JP4296312B2 - Novel triterpene compound and anticancer / immunity enhancer comprising the compound as an active ingredient - Google Patents

Description

２．式２の立体構造式で表されるトリテルペン化合物及びその薬学的に許容される誘導体。
【化４】

３．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む抗ガン剤。
４．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む白血病治療剤。
５．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む免疫増強剤。
６．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むサイトカイン産生促進剤。
７．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むガン予防剤。
８．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む健康食品。
９．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む動物用飼料。
１０．アカテツ（Sapotaceae）科ブメリア（Bumelia）属の植物から得られ、式１で表されるトリテルペン化合物または式２で表されるトリテルペン化合物を含む抽出エキス。
１１．ブメリア（Bumelia）属の植物が、ブメリア サルトルム（Bumelia sartorum）である上記１０に記載の抽出エキス。
１２．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む医薬組成物。
１３．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む健康食品。
１４．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む動物用飼料。
【０００７】
本発明における「誘導体」とは、上記式１または２で表される化合物を基本骨格として、その３位、１３位、及び１８位の３つのケトン基のうちの任意の少なくとも１つが、それぞれ独立にヒドロキシル基（−ＯＨ）、オキシム基（＝Ｎ−ＯＨ）、あるいはヒドラゾノ基（＝Ｎ−ＮＨ_２）となっている化合物を意味するものである。
これらの誘導体は、上記式１または２で表される化合物から還元処理やヒドロキシルアミンなどとの反応によって誘導される。
【０００８】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、南米産のアカテツ（Sapotaceae）科植物の一属であるブメリア（Bumelia）属の植物から得られる上記式１または２で表される新規トリテルペン化合物に関する。
本発明は、好ましくはブメリア（Bumelia）属の植物に分類されるブメリア サルトルム（Bumelia sartorum）、特に好ましくはその樹皮、から得られる上記式１または２で表される新規トリテルペン化合物に関する。
【０００９】
アカテツ科の植物は、熱帯に主として広く分布し、約１１６属１１００種のものが知られている（非特許文献１）。
本発明で用いるブメリア属の植物は、熱帯アメリカを中心に分布し、約２５種類が知られており、いずれも木本植物である。
原料として特に好ましい植物であるブメリア サルトルムは多くブラジルの乾燥地帯に自生している。
このブメリア サルトルムに近縁の植物であって、原料として好ましい植物として、ブメリア オブツシフォリア（Bumelia obutusiforia）、ブメリア エクセルサ（Bumelia excelsa）、ブメリア ラムノイデス（Bumelia rhamnoides）があり、これらはブラジル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、アルゼンチンに分布している。
これら近縁の植物は、ブメリア サルトルムを含め、高さ５〜１５ｍの高木であり、枝は有毛で棘がある。現地ではクイシャベイラ（QUIXABEIRA）、コロニーリャ（CORONILHA）などと呼ばれ、その樹皮、花は茶剤、煎剤として用いて収斂、強壮、糖尿病、下痢止めなどに効果があるといわれている。
【００１０】
上記式１または２で表されるトリテルペン化合物の単体は、ブメリア属の植物体、好ましくはそれらの樹皮を原料とし、これらの植物体から適宜の溶剤を用いて粗抽出エキスを得て、これを順相・逆相のカラムクロマトグラフイーで分離精製を複数回実施することにより単離することができる。
ブメリア属植物のなかでも、好ましくはブメリア サルトルム及び上記近縁の植物から、式１または２で表されるトリテルペン化合物を抽出、単離できる。
【００１１】
原料植物体は、抽出処理に先立ち、乾燥、小片化しておくことが好ましい。
抽出溶剤としては、水、メタノールやエタノールなどのアルコール類、エーテル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムなど適宜の溶剤を、単独または混合して用いることができるが、好ましい抽出溶媒はメタノール、エタノールなどのアルコールである。
抽出には、冷浸、温浸、還流冷却下での加熱、超臨界流体抽出など適宜の方法用いることができる。超臨界流体抽出における超臨界流体としては、例えば二酸化炭素、ペンタンを使用できる。抽出は所望により超音波をかけながら行うことができる。抽出は、連続式、バッチ式のいずれでもよく、加圧、常圧または減圧下で実施できる。抽出時間は抽出方法、抽出溶媒の種類などに応じて適宜決定できるが、例えば室温の場合、１時間〜１０日であり、溶媒の沸点付近の温度では１０分〜１０時間である。
抽出後、抽出溶媒を常圧または減圧下で留去して除去するか、凍結乾燥して粗抽出エキスを得る。
【００１２】
粗抽出エキスをさらにカラムクロマトグラフィー手段などにより分離精製処理する場合には、分離精製に用いるカラムクロマトグラフイーとしては、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。
好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分離精製法を採用する。
カラムクロマトグラフィーに用いる溶媒は、ベンゼン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム、n-ヘキサンなど適宜の溶剤を用いることができる。
【００１３】
上記式１または式２で表されるトリテルペン化合物またはその誘導体は、近似の化合物を出発材料とした化学合成法によっても製造することが可能である。
【００１４】
本発明における上記式１であらわされるトリテルペン化合物またはその誘導体は、後述するように、強い抗ガン作用と免疫増強作用の両方の作用を有し、さらにサイトカインの産生促進作用をも有しているので、これらの化合物を有効成分として用いて、ガン治療剤、免疫増強剤、サイトカイン産生促進剤である医薬を製造することができる。
また、この式１であらわされるテルペン化合物またはその誘導体を有効成分として用いて、ガン予防作用、免疫増強作用を有する健康食品、動物用飼料を製造することができる。
【００１５】
この式１であらわされるトリテルペン化合物を含む粗抽出エキス及びこの粗抽出エキスを精製していく途中の工程で得られる抽出エキス（これらを、単に「抽出エキス」ということあり。）には、特に有毒成分は含まれていないのでこの抽出エキスを用いても、式１、２またはその誘導体であらわされるトリテルペン化合物単体を用いる場合と同様の医薬、健康食品、動物飼料を製造することができる。
以下、本発明において、トリテルペン化合物という場合は、とくに単体であると断らない限り、式１または２で表されるトリテルペン化合物またはその誘導体単体だけでなく、それを含む抽出エキスをも意味するものとする。
【００１６】
［有効な投与量及び投与方法］
本発明のトリテルペン化合物はそのまま、あるいは慣用の担体とともに医薬、健康食品、飼料として、動物または人間に投与することができる。
投与形態としては特に限定されないが、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤などの経口剤の製剤、注射剤、経皮吸収剤、ローション、クリーム、軟膏、座剤などの非経口剤の製剤が採用できる。
本発明のトリテルペン化合物を製剤とする場合、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、無痛化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料などを適宜用いることができる。
人間の健康食品として用いる場合は、本発明のトリテルペン化合物を飲料や食品に添加、配合して用いることができる。
家畜、家禽、養殖魚類などの動物に本発明のトリテルペン化合物を適用する場合は、本発明のトリテルペン化合物を飲料水や飼料に添加、配合して用いることができる。
【００１７】
経口剤としての有効量は、治療か予防かの適用目的の違い、および、適用するヒトや動物の年齢、重量、疾患の程度、などにより異なるが、例えば通常ヒトの成人で本発明のトリテルペン化合物の単体に換算して、1日当たり重量で10ｍｇ〜5ｇであり、1日数回に分けて適用することができる。
非経口剤として、発ガン予防、治療効果を得るためには、例えば通常成人で本発明のトリテルペン化合物の単体を、1日当たり重量で1ｍｇ〜1000ｍｇの静脈注射、皮下注射、筋肉注射で適用することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細を説明する。
【実施例】
以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
［ブメリア属の植物の一種であるブメリア サルトルムからの式１で表されるトリテルペン化合物の抽出、分離］
ブメリア サルトルム（Bumelia sartorum）の乾燥樹皮１Ｋｇを粉砕後、超音波条件下７０％エタノール７Ｌを用いて３０分間抽出を行いガラス濾過器により濾過した。この抽出操作をさらに２回繰り返し、得られた濾液を減圧下で濃縮して粗抽出エキス（１５７．９ｇ）を得た。
【００１９】
（クロマトグラフィーによる粗抽出エキスの精製）
得られた粗抽出エキスをＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、４０％メタノール（Fr.1）、７０％メタノール（Fr.2）、１００％メタノール（Fr.3）、アセトン（Fr.4）にて順次溶出した。次いで、Fr.4をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し クロロホルム：メタノール＝100:0、50:1、30:1、10:1、9:1、6:4、0:100 にて順次溶出し、７分画（Fr.4-1〜Fr.4-7）した。
さらに画分Fr.4-5を、カラムとしてSenshu Pak PEGASIL silica 20mm×250mm、溶出液としてヘキサン：酢酸エチル＝10:1 を用いて、順相高速液体クロマトグラフィー（np-HPLC）に付して精製し、油状の目的トリテルペン化合物（３mg）を得た。
【００２０】
（分離されたトリテルペン化合物の物性）
［α］_Ｄ ^２０ ＋107.0（ｃ 0.3，ＭｅＯＨ）
HR_EI-MS m/z 456.3601［Ｍ］^＋（組成式 Ｃ_３０Ｈ_４８Ｏ_３）
^１Ｈ−ＮＭＲ（400ＭＨｚ、δ in ＣＤＣｌ_３）スペクトルと^１３Ｃ−ＮＭＲ（100ＭＨｚ、δ in ＣＤＣｌ_３）スペクトルの測定結果を表に示す。
【表１】

【００２１】
表−１から明らかなように、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルからは、６個の３級メチル基［δ1.12,1.07,1.06,1.01,0.95,0.89（各3H，s）］と２個の２級メチル基［δ1.02,0.89 0.87（各3H，d,J=6.6Hz）］の存在が推定され、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルからは、８個のメチル炭素、１０個のメチレン炭素、４個のメチン炭素、５個の４級炭素、３個のカルボニル炭素（δ224.0,219.4,215.1）に基づくシグナルが観測された。
これらのデータから、単離された化合物が式１で表される新規トリテルペン化合物であることは明らかである。
【００２２】
【実施例２】
［トリテルペン化合物のヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性］
式１で表されるトリテルペン化合物のヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性を検討するために細胞増殖抑制試験（阻害率の測定）を次のように行った。
RPMI-1640培地（SIGMA社製）にストレプトマイシン（100μg/mL：明治製菓）とペニシリン（100U/mL：明治製菓）を添加し、さらに全培地量に対し10%のウシ胎児血清（FCS：GIBCO社製）を加えた。
この培地にガン細胞の一種であるヒト前骨髄性白血病細胞（HL-60：大日本製薬）を1.0×10⁵ cells/mLになるように懸濁させ、96穴のシャーレに（90μLずつ）分注した。次に試験試料のDMSO溶液1μLにRPMI-1640培地を99μL加え、予備希釈した試料を調整し、この希釈試料から10μLづつを各ウエルに分注し、ＣＯ_２インキュベーター（ＣＯ_２5%）にて72時間培養した。
【００２３】
培養後、各ウエルにAlamar Blue 染色液（BIOSORCE INTERNATIONAL社製）10μLを加え、さらに4時間培養した。 培養後、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model 3550）を用いて各ウエルの吸光度を測定した。吸光度（A）は、570nmおよび595nmの2波長で測定した。
同様にして、ブランクの吸光度とコントロールの吸光度を測定した。
ただし、ブランクは細胞、被験試料を加えず培養したウエルにAlamar Blue 染色液を添加したもの、コントロールは細胞とDMSOを加え培養したウエルにAlamar Blue 染色液を添加したものである。
阻害率を、以下の計算式により算出したところ、９４．８％であった。
阻害率（％）＝１００［１−｛サンプル（A_570nm-A_595nm）-ブランク（A_570nm-A_595nm）｝／｛コントロール（A_570nm-A_595nm）-ブランク（A_570nm-A_595nm）｝］式１で表されるトリテルペン化合物は10μg/mLの濃度でヒト前骨髄性白血病細胞に対し、94.8%の阻害率（細胞増殖抑制活性）を示した。
【００２４】
【実施例３】
［トリテルペン化合物のヒト末梢血単核細胞に対する生物活性］
免疫担当細胞の一種であり、正常細胞としてのヒト末梢血単核細胞（PBL）に対する式１で表されるトリテルペン化合物の示す生物活性を検討するために細胞増殖活性試験を次のように行った。
健常成人男性のボランティアから採取した末梢血から、フィコール・ハイパーク濃度勾配法を用いて1500rpm、30分遠心することにより、正常細胞の一種であるヒト末梢血単核細胞（PBL）を分離した。生存率はトリパンブルー染色法により算出した（＞99%）。
RPMI-1640培地（SIGMA社製）にストレプトマイシン（100μg/mL：明治製菓）とペニシリン（100U/mL：明治製菓）を添加し、さらに全培地量に対し10%のウシ胎児血清（FBS：GIBCO社製）を加えた。
調整したPBLを1.0×10^６ cells/mLになるようにRPMI-1640に懸濁させ、96穴のシャーレに（90μLづつ）分注した。次に試験試料のDMSO溶液1μLにRPMI-1640培地を99μL加え、予備希釈した試料を調整し、この希釈試料から10μLづつを各ウエルに分注し、ＣＯ_２インキュベーター（ＣＯ_２5%）にて72時間培養した。
【００２５】
培養後、各ウエルにAlamar Blue 染色液（BIOSORCE INTERNATIONAL社製）10μLを加え、さらに4時間培養した。 培養後、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model 3550）を用いて各ウエルの吸光度を測定した。吸光度（A）は、570nmおよび595nmの2波長で測定した。
同様にして、ブランクの吸光度とコントロールの吸光度を測定した。
ただし、 ブランクは細胞、被験試料を加えず培養したウエルにAlamar Blue 染色液を添加したもの、コントロールは細胞とDMSOを加え培養したウエルにAlamar Blue 染色液を添加したものである。
増殖率を、以下の計算式により算出したところ、２５．７％であった。
増殖率（％）＝１００［｛サンプル（A_570nm-A_595nm）-ブランク（A_570nm-A_595nm）｝
／｛コントロール（A_570nm-A_595nm）-ブランク（A_570nm-A_595nm）｝
−１］
式１で表されるトリテルペン化合物は10μg/mLの濃度で正常細胞であるヒト末梢血単核細胞に対し、25.7%の増殖率（細胞増殖活性）を示した。
【００２６】
上記ヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性及びヒト末梢血単核細胞に対する生物活性の測定結果からみて、式１で表されるトリテルペン化合物は、ガン細胞に対しては増殖を抑制する作用を発揮し、正常細胞に対しては毒性を示さないばかりでなく、むしろ正常な免疫担当細胞に対して増殖を促進する作用を有しているものであるということは明らかである。
【００２７】
【実施例４】
［トリテルペン化合物のサイトカイン産生能の促進作用］
ヒト末梢血単核細胞（PBL）のサイトカイン産生能（hIL-10，hIFN-γ）の測定は、ELISA Kit(Human IL-10 ELISA 及びHuman IFN-γELISA、ともに ENDODEN社製)を用いて行った。被験試料とともにPBLを７２時間培養し、その培養上澄を一次抗体でプレコートしてある９６穴プレートに加えた後、Biotin化二次抗体を添加した。
プレートを洗浄後、Streptavidin-horse radish peroxidase を加えて室温にてインキュベート後に基質を添加し、マイクロプレートリーダーにて吸光度（λ 490 nm）を測定した。PBLに対する各試料のサイトカイン産生量を標準品の検量線より算出した。
【００２８】
結果を表−２に示す。
【表２】

表−２から明らかなように、式１で表される化合物は、PBLに対し10μg/mLの濃度においてhIL-10の産生は示さないが、hIFN-γの産生を15 pg/mL促すことが認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明による式１、２またはその誘導体で表されるトリテルペン化合物は、ガン細胞に対しては強い細胞毒性を示す一方、免疫担当細胞に対しては増殖活性を示し、さらにサイトカインの産生能を促進するという、極めて特異で、有用な性質を有するものである。
したがって、本発明による式１、２で表されるトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体、さらに式１、２で表されるトリテルペン化合物を含有する抽出エキスは、抗ガン剤、免疫増強剤、ガン予防剤などとしての医薬品、健康食品、動物健康飼料の有効成分として用いることができるという優れた効果を有するものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel triterpene compound.
The present invention also relates to a pharmaceutical for preventing cancer, for treating cancer, for enhancing immunity, health food, and animal feed comprising the novel triterpene compound as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Cancer is the main cause of death in Japan, and the death rate from cancer is said to increase further in the future.
Today, cancer countermeasures are an important and urgent issue in national medical care, and approaches to cancer countermeasures have been made from various directions, but no definitive solution has yet been found.
Chemotherapy and immunotherapy are generally performed as drugs for cancer treatment.
However, in chemotherapy using an anti-cancer agent composed of a synthetic compound, an anti-cancer agent generally has an action of attacking not only cancer cells but also normal cells. There are many problems. In addition, immunotherapy using interferon has attracted attention, but the cure rate of cancer by immunotherapy is generally not high.
[0003]
On the other hand, an antitumor agent (Patent Document 1), a carcinogenesis preventing agent (Patent Document 2), a carcinogenic promoter inhibitor (Patent Document 3), and the like, which have been conventionally extracted from a natural body, particularly a triterpene compound, as an active ingredient. Many are known.
However, these drugs focus exclusively on the effects on cancer cells, the effects on normal cells are unknown, and triterpene compounds that combine both anticancer and immune enhancing effects Not known until.
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 8-119866 [Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 9-25232 [Patent Document 3]
JP-A-9-176184 [Non-Patent Document 1]
Brazilian Medicinal Plant Dictionary April 27, 1996 First edition published by Author Hiroo Hashimoto Co-author Yoshishige Moto Publishing House Abbok Publishing Co., Ltd. pp. 1088-181 [0005]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a novel compound that exhibits an action of suppressing proliferation of cancer cells and not only exhibits toxicity to normal cells, but rather exhibits an action of promoting proliferation. And In particular, the present invention provides a novel triterpene compound that exhibits an antiproliferative effect on cancer cells and an antiproliferative effect on immunocompetent cells, and provides a composition containing the compound. And providing a use of the composition.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention comprises the following items.
1. A triterpene compound represented by the chemical formula of Formula 1 and a pharmaceutically acceptable derivative thereof.
[Chemical 3]

2. A triterpene compound represented by the three-dimensional structural formula of Formula 2 and a pharmaceutically acceptable derivative thereof.
[Formula 4]

3. An anticancer agent comprising a triterpene compound of formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
4). A therapeutic agent for leukemia comprising a triterpene compound of formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
5. An immunopotentiator comprising a triterpene compound of Formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
6). A cytokine production promoter comprising a triterpene compound of Formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
7). A cancer preventive agent comprising a triterpene compound of formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
8). A health food comprising a triterpene compound of Formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
9. Animal feed comprising a triterpene compound of formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof.
10. An extract containing a triterpene compound represented by Formula 1 or a triterpene compound represented by Formula 2, which is obtained from a plant belonging to the genus Bumelia belonging to the family Sapotaceae.
11. 11. The extract according to 10 above, wherein the plant belonging to the genus Bumelia is Bumelia sartorum.
12 A pharmaceutical composition comprising the extract according to 10 or 11 as an active ingredient.
13. A health food comprising the extract according to 10 or 11 as an active ingredient.
14 Animal feed comprising the extract according to 10 or 11 as an active ingredient.
[0007]
In the present invention, the “derivative” refers to any one of the three ketone groups at the 3-position, the 13-position, and the 18-position, with the compound represented by the above formula 1 or 2 as a basic skeleton, each independently. Further, it means a compound having a hydroxyl group (—OH), an oxime group (═N—OH), or a hydrazono group (═N—NH ₂ ).
These derivatives are derived from the compound represented by the above formula 1 or 2 by a reduction treatment or a reaction with hydroxylamine.
[0008]
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
The present invention relates to a novel triterpene compound represented by the above formula 1 or 2 obtained from a plant of the genus Bumelia, which is a genus of the plant belonging to the family Sapotaceae from South America.
The present invention relates to a novel triterpene compound represented by the above formula 1 or 2 obtained from Bumelia sartorum, particularly preferably its bark, which is preferably classified as a plant of the genus Bumelia.
[0009]
Plants of the Acetaceae family are widely distributed mainly in the tropics, and those of about 116 genera and 1100 species are known (Non-patent Document 1).
Plants belonging to the genus Bumeria used in the present invention are distributed mainly in tropical America, and about 25 types are known, all of which are woody plants.
Bumeria Sartrum, a particularly preferred plant as a raw material, is abundant in arid regions of Brazil.
Plants that are closely related to Bumeria sartrum and are preferred as raw materials include Bumelia obutusiforia, Bumelia excelsa, and Bumelia rhamnoides, which are Brazil, Peru, Bolivia, and Paraguay. Is distributed in Argentina.
These closely related plants are tall trees of 5 to 15 m in height, including Bumeria sartrum, with branches having hair and thorns. Locally known as QUIXABEIRA, CORONILHA, etc. The bark and flowers are used as tea and decoction and are said to be effective in astringency, tonic, diabetes, diarrhea prevention, etc.
[0010]
The simple substance of the triterpene compound represented by the above formula 1 or 2 is made from a plant body of the genus Bumeria, preferably a bark thereof, and a crude extract is obtained from these plants using an appropriate solvent. Isolation can be achieved by performing separation and purification a plurality of times in normal phase / reverse phase column chromatography.
Among the plants belonging to the genus Bumeria, the triterpene compound represented by the formula 1 or 2 can be extracted and isolated preferably from Bumeria sartrum and the above-mentioned related plants.
[0011]
The raw material plant body is preferably dried and fragmented prior to the extraction treatment.
As the extraction solvent, water, alcohols such as methanol and ethanol, and appropriate solvents such as ether, ethyl acetate, acetone and chloroform can be used alone or as a mixture, but preferred extraction solvents are alcohols such as methanol and ethanol. It is.
For the extraction, an appropriate method such as immersion, digestion, heating under reflux cooling, or supercritical fluid extraction can be used. For example, carbon dioxide or pentane can be used as the supercritical fluid in the supercritical fluid extraction. Extraction can be performed while applying ultrasonic waves if desired. The extraction may be either a continuous type or a batch type, and can be carried out under pressure, normal pressure or reduced pressure. The extraction time can be appropriately determined according to the extraction method, the type of extraction solvent, and the like. For example, at room temperature, it is 1 hour to 10 days, and at a temperature near the boiling point of the solvent, it is 10 minutes to 10 hours.
After extraction, the extraction solvent is removed by distillation under normal pressure or reduced pressure, or freeze-dried to obtain a crude extract.
[0012]
When the crude extract is further separated and purified by column chromatography means or the like, examples of column chromatography used for separation and purification include HP-20 column chromatography and silica gel column chromatography.
Preferably, a separation and purification method using high performance liquid chromatography (HPLC) is employed.
As the solvent used in the column chromatography, an appropriate solvent such as benzene, ethyl acetate, ethanol, methanol, acetone, ether, chloroform, n-hexane or the like can be used.
[0013]
The triterpene compound represented by Formula 1 or Formula 2 or a derivative thereof can also be produced by a chemical synthesis method using an approximate compound as a starting material.
[0014]
As described later, the triterpene compound represented by the above formula 1 or a derivative thereof in the present invention has both a strong anticancer effect and an immune enhancing effect, and also has a cytokine production promoting effect. These compounds can be used as active ingredients to produce pharmaceuticals that are cancer therapeutic agents, immune enhancers, and cytokine production promoters.
In addition, by using the terpene compound represented by the formula 1 or a derivative thereof as an active ingredient, health foods and animal feeds having cancer preventive action and immune enhancing action can be produced.
[0015]
The crude extract containing the triterpene compound represented by the formula 1 and the extract obtained in the process of purifying the crude extract (these are sometimes simply referred to as “extract extracts”) are particularly toxic. Since this ingredient is not contained, even if this extract is used, the same medicine, health food and animal feed as in the case of using the triterpene compound alone represented by Formula 1, 2 or a derivative thereof can be produced.
Hereinafter, in the present invention, the term “triterpene compound” means not only a triterpene compound represented by formula 1 or 2 or a derivative thereof alone, but also an extract containing the same unless otherwise specified as a simple substance. To do.
[0016]
[Effective dosage and administration method]
The triterpene compound of the present invention can be administered to an animal or a human as it is or together with a conventional carrier as a medicine, health food or feed.
The form of administration is not particularly limited, but preparations of oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, liquids, preparations of parenteral preparations such as injections, transdermal absorption agents, lotions, creams, ointments, suppositories, etc. Can be adopted.
When the triterpene compound of the present invention is used as a preparation, an excipient, binder, disintegrant, lubricant, wetting agent, fluidizing agent, preservative, surfactant, emulsifier, stabilizer, diluent as necessary. , Solubilizers, tonicity agents, soothing agents, bactericides, preservatives, flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fragrances and the like can be used as appropriate.
When used as a human health food, the triterpene compound of the present invention can be added to and blended with beverages and foods.
When the triterpene compound of the present invention is applied to animals such as livestock, poultry, and cultured fish, the triterpene compound of the present invention can be added to and mixed with drinking water or feed.
[0017]
The effective amount as an oral preparation varies depending on the application purpose of treatment or prevention, and the age, weight, disease level, etc. of the human or animal to be applied. For example, the triterpene compound of the present invention is usually used in human adults. In terms of a simple substance, the weight per day is 10 mg to 5 g, which can be applied several times a day.
In order to obtain carcinogenesis prevention and treatment effects as a parenteral agent, for example, in general adults, the triterpene compound of the present invention alone is applied by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection of 1 mg to 1000 mg by weight per day. Can do.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Details of the present invention will be described below.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[Example 1]
[Extraction and Separation of Triterpene Compound Represented by Formula 1 from Bumeria Sartorum, a kind of plants belonging to the genus Bumeria]
After 1 kg of dried bark of Bumelia sartorum was pulverized, extraction was performed for 30 minutes using 7 L of 70% ethanol under ultrasonic conditions, and the mixture was filtered through a glass filter. This extraction operation was further repeated twice, and the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a crude extract (157.9 g).
[0019]
(Purification of crude extract by chromatography)
The resulting crude extract was subjected to HP-20 column chromatography, 40% methanol (Fr.1), 70% methanol (Fr.2), 100% methanol (Fr.3), acetone (Fr.4). Were eluted sequentially. Next, Fr. 4 was subjected to silica gel column chromatography, and eluted sequentially with chloroform: methanol = 100: 0, 50: 1, 30: 1, 10: 1, 9: 1, 6: 4, 0: 100, Seven fractions (Fr.4-1 to Fr.4-7) were obtained.
Further, fraction Fr.4-5 was subjected to normal phase high performance liquid chromatography (np-HPLC) using Senshu Pak PEGASIL silica 20 mm × 250 mm as a column and hexane: ethyl acetate = 10: 1 as an eluent. Purification gave the oily desired triterpene compound (3 mg).
[0020]
(Physical properties of the separated triterpene compound)
[Α] _D ²⁰ +107.0 (c 0.3, MeOH)
HR_EI-MS m / z 456.3601 [M] ⁺ (composition formula C ₃₀ H ₄₈ O ₃ )
The measurement results of ¹ H-NMR (400 MHz, δ in CDCl ₃ ) spectrum and ¹³ C-NMR (100 MHz, δ in CDCl ₃ ) spectrum are shown in the table.
[Table 1]

[0021]
As is apparent from Table 1, from the ¹ H-NMR spectrum, 6 tertiary methyl groups [δ1.12, 1.07, 1.06, 1.01,0.95, 0.89 (each 3H, s)] and 2 2 Presence of a quaternary methyl group [δ1.02, 0.89 0.87 (each 3H, d, J = 6.6 Hz)] was estimated, and from ¹³ C-NMR spectrum, 8 methyl carbons, 10 methylene carbons, 4 Of methine carbon, 5 quaternary carbons, and 3 carbonyl carbons (δ224.0, 219.4, 215.1) were observed.
From these data, it is clear that the isolated compound is a novel triterpene compound represented by Formula 1.
[0022]
[Example 2]
[Bioactivity of triterpene compounds against human promyelocytic leukemia cells]
In order to examine the biological activity of the triterpene compound represented by Formula 1 on human promyelocytic leukemia cells, a cell growth inhibition test (measurement of inhibition rate) was performed as follows.
Streptomycin (100 μg / mL: Meiji Seika) and penicillin (100 U / mL: Meiji Seika) are added to RPMI-1640 medium (SIGMA), and 10% fetal calf serum (FCS: GIBCO) is added to the total medium. Made).
Suspend human promyelocytic leukemia cells (HL-60: Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), a type of cancer cell, in this medium at 1.0 × 10 ⁵ cells / mL and dispense into a 96-well petri dish (90 μL each). Noted. Next, 99 μL of RPMI-1640 medium is added to 1 μL of DMSO solution of the test sample to prepare a pre-diluted sample, and 10 μL of this diluted sample is dispensed into each well, and then in a CO ₂ incubator (CO ₂ 5%). Cultured for 72 hours.
[0023]
After culturing, 10 μL of Alamar Blue staining solution (BIOSORCE INTERNATIONAL) was added to each well and further cultured for 4 hours. After the culture, the absorbance of each well was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 3550). Absorbance (A) was measured at two wavelengths, 570 nm and 595 nm.
Similarly, the absorbance of the blank and the absorbance of the control were measured.
However, the blank is obtained by adding Alamar Blue staining solution to wells cultured without adding cells or test samples, and the control is obtained by adding Alamar Blue staining solution to wells cultured by adding cells and DMSO.
When the inhibition rate was calculated by the following formula, it was 94.8%.
Inhibition rate (%) = 100 [1- {sample (A _{570 nm-} A _{595 nm} ) _-blank (A _{570 nm-} A _{595 nm} )} / {control (A _{570 nm-} A _{595 nm} ) _-blank (A _{570 nm-} A _{595 nm} )}] The triterpene compound represented by Formula 1 exhibited a 94.8% inhibition rate (cell proliferation inhibitory activity) against human promyelocytic leukemia cells at a concentration of 10 μg / mL.
[0024]
[Example 3]
[Bioactivity of triterpene compounds on human peripheral blood mononuclear cells]
In order to examine the biological activity of the triterpene compound represented by Formula 1 against human peripheral blood mononuclear cells (PBL) as normal cells, a type of immunocompetent cell, a cell proliferation activity test was performed as follows. .
Human peripheral blood mononuclear cells (PBL), which are a kind of normal cells, were separated from peripheral blood collected from healthy adult male volunteers by centrifugation at 1500 rpm for 30 minutes using the Ficoll-Hypaque concentration gradient method. Survival was calculated by trypan blue staining (> 99%).
Streptomycin (100 μg / mL: Meiji Seika) and penicillin (100 U / mL: Meiji Seika) were added to RPMI-1640 medium (SIGMA), and 10% fetal bovine serum (FBS: GIBCO) Made).
The adjusted PBL was suspended in RPMI-1640 at 1.0 × 10 ⁶ cells / mL and dispensed into a 96-well petri dish (in 90 μL increments). Then added 99μL of RPMI-1640 medium in DMSO solution 1μL of the test sample to adjust the sample was pre-diluted at pipetted into each well 10μL increments from the diluted sample, CO ₂ incubator (CO 2 _5%) Cultured for 72 hours.
[0025]
After culturing, 10 μL of Alamar Blue staining solution (BIOSORCE INTERNATIONAL) was added to each well and further cultured for 4 hours. After the culture, the absorbance of each well was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 3550). Absorbance (A) was measured at two wavelengths, 570 nm and 595 nm.
Similarly, the absorbance of the blank and the absorbance of the control were measured.
However, the blank is obtained by adding Alamar Blue staining solution to wells cultured without adding cells or test samples, and the control is obtained by adding Alamar Blue staining solution to wells cultured by adding cells and DMSO.
The proliferation rate was calculated by the following calculation formula and found to be 25.7%.
Growth rate (%) = 100 [{sample (A _{570 nm-} A _{595 nm} ) _-blank (A _{570 nm-} A _{595 nm} )}
/ {Control (A _570nm -A _595nm ) _-Blank (A _570nm -A _595nm )}
-1]
The triterpene compound represented by Formula 1 exhibited a proliferation rate (cell proliferation activity) of 25.7% with respect to human peripheral blood mononuclear cells which are normal cells at a concentration of 10 μg / mL.
[0026]
From the measurement results of the biological activity against human promyelocytic leukemia cells and the biological activity against human peripheral blood mononuclear cells, the triterpene compound represented by Formula 1 exerts an action of suppressing the proliferation of cancer cells. It is clear that not only is it not toxic to normal cells, but rather has the effect of promoting proliferation on normal immunocompetent cells.
[0027]
[Example 4]
[Promoting effect of triterpene compound on cytokine production]
Measurement of cytokine production capacity (hIL-10, hIFN-γ) of human peripheral blood mononuclear cells (PBL) was performed using ELISA Kit (Human IL-10 ELISA and Human IFN-γ ELISA, both from ENDODEN) . The PBL was cultured for 72 hours together with the test sample, and the culture supernatant was added to a 96-well plate precoated with the primary antibody, and then a biotinylated secondary antibody was added.
After washing the plate, Streptavidin-horse radish peroxidase was added and incubated at room temperature, the substrate was added, and the absorbance (λ 490 nm) was measured with a microplate reader. The amount of cytokine production of each sample relative to PBL was calculated from the standard curve of the standard.
[0028]
The results are shown in Table-2.
[Table 2]

As is clear from Table 2, the compound represented by Formula 1 does not show hIL-10 production at a concentration of 10 μg / mL with respect to PBL, but promotes hIFN-γ production by 15 pg / mL. Admitted.
[0029]
【The invention's effect】
The triterpene compound represented by the formula 1, 2 or a derivative thereof according to the present invention exhibits strong cytotoxicity against cancer cells, but exhibits proliferative activity against immunocompetent cells and further promotes cytokine production ability. It has very unique and useful properties.
Therefore, the triterpene compound represented by formulas 1 and 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof according to the present invention, and the extract containing the triterpene compound represented by formulas 1 and 2 are anticancer agents and immune enhancers. It has an excellent effect that it can be used as an active ingredient in pharmaceuticals, health foods, and animal health feeds as cancer preventives.

Claims (11)

A triterpene compound represented by the chemical formula of Formula 1 and a pharmaceutically acceptable derivative thereof.

A triterpene compound represented by the three-dimensional structural formula of Formula 2 and a pharmaceutically acceptable derivative thereof.

An anticancer agent comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. A therapeutic agent for leukemia comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. An immunopotentiator comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. A cytokine production promoter comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. A cancer preventive agent comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. A health food comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient. An animal feed comprising the triterpene compound according to claim 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable derivative thereof. The triterpene compound according to claim 1 or 2 and a pharmaceutically acceptable derivative thereof obtained by extraction from a plant belonging to the genus Bumelia belonging to the family Sapotaceae . The triterpene compound and pharmaceutically acceptable derivatives thereof according to claim 10, wherein the plant belonging to the genus Bumelia is Bumelia sartorum .