ES2294949B1 - Gel para la separacion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Gel para la separación de proteínas. Gel de poliacrilamida que comprende: (i) una parte inferior que tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; y (ii) una parte superior que tiene una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; donde ambas partes forman una única capa. La invención también se refiere al procedimiento y al kit para obtener este gel de poliacrilamida. Es útil para la separación electroforética simultánea de proteínas de elevado y bajo peso molecular.
Description
Gel para la separación de proteínas.
La invención se relaciona con la electroforesis
en gel y particularmente con con un gel de poliacrilamida para la
separación de proteínas así como con un procedimiento para obtener
el gel.
La electroforesis en gel configura un grupo de
técnicas usadas por los científicos para separar moléculas en base
a sus características físicas tales como su tamaño, su forma o su
punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza normalmente
con fines analíticos aunque también puede ser usada como técnica
preparativa para la purificación parcial de moléculas previo a su
uso en otros métodos para su caracterización, tales como la
espectrometría de masas, la PCR (del inglés, "Polymerase Chain
Reaction"), el clonaje, la sequenciación de ADN o el
immunoblotting.
Más de cuarenta años después de su descripción
inicial (cfr. J.V. Maizel, 2000, TIBS, vol. 25, pp.
590-592), la electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE) continúa siendo una de las herramientas más poderosas para
el análisis de proteínas. Existen distintas variantes de la PAGE
que proporcionan diferentes tipos de información sobre las
proteínas analizadas (masa, carga, pureza, etc). Entre estas
variantes, la más común es probablemente la que se usa el dodecil
sulfato sódico ("sodium dodecyl sulfate", SDS), comúnmente
referida como SDS-PAGE. Este detergente aniónico
(SDS) se une a lo largo de toda la superficie de las proteínas
desnaturalizadas por calor, confiriéndoles por ello una carga total
que es proporcional a su tamaño (i.e., una proporción masa:carga
uniforme). Como resultado, la distancia de migración de una
proteína cuando se aplica una corriente eléctrica a un gel
SDS-PAGE, depende únicamente de la masa de la
proteína. Este hecho junto con algunos otros refinamientos tales
como el uso de agentes reductores y el uso de un gel concentrador,
ha hecho que sea posible separar proteínas según su peso molecular
con una resolución considerable.
Para obtener una resolución de proteínas óptima
mediante SDS-PAGE, es necesario verter un gel
concentrador sobre el gel separador. El gel concentrador posee una
concentración menor de acrilamida (mayor tamaño de poro), un pH
inferior y un contenido iónico diferente. Esto permite a las
proteínas de cada carril concentrarse en una banda estrecha, antes
de su entrada en el gel separador, produciendo un gel con bandas de
proteínas más estrechas y mejor separadas.
La SDS-PAGE es una técnica
conocida para la separación de proteínas pequeñas. En este caso, se
usa normalmente un gel con concentración de poliacrilamida entre 5
y 20% y una proporción acrilamida:bisacrilamida de alrededor de
40:1, para el análisis de proteínas de 5 a 200 kDa (cfr. A.V.
Ershov et al., 1996, The Journal of Biological
Chemistry, vol. 271, pp. 28458-28462).
Con el objetivo de analizar proteínas gigantes,
se usa un gel compuesto con una mayor porosidad. Este gel se
consigue incrementando la proporción acrilamida:bisacrilamida hasta
80:1 por ejemplo. También es necesario un porcentaje de acrilamida
bajo de alrededor del 4-5% (cfr. J.L. Rosa et
al., 1996, EMBO J., vol. 15, pp.
4262-73). Sin embargo, este tipo de geles son
demasiado blandos y pegajosos, lo cual los hace de difíciles de
manipular en tinciones o para transferirlos en membranas.
Otros geles conocidos hacen uso de un gradiente
de concentración, como los descritos en la solicitud de patente US
2003/0027965. Este tipo de geles o sistemas de geles son capaces de
separar moléculas con unos pesos moleculares en el intervalo entre
7 y 195 KDa (BioRad laboratories, Hercules, CA, USA). No obstante,
ninguno de los geles conocidos en la actualidad es capaz de separar
simultáneamente tanto proteínas gigantes como proteínas
pequeñas.
La presente invención se refiere a un nuevo gel
de poliacrilamida capaz de separar simultáneamente proteínas de
peso molecular alto y bajo (es decir, proteínas con un peso
molecular en el intervalo de 5 kDa a mayor que 200 kDa), donde este
gel comprende una capa uniforme formada por diferentes soluciones,
todas ellas polimerizadas al mismo tiempo.
Así, utilizando el gel de polacrilamida de la
invención, es posible analizar simultáneamente proteínas gigantes
tales como HERC1 (532 kDa) y la cadena pesada de la dineína (DYHC,
527 kDa), proteínas grandes como la cadena pesada de la clatrina
(CHC, 192 kDa) y pequeñas proteínas como el factor 1 de
ribosilación del ADP (ARF1, 20 kDa). El gel de poliacrilamida de la
invención tiene una buena resolución, coste de fabricación bajo,
alta reproducibilidad y ahorra tiempo en comparación con los
sistemas de gel utilizados en la técnica. Todas estas
características, junto con el hecho de que se puede utilizar un
aparato estándar disponible en cualquier laboratorio de bioquímica
para hacer el gel de la presente invención, hace que sea una
herramienta fácil y fiable.
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere a un gel de poliacrilamida que comprende: (i) una parte
inferior que tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida
dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1
a 20:1; y (ii) una parte superior que tiene una concentración de
poliacrilamida (fija o el gradiente) en el intervalo de 3% a 10% y
una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del
intervalo de 100:1 a 70:1; donde ambas partes forman una
única
capa.
capa.
El término "única capa" como se usa aquí,
se refiere a un gel uniforme sin separación o deformaciones entre
las dos partes. Para hacer la parte superior más tratable, ambas
partes deben polimerizarse al mismo tiempo. Corn resultado, el gel
final es una unidad más consistente y puede ser manipulado
cogiéndolo por su región inferior más densa. Esto es especialmente
importante cuando el gel tiene que teñirse o transferirse a una
membrana para llevar a cabo p. ej. un western blot. Un experto en la
materia fácilmente entenderá el significado de los términos
"parte superior" y "parte inferior" de un gel.
En una primera realización de la presente
invención, la parte inferior tiene un gradiente de concentración de
poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 50:1
a 30:1. En otra realización, la parte superior tiene una
concentración de poliacrilamida en el intervalo de 4% a 8% y una
proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del
intervalo de 90:1 a 80:1.
En una realización más preferida, la parte
inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida
desde el 6% al 15% y una proporción acrilamida:entrecruzador de
40:1. En otra realización, la parte superior tiene una
concentración de poliacrilamida del 4% y una proporción
acrilamida:entrecruzador de 80:1.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un procedimiento para obtener el gel de la invención, que
comprende los siguientes pasos: (a) verter en un generador de
gradiente soluciones que comprenden acrilamida y entrecruzador,
adecuadas para obtener un gradiente de concentración de
poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1
a 20:1; (b) añadir una segunda solución que comprende acrilamida y
entrecruzador, adecuada para obtener una concentración de
poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1
a 70:1; y (c) dejar polimerizar las soluciones de los pasos (a) y
(b) al mismo tiempo para formar una única
capa.
capa.
Para generar el gel de la invención, la
acrilamida que se utiliza para hacer las soluciones de los pasos
(a) y (b) del procedimiento de la invención tiene que mezclarse con
un entrecruzador con el fin de formar el polímero entrecruzado.
Además, esta polimerización debe hacerse en presencia de una
solución de peróxido y de un agente reductor.
En una realización preferida de la invención, la
solución de peróxido, que se utiliza para formar el polímero
entrecruzado puede ser, pero no se limita a, peroxodisulfato de
amonio, y un peroxodisulfato de un metal alcalino.
En otra realización de la invención, los agentes
reductores que se utilizan para formar el polímero entrecruzado
pueden ser, pero no se limitan a, compuestos amina, p. ej.
N,N,N',N'-tetrametiletilenediamina (TEMED),
N,N,-dimetiletilenediamina,
3-dimetilamino-n-propilamina,
3-dimetilaminopropionitrilo,
N-n-butildimetilamina y
N,N'-dimetilpiperazina.
En una realización más preferida, en el paso (a)
el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida dentro del
intervalo de 4% a 18%, y una proporción acrilamida:entrecruzador
seleccionada dentro del intervalo de 50:1 a 30:1; y en el paso (b)
la concentración de poliacrilamida está en el intervalo de 4% a 8%,
y tiene una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro
del intervalo de 90:1 a 80:1.
En todavía otra realización más, en el paso (a)
el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida desde el 6%
al 15%, y una proporción acrilamida:entrecruzador de 40:1; y en el
paso (b) la concentración de polacrilamida es 4% y la proporción
acrilamida:entrecruzador de 80:1.
Como se usa aquí, el término
"entrecruzador" ("crosslinker") se refiere a cualquier
compuesto que posee funciones de entrecruzamiento. Ejemplos
específicos de compuestos pueden ser, pero no se limitan a,
N,N'-metilenebisacrilamida (BIS o bisacrilamida),
N,N'-propilenebisacrilamida, diacrilamida dimetil
éter y piperazina diacrilamida. En todavía una realización más
preferida de la presente invención, el entrecruzador es
bisacrilamida.
Debe tenerse en cuenta que, en el procedimiento
de la invención, es innecesario el uso de un gel de concentración
puesto que el tamaño de poro decreciente continuo realiza la misma
función.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere al uso del gel de la invención para la separación de
proteínas por electroforesis. En una realización preferida, el gel
de la invención se utiliza para separar simultáneamente proteínas
de muy diferentes tamaños. La parte inferior del gel de la
invención es capaz de separar proteínas cuyos pesos moleculares son
en el intervalo de 5 kDa a 200 kDa y la parte superior del gel es
capaz de separar proteínas cuyos pesos moleculares son mayores de
200 kDa, con buena resolución.
Finalmente, otro aspecto de la invención se
refiere a un kit para llevar a cabo el procedimiento definido
anteriormente, que comprende cantidades apropiadas de acrilamida,
de entrecruzador y de un tampón adecuado. Un tampón adecuado puede
ser Tris/HCI (pH 8.8) + SDS.
\newpage
Aplicaciones frecuentes de la electroforesis
SDS-PAGE para separar proteínas utilizando el gel
de la invención son el análisis immunoblot (western blot), la
inmunoprecipitación, la proteómica, estudios de interacción y otras
aplicaciones conocidas por cualquier experto en la materia.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
La Fig. 1A es una representación esquemática
donde se muestra cómo se prepara el gel de la invención, entre dos
cristales de un aparato para Western blot ("slab"). La Fig. 1B
muestra la separación de las proteínas pertenecientes a vesículas
con cubierta de clatrina (CCV) mediante el gel de la invención.
b.p. = parte inferior; u.p. = parte superior; m. = marcadores.
La Fig. 2 muestra algunas aplicaciones del gel.
La Fig. 2A es una representación esquemática de distintas proteínas
de fusión con GFP, de la proteína gigante HERC1 y sus dominios. Las
Fig. 2B y Fig. 2C muestran plásmidos que expresan las proteínas de
fusión con GFP, transfectados en células HEK-293 y
analizados mediante "immunoblot" con anticuerpos
anti-GFP (Fig. 2B) o anti-HERC1
(Fig. 2C). La Fig. 2D muestra lisados de células
HEK-293 inmunoprecipitados con anticuerpos contra
HERC1, pre-inmune (P) o inmune (I).
Un ejemplo del gel de la invención se muestra en
la Fig 1. El gel fue preparado entre dos cristales (16 cm x 18 cm)
de un aparato para Western blot estándar (cfr. F.W.Studier, 2000
TIBS, vol. 35, pp. 588-590). Para la
generación del gel, se prepararon tres soluciones de acrilamida con
bisacrilamida. Dichas soluciones tenían las siguientes
características:
- Una concentración de poliacrilamida del 6% y
una proporción acrilamida:bisacrilamida de 40:1.
- Una concentración de poliacrilamida del 15% y
una proporción acrilamida:bisacrilamida de 40:1.
- Una concentración de poliacrilamida del 4% y
una proporción acrilamida:bisacrilamida de 80:1.
Todas las soluciones acrilamida:bisacrilamida se
añadieron en un tampón [37.5 mM Tris/HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) SDS]
en presencia de peroxodisulfato de amonio (10 \mul de la solución
al 10% en 20 ml de solución) y TEMED (50 \mul en 20 ml de
solución).
Las soluciones de acrilamida al 6% (40:1) y 15%
(40:1) fueron vertidas en cada uno de los compartimentos del
aparato generador de gradiente al mismo tiempo. Rápidamente a
continuación y antes que el gel solidificara, fue añadida la
solución al 4% (80:1). De esta forma el gel final era una unidad o
capa más consistente que podía ser manipulada más fácilmente
cogiéndolo por su parte inferior más densa.
Con el objetivo de probar su resolución y sus
posibles aplicaciones, se usaron vesículas con cubierta de clatrina
(CCV) (cfr J.H. Keen et al., 1979 Cell, vol. 16, pp.
303-312) puesto que están formadas por relativamente
pocas proteínas pero con un intervalo de pesos moleculares muy
diverso.
En las Figuras se muestran los marcadores de
peso molecular (Miosina: 195 kDa;
\beta-galactosidasa: 116 kDa; Albúmina de suero
bovino: 95 kDa; Ovoalbúmina: 51 kDa; Anhidrasa carbónica: 37 kDa;
inhibidos de la Tripsina de semilla de soja: 29 kDa; Lisozima: 20
kDa; Aprotinina: 7 kDa) (BioRad laboratories, Hercules, CA,
USA).
Se separaron proteínas de las CCV mediante el
gel de la invención (Ejemplo 1), se visualizaron por tinción con
Coomassie Brilliant Blue y luego fueron identificadas por
espectrometría de masas (MS) y immunoblot con anticuerpos
específicos.
Se hirvieron durante 10 minutos 100 \mug de
CCV resuspendidos en tampón Laemmli [50 mM Tris/HCl (pH 8.8), 2%
(w/v) SDS, 100 mM DTT, 10% (v/v) glicerol y 0.01% azul de
bromofenol] (cfr. U.K. Laemmli, 1970 Nature, vol. 227, pp.
680-685) y se cargó en un gel previamente preparado
entre dos cristales (16 cm x 18 cm) de una aparato estándar para
Western blot. Se dejó correr la electroforesis a 45 V durante 16
horas y a temperatura ambiente.
A continuación, el gel se tiñó con Coomassie
Brilliant Blue, con lo cual los marcadores de peso molecular
mostraron la buena resolución de este sistema (Fig. 1B). En el
carril de las CCV, la tinción muestra un amplio abanico de
proteínas con muy distintos pesos moleculares. La posterior
identificación mediante proteómica confirmó la separación en el
mismo gel de proteínas gigantes, como la cadena pesada de la
dineína (DYHC, 527 kDa), proteínas grandes como la cadena pesada de
la clatrina (CHC, 192 kDa), proteínas medianas como la chaperona
Hsc70 (72 kDa) o la sinaptotagmina I (Syt I, 65 kDa), y proteínas
pequeñas como el factor 1 de ribosilación del ADP (ARF1, 20 kDa).
Se conoce que todas ellas están presentes en las CCV (cfr. F.
Blondeau et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.
101, pp. 3833-3838). Estos resultados mostraron la
habilidad del gel de la invención para separar simultáneamente
proteínas desde muy elevado hasta muy bajo peso molecular,
utilizando una electroforesis de una dimensión, que además permite
ahorrar tiempo.
Una aplicación frecuente de la electroforesis de
proteínas SDS-PAGE son los análisis por immunoblot.
Esta aplicación también fue comprobada con el gel de la invención.
Se observó que la polimerización simultánea de ambas partes del gel
(parte inferior y superior) permite una manipulación del gel más
sencilla.
Para la transferencia (western blotting), se usó
un aparato húmedo y un protocolo estándar para Western blot (BioRad
laboratories, Hercules, CA, USA) con un tiempo de transferencia
incrementado hasta 4 horas con 1=400 mA y a 4ºC. Bajo estas
condiciones, los marcadores de peso molecular para proteínas
(7-200 kDa) fueron transferidos completamente. Se
usaron membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) ya que las
de nitrocelulosa resultaron pegarse demasiado a la parte superior
del gel. Además, se observó que con el fin de obtener resultados
reproducibles en el immunoblot, era preferible el uso de dos
membranas de PVDF (una en cada lado del gel) durante la
transferencia. De no ser así, cuando se analizaba la membrana con
anticuerpos se observaba un intenso fondo en la parte de elevado
peso molecular del gel, probablemente debido a impurezas en el
tampón de transferencia. Siguiendo estas indicaciones, proteínas de
todos los tamaños pudieron ser analizadas simultáneamente mediante
immunoblot. A modo de ejemplo de sus aplicaciones y de su
resolución, se usaron diversas proteínas de fusión a GFP de la
proteína gigante llamada HERC1 (532 kDa) (Fig. 2A). Se muestran
entre paréntesis los aminoácidos de la secuencia de HERC1 que
incluyen cada una de las proteínas de fusión.
Se transfectaron plásmidos que expresan las
proteínas de fusión indicados, a células HEK-293
(Fig. 2B, 2C). 48 horas más tarde, se analizaron lisados de estas
células con el gel y se transfirieron a una membrana de PVDF tal y
como se indica previamente. Las proteínas de fusión a GFP se
identificaron mediante incubación con anticuerpos monoclonales
anti-GFP (Roche). Como se muestra en en la Fig. 2B,
se detectaron todas las proteínas de fusión a GFP en la misma
membrana, observándose tal y como se esperaba una disminución en el
grado de expresión de las proteínas de fusión directamente
proporcional a su tamaños. De esta forma, las proteínas de fusión
más pequeñas como la PFG40 fueron detectadas más rápidamente que
proteínas de mayor tamaño como la proteína gigante pFG43, la cual
se pudo detectar claramente con anticuerpos anti HERC1 (Fig.
2C).
A modo de otra aplicación de electroforesis de
proteínas SDS-PAGE, se realizó la
inmunoprecipitación de HERC1 con anticuerpos específicos
anti-HERC1 en lisados de células
HEK-293. HERC1 y sus proteínas asociadas (CHC:
cadena pesada de la clatrina; Hsp 70; CLC: cadena ligera de la
Clatrina) fueron separadas con el gel y transferidas a una membrana
de PVDF. Se analizaron las proteínas usando anticuerpos específicos
(Fig. 2D).
En resumen, todos estos ejemplos destacan la
capacidad del gel para analizar simultáneamente con una elevada
resolución y definición, proteínas con peso molecular muy elevado o
muy pequeño, ampliando las utilidades de la electroforesis en gel
SDS-PAGE.
Claims (15)
1. Gel de poliacrilamida que comprende:
(i) una parte inferior que tiene un gradiente de
concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y
una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del
intervalo de 60:1 a 20:1; y
(ii) una parte superior que tiene una
concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una
proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del
intervalo de 100:1 a 70:1;
donde ambas partes forman una única capa.
2. Gel según la reivindicación 1, donde la parte
inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida
dentro del intervalo de 4% a 18% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 50:1
a 30:1.
3. Gel según la reivindicación 2, donde la parte
inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida
desde el 6% al 15% y una proporción acrilamida:entrecruzador de
40:1.
4. Gel según cualquiera de las reivindicaciones
1-3, donde la parte superior tiene una
concentración de poliacrilamida en el intervalo de 4% a 8% y una
proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del
intervalo de 90:1 a 80:1.
5. Gel según la reivindicación 4, donde la parte
superior tiene una concentración de poliacrilamida del 4% y una
proporción acrilamida:entrecruzador de 80:1.
6. Gel según cualquiera de las reivindicaciones
1-5, donde el entrecruzador es bisacrilamida.
7. Procedimiento para obtener el gel de
poliacrilamida según se define en la reivindicación 1, que
comprende los siguientes pasos:
(a) verter en un generador de gradiente
soluciones que comprenden acrilamida y entrecruzador, adecuadas
para obtener un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro
del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador
seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1;
(b) añadir una segunda solución que comprende
acrilamida y entrecruzador, adecuada para obtener una concentración
de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1
a 70:1; y
(c) dejar polimerizar las soluciones de los
pasos (a) y (b) al mismo tiempo para formar una única capa.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
donde en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de
poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18%, y una proporción
acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 50:1
a 30:1.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
donde en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de
poliacrilamida desde el 6% al 15%, y una proporción
acrilamida:entrecruzador de 40:1.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7-9, donde en el paso (b) la
concentración de poliacrilamida está en el intervalo de 4% a 8%, y
tiene una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro
del intervalo de 90:1 a 80:1.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
donde en el paso (b) la concentración de polacrilamida es 4% y la
proporción acrilamida:entrecruzador de 80:1.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7-11, donde el entrecruzador es
bisacrilamida.
13. Uso del gel de polacrilamida según se define
en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la
separación de proteínas por electroforesis.
14. Uso según la reivindicación 13, para separar
simultáneamente proteínas de muy diferentes tamaños, de 5 kDa a más
de 200 Kda.
15. Kit para llevar a cabo el procedimiento
según se define en cualquiera de las reivindicaciones
7-12, que comprende cantidades apropiadas de
acrilamida, de entrecruzador y de un tampón adecuado.
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|---|---|---|---|
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| ES200602462A ES2294949B1 (es) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | Gel para la separacion de proteinas. |
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| J. MARGOLIS et al., "Improvement of pore gradient electrophoresis by increasing the degree of cross-linking at high acrylamide concentrations", J. Chromatogr., 1975, vol. 106, páginas 204-209, ver página 207. * |
| W. P. CAMPBELL et al., "Electrophoresis of small proteins in highly concentrated and crosslinked polyacrylamide gradient gels", Anal. Biochem., 1983, vol. 129, páginas 31-36, ver páginas 32-33. * |
| Z. KHALKHALI-ELLIS, "{}An improved SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for resolution of peptides in the range of 3.5-200 KDa", Prep. Biochem., 1995, vol. 25, nº 1&2, páginas 1-9. * |
Also Published As
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