
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa sobre los linfocitos T implica una
interacción basada en un receptor. El Me-IMP se ha
demostrado que induce marcadores de diferenciación de protimocitos
(Touraine y otros, 1991) además de los efectos descritos sobre
linfocitos T maduros.
La ruta de conservación de purina tiene
importantes implicaciones para el desarrollo y función de los
linfocitos T. Las deficientes, tanto deaminasa adenosina como
nucleosidefosforilasa, tienen como resultado síndromes de
inmunodeficiencia con falta de linfocitos T funcionales. Se puede
sugerir que algunas moléculas que contienen inosina son algo
esenciales para el desarrollo y función de los linfocitos T. La base
para esta suposición se encuentra en el factor de transferencia
(Wilson y Fudenberg, 1983). Si IMP es parte del fenómeno de factores
de transferencia, entonces el IMP protegido puede imitar aspectos
no específicos de la función del factor de transferencia, quizás a
través de un receptor en linfocitos T. Los solicitantes han
confirmado que un preparado de factores de transferencia induce un
marcador de diferenciación en protimocitos, es decir, imita
Me-IMP (Hadden y otros, 1986).
La implicación de que el IMP protegido es
regulador de la acción de IL-2 tiene importancia en
el papel central jugado por IL-2 en organizar las
respuestas inmunes celulares, mediadas por células helper T tipo
Th1. A este respecto, es notable que el PHA, el mitógeno de
principio utilizado en estudios de los solicitantes con IMP
protegido, elicita preferentemente un modelo de Th1 de citoquinas
IL-1, IL-2,
\gamma-IFN, y IL-12. Los
solicitantes han descubierto que el PHA induce realmente
IL-10, pero no IL-3 o
IL-4. Datos preliminares indican que el
Me-IMP tiene solamente un efecto reducido en el
incremento de IL-2 o \gamma-IFN
inducidos por PHA, pero potencialmente inhibe la producción de
IL-10. Estas observaciones sugieren que el IMP
protegido actúa sobre las respuestas de Th1. Las respuestas de Th1
han sido implicadas como cítricas en la resistencia a HIV, cáncer e
infección patógena, es decir, Toxoplasma, Listeria, y Leishmania
(Clerici y Shearer, 1995; Teppler, 1993; Scott y Trinchieri, 1989).
Por lo tanto, los efectos de IMP protegido favoreciendo estas
respuestas implican utilidad clínica en estas condiciones.
En soporte de este análisis se encuentran los
estudios in vivo con IMP protegido en los que DTH es
estimulado preferentemente sobre respuestas PFC, y en el que la
supervivencia ha sido incrementada en SIDA, tumores y ataques
infecciosos (Listeria y Salmonela). En estos estudios,
Me-IMP se demostró activo por la ruta oral a dosis
de 1 mg/kg o inferiores, y no era tóxico (oral LD_{50} > 5000
mg/kg).
Por lo tanto, las implicaciones clínicas de
compuestos IMP protegidos, tales como Me-IMP, son
relevantes para el inmunorestablecimiento en inmunodeficiencias
secundarias en las que la función de los linfocitos T queda
comprometida, pero el número de linfocitos T queda razonablemente
mantenido. Estas deficiencias han sido descritas en fases
rápidamente adelantadas de infección HIV (ARC) y cáncer.
En una infección temprana por HIV, las respuestas
de los linfocitos T se han considerado esenciales para prevenir el
avance a SIDA. Las respuestas a los linfocitos T se suprimen por
productos de HIV incluyendo gp160, gp41, y TAT (ver Good y otros,
1991 como resumen). Trabajos recientes sugieren que un péptido
retrovírico CKS-17, asociado con
P-15E, puede disparar el desplazamiento de Th1 a Th2
al inhibir la producción de IL-2 y
\gamma-IFN, y promover producción de
IL-10 (Haraguchi y otros, 1995). Los solicitantes
han comprobado el efecto de Me-IMP en la inversión
del efecto inmunosupresor de un péptido de 17 aminoácidos de gp41,
que tiene homología para CKS-17 y han encontrado
inversión si la supresión era de suave a moderada. El
Me-IMP aumentó también las respuestas PHA de
individuos infectados por HIV. Estos resultados indican que el IMP
protegido puede ser utilizado para inhibir el avance de los
pacientes infectados por HIV a SIDA.
La utilización de IMP protegido en otras
infecciones víricas se da a conocer también en la presente
invención, dado que la inmunosupresión se aplica a infecciones
víricas de todos los tipos estudiados (Rouse y Horohov, 1986). La
inmunosupresión es responsable de la elevada mortalidad de la gripe
en personas mayores y la elevada morbilidad debida a infecciones
bacterianas secundarias. La producción de interferón representa un
mecanismo por el cual los virus pueden suprimir la inmunidad. El
efecto de IMP protegido en la inversión de la supresión de
IFN\alpha en la respuesta de PHA recomienda su aplicación en este
respecto.
Es sabido que la inflamación y trauma físico
suprimen las respuestas celulares inmunes mediadas, en parte, por
Prostaglandinas (Davis y Shires, 1986). La capacidad de MIMP de
invertir el efecto supresor de PGE_{2} sobre la respuesta PHA
apoya su utilidad en estas formas de inmunodeficiencias
secundarias.
La explicación anterior proporciona una base
objetiva y teórica para la utilización de derivados de
inosina-5'-monofosfato resistente a
5'-nucleotidasa. Los métodos utilizados en la
presente invención y la utilidad de la misma pueden ser demostrados
por los ejemplos siguientes.
Si no se indica lo contrario, fueron utilizados
los siguientes materiales y procesos.
Metil-5'-inosina-monofosfato
(Metil-IMP o Me-IMP,
metil-5'-inosina-fosfatona
(Mp-IMP),
etil-5'-inosina-monofosfato
(Etil-IMP o E-IMP),
arginina-5'-inosina-monofosfato
(Arginina-IMP o Arg-IMP) y
(Heptamina-1-ol)-5'-inosina-monofosfato
(Ha-IMP) fueron preparados como ejemplos de
preparación 1, 2, 3, 4, y 5, respectivamente. Los preparados de
MIMP a utilizar en cultivos celulares fueron confirmados como libres
de endotoxinas por un ensayo de lisado de limulos (Whittaker
Bioproducts, Walkersville, MD).
Se obtuvieron
inosina-5'-monofosfato (IMP) y
adenosina-5'-monofosfato de la firma
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Los mitógenos de linfocitos fitohemaglutinina
(PHA), concanavalina A (Con A) y mitógeno "pokeweed" (PWM)
fueron obtenidos de Burroughs Wellcome (Research Triangle Park,
NC), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Gibco (Grand Island, NY) y
Murex Diagnostics (Atlanta, GA), tal como se ha indicado.
Se obtuvieron células de glóbulos rojos de ovejas
(SRBC) de la firma Diamedix Corp. (Miami, FL). Se consiguieron
solución salina equilibrada de Hank y complemento de cobaya de la
firma Gibco. La agarosa fue obtenida de la firma Bacto (Detroit,
MI) y DEAE-Dextram de Sigma (St. Louis, MO). Se
obtuvieron placas de cultivo de tejidos (96 pocillos y 6 pocillos)
de la firma Falcon. Se obtuvo FICOLL-HYPAQUE de la
firma Pharmacia, Inc. (Piscataway, NJ) y E. coli
lipopolysaccharido (LPS) se obtuvo de la firma Sigma.
El IL-2 (rIL-2)
recombinante fue un regalo de G. Caspritz de Hoechst Pharmaceuticals
(Frankfurt, FRG).
Se sintetizó una secuencia de 17 aminoácidos a
partir de la parte gp41 del péptido gp160 del virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) y fue amablemente facilitada a los
inventores por M.Strand (Johns Hopkins University, Baltimore, MD)
(Reugg y Strand, 1990).
Se obtuvo Prostaglandina E_{2} de la firma
Sigma Chemicals (St. Louis, MO) e interferón \alpha recombinante
(IFN\alpha, Intron A) se obtuvo de la firma Schering Corp.
(Kenilworth, NJ).
Los donantes humanos comprendían 22 individuos de
control sanos (edades comprendidas de 20 a 50), 24 personas de edad
(edad media 84 años \pm1), 8 pacientes pre-SIDA
infectados por HIV (clase CDC II-contaje 544 CD4
medio), y 8 pacientes de SIDA (contaje 40 CD4 medio).
Se obtuvieron subconjuntos de linfocitos humanos
CD4+ y CD8+ de controles normales utilizando técnicas de lavado con
batea comerciales (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA).
Todas las etapas relativas a cultivo celular
fueron llevadas a cabo en condiciones estériles. Los métodos
generales de inmunología celular no descritos son llevados a cabo
tal como se describe, en modo general, en referencias para técnicas
de inmunología celular, tales como Mishell y Shiigi, Selected
Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman & Co. (New
York, 1981) y en Stites y Terr, Basic and Clinical
Immunology, Séptima edición, Appleton & Lange (Norwalk,
Connecticut, 1991).
In vitro: Se utilizaron linfocitos de
sangre periférica humana (HPBL) y linfocitos de bazo de ratón (MSL).
La proliferación fue ensayada por incorporación de timidina
titulada, tal como se describe en Hadden y otros (1975), y Hadden y
otros (1986). Para la transformación HPBL, se utilizaron PHA y PWM
con una concentración de 0,5 \mug/ml. Para la transformación
MSL, se utilizó Con A a 0,5 \mug/ml, fitohemaglutinina (PHA, Murex
Diagnostics, Atlanta, GA) a 0,5 \mug/ml y endoxotina
lipopolisacárido (LPS, Sigma, St. Louis, MO) a 10 \mug/ml. Cuando
se añadieron derivados IMP protegidos, fueron añadidos al inicio del
cultivo, con concentraciones variables comprendidas entre 0,1
\mug/ml y 100 \mug/ml.
Los esplenocitos murinos fueron obtenidos a
partir de ratones BALB/c, con edades de 4-12 meses,
por procesos estándar (Hadden y otros, 1975). Fueron cultivados en
placas de micropozos con una concentración de 1,5x10^{6}
células/ml de medio esencial mínimo (MEM, Gibco Labs, Grand Island,
NY) con 5% de suero fetal de vaca (FCS, Hycolne Labs, Logan, UT) y
se comprobaron en cuanto a su respuesta poliferativa con respecto a
mitógenos, medido con incorporación de timidina titulada (^{3}H)
(New England Nuclear, Wilmington DE, 6,7 \muCi/mmol; 2,5
\muCi/ml) durante un impulso terminal seguido de espectrometría
líquida de centelleo. Se sembraron células humanas a 10^{4}/ml y
se cultivaron durante 48 horas con un impulso de 18 horas con
^{3}H-thimidina.
In vivo: Se administraron los compuestos
oralmente, por gavage o intraperitonealmente. Al final se obtuvieron
los bazos, tal como se describe por Florentin y otros (1982), y se
prepararon las células para respuesta de proliferación con Con A =
0,5 \mug/ml, PHA = 0,5 \mug/ml o LPS = 0,5 \mug/ml.
Se ensayaron células de bazo de ratón, formadoras
de anticuerpos (PFC), de acuerdo con la técnica de Jerne y otros
(1963), con ciertas modificaciones. De forma breve, se inmunizó un
grupo de ratones con SRBC, intraperitonealmente, y se administraron
los compuestos de interés por vía oral o intraperitoneal, tal como
se indica en los resultados. Cinco días más tarde, se prepararon
suspensiones de células de bazo y su viabilidad fue determinada por
prueba de exclusión de azul tripán. Las células fueron suspendidas a
3x10^{6}/ml. Se mezclaron 0,2 ml de suspensión de células de bazo
con 0,8 ml de agarosa al 0,7% y 0,2 ml de SRBC recién lavado (a
6x10^{5}/ml). La mezcla fue vertida inmediatamente en la placa y
se dejó solidificar. Después de 60 minutos de incubación a 37ºC en
una atmósfera húmeda a 5% de CO_{2} en el aire, la placa fue
inundada con 1 ml de complemento de cobaya, diluido 1:5 con
solución salina equilibrada de Hank. Se contaron placas hemolíticas
con un contador invertido, utilizando 4x aumentos.
Cada uno de los experimentos se llevan a cabo de
2 a 10 veces tal como se ha indicado. Se utilizaron muestras
cuadruplicadas de cada donante en cada valor de concentración. Los
datos se han explicado como medias \pm error estándar de la media
(SEM) para experimentos representativos individuales o como
proporción al control \pm SEM para datos reunidos. Los datos
fueron analizados en cuanto a significación estadística utilizando
la prueba t de Student´s si no se indica lo contrario.
En general, se llevaron a cabo inmunoensayos EIAs
o RIAs con juego disponibles comercialmente, tal como se ha
indicado. De manera alternativa se puede desarrollar un EIA tal como
es conocido por los técnicos en la materia. Se pueden preparar y
utilizar en los ensayos anticuerpos tanto policlonales como
monoclonales. La tecnología estándar de producción de anticuerpos
es bien conocida por los técnicos en la materia que describen de
manera general en la publicación Harlow y Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, 1988. En caso apropiado se pueden utilizar otros
inmunoensayos, tales como radioinmunoensayos (RIA), dado que éstos
son conocidos por los técnicos en la materia. Los inmunoensayos
disponibles se describen de manera extensa en la literatura
científica y de patentes. Ver, por ejemplo, las patentes U.S.A
3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517;
3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074;
4.098.876, 4.879.219 y 5.011.771; así como la publicación del
Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Springs Harbor, Nueva York, 1989.
Dependiendo de los patógenos sometidos a prueba,
se utilizaron diferentes cepas de ratones. Para probar Salmonella y
Listeria se utilizaron ratones BALB/c con pesos de
14-16 g. Para respuestas al virus de la gripe se
utilizaron cepas de ratones NMRI. Los ratones fueron obtenidos del
Animal Laboratory, Academy of Medical Science, Rusia, y fueron
utilizados en los ejemplos 11-13 que se indican a
continuación.
Diferentes cepas de ratones codificados por HBV
de gen-S zona Pre-S2 en cuanto a sus
respuestas inmunes para proteínas fueron colocados en el siguiente
orden de haplotipo (Benaceraf y McDevitt, 1972):
H-2^{b}>H-2^{d}>H-2^{s}>H-2^{k}>H-2^{f}.
Los ratones de DBA/2 no produjeron anticuerpos frente a HBsAg a
nivel elevado cuando fueron tratados con antígeno solo (Walker y
otros, 1981). Por lo tanto, se obtuvieron ratones macho DBA/2 con
pesos de 16-18 gramos a partir de Animal Laboratory,
Academy of Medical Science, Rusia, y fueron utilizados en los
ejemplos indicados anteriormente. Esta línea de ratones fue escogida
puesto que tienen respuestas poco satisfactorias a la vacuna de
hepatitis B.
Los ratones experimentales fueron irradiados con
una proporción de dosis de 25 rad/min (1 rad = 0,01 Gy) utilizando
una fuente de haz ^{60}Co\gamma durante 4 minutos. Los datos
representan el promedio de diez animales en cada grupo.
Se comprobaron muestras de suero de ratones
inmunizados en cuanto a la presencia de anti-HBs en
un inmunoensayo de enzimas (EIA) utilizando los equipos de
diagnóstico de Roche Diagnostica según las instrucciones del
fabricante. El equipo EIA anti-HBs (Roche) tiene
una sensibilidad de <10 IU/1.
La concentración de anticuerpos fue determinada
con ayuda de curvas de calibración diseñadas en base a los
resultados de detección anti-HBs en un panel de
suero estándar (Roche Diagnostica) con las concentraciones
siguientes: 10 IU/1; 50 IU/1; 100 IU/1 y 150 IU/1. Los resultados de
los dos experimentos fueron utilizados para el cálculo de valores
medios.
Se administró HBsAg a una dosis de 16 mg/ratón en
0,2 ml PBS (pH 7,4) dos veces con un intervalo de dos semanas entre
inyecciones.
Un IMP protegido, MIMP, fue introducido tanto por
vía oral como intraperitoneal con una dosis de 50 mg/kg.
Se utilizaron tres esquemas de administración
MIMP:
Esquema 1: Se suministró MIMP oralmente por
cebadura 30 minutos antes de la introducción de HBsAG.
Esquema 2: Se administraron HBsAg y MIMP
intraperitonealmente.
Esquema 3: Se administraron HBsAg y MIMP una vez
interperitonealmente seguido de administración oral de MIMP durante
4 días.
Ejemplo de preparación 1
(Referencia)
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
metil-5'-inosina-monofosfato
por la reacción de
inosina-5'-monofosfato con metanol
utilizando diciclohexilcarbodiimida como agente de condensación.
A una solución de
inosina-5'-monofosfato (2,2 g, 6
mmoles) en metanol (300 ml), se añadieron tributilamina (1,4 ml, 12
mmoles) y diciclohexilcarbodiimida (6,56g, 30 mmoles). La solución
se mantuvo cuatro días a 25ºC y se evaporó hasta estado seco a
presión reducida. Se añadió al residuo una solución de 2,3% NaOH (20
ml, 11,4 mmoles) y la suspensión resultante fue filtrada. El
precipitado fue lavado con agua (20 ml)y se descartó. El
filtrado fue extraído tres veces con éter, se colocó en una columna
conteniendo 50 g de Amberlite IR/20 PLUS (Forma NH_{4}^{+}) y
se eluyó con agua. Las fracciones que absorben UV fueron evaporadas
a presión reducida y el jarabe resultante fue disuelto en metanol
(20 ml). Esta solución fue vertida en acetona (300 ml) y la
suspensión resultante fue lavada con acetona y éter, secada en vacío
sobre P_{2}O_{5} dando lugar a 1,4 g (68%) de un producto en
polvo, p.f. 145ºC, UV \lambda max 249 nm (pH 5,5H_{2}O) y 253 nm
(pH 10).
Anal. \hskip0.3cm Resultado calculado
para C_{11}H_{20}N_{5}O_{9}P (M.W. 397,24): C, 33,25; H,
5,07; N, 17,63.
| Hallado: | C, 33,31; | H, 5,13; | N, 17,34. |
| C, 33,36; | H, 5,13; | N, 17,34. |
Datos NMR DMSO-d_{6}: 3,50 (s,
3H, CH_{3}OP), 3,20-4,70 (m, 7H, ribosa), 5,94 (d,
1H, anómero J-6Hz), 8,12 (s, 1H,
C-2), 8,40 (s, 1H, C-8), 8,20 (br s
5H, NH (CO) y NH_{4}).
Ejemplo de preparación
2
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
metil-5'-inosina monofosfonato por
la reacción de 2', 3'-isopropilideninosina con
dicloruro metilfosfónico seguido de desbloqueo del nucleótido.
A una mezcla en frío de 2',
3'-isopropilideninosina (2 g, 6,49 mmmoles) en 50 ml
de piridina seca a 10ºC se añadió dicloruro metilfosfónico (0,86 g,
6,49 mmoles) gota a gota. Después de que la mezcla fue agitada
durante 18 horas se añadieron hielo y agua para proporcionar el
nucleótido protegido. La hidrólisis del nucleótido bloqueado fue
llevada a cabo con ácido fórmico. Se llevó a cabo HPLC con
H_{2}O/metanol. Las fracciones apropiadas fueron evaporadas a
presión reducida para conseguir
metil-5'-inosina monofosfonato.
Ejemplo de preparación
3
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
etil-5'-inosina-monofosfato
de modo similar al ejemplo de preparación 1 excepto que se hizo
reaccionar inosina-5'-monofosfato
con etanol utilizando diciclohexilcarbodiimida como agente de
condensación.
Ejemplo de preparación
4
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó
arginina-5'-inosinamonofosfato por
la reacción de
inosina-5'-monofosfato con arginina
utilizando diciclohexilcarbodiimida como agente de
condensación.
A una solución de
inosina-5'-monofosfato (0,55 g, 0,15
mmoles) en formamida (3 ml), se añadió L-arginina
base (1,04 g, 6 mmoles). Se añadió diciclohexilcarbodiimida (1,6 g,
7,5 mmoles) en alcohol t-butílico (10 ml) a la
mezcla y la suspensión resultante fue calentada a 80ºC durante 8
horas.
El precipitado formado fue filtrado, lavado tres
veces con agua y el filtrado combinado fue evaporado para eliminar
el alcohol t-butílico. La solución fue extraída tres
veces con iguales volúmenes de éter y evaporada hasta conseguir un
jarabe en vacío. Después de la adición de etanol (30ml), el
precipitado resultante fue filtrado dando lugar a un material
gomoso muy higroscópico. Después de permanecer 10 días, el material
gomoso se hizo sólido, pf 130ºC. UV \lambda max 249 nm
(H_{2}O).
\newpage
Ejemplo de preparación
5
Se preparó por la reacción de
(Heptamina-1-ol)-5'-inosina-monofosfato
por la reacción de
inosina-5'-monofosfato con
6-amino-2-metil-2-heptanol
utilizando diciclohexilcarbodiimida como agente condensante.
A una solución de
inosina-5'-monofosfato monohidrato
(1,045 g, 3 mmoles) en formamida (5 ml), se añadió clorhidrato de
6-amino-2-
metil-2-heptanol. Una solución de
diciclohexilcarbodiimida (6,22 g, 30 mmoles) en alcohol butílico
(25 ml) fue añadida a la mezcla. La mezcla de reacción resultante
fue calentada con agitación a 80-90ºC durante 8
horas. El precipitado resultante fue filtrado y lavado tres veces
con 5 ml de agua. El precipitado de diciclohexilurea fue eliminado
y el filtrado combinado fue evaporado para eliminar el alcohol
butílico. La solución fue extraída tres veces con éter y evaporada
hasta estado seco en vacío. El residuo aceitoso fue suspendido en
acetona para dar lugar a un material higroscópico de color blanco.
Fue purificado por disolución en agua y tratamiento con carbón
activado y a continuación fue precipitado en acetona para dar lugar
a un material higroscópico de color blanco. UV \lambda max 249 nm
(H_{2}O).
Rendimiento de material purificado 0,7 g (53,4%),
pf 95ºC, con la fórmula empírica
C_{18}H_{28}N_{5}O_{8}P:
%P \hskip1cm Calculado 7,03 \hskip1cm Hallado
5,81
Ejemplo de preparación
6
Se purificó de plasma sanguíneo de portadores de
antígeno, antígenos de superficie de hepatitis B (HBsAG; subtipos
ad y ay) según el esquema siguiente:
(1) Plasma sanguíneo conteniendo HBsAg diluido
inicialmente con dos volúmenes de solución salina fisiológica fue
calentado en un baño de agua durante 60 minutos a 80ºC. La
coagulación que se formó fue eliminada y tratada mecánicamente y
las proteínas desnaturalizadas fueron retiradas por
centrifugación.
(2) El HBsAg fue precipitado a continuación con
polietilenglicol M 6000 a una concentración final de 15%
(peso/volumen). El precipitado conteniendo HBsAg fue dializado
contra 0,9 M NaCl y tratado con pepsina (100 mg/ml) y
Tween-80 (concentración final -2%).
(3) La solución resultante de HBsAg fue
ultracentrifugada dos veces en un gradiente lineal de sacarosa. El
preparado purificado de HBsAg fue dializado contra 0,9 M NaCl,
alicuotado en volúmenes de 1 ml y congelado a -60ºC.
(4) Después de una concentración de
50-100 veces, el preparado resultante tenía las
siguientes características: consistía solamente en partículas
esféricas de 18-25 nm de diámetro y carecía de
partículas DANE o partículas filamentosas de HBsAg. Se obtuvieron
resultados negativos en pruebas para HBsAg (equipo EIA de Abbott
Laboratories); DNA-polimerasa;
HBV-DNA por el método de amplificación dirigida; y
presencia de característica de proteínas de suero sanguíneo humano
normal.
El preparado obtenido sirvió como base para la
elaboración de lotes experimentales de vacuna de hepatitis B (Alper
y otros, 1989).
Alternativamente la vacuna de la hepatitis B se
puede conseguir de Smithkline Beecham Biologicals y el HBsAg puede
ser adquirido de Sigma.
La capacidad de 5'-nucleotidasa
(de veneno de Crotalus atrox, Sigma Chemical Co. St. Louis,
MO) en hidrolizar IMP y otros compuestos fue comprobada midiendo la
liberación de fosfato inorgánico de acuerdo con el método de Ames y
otros, (1960). Se incubaron muestras de nucleotidos
(40-60 nmoles) a 37ºC durante 10 minutos con 0,02
unidades de 5'-nucleotidasa en un volumen total de
100 \mul conteniendo 50 mmoles de HEPES, pH 7,3 y 5 mmoles de
MgCl_{2}. Se terminaron las reacciones por añadidura de 800 \mul
de molibdato sódico al 0,42% en H_{2}SO_{4} 1N:ácido ascóbico
al 10% (6:1 v/v), seguido por 0,3 ml H_{2}O.KH_{2}PO_{4}; se
trataron estándares (2-80 nmoles) de manera
similar; y se incubaron las muestras y los estándares a 45ºC durante
20 minutos. Se determinó el fosfato por la absorbencia de 820 nm.
Se comprobaron muestras en bruto que consistían en nucleótido, pero
sin enzima, en paralelo para corregir la hidrólisis no enzimática.
Se calculó el % hidrolizado a partir del número exacto de sustrato
de nucleótido, determinado por absorbencia de ultravioleta
utilizando el coeficiente de extinción e=12,2 a 249 nm. Los
resultados de cuatro experimentos se resumen en la tabla 1A.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Compuesto \+ \hskip4cm \+ Hidrólisis \cr IMP \+ \+
88,0\cr Me-IMP \+ \+ 2,1\cr Mp-IMP
\+ \+ < 1,0\cr E-IMP \+ \+ 2,9\cr
Ha-IMP \+ \+ 76,0\cr Arg-IMP \+ \+
12,0\cr Adenosina MP \+ \+
86,0\cr}
Se observó que los materiales comprobados tenían
una resistencia variable al fraccionamiento por
5'-nucleotidasa. El Ha-IMP y
Arg-IMP mostraron resistencia suave y moderada a la
hidrólisis, respectivamente, mientras que ambos
Me-IMP y Mp-IMP fueron
extremadamente resistentes a la hidrólisis, tal como
E-IMP. Ninguno de los derivados
5'-IMP se observó que inhibiera la hidrólisis de
IMP, indicando que los compuestos no son inhibidores de la
5'-nucleotidasa por si mismos.
Otro conjunto de experimentos fue llevado a cabo,
en los que se comprobaron IMP, MIMP y
Adenosina-5'-monofosfato (AMP) en
cuanto a susceptibilidad a fraccionamiento por
5'-nucleotidasa. El protocolo era el mismo que
anteriormente excepto que la primera incubación tuvo lugar durante
20 minutos en un volumen total de 200 \mul, 0,1 mM HEPES y 10 mM
MgCl_{2}. El porcentaje de hidrólisis de nucleótidos se llevó a
cabo en duplicado para cada ensayo. Los resultados se presentan en
la tabla 1B.
| Compuesto | Ensayo 1 | Ensayo 2 | Ensayo 3 |
| Me-IMP | 1,5 | 2,2 | 2,6 |
| IMP | 72,0 | 97,0 | 95,2 |
| AMP | 100,0 | 95,1 | 63,7 |
Estos datos indican que el efecto
inmunoestimulatorio de derivados de 5'-IMP es una
función de la resistencia del 5'-IMP sustituido a
la hidrólisis en vez de la naturaleza de la sustitución
específica.
Se estimularon linfocitos de sangre periférica
humana normal (HPBL) con los agentes mitogénicos PHA o PWM. En una
serie de experimentos se analizaron Ha-IMP,
Arg-IMP, E-IMP,
Me-IMP, Mp-IMP e
inosina-5'-monofosfato (IMP), en
una gama de concentraciones de 0,1, 1, 10, y 100 \mug/ml, en
cuanto a su efecto en estimular estas respuestas. Si bien los
donantes de sangre individuales variaron en su respuesta a estos
mitógenos y a los compuestos de interés, los cinco derivados de IMP
estimularon de manera continuada las respuestas de HPBL a PHA, tal
como se ha mostrado en la figura 1. El IMP en sí mismo mostró una
actividad comparable a Me-IMP. El
Ha-IMP era bajo, mientras que
Arg-IMP, Me-IMP y
E-IMP eran más activos, y el Mp-IMP
era el compuesto más activo. Los compuestos objeto de prueba
mostraron poco o ningún efecto en la respuesta PWM. Ninguno de los
compuestos estimuló HPBL en ausencia de mitógeno. Dado que la
respuesta de PHA refleja la proliferación de linfocitos T y la
respuesta de PWM refleja la proliferación de linfocitos B, los
resultados indican que los derivados de IMP
5'-sustituidos potencian preferentemente las
respuestas de linfocitos T. Como ejemplo, se utilizó
Me-IMP (MIMP) en los siguientes experimen-
tos.
tos.
En la figura 2, se han presentado los resultados
de las respuestas HPBL a PHA in vitro de dos donantes en
presencia de IMP y MIMP. Las respuestas de los linfocitos de control
para tres donantes normales a la estimulación con PWM no fueron
afectados tampoco en este caso por MIMP con respecto a una serie de
concentraciones.
Los linfocitos de sangre periférica humana están
compuestos como promedio aproximadamente de 80% de linfocitos T y
20% de linfocitos B y de los linfocitos T dos tercios son el
fenotipo CD4+ helper/inductor y 1/3 son del fenotipo CD8+
supresor/citotóxico. El enriquecimiento de las células CD4+ T o CD8+
T puede ser conseguido por reducción del otro fenotipo (>98%)
utilizando la adherencia a frascos con recubrimiento de anticuerpo
monoclonal ("panning"). Este enriquecimiento fue utilizado con
tres controles normales (datos reunidos) y la figura 3 muestra el
efecto de MIMP sobre estas dos poblaciones de células. Las
respuestas PHA de los linfocitos CD4+ y CD8+ aumentaron
significativamente por MIMP (p <0,01 para la respuesta de cada
uno de los tres individuos).
Un péptido de 17 aminoácidos sintético
representando el lugar inmunosupresor de la parte intramembranosa
gp41 del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) fue comprobado
sobre linfocitos de controles. Un experimento representativo de
cinco es el que se muestra en la figura 4, en el que este péptido
indujo inhibición progresiva de proliferación de linfocitos
inducida por PHA con una dosis supresora máxima de 100 mM. El efecto
de MIMP de 0,1-100 \mug/ml fue examinado en
combinación con varios grados de inhibición por el péptido. El MIMP
restableció la respuesta proliferativa a gamas casi normales cuando
la supresión inducida por el péptido fue menor de 50%; no obstante,
cuando la inhibición fue más importante (>50%), el efecto de los
MIMP no fue significativo. Estos datos indican que el MIMP es capaz
de invertir el efecto inmunosupresor de un péptido asociado a HIV
cuando el efecto es suave hasta moderado, pero no cuando es
fuerte.
Las infecciones de virus están asociadas con
respuestas linfoproliferativas reducidas. La figura 5 muestra el
efecto de un mediador inducido por virus,
rIFN-\alpha en inhibir la respuesta in
vitro de PHA de linfocitos de controles y el efecto de MIMP a
1,10, 100 \mug/ml en invertir la inhibición cuando es moderado,
es decir, a la concentración de 10 y 100 unidades/ml IFN
\alpha.
La inflamación, tal como se aprecia en artritis
reumatoide, es asociada con respuestas linfo proliferativas
rebajadas. La figura 6 muestra el efecto de un mediador
inflamatorio, PGE_{2} (a 10^{-5} M), para inhibir la respuesta
PHA de linfocitos normales y el efecto de MIMP
(1-100 \mug/ml) en invertir la inhibición.
La figura 7 muestra las respuestas PHA de estas
personas de edad y de los individuos infectados por HIV y el efecto
de estimulación con 100 \mug/ml de MIMP en comparación con
controles normales (C). Los pacientes de control (22) tenían
respuestas normales PHA y MIMP. Quince personas de edad (Ag+) tenían
respuestas PHA normales y respuestas a MIMP. Nueve pacientes de
edad (Ag-) tenían respuestas fuertemente reducidas a PHA y también
a MIMP. De los nueve pacientes de edad aparentemente sanos que
mostraron poca respuesta a PHA, cinco fueron comprobados en
contajes de linfocitos y eran normales en promedio.
Ocho individuos infectados por HIV (ARC) dieron
un promedio de 50% en las respuestas PHA normales medias y
mostraron una respuesta significativa a MIMP. Ocho pacientes de SIDA
no mostraron respuesta. Estos datos sugieren que los sujetos
clínicos para tratamiento de MIMP deben ser precomprobados en cuanto
a sensibilidad al medicamento in vitro antes del
tratamiento.
El protocolo experimental anterior fue repetido
con Mp-IMP a 10 y 100 \mug/ml con los mismos
resultados que se aprecian con 100 \mug/ml MIMP.
Se estimularon MSL con los agentes mitogénicos
Con A y LPS. Se analizaron en una serie de experimentos
Ha-IMP, Arg-IMP,
E-IMP, Me-IMP,
Mp-IMP y IMP en una gama de concentraciones de 0,1,
1, 10 y 100 \mug/ml en cuanto a sus efectos en la estimulación de
estas respuestas. Ha-IMP, Arg-IMP,
E-IMP, Me-IMP,
Mp-IMP y IMP estimularon las respuestas
proliferativas de MSL a Con A, tal como se muestra en la figura
8.
Comparando los datos de linfocitos de ratón
(Figura 8) y humanos (Figura 1), los linfocitos humanos son más
sensibles a estos compuestos que los linfocitos de ratón.
En otro experimento adicional se incubaron
esplenocitos murinos con PHA o LPS y MIMP (1-100
\mug/ml). El MIMP no afectó la respuesta de los esplenocitos en
ausencia de mitógenos. En presencia de mitógenos el MIMP aumentó de
manera progresiva y significativa las respuestas proliferativas de
los linfocitos medidas por la incorporación de timidina titulada,
tal como se muestra a continuación. Las respuestas de los
esplenocitos a PHA reflejan preferentemente las respuestas de los
linfocitos T, confirmando las respuestas apreciadas con ConA. Las
respuestas LPS son también similares al experimento anterior.
| MIMP | PHA 0,5 \mug/ml | LPS 10 \mug/ml | |
| \mug/ml | |||
| 0 | 100933 \pm 4202 | 44864 \pm 2350 | |
| 1 | 106647 \pm 4917 | 47261 \pm 997 | |
| 10 | 117247 \pm 6500* | 57481 \pm 2343* | |
| 100 | 124801 \pm 6630** | 55153 \pm 6176* |
Los datos fueron obtenidos de cuatro animales
distintos y representan muestras cuadriplicadas para cada
concentración. Se expresan como medias CPM \pm SEM, con *
mostrando una significancia de p<0,05 y ** mostrando
p<0,01.
Para determinar si los compuestos estimulan los
linfocitos, in vivo, se inmunizaron ratones con eritrocitos
de oveja (SRBC), se midieron cinco días más tarde, 1x10^{8}
células, y 50 mg/kg de peso corporal de Ha-IMP,
Arg-IMP, Me-IMP o IMP, ip, y células
formadoras de anticuerpo de placas de bazo (PFC). Los
Ha-IMP, Arg-IMP y
Me-IMP estimularon significativamente la respuesta
de PFC (tal como se ha mostrado en la figura 9). El IMP fue
comparado al control en tres experimentos a 50 mg/kg de peso
corporal y no tuvo efecto significativo (IMP: 12 muestras con PFC
medio 197 \pm 21; control: 15 muestras con PFC medio 210 \pm
17). Esto muestra que el IMP tiene solamente actividad in
vivo cuando está protegido contra la actividad de
5'-nucleotidasa.
Los datos de la respuesta de dosis para
Ha-IMP, Arg-IMP y
Me-IMP con respecto a la respuesta de PFC se
desarrollaron, tal como se ha mostrado en las figuras 10A, 10B y
10C, respectivamente. Los tres compuestos estimularon de manera
óptima a 50 mg/kg de peso corporal; no obstante, el
Me-IMP tenía actividad a dosis más bajas.
Como contraste, en los datos in vitro con
proliferación de linfocitos de ratón, el Me-IMP
pareció ser el más potente de los compuestos comprobados.
Para determinar si existe actividad en
administración oral, se inmunizaron ratones con eritrocitos de oveja
(SRBC), 1x10^{8} células, por vía intraperitoneal, y oralmente
con Me-IMP. El Me-IMP fue
administrado en el momento de la inmunización con el antígeno de
SRBC y diariamente durante cinco días a continuación. Se midieron
las células formadoras de anticuerpos de placas de bazo (PFC) al
final de los cinco días. La figura 11 muestra los resultados para
diferentes niveles de dosis del Me-IMP.
Múltiples dosis de Me-IMP
administrado oralmente con el antígeno SRBC y diariamente durante
cinco días estimulan la respuesta PFC con un valor máximo de 50
mg/kg de peso corporal.
Ejemplo
5
(Referencia)
Un experimento paralelo al del Ejemplo 4 confirma
que ambas respuestas PHA y Con A de linfocitos de bazo son
estimuladas por administración oral de Me-IMP.
Se obtuvieron linfocitos de bazo a partir de
ratones que habían recibido administración oral de
Me-IMP durante cinco días, con una gama de valores
de 0-100 mg/kg de peso corporal, y a continuación
fueron sacrificados. Los linfocitos de bazo fueron incubados con
PHA (0,5 \mug/ml) o Con A (0,5 \mug/ml) durante 48 horas. Los
cultivos fueron tratados con timidina tritiada durante las últimas
18 horas. La figura 12 muestra los resultados para los diferentes
niveles de dosis oral del Me-IMP.
Estos datos indican que los derivados de
5'-IMP, en contraste con IMP, son potentes
coadyuvantes para respuesta de anticuerpos dependientes de las
células T, y en el caso de Me-IMP, un potente
estimulante de las respuestas proliferativas de linfocitos T.
A las dosis de utilización, el
Me-IMP era activo parenteral y oralmente, y
aparentemente no tóxico. La toxicidad aguda (LD50) de
Me-IMP era superior a 500 mg/kg de peso corporal,
por vía intraperitoneal, y superior a 5000 mg/kg de peso corporal,
por vía oral.
Ejemplo
6
(Referencia)
Se inmunizaron ratones por administración
intraperitoneal de SRBC en dosis graduadas de 10^{6} a 10^{9}
células. Los experimentos preliminares indicaron que una dosis
óptima de inmunización de SRBC para hipersensibilidad de tipo
retardado se encontraba entre 10^{7} y 10^{8} células. Se
escogió una dosis de 10^{7} para inmunizar animales en este
estudio.
Cuatro días después de la inmunización, cada uno
de los ratones fue atacado por inyección subcutánea de la planta de
la pata izquierda posterior con 10^{8} SRBC en 50 \mul de
solución salina con tampón fosfato (PBS). El vehículo (50 \mul
PBS) fue inyectado por vía subcutánea en la planta de la pata
derecha posterior como control. Los compuestos objeto de prueba
fueron inyectados intraperitonealmente en el momento de la
inmunización o en el momento de la elicitación. Después de 24 horas
de ataque, se midió el hinchamiento de la planta de la pata como
incremento del grosor de dicha zona (izquierda menos derecha)
utilizando un pie de rey técnico.
Los resultados se expresan en forma de
incrementos del grosor de la planta del pie en unidades de 0,1 mm.
Las características de hipersensibilidad de tipo retardado medidas
de esta manera han sido descritas anteriormente por MacDonald y
otros (1979). Las figuras 13 y 14 muestran el resultado de estas
pruebas. En particular, la figura 13 muestra un gráfico de
dosis-respuesta para Me-IMP
administrado en el momento de la inmunización. La figura 14 muestra
la respuesta para Me-IMP cuando se administra en el
momento de la inmunización (Inmunización) y cuando se administra en
el tiempo del ataque (Ataque).
Cuando se administró el Me-IMP en
forma de una dosis en el momento de la inmunización, estimuló
significativamente la respuesta de hipersensibilidad de tipo
retardado. Cuando el Me-IMP fue administrado en
forma de una dosis en un momento del ataque, su efecto no fue
significativo. Estos datos indican que el Me-IMP
promueve la inmunidad celular, presumiblemente a través de la
acción en la extremidad aferente de las células helper T de la
respuesta inmune. Esto tiene lugar a dosis más bajas que las que
aumentan la producción de anticuerpos indicando un efecto
preferencial sobre DTH y, por lo tanto, células Th1 que efectúan la
mediación de esta respuesta.
Ejemplo
7
(Referencia)
Para demostrar la utilidad clínica de los
derivados IMP protegidos inmunomoduladores, se infectaron ratones
BALB/c con virus de Leucemia de Friend (FLV). Se trataron ratones de
control con solución salina intraperitonealmente desde el día 3 al
día 13 después de la infección, y los ratones tratados con
Me-IMP fueron tratados con 1 mg/kg/día desde el día
3 al día 13, y se registró el día de su muerte. La figura 15 muestra
que los ratones tratados con Me-IMP tenían un
tiempo de supervivencia medio mayor (MST) que era estadísticamente
significativo (P<0,004) por la prueba de Wilcoxon.
A efectos de comprobar el efecto del
Me-IMP en animales portadores de tumores, se
inocularon grupos de ratones swiss (6) subcutáneamente con tumor
Meth-A, de acuerdo con el método de Carswell y otros
(1975). Después de 8 días, cuando los tumores tenían
aproximadamente 8 mm, los animales fueron tratados por vía
intravenosa con una dosis de cebado de varias cantidades de
Me-IMP o un volumen igual de solución salina. Cinco
horas más tarde, los animales fueron tratados por vía intravenosa
con 10 \mug de endotoxina de lipopolisacárido (LPS). Se
analizaron los niveles de factor de necrosis del tumor (TNF) en el
suero a las 24 horas y la necrosis del tumor (- a +++) fue evaluada
a las 48 horas después de tratamiento. Se evaluó la regresión
completa del tumor en el día 20. Los resultados se muestran en la
tabla 2.
| Tabla de tratamiento | Necrosis del tumor | Regresión del tumor | Vivo en día 20 | |||||
| Primario (\mug) | Elicitación (\mug) | +++ | ++ | + | - | Nº/Total | % | |
| MeIMP (1000) | LPS (10) | 5 | 1 | 0 | 0 | 1/6 | 16,7 | - |
| MeIMP (100) | LPS (10) | 2 | 6 | 1 | 3 | 2/12 | 16,7 | 6/6 |
| MeIMP (10) | LPS (10) | 1 | 3 | 1 | 1 | 1/6 | 16,7 | - |
| MeIMP (100) | solución salina | 0 | 0 | 0 | 6 | 0/6 | 0 | - |
| solución salina | LPS (10) | 0 | 0 | 2 | 4 | 0/6 | 0 | 0/6 |
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 2 muestra que mientras el
Me-IMP (100) solo, o el LPS (10) solo, no tenía
efectos significativos en la necrosis del tumor (todo + o -), la
regresión del tumor (0/12) o tiempo de supervivencia después de los
20 días (0/6), Me-IMP (100) más LPS (10) indujeron
necrosis significativa del tumor (2/3 era ++ o +++), regresión
completa del tumor (2/12) y supervivencia incrementada a los 20 días
(6/6). En estas condiciones, los niveles de TNF eran superiores a
las 24 horas en ratones tratados con Me-IMP más LPS
(4 ratones) que los controles de solución salina más LPS (4
ratones) (4240 vs. <200). Estos datos indican que el
Me-IMP, cuando se utiliza con LPS pero no solo,
tiene una actividad anticáncer significativa, presumiblemente
mediada por la inducción de TNF y linfoquinas relacionadas.
Ejemplo
8
(Referencia)
Infección. Se administró una cepa
bacteriana adaptada a ratón de L.monocytogenes EGD (Gamaleya
Research Institute Academy Medical Science, Russia) a ratones
BALB/c (14-16 gm) con una dosis de 1,7 x 10^{4}
células/ratón intraperitonealmente en 0,5 ml PBS (pH=7,4) en el día
0.
Tratamiento. Se administraron soluciones
con diferentes concentraciones de MIMP
(AGS-36-217) oral o parenteralmente,
tal como se ha mostrado en la tabla 3, empezando 5 días antes de la
infección (día 5).
\vskip1.000000\baselineskip
| Esquema | Dosis MIMP | Ruta | Número de dosis | Días de inicio del tratamiento antes de la | |
| infección (día 0) | |||||
| N1 | 1 | 0,1 | vía bucal | 1 | Día -5 |
| 2 | 1,0 | vía bucal | 1 | Día -5 | |
| 3 | 10,0 | vía bucal | 1 | Día -5 | |
| N2 | 4 | 0,1 | i.p. | 1 | Día -5 |
| 5 | 1,0 | i.p. | 1 | Día -5 | |
| 6 | 10,0 | i.p. | 1 | Día -5 | |
| N3 | 7 | 0,1 | i.p. | 1 | Día -5 |
| vía bucal | 4 | Día de inicio diario-4 | |||
| 8 | 1,0 | i.p. | 1 | Día -5 | |
| vía bucal | 4 | Día de inicio diario-4 | |||
| 9 | 10,0 | i.p. | 1 | Día -5 | |
| vía bucal | 4 | Día de inicio diario-4 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Esquema de tratamiento | Mortalidad: muertos/total | ||||||||
| Días de examen | |||||||||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 10 | 11 | 14 | ||
| N1 | 1 | 9/10 | 1/1 | ||||||
| 2 | 7/10 | 3/3 | |||||||
| 3 | 1/10 | 1/9 | 1/8 | 2/7 | 1/5 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | |
| N2 | 4 | 6/10 | 2/4 | 2/2 | |||||
| 5 | 0/10 | 0/10 | 4/10 | 1/6 | 0/5 | 1/5 | 0/4 | 0/4 | |
| 6 | 0/10 | 6/10 | 3/4 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | |
| N3 | 7 | 3/10 | 1/7 | 3/6 | 1/3 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
| 8 | 5/10 | 3/5 | 1/2 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | |
| 9 | 2/10 | 2/8 | 0/6 | 1/6 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | |
| Control 10 | 7/10 | 3/3 |
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha mostrado en la tabla 4, el MIMP a
10 mg/kg de peso corporal por administración bucal a 1 y 10 mg/kg
por inyección intraperitoneal incrementó el tiempo de supervivencia
medio (MST) y el número absoluto de supervivientes cuando se
administró cinco días antes del ataque. El MIMP a 0,1 a 10 mg/kg
incrementó el MST y los supervivientes cuando se administró con un
tratamiento combinado intraperitoneal y bucal desde los cinco días
antes del ataque.
Ejemplo
9
(Referencia)
Infección. Una cepa 415 de Salm.
Typhimurium adaptada a ratones (Gamaleya Research Institute,
Academy Medical Science, Russia) en una dosis de 5x10^{4} células
en 0,5 ml PBS (pH=7,4) fue inyectada por ratón intraperitonealmente.
Las dosis fueron determinadas a efectos de proporcionar 100% de
mortalidad en el día 6 con el tiempo de supervivencia medio de 2,5
días.
Tratamiento. Se administraron
parenteralmente soluciones con diferentes concentraciones de MIMP
(AGS-36-217), tal como se indica en
la tabla 5, y los resultados de los tratamientos se indican en la
siguiente tabla 6:
\vskip1.000000\baselineskip
| Esquema | Dosis MIMP | Ruta | Secuencia | Tratamiento (horas antes y después | |
| de la inoculación) | |||||
| N1 | 1 | 0,1 | i.p. | 1 | - 24 horas |
| 2 | 1,0 | i.p. | 1 | - 24 horas | |
| 3 | 10,0 | i.p. | 1 | - 24 horas | |
| N2 | 4 | 0,1 | i.p. | 1 | - 4 horas |
| 5 | 1,0 | i.p. | 1 | - 4 horas | |
| 6 | 10,0 | i.p. | 1 | - 4 horas |
| Esquema | Dosis MIMP | Ruta | Secuencia | Tratamiento (horas antes y después | |
| de la inoculación) | |||||
| N3 | 7 | 0,1 | i.p. | 1 | + 4 horas |
| 8 | 1,0 | i.p. | 1 | + 4 horas | |
| 9 | 10,0 | i.p. | 1 | + 4 horas | |
| N4 | 10 | 0,1 | i.p. | 1 | + 24 horas |
| 11 | 1,0 | i.p. | 1 | + 24 horas | |
| 12 | 10,0 | i.p. | 1 | + 24 horas |
\vskip1.000000\baselineskip
| Esquema de tratamiento | Mortalidad: muertos/total | ||||||||
| Días de examen | |||||||||
| 0 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 14 | ||
| N1 | 0,1 | 0/20 | 0/20 | 4/20 | 6/16 | 4/10 | 4/6 | 2/2 | - |
| 1,0 | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 6/20 | 12/14 | 0/2 | 2/2 | - | |
| 10,0 | 0/20 | 2/20 | 4/18 | 6/14 | 2/8 | 2/6 | 2/4 | 0/2 | |
| N2 | 0,1 | 0/20 | 2/20 | 2/18 | 8/18 | 4/10 | 4/6 | 2/2 | - |
| 1,0 | 0/20 | 2/20 | 4/18 | 4/10 | 2/6 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | |
| 10,0 | 0/20 | 0/20 | 4/20 | 14/16 | 0/2 | 2/2 | - | - | |
| N3 | 0,1 | 0/20 | 0/20 | 2/20 | 6/18 | 8/12 | 2/4 | 0/2 | 0/2 |
| 1,0 | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 10/20 | 0/10 | 2/10 | 6/8 | 0/2 | |
| 10,0 | 0/20 | 0/20 | 6/20 | 8/14 | 0/6 | 2/6 | 2/4 | 0/2 | |
| N4 | 0,1 | 0/20 | 4/20 | 2/16 | 2/14 | 12/12 | - | - | - |
| 1,0 | 0/20 | 0/20 | 6/20 | 6/14 | 0/6 | 2/6 | 4/4 | - | |
| 10,0 | 0/20 | 0/20 | 2/20 | 12/18 | 2/6 | 4/4 | - | - | |
| Control | 0/20 | 2/20 | 14/18 | 2/4 | 2/2 | - | - | - |
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se aprecia en la tabla 6, todos los
animales de control murieron a los cinco días con un tiempo de
supervivencia medio aproximado de 2,5 días. Los diferentes
tratamientos de MIMP incrementaron el MST hasta unos cuatro días
(p<0,01) con algunos supervivientes a largo plazo, más visible
con el tratamiento en N3.
Ejemplo
10
(Referencia)
En este modelo, los ratones NMRI fueron atacados
con virus de gripe por el método del aerosol. La dosis del virus de
gripe fue determinada en animales de control, de manera que hubo una
mortalidad de 80-100% con un tiempo de
supervivencia medio de 8 a 11 días. Los tratamientos con el control
(PBS), MIMP (100 ó 200 \mug/ratón) y Squalane (1%) más MIMP (200
\mug/ratón) se iniciaron un día antes de la infección, una hora
antes de la infección y una hora después de la infección.
Los resultados se indican en las tablas 7 y 8 a
continuación. El MIMP incrementó el número de supervivientes y el
tiempo de supervivencia medio (MST) cuando se administró por vía
intranasal a 200 \mug/ratón (5 mg/kg) 24 horas antes (día 1) o
una hora antes o después del ataque (tabla 7). El MIMP incrementó la
supervivencia y el MST cuando se administró a 100 \mug/ratón
solamente facilitado una hora antes de la infección (Figura 16).
En un segundo experimento, el MIMP incrementó los
supervivientes y el MST cuando se administró por vía intranasal con
Squalane (1%) a una dosis de 200 \mug/ratón un día antes de la
infección o una hora después de la infección. Tal como se ha
mostrado en la figura 17, el 100% de los ratones de estos grupos de
tratamiento sobrevivieron. El Squalane solo no tuvo efecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de MIMP en mortalidad
inducida por virus de
gripe
| Tratamiento | Día | Dosis \mug | Ruta | % de mortalidad | MTD\pmSD |
| MIMP | - 1d | 100 | i.n. | 100 | 8,7 \pm 0,48 |
| - 1h | 100 | i.n. | 100 | 7,7 \pm 0,67 | |
| + 1h | 100 | i.n. | 70 | 10,0 \pm 1,15 | |
| - 1d | 200 | i.n. | 60 | 10,7 \pm 0,82 | |
| - 1h | 200 | i.n. | 80 | 10,0 \pm 1,85 | |
| + 1h | 200 | i.n. | 80 | 9,1 \pm 1,25 | |
| PBS control | - 1d | i.n. | 100 | 8,2 \pm 0,63 | |
| MIMP | - 1d | 100 | i.v. | 100 | 10,6 \pm 1,43 |
| - 1d | 200 | i.v. | 90 | 9,8 \pm 1,64 | |
| PBS control | - 1d | i.v. | 100 | 8,2 \pm 1,3 | |
| control sin tratamiento | 100 | 8,5 \pm 0,97 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Tratamiento | Día | Dosis \mug | Ruta | % de mortalidad | MTD\pmSD |
| MIMP | - 1d | 200 | i.v. | 90 | 10,6 \pm 1,13 |
| + 1h | 200 | i.v. | 70 | 9,9 \pm 1,57 | |
| MIMP+ 1% Squalane | - 1d | 200 | i.v. | 70 | 11,0 \pm 1,82 |
| MIMP+ 1% Squalane | + 1h | 200 | i.v. | 80 | 9,8 \pm 1,67 |
| PBS control | - 1d | i.v. | 90 | 9,8 \pm 1,01 | |
| MIMP | - 1d | 200 | i.n. | 50 | 11,2 \pm 1,92 |
| + 1h | 200 | i.n. | 60 | 10,2 \pm 1,94 | |
| MIMP+ 1% Squalane | - 1d | 200 | i.n. | 0 | - |
| MIMP+ 1% Squalane | + 1h | 200 | i.n. | 0 | - |
| PBS control | - 1d | i.n. | 80 | 11,1 \pm 1,89 |
\newpage
Ejemplo
11
(Referencia)
Se utilizaron estudios previos para seleccionar
la cepa murina DBA/2 como respuesta o reacción reducida en la
producción de anticuerpos a HBsAg (Walker y otros, 1981).
Los resultados de la detección
anti-HBs en el grupo de control de ratones tratados
con HBsAg solo y en los grupos tratados con la combinación de HBsAg
y MIMP, preparados en los ejemplos, se presentan en la tabla 9. Los
diferentes programas de vacunación se indican en la lista
siguiente.
| Esquema | Tratamiento |
| 1 | HBsAg solo |
| 2 | HBsAg+MIMP bucal(30 minutos antes de la vacuna) |
| 3 | HBsAg+MIMP i.p. simultáneamente y luego cada 4 días MIMP bucal |
| 4 | HBsAg+MIMP i.p. simultáneamente |
| 5 | Radiación+HBsAg |
| 6 | Radiación+esquema N2 |
| 7 | Radiación+esquema N3 |
| 8 | Control |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Esquema nº | Días después de la inyección | |||
| Día 14 | Día 21 | |||
| HBsAg #1 | <10 IU/l | 260 IU/l | \pm 16,3 | |
| Esquema #2 | <10 IU/l | *370 IU/l | \pm 18,5 | |
| Esquema #3 | **100 IU/l | \pm 12,6 | **610 IU/l | \pm 24,3 |
| Esquema #4 | **100 IU/l | \pm 12,6 | *420 IU/l | \pm 20,6 |
| Control #8 | <10 IU/l | |||
| *0,01<p<0,05 \hskip1cm **p<0,01 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las respuestas de anticuerpos obtenidas con la
administración combinada de HBsAg y MIMP de acuerdo con los
diferentes esquemas, superaron el nivel de anticuerpos del grupo de
animales de control.
En un segundo conjunto de experimentos, se
analizó el efecto de MIMP en la inducción de una respuesta inmune
específica a HBsAg en ratones DBA/2 inmunocomprometidos sometidos a
radiación de ionización, utilizando los mismos esquemas de
vacunación que se han indicado para el grupo de control DBA/2.
Los resultados de detección
anti-HBs en los ratones irradiados del grupo de
control (inyectado solamente con HBsAg) y los tratados con la
combinación (HBsAg y MIMP utilizando los esquemas 2 y 3) se
presentan en la
tabla 10.
tabla 10.
| Esquema No. | Días después de la inyección | ||
| Día 14 | Día 21 | ||
| Esquema #5 | <10 IU/l | <10 IU/l | |
| Esquema #6 | <10 IU/l | **100 IU/l | \pm 10,8 |
| Esquema #7 | <10 IU/l | **100 IU/l | \pm 10,0 |
| Control | <10 IU/l | <10 IU/l | |
| *p < 0,01 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos indican que, en el caso de los esquemas
2 y 3, se incrementaron significativamente los
anti-HBs en el día 21, indicando un efecto de
restablecimiento de MIMP sobre el sistema inmune de estos animales
irradiados.
Los resultados presentados en el ejemplo 11
demuestran que un derivado IMP protegido es capaz de influir en el
desarrollo de respuesta inmune humoral a HBsAg. Se ha demostrado que
el MIMP como administración intraperitioneal única, así como
administración oral única con una dosis de 50 mg/kg, puede inducir
un incremento significativo en el nivel de anticuerpos a HBsAg.
Después de administración intraperitoneal con antígeno, la
administración oral adicional de MIMP no incrementó su
actividad.
Se puede hacer una hipótesis del mecanismo del
efecto coadyuvante de los derivados de
inosina-5'-monofosfato resistentes
a 5'-nucleotidasa pero no se debe considerar como
limitativo de la presente invención a este modo de acción. La falta
de respuesta a la vacuna de la hepatitis B ha sido observada en
pacientes de hemodiálisis (Walz y otros, 1989) y en individuos
inmunocomprometidos (Hess y otros, 1989). En algunos casos, dosis de
vacunas más grandes o un número incrementado de dosis han tenido
como resultado una seroconversión (Walker y otros, 1981). Se han
observado en estos pacientes niveles de
interleuquina-2-receptor soluble y
el empeoramiento resultante de la acción de
interleuquina-2 por unión del IL-2
disponible que puede tener un efecto en la respuesta a la vacuna de
la hepatitis B (Walz y otros, 1989; Meuer y otros, 1989). Meuer y
otros (1989) inyectaron dosis de 40 mg de la vacuna seguido de 1,2
x 10^{5} unidades de interleuquina-2 natural a 10
pacientes de hemodiálisis que eran no reaccionantes
("nonresponders"). Cuatro semanas más tarde, seis de los diez
pacientes mostraron seroconversión, si bien los niveles de
anticuerpos se encontraban todavía debajo de los normales. La falta
de reacción relacionada con MHC a los antígenos de proteínas o
péptidos puede ser también superada por administración de
IL-2. Los resultados de estos ejemplos sugieren que
los derivados IMP protegidos, como coadyuvantes, se pueden
conseguir mediante células T y pueden involucrar
interleuquina-2.
Diferentes publicaciones se han referenciado en
esta solicitud por cita o por número. Las citas completas que no se
han facilitado para las publicaciones de referencia se indican a
continuación.
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Claims (15)
1. Derivado de inosina
5'-monofosfato inmunopotenciador de fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es
C_{1-6} alquilo, C_{2-6} alcoxi
o un grupo amino secundario, en el que el grupo amino secundario
es:
-NHR^{2}, en el que R^{2} es
C_{1-16} alquilo; o
-- NH --
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{R ^{3} }} --
(CH_{2})_{n} --
R^{4}\vskip1.000000\baselineskip
en el
que
R^{3} es hidrógeno, C_{1-9}
alquilo o carboxilo, y
R^{4} es hidróxilo, amino, carbóxilo, alquilo
secundario, hidroximetilo substituido por alquilo,
-NHC(NH)NH_{2},
-CONH_{2},
-CONH_{2},
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y n tiene un valor de 0 a 4;
o
un péptido enlazado a través de su terminal N al
átomo de fósforo, cuyo péptido es seleccionado entre el grupo que
consiste en arg-pro,
arg-pro-lys, y
arg-pro-lys-thr,
para utilización en terapia.
2. Utilización de un derivado de inosina
5'-monofosfato inmunopotenciador según la fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es
C_{1-6} alquilo, C_{2-6} alcoxi
o un grupo amino secundario, en el que el grupo amino secundario
es:
-NHR^{2}, en el que R^{2} es
C_{1-6} alquilo; o
-- NH --
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{R ^{3} }} --
(CH_{2})_{n} --
R^{4}en la
que
R^{3} es hidrógeno, C_{1-9}
alquilo o carbóxilo, y
R^{4} es hidróxilo, amino, carbóxilo, alquilo
secundario, hidroximetilo substituido por alquilo,
-NHC(NH)NH_{2},
-CONH_{2},
-CONH_{2},
siendo n de 0 a 4; o
bien
un péptido enlazado a través de su terminal N al
átomo de fósforo, cuyo péptido es seleccionado entre el grupo que
consiste en arg-pro,
arg-pro-lys, y
arg-pro-lys-thr, en
la fabricación de un medicamento para potenciar la respuesta inmune
de un mamífero.
3. Derivado de inosina
5'-monofosfato, según la reivindicación 1, o la
utilización según la reivindicación 2, en el que dicho alquilo
secundario es de fórmula -CH(R^{5})R^{6}, en la
que R^{5} y R^{6}, que pueden ser iguales o distintos, son
independientemente C_{1-3} alquilo.
4. Derivado de inosina
5'-monofosfato o utilización, según la
reivindicación 3, en el que el grupo alquilo secundario tiene un
total de cuatro átomos de carbono.
5. Derivado de inosina
5'-monofosfato, según la reivindicación 1, o la
utilización según la reivindicación 2, en el que dicho
hidroximetilo substituido por alquilo es de la fórmula
C(R^{7}) (R^{8})OH, en la que R^{7} es
hidrógeno o C_{1-3} alquilo y R^{8} es
C_{1-3} alquilo.
6. Derivado de inosina
5'-monofosfato o utilización, según la
reivindicación 5, en el que R^{7} y R^{8} son ambos metilo.
7. Derivado de inosina
5'-monofosfato, según la reivindicación 1, o
utilización según la reivindicación 2, en el que dicho grupo amino
secundario es arginina.
8. Derivado de inosina
5'-monofosfato, según la reivindicación 1, o la
utilización según la reivindicación 2, en el que dicho derivado de
fórmula (I) es seleccionado entre el grupo que consiste en:
metil-5'-inosina
monofosfonato;
etil-5'-inosina
monofosfato;
arginina-5'-inosina
monofosfato; y
(Heptamin-1-ol)-5'-inosina
monofosfato.
9. Derivado de inosina
5'-monofosfato de fórmula (IB),
en la que R es
C_{2-6} alcoxi o un grupo amino secundario
seleccionado entre el grupo que consiste
en:
-NHR^{2}
donde R^{2} es C_{1-16}
alquilo;
-- NH --
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{R ^{3} }} --
(CH_{2})_{n} --
R_{4}en la
que
R^{3} es hidrógeno, C_{1-9}
alquilo o carbóxilo, y
R^{4} es un alquilo secundario de fórmula
-CH(R^{5})(R^{6}), en la que R^{5} y R^{6}, que
pueden ser iguales o distintos, son independientemente
C_{1-3} alquilo o hidroximetilo substituido por
alquilo de fórmula -C(R^{7})(R^{8})OH, en la que
R^{7} es hidrógeno o C_{1-3} alquilo y R^{8}
es C_{1-3} alquilo;
- arginina; o bien
un péptido enlazado a través de su terminal N al
átomo de fósforo, cuyo péptido es seleccionado entre el grupo que
consiste en arg-pro,
arg-pro-lys, y
arg-pro-lys-thr;
y
n tiene un valor de 0 a 4.
10. Derivado, según la reivindicación 9, en el
que dicho grupo alquilo secundario tiene un total de cuatro átomos
de carbono.
11. Derivado, según la reivindicación 9, en el
que R^{7} y R^{8} son ambos metilo.
12. Derivado, según la reivindicación 9, en el
que dicho grupo amino secundario es arginina.
13. Derivado, según la reivindicación 9, que
consiste en etil-5'-inosina
monofosfato; arginina-5'-inosina
monofosfato; o
(heptamin-1-ol)-5'-inosina
monofosfato.
14. Formulación farmacéutica que comprende un
derivado, definido según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13,
junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente
aceptable.
15. Procedimiento para la preparación del
compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que
comprende:
condensar la inosina
5'-monofosfato con un compuesto R-H,
en el que R es el definido en cualquiera de las reivindicaciones 9 a
13.
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