JP4287284B2

JP4287284B2 - プラスチック製カセット中の欠陥のないポリアクリルアミド電気泳動ゲルの作製

Info

Publication number: JP4287284B2
Application number: JP2003571320A
Authority: JP
Inventors: エム．パナトーニ，コーリー
Original assignee: バイオ−ラッドラボラトリーズ，インコーポレイティド
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: EP1478670B1; EP1478670A1; EP1478670A4; CA2476768A1; US20030162891A1; JP2005519145A; US20050059761A1; WO2003072616A1; US6846881B2; AU2003212467B2; AU2003212467A1; CA2476768C; DE60322027D1; AU2003212467C1

Description

本発明は、スラブゲル電気泳動に用いられるようなポリアクリルアミドゲルに関する。

スラブゲルは、多サンプル分析に適応するそれらの能力並びに電気泳動図が観察及び解読（単に個々の成分に対応するところの該ゲル上の様々なバンドの位置を同定することにより）され得る容易性に鑑みて、電気泳動分析にとって特に有用である。ポリアクリルアミドは、スラブゲルにおいて広く用いられているゲル物質である。

スラブゲルは、しばしば、予備注型形態にて供給され、しかしてカセット中の２枚の平透明板の間に保持される。該板は典型的にはプラスチックから作られ、そして認められてきた難点は、ゲルとプラスチックの間の界面近くにおけるゲル細孔サイズの不整に因る溶質バンドの明らかな変形である。これらの不整は電気泳動分析に有害であり、何故なら細孔サイズは溶質バンドの泳動に影響を及ぼしそして細孔サイズの変動は該バンドの変形の原因となるからである。

ポリアクリルアミドゲルはアクリルアミドモノマー及びビスアクリルアミド架橋剤からフリーラジカル反応により形成されるが、分子状酸素がフリーラジカルの形成を阻止しそしてそれによりポリアクリルアミド鎖の成長を制限することが知られている。この問題は、プラスチック製エンクロージャ（「囲い体」：enclosures）中において形成されるポリアクリルアミドゲルに関して特に深刻である。

プラスチック製ゲルカセット中において予備注型されるポリアクリルアミドゲルの界面不整が、該ゲルが注型されるゲル形成溶液中に酸素スカベンジャーを含めることにより低減又は除去され得る、という発見に本発明は存する。該溶液中のモノマー混合物は、該スカベンジャーが該溶液中に存在したまま重合され、そしてその結果、全体にわたって実質的に均一な細孔サイズを有する予備注型ゲルがもたらされることになる。その場合には、カセットにおけるバンド分離能は、ガラス製囲い体中のポリアクリルアミドゲルでもって得られ得るバンド分離能に匹敵し得る。

本発明の更なる詳細及びその好ましい具体的態様が、以下に記載される。
発明の詳細な説明及び好ましい具体的態様

本発明の実施の際に用いられ得る酸素スカベンジャーは、腐食を減じる目的のためにそれらが含められるボイラー操作のような適用において酸素スカベンジャーとしての使用のために用いられてきたか又は開示された物質の多くを包含する。これらの物質の例は、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム、重亜硫酸アンモニウム、ヒドロキノン、ジエチルヒドロキシエタノール、ジエチルヒドロキシルアミン、メチルエチルケトキシム、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びエリソルビン酸ナトリウムである。本願において特に有益な酸素スカベンジャーは、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム及び重亜硫酸アンモニウムであり、そしてこれらのうちで、亜硫酸ナトリウム及び重亜硫酸ナトリウムが最も好ましい。

ゲル形成溶液は、ポリアクリルアミドを形成するように重合可能（一般に、フリーラジカル反応により）であるモノマー混合物の水溶液である。ポリアクリルアミドゲルを形成させる際の使用のために用いられてきたか又は開示されているモノマー混合物は、本発明の実施の際に用いられ得る。モノマー混合物は、典型的には、アクリルアミド、架橋剤及びフリーラジカル開始剤を含む。好ましい架橋剤はビスアクリルアミドであり、そして特に好都合な架橋剤はＮ，Ｎ′−メチレン−ビスアクリルアミドである。

ゲル形成溶液はまた、典型的には、フリーラジカル開始剤系を含む。用いられる最も普通の系は、過硫酸アンモニウムと組み合わされたＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）である。他の系は、当業者に明らかであろう。

電気泳動の利用及び電気泳動ゲルの作製における当業者の間で、ポリアクリルアミドゲルはパラメーターＴ及びＣにより特徴づけられ、しかしてパラメーターＴ及びＣは、パーセントとして表されそして次のとおり定義される（ここで、「ビス」はビスアクリルアミド架橋剤を指す）。すなわち、

Ｔ及びＣの値は、一般にポリアクリルアミドゲルの用途に関して変動するので、本発明において変動し得る。本発明の目的にとって、Ｔ値の好ましい範囲は約５％から約３０％であり、そして最も好ましくは約１０％から約２０％である。Ｃ値の好ましい範囲は約１％から約１０％（約１０：１から約１００：１のアクリルアミド対ビスアクリルアミドの重量比の範囲に相当する）であり、そして最も好ましくは約２％から約４％（約２５：１から約５０：１のアクリルアミド対ビスアクリルアミドの重量比の範囲に相当する）である。

本発明から利するカセットの支持板を形成するために用いられるプラスチック物質は、広く様々なプラスチックを包含する。該プラスチックは一般に射出成形可能なプラスチックであり、そしてその選択は、該プラスチックがゲル形成溶液、ゲルそれ自体、カセット中において分析されるべきサンプル中の溶質（典型的には、タンパク質）、緩衝剤、及びサンプル中に典型的には存在するいかなる他の成分に対しても不活性である必要性によってのみ制限される。これらのプラスチックの例は、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリルポリマー、スチレン−アクリロニトリルコポリマー（ＳＡＮ，ＮＡＳ）、BAREX（登録商標）アクリロニトリルポリマー（米国イリノイ州ネーパービルのBarex Resins）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンテレフタレートグリコレート（ＰＥＴＧ）及びポリ（エチレンナフタレンジカルボキシレート）（ＰＥＮ）である。

ゲル形成溶液中に含められる酸素スカベンジャーの量は本発明にとって決定的には重要でなく、広範囲にわたって変動され得る。或るプラスチックは他のものより多い量の酸素スカベンジャーを必要とし、何故ならプラスチック中に保持された酸素の量は、異なるプラスチック間で及びそれらが形成される態様間で変動するからである。酸素スカベンジャーの最適量はまた、スカベンジャーの選択と共に変動し得る。しかしながら、一般に、最良結果は、ゲル形成水溶液中約１ｍＭから約３０ｍＭ好ましくは約３ｍＭから約１５ｍＭの範囲内にある酸素スカベンジャーの濃度でもって得られる。用いられる酸素スカベンジャーの量はまた、その他の成分の最適量に影響を及ぼし得る。たとえば、或る酸素スカベンジャーはフリーラジカル反応に対して触媒活性を示し、そしてその場合には、かかるスカベンジャーが存在するとき、フリーラジカル開始剤のより低い濃度が用いられ得る。たとえば亜硫酸塩又は重亜硫酸塩が用いられる場合、ＴＥＭＥＤ及び過硫酸アンモニウム（又は他のフリーラジカル開始剤系）の濃度は、別の場合において用いられるより低くあり得る。

次の例は例示の目的のために供され、しかして本発明の範囲を限定するよう意図されていない。
実施例１

次の成分を一緒にして指摘濃度の水溶液にすることにより、ゲル形成溶液を作製した。すなわち、
アクリルアミド／Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビスアクリルアミド（Ｔ＝１２％，Ｃ＝２．６７％）
０．３７５Ｍトリス−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩），ｐＨ８．６
０．０６７％ＴＥＭＥＤ
０．０５％過硫酸アンモニウム
６ｍＭ亜硫酸ナトリウム

この溶液中のアクリルアミド／ビスアクリルアミド混合物を室温（おおよそ２０℃）にて３０〜６０分間重合させて、電気泳動用に準備されたゲルを形成させた。
実施例２

１枚のガラス板及び１枚のアクリルプラスチック板でもって構築されたゲルカセット向けの分離用及び濃縮用ゲルを形成させる際の使用のために、次の溶液を作製した。別段指摘されていなければ、パーセントはすべて重量により、そして溶液はすべて水溶液である。
表Ｉ
分離用ゲル：脱イオンＨ₂Ｏ３４．５ｍＬ
１．５Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．８２５．０ｍＬ
３０％（３７．５：１）４０．０ｍＬ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド
１０％過硫酸アンモニウム５００μＬ
ＴＥＭＥＤ５０μＬ
濃縮用ゲル：脱イオンＨ₂Ｏ６．２ｍＬ
１．５Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８２．５ｍＬ
３０％（３７．５：１）１．３ｍＬ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド
１０％過硫酸アンモニウム５０μＬ
ＴＥＭＥＤ１０μＬ

亜硫酸ナトリウムの原液（１Ｍ水性）もまた作製し、そして上記の分離用及び濃縮用ゲル溶液に次のとおり異なるレベルにて添加した。すなわち、
（１）亜硫酸ナトリウムは、どちらのゲルにも添加されなかった。
（２）原液５７．１μＬが両方のゲル溶液に添加されて、各溶液中７２．０２μｇ／ｍＬ（０．５７１ｍＭ）の最終亜硫酸ナトリウム濃度にされた。
（３）原液５７１．４μＬが両方のゲル溶液に添加されて、各溶液中７２０．２μｇ／ｍＬ（５．７１４ｍＭ）の最終亜硫酸ナトリウム濃度にされた。

これらのゲル溶液を、上記に記載されたカセットにおいて、７ｃｍ×８．３ｃｍ×１ｍｍのゲル空間に入れた。これらのゲルを重合させ、そして次いで大腸菌ライゼートをいくつかのバンドにて及び標準タンパク質混合物をいくつかの他のバンドにて装填した。標準タンパク質混合物は、ミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤ）、オボアルブミン（４５ｋＤ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１ｋＤ）、トリプシン阻害剤（２１．５ｋＤ）及びリゾチーム（１４．５ｋＤ）であった。電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）すると、溶質バンドの変形（すなわち、外縁に向かって上方に湾曲）がすべてのゲルにおいて標準タンパク質混合物の端レーンに現れたが、しかし亜硫酸ナトリウムを有さない及びわずか０．５７１ｍＭの亜硫酸ナトリウムを有するゲルにおいて非常に顕著であった。加えて、大腸菌ライゼート及び標準タンパク質混合物の両方からのバンドは、５．７１４ｍＭの亜硫酸ナトリウムの場合比較的広くなくて比較的シャープであった。
実施例３

無被覆ポリスチレン−アクリロニトリルコポリマー（SAN 880B TYRIL（登録商標），米国ミシガン州ミッドランドのThe Dow Chemical Company）の２枚の板から形成されたゲルカセット向けの分離用及び濃縮用ゲルとしての使用のために、次の溶液を作製した。別段指摘されていなければ、パーセントはすべて重量により、そして溶液はすべて水溶液である。
表ＩＩ
分離用ゲル：脱イオンＨ₂Ｏ３４．５ｍＬ
１．５Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．８２５．０ｍＬ
３０％（３７．５：１）４０．０ｍＬ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド
１０％過硫酸アンモニウム５００μＬ
ＴＥＭＥＤ５０μＬ
濃縮用ゲル：脱イオンＨ₂Ｏ６．２ｍＬ
１．５Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８２．５ｍＬ
３０％（３７．５：１）１．３ｍＬ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド
１０％過硫酸アンモニウム５０μＬ
ＴＥＭＥＤ１０μＬ

１Ｍ水性亜硫酸ナトリウムの原液もまた作製し、そして上記の分離用及び濃縮用ゲル溶液に次のとおり異なるレベルにて添加した。すなわち、
（１）亜硫酸ナトリウムは、どちらのゲルにも添加されなかった。
（２）原液５７．１μＬが両方のゲル溶液に添加されて、各溶液中７２．０２μｇ／ｍＬ（０．５７１ｍＭ）の最終亜硫酸ナトリウム濃度にされた。
（３）原液５７１．４μＬが両方のゲル溶液に添加されて、各溶液中７２０．２μｇ／ｍＬ（５．７１４ｍＭ）の最終亜硫酸ナトリウム濃度にされた。

これらのゲル溶液を、上記に述べられた総プラスチック製カセットにおいて、７ｃｍ×８．３ｃｍ×１ｍｍのゲル空間に入れた。これらのゲルを重合させ、そして次いで実施例２において用いられたのと同じタンパク質混合物をこれらのゲルのいくつかの異なるレーンに装填した。電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）すると、溶質バンドの変形（すなわち、波形バンド）が、亜硫酸ナトリウムを有さない及びわずか０．５７１ｍＭの亜硫酸ナトリウムを有するゲルのすべてのレーンにおいて現れたのに対して、５．７１４ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含有するゲルにおける溶質バンドは顕著により直線状であった。加えて、５．７１４ｍＭの亜硫酸ナトリウムの場合のバンドは、比較的広くなくて比較的シャープであった。

以上の記載は、主として例示の目的のためである。更なる改変、置換及び変型は当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内に含まれる。

Claims

プラスチック製ゲル囲い体中においてポリアクリルアミド電気泳動ゲルを注型する方法であって、
（ａ）アクリルアミドと、架橋剤と、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム、重亜硫酸アンモニウム、ヒドロキノン、ジエチルヒドロキシエタノール、ジエチルヒドロキシルアミン、メチルエチルケトキシム、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びエリソルビン酸ナトリウムから成る群から選択された群員である酸素スカベンジャーとを含むモノマー混合物の水溶液を形成させ、ここで、水溶液中の酸素スカベンジャーの濃度が、１ｍＭから３０ｍＭである、そして（ｂ）該モノマー混合物をプラスチック製ゲル囲い体中で重合してポリアクリルアミド電気泳動ゲルを形成させることを含む方法。
モノマー混合物が、フリーラジカル開始剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
酸素スカベンジャーが、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム及び重亜硫酸アンモニウムから成る群から選択された群員である、請求項１に記載の方法。
酸素スカベンジャーが、亜硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
水溶液中の酸素スカベンジャーの濃度が、３ｍＭから１５ｍＭである、請求項３に記載の方法。
プラスチック製ゲル囲い体が、ポリカーボネート、ポリスチレン、スチレン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートグリコレート及びポリ（エチレンナフタレンジカルボキシレート）から成る群から選択された群員である、請求項１に記載の方法。
プラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲルであって、（ａ）アクリルアミドと、架橋剤と、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム、重亜硫酸アンモニウム、ヒドロキノン、ジエチルヒドロキシエタノール、ジエチルヒドロキシルアミン、メチルエチルケトキシム、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びエリソルビン酸ナトリウムから成る群から選択された群員である酸素スカベンジャーとを含むモノマー混合物の水溶液を形成させること、ここで、水溶液中の酸素スカベンジャーの濃度が、１ｍＭから３０ｍＭである、および（ｂ）該モノマー混合物をプラスチック製ゲル囲い体中で重合してポリアクリルアミドゲルを形成させることにより、製造されたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
前記モノマー混合物がフリーラジカル開始剤を更に含む請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
酸素スカベンジャーが、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム及び重亜硫酸アンモニウムから成る群から選択された群員である、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
酸素スカベンジャーが、亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸ナトリウムである、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
酸素スカベンジャーが、亜硫酸ナトリウムである、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
水溶液中の酸素スカベンジャーの濃度が、１ｍＭから３０ｍＭである、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
水溶液中の酸素スカベンジャーの濃度が、３ｍＭから１５ｍＭである、請求項９に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
プラスチック製ゲル囲い体が、ポリカーボネート、ポリスチレン、スチレン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートグリコレート及びポリ（エチレンナフタレンジカルボキシレート）から成る群から選択された群員である、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
モノマー混合物が、水溶液中においてアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドを含み、しかもこれらのアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドの総量が水溶液の５％から３０％になる、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
モノマー混合物が、アクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドを、水溶液の１０％から２０％の総合濃度にて含む、請求項７に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
アクリルアミド対Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドの重量比が、１０：１から１００：１である、請求項１５に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。
アクリルアミド対Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドの重量比が、２５：１から５０：１である、請求項１５に記載のプラスチック製ゲル囲い体中に囲まれたポリアクリルアミド電気泳動ゲル。