JP4278936B2

JP4278936B2 - Microorganism measurement method

Info

Publication number: JP4278936B2
Application number: JP2002252735A
Authority: JP
Inventors: 康雅小田; 圭一井波; 徳晃小枝; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: JP2004089039A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物を迅速に計測するための測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
臨床、食品、環境水質、医薬品等の様々な分野で、微生物の検査が行われている。例えば、食品検査の分野では、食品衛生法に基づく規格基準、衛生規範等で、大腸菌群，大腸菌，黄色ブドウ球菌等の細菌数を検査することが定められている。また、食品製造業者においては、法規制とは別に、自主的衛生管理のために特定微生物の検査を行っている。
【０００３】
従来、これらの検査は、公定法として定められた方法で行われるが、非常に煩雑かつ検査時間が長い（24〜48時間以上）ことから、特定の細菌を選択的に培養できる培地を用いた簡易培養法が一般的に用いられている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌が増殖してコロニーとして肉眼で判別できるようになるまで、24時間程度の時間が必要であり、より短時間で特定の細菌を計測できる方法が強く望まれている。また、コロニーのカウントは手間がかかり労力を要することから，より簡便な方法が望まれている。
【０００４】
一方、これらの方法とは別に、試料を特定の微生物を増殖培養できる液体培地で培養し、微生物の増殖にともなって変化する特性値を測定することによって微生物を計測する方法が開発されている。これらの微生物の増殖を検出する特性値としては、溶存酸素の減少，二酸化炭素の増加によるpH低下（ｐH指示薬の吸光度変化を検出），電気抵抗の変化などが利用されている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌の増殖を特性値の変化として間接的に検出するため、かなりの時間を要する。例えば、溶存酸素の変化を検出するには、初期濃度10⁵個/mlの細菌を検出するために、６〜8時間の培養が必要であると報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、微生物を直接検出することにより、短時間で特定の微生物を検出する計測法を提供することを課題とする。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
本発明の微生物計測方法は、以下の工程で特定の微生物を短時間で検出することを特徴とする。
１）測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程、
２）増殖した微生物を計数する工程、および
３）初期濃度既知の前記微生物を、培養培地、培養温度および増殖時間が前記工程１）と同じ条件で増殖培養して測定された増殖培養後濃度と前記初期濃度との関係に基づき作成された検量線を用いて、増殖後の微生物数から、初期微生物数を推定する工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程とは、微生物を含む試料を、少なくとも測定対象の微生物が増殖可能であり、測定対象外の微生物の増殖を抑制することができる培地と混合して培養する工程である。具体的な方法は、測定対象とする試料，微生物によって異なり、実施の形態は特に限定されるものではない。微生物を選択的に増殖させる方法は、種々の方法が、文献，教科書等で開示されており、容易に入手可能である。例えば、測定対象とする微生物が細菌の場合は、特定の細菌を増殖させる液体培地が知られている。具体例としては、例えば、大腸菌を選択的に増殖させるためには、EC培地を用いて、44.5℃で培養する方法が、食品衛生検査指針に収載されている。大腸菌群を選択的に増殖させるためには、ＬＢ培地，BGLB培地などを用いて３７℃で培養する方法が知られている。腸炎ビブリオを選択的に増殖させるには食塩ポリミキシン培地で37℃で培養する方法が知られている。サルモネラを選択的に増殖させるには、ラパポート培地で37℃で培養する方法が知られている。上記の例はほんの一例に過ぎず、上記以外にも特定の細菌を選択的に増殖させる培地が数多く報告されており、本発明の実施形態は上記に記載した培地例に限定されるものではない。
【０００８】
培養に必要な時間は、測定対象とする細菌、培養条件によって異なるが、例えば、後述するように計数する工程としてフローサイトメータを使用する場合には、試料中の細菌濃度として10²個/ml〜10³個/ml以上が好適である。例えば、大腸菌を好適な培養条件で培養した場合、1個/mlの初期濃度の大腸菌を10³個/ml以上の濃度まで増殖するには、約４〜５時間の培養時間が必要である。
【０００９】
本法では、細菌を直接検出して計数するために、従来法に比べ短時間の培養で細菌を検出する事ができる。理論的には１個から細菌を検出可能であるが、実用的なフローサイトメータでは数μl〜数百μlの試料を測定するために、前述のように試料中の細菌濃度として10²個/ml〜10³個/ml以上の濃度が好適である。
【００１０】
なお、測定対象試料が、食品試料等で固形物・半固形物の場合は、試料１容と生理食塩水等の溶液9容を混合し、ストマッカーで処理し、５０μm程度のフィルターで処理することが好適である。
【００１１】
増殖した微生物を計数する工程とは、前工程で増殖させた微生物を一個一個計数する工程であって、種々の粒子計測装置が利用可能である。使用する粒子計測装置は、約1〜20ミクロン程度の微粒子を計数できる粒子計測装置であれば特に限定されない。本発明に使用できる粒子計測装置としては、例えば、電気抵抗式粒子計測装置、フロー画像解析装置、フローサイトメータが好適に用いられる。試料が飲料水、清涼飲料水等で微生物以外の粒子成分を含まない場合は、電気抵抗式粒子計測装置が好適である。電気抵抗式粒子計測装置は、クールター原理として良く知られる測定原理を用いた粒子計測装置であり、例えば、シスメックス株式会社より販売されているSD-2000，CDA-500などの装置が好適に使用できる。これらの装置では、約１００μm程度のオリフィスの両サイドに電極を置き、微粒子がオリフィスを通過する際に生じる電気抵抗の変化を電気パルスとして検出し、微粒子を計数することができるまた、同時に微粒子の体積を正確に計測することが可能であり、体積の違いによって、微生物と微生物以外の粒子(以下デブリスと称する)を区別して計数することができる。一方、微生物とデブリスの体積が同じ場合は、電気抵抗式粒子計測装置で微生物のみを正確に計数することは困難である。この場合は、何らかの方法で、微生物とデブリスを区別して計数する必要がある。この場合には、シスメックス株式会社より発売されているFPIAシリーズなどのフロー式画像解析装置が好適に使用できる。この装置では、フローセルを流れる粒子画像を撮像し解析することにより、微粒子を計測することができる。本装置では、粒子画像を得ることができるため、微生物とデブリスを容易に弁別可能である。より好適にはフローサイトメータの使用が好適である。フローサイトメータとしては、ベックマン・クールター社より発売されているEPICSシリーズ，ベクトン・ディッキンソン社より発売されているFACSシリーズが良く知られている。本発明の実施はこれらの機種に限定されるものではなく、一般的に定義されているフローサイトメータであれば特に限定されるものではない。本発明のフローサイトメータとは、検出部を流れる粒子にレーザ等の光を照射し、粒子から発生する散乱光、蛍光等の光学的情報から粒子の大きさ、形態、あるいは、粒子が細胞の場合は、核酸量、蛋白量等の情報を計測する装置を言う。
【００１２】
フローサイトメータを用いる場合には、試料中の微生物をあらかじめ、微生物中の核酸（RNA,DNA）あるいは、蛋白、その他微生物の構成物質を特異的に染色する蛍光色素あるいは、蛍光色素を標識した抗体で染色することが好適である。特に核酸を染色する蛍光色素で染色することが好適である。染色に使用する染色液例としては、特開平9-104683，特開2001-258590に記載の試薬を用いた場合、１分以内に細菌を染色することができ、特に好適である。特にRNAを特異的に染色する蛍光色素を用いた場合には、増殖中の微生物は豊富なRNAを有し、強い蛍光を発することからデブリスと微生物の区別がより容易になるというメリットがある。さらに、RNA量は微生物の増殖活性を反映しており、蛍光強度は微生物の増殖活性の指標として使用することができる。染色液は基本的に蛍光色素と緩衝剤を含む水溶液であるが、染色性を改善するためあるいは微粒子の分散を改善するために界面活性剤等の添加物を含んでも良い。また、蛍光色素の安定性が悪い場合には，色素をエチレングリコール等の溶液で保存し、使用時に希釈液と混合して使用することが好適である。
【００１３】
増殖後の微生物数から初期微生物数を推定する工程とは、測定対象とする初期濃度既知の特定微生物を、「測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程」で増殖した後に、「増殖した微生物を計数する工程」で増殖後の微生物濃度を計数し、図１に示す、初期濃度−増殖後濃度の関係をプロットし得られた回帰直線式等を検量線として、初期濃度未知の試料を増殖した後の増殖後濃度から初期濃度を算出する工程を言う。
【００１４】
本発明の実施例を以下に示す。本発明の実施形態は以下の実施例に限定されるものでは無い。
【００１５】
【実施例】
初期濃度10⁰,10¹,10²,10³,10⁴個/mlとなるよう大腸菌をEC培地（日水製薬）に添加し、４時間44.5℃で培養し、大腸菌数を計数した。初期細菌濃度と4時間培養後の細菌数をプロットし、4時間培養後の細菌数から初期細菌濃度を推定するための検量線を作成した（図１）。
【００１６】
大腸菌数の測定は以下の方法を用いた。
▲１▼測定試料調製
一定時間培養後の大腸菌試料50μlに希釈液340μlを添加して希釈後、染色液10μlを添加し、42℃で20秒間インキュベートし測定用試料を調製した。希釈液,染色液の組成は、以下の組成を使用した。
【００１７】
（希釈液）
クエン酸二水塩 21.6ｇ/l
ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド 1g/l
精製水 1.0 l
NaOHでpH2.5に調製した
【００１８】
（染色液）
下記の構造を有する色素 50mg
【００１９】
【化１】

エチレングリコール 1.0 l
【００２０】
▲２▼細菌数測定
633nmの赤色半導体レーザを光源とするフローサイトメータを用いて、▲１▼で作成した試料を測定し、前方散乱光と赤色蛍光(650nm以上)を測定し、前方散乱光-赤色蛍光のスキャッタグラム（図２）を作成し、細菌領域内の粒子を細菌として計数し細菌濃度を求めた。
【００２１】
試料測定例
食品試料１（レタス），食品試料２（鶏ささみ肉）25gを生理食塩水225mlとともにストマック処理したのち、約50μmのフィルターで濾過した試料１ｍｌとEC培地10ｍｌを混合し44.5℃で４時間培養したのち、上記の方法で細菌濃度を計測した。図３に試料１の測定例を示す。
【００２２】
４時間培養後の計測値から図１の検量線を用いて初期細菌濃度を推定した。
【００２３】
対照の測定法として、XM-G寒天培地（日水製薬製）を用いた混釈法で大腸菌濃度を求めた。コロニーの計数は培養２４時間後に行った。
【００２４】
表１に示すように本法と対照法の測定結果は良く一致しており、本法を用いて短時間で細菌濃度が計数可能であることが確認できた。
【００２５】
【表１】

【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、短時間で特定微生物の初期濃度を計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌をEC培地で４時間培養した場合の初期濃度と４時間培養後細菌濃度のプロットして求めた検量線である。
【図２】初期濃度10³/ml試料の4時間培養後のスキャッタグラムである。
【図３】試料１の4時間培養後のスキャッタグラムである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a measurement method for rapidly measuring a specific microorganism.
[0002]
[Prior art]
Microorganisms are examined in various fields such as clinical, food, environmental water quality, and pharmaceuticals. For example, in the field of food inspection, it is stipulated that the number of bacteria such as Escherichia coli, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc. is inspected according to standards and hygiene standards based on the Food Sanitation Law. In addition to food regulations, food manufacturers inspect specific microorganisms for voluntary hygiene management.
[0003]
Conventionally, these tests are performed by a method defined as an official method. However, since the test is very complicated and the test time is long (24 to 48 hours or more), a medium capable of selectively culturing specific bacteria is used. A simple culture method is generally used. However, even when these methods are used, it takes about 24 hours for the bacteria to grow and be identified as colonies by the naked eye, and a method that can measure specific bacteria in a shorter time is strongly desired. It is rare. In addition, since counting colonies is time consuming and labor intensive, a simpler method is desired.
[0004]
On the other hand, apart from these methods, a method for measuring microorganisms by culturing a sample in a liquid medium capable of growing and culturing specific microorganisms and measuring characteristic values that change with the growth of the microorganisms has been developed. As characteristic values for detecting the growth of these microorganisms, a decrease in dissolved oxygen, a decrease in pH due to an increase in carbon dioxide (detection of change in absorbance of pH indicator), a change in electrical resistance, and the like are used. However, even when these methods are used, considerable time is required to indirectly detect bacterial growth as a change in the characteristic value. For example, in order to detect changes in dissolved oxygen, it has been reported that culturing for 6 to 8 hours is required to detect bacteria with an initial concentration of 10 ⁵ cells / ml.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a measurement method for detecting a specific microorganism in a short time by directly detecting the microorganism.
[0006]
[Means for solving problems]
The microorganism measuring method of the present invention is characterized by detecting a specific microorganism in a short time in the following steps.
1) a step of selectively growing microorganisms to be measured,
2) a step of counting the grown microorganisms, and 3) a post-growth culture concentration measured by growing the above-mentioned microorganisms having a known initial concentration under the same conditions as in step 1). A step of estimating the initial number of microorganisms from the number of microorganisms after growth, using a calibration curve created based on the relationship with the initial concentration .
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The step of selectively proliferating a microorganism to be measured is a culture in which a sample containing microorganisms is mixed with a medium in which at least the microorganism to be measured can be grown and the growth of microorganisms not to be measured can be suppressed. It is a process to do. The specific method differs depending on the sample and microorganism to be measured, and the embodiment is not particularly limited. Various methods for selectively growing microorganisms are disclosed in literatures, textbooks, and the like, and are easily available. For example, when the microorganism to be measured is a bacterium, a liquid medium for growing a specific bacterium is known. As a specific example, for example, in order to selectively proliferate E. coli, a method of culturing at 44.5 ° C. using EC medium is listed in the food hygiene inspection guidelines. In order to selectively proliferate the coliform group, a method of culturing at 37 ° C. using LB medium, BGLB medium or the like is known. A method of culturing Vibrio parahaemolyticus selectively at 37 ° C. in a saline polymyxin medium is known. In order to selectively grow Salmonella, a method of culturing at 37 ° C. in a Lapaport medium is known. The above example is only an example, and many other media for selectively growing a specific bacterium have been reported in addition to the above, and embodiments of the present invention are not limited to the media examples described above. .
[0008]
The time required for cultivation, the bacteria to be measured, varies depending culture conditions, for example, when using a flow cytometer as a step of counting, as will be described later, 10 ² cells / ml Bacterial concentration in the sample 10 or ³ cells / ml are preferred. For example, when E. coli is cultured under suitable culture conditions, a culture time of about 4 to 5 hours is required to grow E. coli having an initial concentration of 1 cell / ml to a concentration of 10 ³ cells / ml or more.
[0009]
In this method, since bacteria are directly detected and counted, the bacteria can be detected in a shorter period of culture than in the conventional method. Theoretically, bacteria can be detected from one, but in order to measure a sample of several μl to several hundred μl with a practical flow cytometer, as described above, the concentration of bacteria in the sample is 10 ² / ml to 10 ³ cells / ml or more concentrations it is preferred.
[0010]
When the sample to be measured is a food sample or the like, which is a solid or semi-solid, mix 1 volume of the sample and 9 volumes of a solution such as physiological saline, treat with a stomacher, and process with a filter of about 50 μm. Is preferred.
[0011]
The step of counting the grown microorganisms is a step of counting the microorganisms grown in the previous step one by one, and various particle measuring devices can be used. The particle measuring device to be used is not particularly limited as long as it is a particle measuring device capable of counting fine particles of about 1 to 20 microns. As the particle measuring apparatus that can be used in the present invention, for example, an electric resistance particle measuring apparatus, a flow image analyzing apparatus, and a flow cytometer are preferably used. When the sample is drinking water, soft drink or the like and does not contain particle components other than microorganisms, an electric resistance particle measuring device is suitable. The electric resistance type particle measuring device is a particle measuring device using a measurement principle well known as a Coulter principle, and for example, devices such as SD-2000 and CDA-500 sold by Sysmex Corporation can be suitably used. . In these devices, electrodes are placed on both sides of an orifice of about 100 μm, the change in electrical resistance generated when the fine particles pass through the orifice can be detected as electric pulses, and the fine particles can be counted. The volume can be accurately measured, and the microorganisms and particles other than the microorganisms (hereinafter referred to as debris) can be distinguished and counted depending on the volume difference. On the other hand, when the volume of the microorganism and the debris is the same, it is difficult to accurately count only the microorganism with the electric resistance particle measuring device. In this case, it is necessary to distinguish and count microorganisms and debris by some method. In this case, a flow image analysis apparatus such as the FPIA series sold by Sysmex Corporation can be suitably used. In this apparatus, fine particles can be measured by capturing and analyzing a particle image flowing through the flow cell. In this apparatus, since a particle image can be obtained, microorganisms and debris can be easily distinguished. More preferably, a flow cytometer is used. As the flow cytometer, the EPICS series released by Beckman Coulter and the FACS series released by Becton Dickinson are well known. Implementation of the present invention is not limited to these models, and is not particularly limited as long as it is a generally defined flow cytometer. The flow cytometer of the present invention irradiates the particles flowing through the detection unit with light such as a laser, and the size, form, or particle size of the cells is determined from optical information such as scattered light and fluorescence generated from the particles. In this case, it refers to an apparatus that measures information such as the amount of nucleic acid and the amount of protein.
[0012]
In the case of using a flow cytometer, the microorganism in the sample is preliminarily stained with nucleic acid (RNA, DNA) or protein in the microorganism, or a fluorescent dye that specifically stains other microbial constituents, or an antibody labeled with the fluorescent dye. It is preferable to dye with. It is particularly preferable to stain with a fluorescent dye that stains nucleic acids. As an example of a staining solution used for staining, when the reagents described in JP-A-9-104683 and JP-A-2001-258590 are used, bacteria can be stained within 1 minute, which is particularly preferable. In particular, when a fluorescent dye that specifically stains RNA is used, the growing microorganism has abundant RNA and emits strong fluorescence, which makes it easier to distinguish between debris and microorganism. Furthermore, the RNA amount reflects the growth activity of the microorganism, and the fluorescence intensity can be used as an indicator of the growth activity of the microorganism. The staining solution is basically an aqueous solution containing a fluorescent dye and a buffer, but may contain an additive such as a surfactant in order to improve the dyeability or improve the dispersion of the fine particles. In addition, when the stability of the fluorescent dye is poor, it is preferable to store the dye in a solution such as ethylene glycol and mix it with a diluent at the time of use.
[0013]
The step of estimating the initial number of microorganisms from the number of microorganisms after growth means that a specific microorganism whose initial concentration is known to be measured is grown in the “step of selectively growing the microorganism to be measured” and then “the grown microorganisms” In the step of counting, the microorganism concentration after growth is counted, and a sample of unknown initial concentration is grown using the regression line equation obtained by plotting the relationship between the initial concentration and the concentration after growth shown in FIG. The initial concentration is calculated from the post-growth concentration.
[0014]
Examples of the present invention are shown below. The embodiments of the present invention are not limited to the following examples.
[0015]
【Example】
It was added to the initial concentration of 10 ^0, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ cells / ml and so as Escherichia coli EC medium (Nissui Seiyaku), were cultured in 4 hours 44.5 ° C., and counted the number of E. coli. The initial bacterial concentration and the number of bacteria after 4 hours of culture were plotted, and a calibration curve was prepared for estimating the initial bacterial concentration from the number of bacteria after 4 hours of culture (FIG. 1).
[0016]
The following method was used to measure the number of E. coli.
(1) Preparation of measurement sample A dilution sample of 340 μl was added to 50 μl of the E. coli sample after incubation for a certain period of time, diluted, 10 μl of staining solution was added, and incubated at 42 ° C. for 20 seconds to prepare a measurement sample. The following composition was used for the composition of the diluted solution and the staining solution.
[0017]
(Diluted solution)
Citric acid dihydrate 21.6g / l
Myristyltrimethylammonium bromide 1g / l
Purified water 1.0 l
Adjusted to pH 2.5 with NaOH
(Staining solution)
Dye having the following structure 50mg
[0019]
[Chemical 1]

Ethylene glycol 1.0 l
[0020]
(2) Bacterial count measurement
Using a flow cytometer that uses a 633 nm red semiconductor laser as the light source, measure the sample prepared in (1), measure the forward scattered light and red fluorescence (650 nm or more), and then the forward scattered light-red fluorescence scattergram. (FIG. 2) was prepared, and particles in the bacterial region were counted as bacteria to determine the bacterial concentration.
[0021]
Sample measurement sample Food sample 1 (lettuce), food sample 2 (chicken fillet meat) 25g with 225ml of physiological saline, and then mixed with 1ml of sample filtered through a 50μm filter and 10ml of EC medium for 4 hours at 44.5 ° C After culturing, the bacterial concentration was measured by the above method. FIG. 3 shows a measurement example of Sample 1.
[0022]
The initial bacterial concentration was estimated from the measured values after 4 hours of culture using the calibration curve of FIG.
[0023]
As a control measurement method, the E. coli concentration was determined by the pour method using XM-G agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical). Colonies were counted after 24 hours of culture.
[0024]
As shown in Table 1, the measurement results of this method and the control method were in good agreement, and it was confirmed that the bacterial concentration could be counted in a short time using this method.
[0025]
[Table 1]

[0026]
【The invention's effect】
According to the present invention, the initial concentration of a specific microorganism can be measured in a short time.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a calibration curve obtained by plotting the initial concentration in the case of culturing Escherichia coli in EC medium for 4 hours and the bacterial concentration after culturing for 4 hours.
FIG. 2 is a scattergram after a 4-hour culture of an initial concentration of 10 ³ / ml sample.
FIG. 3 is a scattergram after incubation of sample 1 for 4 hours.

Claims

1) a step of selectively growing microorganisms to be measured,
2) a step of counting the grown microorganisms, and 3) a post-growth culture concentration measured by growing the above-mentioned microorganisms having a known initial concentration under the same conditions as in step 1). A microorganism measuring method comprising a step of estimating the initial number of microorganisms from the number of microorganisms after growth, using a calibration curve created based on the relationship between the initial concentrations .

The microorganism measuring method according to claim 1, wherein the microorganism to be measured is a bacterium, and the step of selectively growing is a step of culturing in a medium for selectively growing the bacterium.

2. The microorganism measurement according to claim 1, wherein the step of counting microorganisms is a step of counting microorganisms with at least one device selected from the group consisting of a flow cytometer, a flow type image analysis device, and an electric resistance type particle count analysis device. Method.

4. The method of measuring microorganisms according to claim 3, wherein the step of counting microorganisms is a step of counting microorganisms with a flow cytometer including a step of staining a material containing microorganisms grown before counting with a fluorescent dye having nucleic acid specificity.