JP4251600B2 - 核酸固定化方法及び固定化核酸 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上に核酸を固定化する核酸固定化方法及びその核酸固定化方法によって作製される固定化核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
固体表面等の基板上に核酸分子を固定化、すなわち結合させることは、種々の分野において周知の課題である。例えば、基板上に核酸分子を結合させることは、以下の文献[1]等にも記載されているように、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップ等の核酸に基づくナノエレクトロニクスといった、核酸に基づくナノテクノロジの開発にとって非常に重要である。
[1] Storhoff,J.J., Mirkin,C.A. (1999) Chem.Rev. ,99, 1849−1862“Programmed Materials Synthesis with DNA”
【０００３】
また、例えば以下の文献[2]及び文献[3]に記載されているように、医学や生物学の分野においても、核酸の特性決定或いは核酸工学に際して、基板や膜上に核酸分子を固定化する必要がある。
[2] Allison,D.P., Bottomley,L.A., Thundat,T., Brown,G.M., Woychik,R.P., Schrick,J.J., Jacobson,K.B. and Warmack,R.J. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 2110129-10133“Immobilization of DNA for scanning probe microscopy”
[3] Bezanilla,M., Manne,S., Laney,D.E., Lyubchenko,Y.L. and Hansma,H.G. (1995) Langmuir, 11, 655-659“Absorption of DNA to mica, silylated mica and minerals：characterization by atomic force microscopy”
【０００４】
さらに、米国特許第5523392号及び米国特許第5503816号に記載されているように、核酸溶液を精製する際にも、基板に核酸分子を結合させることがある。
【０００５】
このような固体表面に核酸を結合させる課題は、従来、種々の方法によって解決されてきた。このうち最も一般的な方法は、化学処理によって基板表面を改質することである。具体的には、例えば以下の文献[4]に記載されているように、基板表面にシラン処理を施すことによって、核酸分子と結合するビニル基を基板表面に導入する。
[4] Bensimon,D., Simon,A.J., Croquette,V., Bensimon,A. (1995) Physical Review Letters 74, 23, 4754-4757“Stretching DNA with a Receding Meniscus: Experiments and Models”
【０００６】
また、以下の文献[5]乃至文献[8]等に記載されているように、カウンターイオン法を用いて雲母基板上に核酸を結合させる方法も知られている。この方法は、例えばＭｇ２＋のような２価の陽イオンを用いて、核酸を雲母基板状に結合させるものである。すなわち、カウンターイオンが負に帯電した核酸主鎖に結合し、そのカウンターイオンを介して、核酸が負に帯電した雲母表面に結合する。
[5] Ye,Ｊ.Ｙ., Umemura,K., Ishikawa,M., Kuroda,R. (2000) Analytical Biochemistry 281, 21-25“Atomic Force Microscopy of DNA Molecules Stretched by Spin-Coating Technique”
[6] Dunlap,D.D., Maggi,A., Soria,M.R., Monaco,L. (1997) Nucl.Acid Res. 25, 3095“Nanoscopic Structure of DNA Condensed for Gene Delivery”
[7] Lyubchenko,Y.L., Shlyakhtenko,L.S. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 496“Direct Visualization of Supercoiled DNA in situ with Atomic Force Microscopy”
[8] Yokota,H., Sunwoo,J., Snikaya,M., van den Engh,G., Aebersold,R. (1999)“Spin-Stretching of DNA and Protein Molecules for Detection by Fluorescence and Atomic Force Microscopy”
【０００７】
また、ｐＨ値を化学的に制御することによって、種々の基板表面における固定化の程度を調整することが、例えば以下の文献[9]等に記載されている。
[9] Allemand,J.F., Bensimon,D., Julien,L., Bensimon,A., Croquette,V. (1997) Biophysical Journal, 73, 2064-2070“pH-Dependent Binding and Combing
of DNA”
【０００８】
また、以下の文献[10]等には、Ｎａ３ＰＯ４水溶液でサファイア表面を処理することにより、表面を親水性化することについて記載されている。すなわち、湿潤処理後に表面が親水性となるため、核酸分子を基板表面に容易に結合させることができる。なお、別の方法では、チオール基を末端基とする核酸が金表面及び電極に特異的に結合、すなわち化学吸着することを利用している。
[10] Yoshida,K., Yoshimoto,M., Sasaki,K., Ohnishi,T., Ushiki,T., Hitomik,J., Yamamoto,S., Sigeno,M. (1998) Biophysical Journal, 74, 1654-1657“Fabrication of a New Substrate for Atomic Force Microscopic Observation of DNA Molecules from an Ultrasmooth Sapphire Plate”
【０００９】
また、他の電気分野において、以下の文献[11]等には、核酸がアルミニウム電極に対して共有結合類似の強い結合を示すことについて報告されている。
[11] Washizu,M., Kurosawa,O., Arai,I., Suzuki,S., Shimamoto,N. (1995) IEEE Trans. Industr. Appl., 31, 3, 447−456“Applications of Electostatic Stretch-and-Positioning of DNA”
【００１０】
また、酸素プラズマ処理は、酸化によって表面から有機不純物を除去する手法としてよく知られており、この際、ＯＨ基が生成される。また、米国特許第5055316号には、酸素プラズマによってタンパク質が基板表面に強固に結合することについて記載されている。さらに、米国特許第5876753号には、プラズマ処理を用いて基板表面の分子を改変することについて記載されている。さらにまた、米国特許第5369012号には、原子状酸素又はヒドロキシルラジカルを用いて細胞又は抗体を結合するために親水性又は疎水性表面をもつ膜を形成する方法について記載されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上述したように、現在までのところ種々の核酸固定化方法が提案されてきているが、それらの方法は、基板を改質するために湿潤化学的処理を用いるものが殆どである。
【００１２】
したがって、上述した従来の方法では、高価な化学成分を使用する必要があり、また、基板上に核酸分子を再現可能且つ永久的に固定化することができないという問題があった。
【００１３】
また、この湿潤化学的処理では、使用し得る基板材料の種類が限定されるという問題があった。
【００１４】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、基板の湿潤化学的処理を行うことなく基板上に核酸分子を固定化する核酸固定化方法、及びその核酸固定化方法によって作製される固定化核酸を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る核酸固定化方法は、基板上に核酸分子を固定化する核酸固定化方法であって、上記基板が単結晶表面またはアモルファス表面であり、上記基板を原子状酸素プラズマで処理する工程と、上記基板のプラズマ処理工程の後に湿潤化学的処理を行うことなく、上記基板上へ直接上記核酸を固定化する工程とを有することを特徴としている。
【００１６】
このような核酸固定化方法では、基板を原子状酸素プラズマで処理することにより基板状に核酸の結合部位が形成され、この結合部位に核酸が固定化される。また、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間を変えることにより、固定化の程度を制御することができる。
【００１７】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る固定化核酸は、本発明に係る核酸固定化方法によって作製されることを特徴としている。
【００１８】
このような固定化核酸は、原子状酸素プラズマで処理された基板状に核酸が結合したものであり、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間によって固定化の程度が異なる。また、この固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップを含むナノエレクトロニクスを含む核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態は、基板を原子状酸素プラズマで処理することによって、核酸を基板状に固定化、すなわち結合させる核酸固定化方法、及びその核酸固定化方法によって作製された固定化核酸について説明するものである。
【００２０】
ここで、本実施の形態における核酸は、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ（ペプチド核酸），ＣＮＡ（アミノシクロヘキシルエタン酸核酸），ＨＮＡ（ヘキシトール核酸），ｐ−ＲＮＡ（ピラノシルＲＮＡ），オリゴヌクレオチド，ＤＮＡのオリゴヌクレオチド，ＲＮＡのオリゴヌクレオチド，プライマ，Ａ−ＤＮＡ，Ｂ−ＤＮＡ，Ｚ−ＤＮＡ，ＤＮＡのポリヌクレオチド，ＲＮＡのポリヌクレオチド，核酸のＴジャンクション，非核酸ポリマのドメインと核酸とのブロックコポリマ及びそれらの組み合わせから選択することができる。ブロックコポリマに用いる非核酸ポリマとして適しているのは、ポリペプチド、セルロース等の糖鎖、或いはプラスチック等の合成ポリマがあるが、その他、当業者にとって一般的なものを用いることができる。また、核酸は、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００２１】
さらに、核酸は、例えば官能基で置換するといった変更が加えられた、若しくは何も変更が加えられていない天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。
【００２２】
また、本実施の形態における基板の表面材料は、酸化ケイ素，ガラス，酸化アルミニウム，サファイア，ＳｒＴｉＯ３，ＬａＡｌＯ３，ＮｄＧａＯ３及びＺｒＯ２及びそれらの誘導体等の灰チタン石，及びドープ処理された及び／又は安定化されたそれらの誘導体から選択することができる。ここで、安定剤としては、例えばイットリウムが用いられる。また、基板は、単結晶表面であってもアモルファス表面であってもよい。
【００２３】
以下具体的な実施例について説明するが、この実施例では、核酸の一例としてウシ胸腺由来のｃｔ−ＤＮＡ分子（Sigma社製）を用いて説明する。また、基板としては、サファイア、シリコン若しくはガラスを用い、プラズマプロセッサとしては、PlasmaPrep5（Gala Instruments社製）を用いる。
【００２４】
本実施の形態における核酸固定化方法は、大別して以下の４つのステップにより構成される。
【００２５】
（ステップ１）
ステップ１では、基板表面をアセトン及びプロパノールで洗浄し、圧縮空気又は窒素ガスで乾燥させる。
【００２６】
（ステップ２）
ステップ２では、基板を真空容器内に入れて排気し、所望の酸素圧力ｐｏ２が得られるまで容器内に酸素ガスを充填する。なお、所望の酸素圧力とは、０．１乃至１．０ｍｂａｒ、好ましくは０．２乃至０．８ｍｂａｒである。
【００２７】
（ステップ３）
ステップ３では、ステップ２で得られた酸素圧力ｐｏ２で酸素プラズマを発生させる。これにより基板表面に核酸の結合部位が形成される。なお、このプラズマ処理の持続時間は、基板材料に依存するが、一般に、処理時間が短すぎると核酸の固定化効果が弱くなり、反対に処理時間が長すぎると、試料が加熱されて核酸の固定化効果が低減するため、０．１分間乃至１０分間であることが好ましい。なお、実際に核酸分子（この例ではＤＮＡ）を有効に結合する最少密度を得るのに必要な時間は、数秒程度である。
【００２８】
ここで、以下の表１に、サファイア、シリコン及びガラスについての、酸素圧力及びプラズマ処理時間のパラメータを示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
（ステップ４）
ステップ４では、Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]（ＨＥＰＥＳ）バッファ（Sigma社製）中にＤＮＡを１〜２滴入れたＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液によって基板表面全体を被覆する。なお、実際に用いられたＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液は、波長２５８ｎｍ、光路長１ｃｍにおけるＯＤ（Optical Density）値が０．０９３であった。
【００３１】
数秒間乃至５分間、好ましくは１分間乃至２分間の処理時間の後、基板を１０００乃至５０００ｒｐｍの回転率で回転させ、ＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液の液体成分を除去して乾燥させる。その後、基板表面は、ＨＥＰＥＳ溶液中の塩成分を除去するために数滴の脱イオン水で洗浄される。
【００３２】
以上のようにして処理した基板表面について、原子間力顕微鏡（AFM:Atomic Force Microscopy）（Digital Instruments社製。NanoScope IIIaモデル）を用いて観察する。
【００３３】
先ず、上述のステップ４のみ適用して処理したサファイア基板表面のＡＦＭ像を図１に示す。図１に示すように、基板表面には、高濃度のコイル状ＤＮＡ分子が確認されるが、これらは有効に固定化されてない。そのため、このＤＮＡ分子は、水で洗浄することによって容易に除去される。
【００３４】
また、図１に示すように、数分子が伸長されているのみであり、殆どの分子が伸長せずにコイル状となっていることから、基板にＤＮＡ分子が有効に結合していないことが分かる。
【００３５】
次に、上述した表１に示すパラメータを用いてステップ１からステップ４まで実施して処理したサファイア基板表面のＡＦＭ像を図２に示す。図２に示すように、十分に伸張したＤＮＡ分子が確認される。このＤＮＡ分子は、コイル状となっておらず、また、水で洗浄しても容易に除去できないことから、ＤＮＡ分子が基板表面に強く結合していることが分かる。
【００３６】
以上と同様に、シリコン基板表面及びガラス基板表面についてもＡＦＭ像が観察された。以下では、シリコン基板表面についての結果のみ説明する。
【００３７】
先ず、上述のステップ４のみ適用して処理したシリコン基板表面のＡＦＭ像を図３に示す。図３に示すように、図１と同様の状態が観察され、基板にＤＮＡ分子が有効に固定化されていないことが分かる。
【００３８】
次に、上述の表１に示すパラメータを用いてステップ１からステップ４まで実施して処理したシリコン基板表面のＡＦＭ像を図４に示す。図４に示すように、ＤＮＡが有効に固定化されていることが確認され、この結果は、上述したサファイア基板の例とも一致するものである。
【００３９】
ここで、プラズマの処理時間ｔ及び酸素圧力ｐｏ２を変えた場合における核酸の固定化傾向について、図５に概略的に示す。
【００４０】
ここで図５において、ＤＮＡ分子は、領域Ａ及び領域Ｃでは基板表面に殆ど結合せず、領域Ｂでは基板表面に有効に結合する。
【００４１】
図５から分かるように、基板上に核酸を有効に固定化するためには、最短処理時間ｔｍｉｎがある。この最短処理時間ｔｍｉｎ以下では、核酸は、有効に基板上に固定化されない。さらに、この最短処理時間ｔｍｉｎ以上であっても、酸素圧力が高すぎるか低すぎる場合には、ＤＮＡ分子は、有効に固定化されない。
【００４２】
つまり、領域Ｂで示すように、ＤＮＡが有効に固定化される中間範囲が存在し、この範囲内では、処理時間及び酸素圧力に従って結合の強さが増大する。
【００４３】
この点について、図６及び図７を用いて説明する。なお、何れの場合もＤＮＡは、シリコン基板に固定化される。
【００４４】
短時間／低圧状態（ｐｏ２＝０．４ｍｂａｒ、ｔ＝４分）で処理した場合における、基板表面のＤＮＡのＡＦＭ像を図６に示す。また、長時間／高圧状態（ｐｏ２＝０．８ｍｂａｒ、ｔ＝８分）で処理した場合における、基板表面のＤＮＡのＡＦＭ像を図７に示す。
【００４５】
図７では、図６と比較して単位面積当り１層多いＤＮＡ分子が得られており、また、ＤＮＡ分子があまり伸張されずにジグザク形態に結合している。これにより、図７では高い結合エネルギが得られ、ＤＮＡが一層有効に固定化される。
【００４６】
なお、図６及び図７におけるパラメータは、５０Ｈｚの周波数で３３ワットの高電圧電力に相当する。このパラメータは、時間／電力／費用対効果を考慮して最適に設定したものである。このパラメータは、種々の値を設定することができ、処理時間を短縮するために比較的高い電力を用いることもできる。
【００４７】
以上説明したように、本実施の形態における核酸固定化方法では、原子状酸素プラズマを用いることによって、種々の固体表面に対して、核酸分子を長期間安定に結合することができる。また、処理時間及び酸素圧力といったパラメータを調整することによって、核酸分子の固定化の程度を制御することができる。
【００４８】
なお、固定化の程度は、表面に有効に固定化された核酸の濃度及び結合部位の密度によって評価することができる。ここで、濃度及び結合部位の密度は、ＡＦＭ像を観察することによって評価できる。さらに、固定化の程度は、基板表面における核酸分子の形態に基づいて評価することもできる。
【００４９】
また、本実施の形態における核酸固定化方法は、安価であり、核酸を固定化する前に基板表面を化学処理する必要がないため、化学性廃棄物が発生することもない。
【００５０】
また、この核酸固定化方法によって作製された固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップ等のナノエレクトロニクスといった核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【００５１】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００５２】
例えば、上述した説明では、マイクロ波によって酸素プラズマを発生させ、これにより原子状酸素を発生させるものとして説明したが、これに限定されるものではなく、高電圧若しくはＵＶ光放出源によって酸素プラズマを発生させるようにしても構わない。また、その際、酸素のみではなく、酸素を含むガス混合物を用いるようにしても構わない。なお、酸素に添加するガスとしては、希ガスが好ましい。このように希ガスを加えることによって、圧力を略々一定に保つことができ、また、同時に基板を洗浄することができる。
【００５３】
また、レーザ光を用いることにより、原子状酸素プラズマを発生させるために必要なエネルギを数ナノ秒という短時間で得ることも可能である。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明に係る核酸固定化方法は、基板上に核酸を固定化する核酸固定化方法であって、当該固定化前に上記基板を原子状酸素プラズマで処理することを特徴としている。
【００５５】
このような核酸固定化方法によれば、基板を原子状酸素プラズマで処理することにより基板状に核酸の結合部位が形成され、この結合部位に核酸が固定化される。また、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間を変えることにより、固定化の程度を制御することができる。
【００５６】
また、本発明に係る固定化核酸は、本発明に係る核酸固定化方法によって作製されることを特徴としている。
【００５７】
このような固定化核酸は、原子状酸素プラズマで処理された基板状に核酸が結合したものであり、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間によって固定化の程度が異なる。また、この固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップを含むナノエレクトロニクスを含む核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】未処理のサファイア表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図２】原子状酸素プラズマで処理したサファイア表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図３】未処理のシリコン表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図４】原子状酸素プラズマで処理したシリコン表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図５】酸素圧力及び処理時間を変化させた場合におけるＤＮＡの固定化効果を概略説明する図である。
【図６】低酸素圧力且つ短時間処理でシリコン上に固定化したＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図７】高酸素圧力且つ長時間処理でシリコン上に固定化したＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上に核酸を固定化する核酸固定化方法及びその核酸固定化方法によって作製される固定化核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
固体表面等の基板上に核酸分子を固定化、すなわち結合させることは、種々の分野において周知の課題である。例えば、基板上に核酸分子を結合させることは、以下の文献[1]等にも記載されているように、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップ等の核酸に基づくナノエレクトロニクスといった、核酸に基づくナノテクノロジの開発にとって非常に重要である。
[1] Storhoff,J.J., Mirkin,C.A. (1999) Chem.Rev. ,99, 1849−1862“Programmed Materials Synthesis with DNA”
【０００３】
また、例えば以下の文献[2]及び文献[3]に記載されているように、医学や生物学の分野においても、核酸の特性決定或いは核酸工学に際して、基板や膜上に核酸分子を固定化する必要がある。
[2] Allison,D.P., Bottomley,L.A., Thundat,T., Brown,G.M., Woychik,R.P., Schrick,J.J., Jacobson,K.B. and Warmack,R.J. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 2110129-10133“Immobilization of DNA for scanning probe microscopy”
[3] Bezanilla,M., Manne,S., Laney,D.E., Lyubchenko,Y.L. and Hansma,H.G. (1995) Langmuir, 11, 655-659“Absorption of DNA to mica, silylated mica and minerals：characterization by atomic force microscopy”
【０００４】
さらに、米国特許第5523392号及び米国特許第5503816号に記載されているように、核酸溶液を精製する際にも、基板に核酸分子を結合させることがある。
【０００５】
このような固体表面に核酸を結合させる課題は、従来、種々の方法によって解決されてきた。このうち最も一般的な方法は、化学処理によって基板表面を改質することである。具体的には、例えば以下の文献[4]に記載されているように、基板表面にシラン処理を施すことによって、核酸分子と結合するビニル基を基板表面に導入する。
[4] Bensimon,D., Simon,A.J., Croquette,V., Bensimon,A. (1995) Physical Review Letters 74, 23, 4754-4757“Stretching DNA with a Receding Meniscus: Experiments and Models”
【０００６】
また、以下の文献[5]乃至文献[8]等に記載されているように、カウンターイオン法を用いて雲母基板上に核酸を結合させる方法も知られている。この方法は、例えばＭｇ２＋のような２価の陽イオンを用いて、核酸を雲母基板状に結合させるものである。すなわち、カウンターイオンが負に帯電した核酸主鎖に結合し、そのカウンターイオンを介して、核酸が負に帯電した雲母表面に結合する。
[5] Ye,Ｊ.Ｙ., Umemura,K., Ishikawa,M., Kuroda,R. (2000) Analytical Biochemistry 281, 21-25“Atomic Force Microscopy of DNA Molecules Stretched by Spin-Coating Technique”
[6] Dunlap,D.D., Maggi,A., Soria,M.R., Monaco,L. (1997) Nucl.Acid Res. 25, 3095“Nanoscopic Structure of DNA Condensed for Gene Delivery”
[7] Lyubchenko,Y.L., Shlyakhtenko,L.S. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 496“Direct Visualization of Supercoiled DNA in situ with Atomic Force Microscopy”
[8] Yokota,H., Sunwoo,J., Snikaya,M., van den Engh,G., Aebersold,R. (1999)“Spin-Stretching of DNA and Protein Molecules for Detection by Fluorescence and Atomic Force Microscopy”
【０００７】
また、ｐＨ値を化学的に制御することによって、種々の基板表面における固定化の程度を調整することが、例えば以下の文献[9]等に記載されている。
[9] Allemand,J.F., Bensimon,D., Julien,L., Bensimon,A., Croquette,V. (1997) Biophysical Journal, 73, 2064-2070“pH-Dependent Binding and Combing
of DNA”
【０００８】
また、以下の文献[10]等には、Ｎａ３ＰＯ４水溶液でサファイア表面を処理することにより、表面を親水性化することについて記載されている。すなわち、湿潤処理後に表面が親水性となるため、核酸分子を基板表面に容易に結合させることができる。なお、別の方法では、チオール基を末端基とする核酸が金表面及び電極に特異的に結合、すなわち化学吸着することを利用している。
[10] Yoshida,K., Yoshimoto,M., Sasaki,K., Ohnishi,T., Ushiki,T., Hitomik,J., Yamamoto,S., Sigeno,M. (1998) Biophysical Journal, 74, 1654-1657“Fabrication of a New Substrate for Atomic Force Microscopic Observation of DNA Molecules from an Ultrasmooth Sapphire Plate”
【０００９】
また、他の電気分野において、以下の文献[11]等には、核酸がアルミニウム電極に対して共有結合類似の強い結合を示すことについて報告されている。
[11] Washizu,M., Kurosawa,O., Arai,I., Suzuki,S., Shimamoto,N. (1995) IEEE Trans. Industr. Appl., 31, 3, 447−456“Applications of Electostatic Stretch-and-Positioning of DNA”
【００１０】
また、酸素プラズマ処理は、酸化によって表面から有機不純物を除去する手法としてよく知られており、この際、ＯＨ基が生成される。また、米国特許第5055316号には、酸素プラズマによってタンパク質が基板表面に強固に結合することについて記載されている。さらに、米国特許第5876753号には、プラズマ処理を用いて基板表面の分子を改変することについて記載されている。さらにまた、米国特許第5369012号には、原子状酸素又はヒドロキシルラジカルを用いて細胞又は抗体を結合するために親水性又は疎水性表面をもつ膜を形成する方法について記載されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上述したように、現在までのところ種々の核酸固定化方法が提案されてきているが、それらの方法は、基板を改質するために湿潤化学的処理を用いるものが殆どである。
【００１２】
したがって、上述した従来の方法では、高価な化学成分を使用する必要があり、また、基板上に核酸分子を再現可能且つ永久的に固定化することができないという問題があった。
【００１３】
また、この湿潤化学的処理では、使用し得る基板材料の種類が限定されるという問題があった。
【００１４】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、基板の湿潤化学的処理を行うことなく基板上に核酸分子を固定化する核酸固定化方法、及びその核酸固定化方法によって作製される固定化核酸を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る核酸固定化方法は、基板上に核酸分子を固定化する核酸固定化方法であって、上記基板が単結晶表面またはアモルファス表面であり、上記基板を原子状酸素プラズマで処理する工程と、上記基板のプラズマ処理工程の後に湿潤化学的処理を行うことなく、上記基板上へ直接上記核酸を固定化する工程とを有することを特徴としている。
【００１６】
このような核酸固定化方法では、基板を原子状酸素プラズマで処理することにより基板状に核酸の結合部位が形成され、この結合部位に核酸が固定化される。また、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間を変えることにより、固定化の程度を制御することができる。
【００１７】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る固定化核酸は、本発明に係る核酸固定化方法によって作製されることを特徴としている。
【００１８】
このような固定化核酸は、原子状酸素プラズマで処理された基板状に核酸が結合したものであり、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間によって固定化の程度が異なる。また、この固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップを含むナノエレクトロニクスを含む核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態は、基板を原子状酸素プラズマで処理することによって、核酸を基板状に固定化、すなわち結合させる核酸固定化方法、及びその核酸固定化方法によって作製された固定化核酸について説明するものである。
【００２０】
ここで、本実施の形態における核酸は、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ（ペプチド核酸），ＣＮＡ（アミノシクロヘキシルエタン酸核酸），ＨＮＡ（ヘキシトール核酸），ｐ−ＲＮＡ（ピラノシルＲＮＡ），オリゴヌクレオチド，ＤＮＡのオリゴヌクレオチド，ＲＮＡのオリゴヌクレオチド，プライマ，Ａ−ＤＮＡ，Ｂ−ＤＮＡ，Ｚ−ＤＮＡ，ＤＮＡのポリヌクレオチド，ＲＮＡのポリヌクレオチド，核酸のＴジャンクション，非核酸ポリマのドメインと核酸とのブロックコポリマ及びそれらの組み合わせから選択することができる。ブロックコポリマに用いる非核酸ポリマとして適しているのは、ポリペプチド、セルロース等の糖鎖、或いはプラスチック等の合成ポリマがあるが、その他、当業者にとって一般的なものを用いることができる。また、核酸は、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００２１】
さらに、核酸は、例えば官能基で置換するといった変更が加えられた、若しくは何も変更が加えられていない天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。
【００２２】
また、本実施の形態における基板の表面材料は、酸化ケイ素，ガラス，酸化アルミニウム，サファイア，ＳｒＴｉＯ３，ＬａＡｌＯ３，ＮｄＧａＯ３及びＺｒＯ２及びそれらの誘導体等の灰チタン石，及びドープ処理された及び／又は安定化されたそれらの誘導体から選択することができる。ここで、安定剤としては、例えばイットリウムが用いられる。また、基板は、単結晶表面であってもアモルファス表面であってもよい。
【００２３】
以下具体的な実施例について説明するが、この実施例では、核酸の一例としてウシ胸腺由来のｃｔ−ＤＮＡ分子（Sigma社製）を用いて説明する。また、基板としては、サファイア、シリコン若しくはガラスを用い、プラズマプロセッサとしては、PlasmaPrep5（Gala Instruments社製）を用いる。
【００２４】
本実施の形態における核酸固定化方法は、大別して以下の４つのステップにより構成される。
【００２５】
（ステップ１）
ステップ１では、基板表面をアセトン及びプロパノールで洗浄し、圧縮空気又は窒素ガスで乾燥させる。
【００２６】
（ステップ２）
ステップ２では、基板を真空容器内に入れて排気し、所望の酸素圧力ｐｏ２が得られるまで容器内に酸素ガスを充填する。なお、所望の酸素圧力とは、０．１乃至１．０ｍｂａｒ、好ましくは０．２乃至０．８ｍｂａｒである。
【００２７】
（ステップ３）
ステップ３では、ステップ２で得られた酸素圧力ｐｏ２で酸素プラズマを発生させる。これにより基板表面に核酸の結合部位が形成される。なお、このプラズマ処理の持続時間は、基板材料に依存するが、一般に、処理時間が短すぎると核酸の固定化効果が弱くなり、反対に処理時間が長すぎると、試料が加熱されて核酸の固定化効果が低減するため、０．１分間乃至１０分間であることが好ましい。なお、実際に核酸分子（この例ではＤＮＡ）を有効に結合する最少密度を得るのに必要な時間は、数秒程度である。
【００２８】
ここで、以下の表１に、サファイア、シリコン及びガラスについての、酸素圧力及びプラズマ処理時間のパラメータを示す。
【００２９】
【表１】
（ステップ４）
ステップ４では、Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]（ＨＥＰＥＳ）バッファ（Sigma社製）中にＤＮＡを１〜２滴入れたＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液によって基板表面全体を被覆する。なお、実際に用いられたＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液は、波長２５８ｎｍ、光路長１ｃｍにおけるＯＤ（Optical Density）値が０．０９３であった。
【００３１】
数秒間乃至５分間、好ましくは１分間乃至２分間の処理時間の後、基板を１０００乃至５０００ｒｐｍの回転率で回転させ、ＤＮＡ／ＨＥＰＥＳ溶液の液体成分を除去して乾燥させる。その後、基板表面は、ＨＥＰＥＳ溶液中の塩成分を除去するために数滴の脱イオン水で洗浄される。
【００３２】
以上のようにして処理した基板表面について、原子間力顕微鏡（AFM:Atomic Force Microscopy）（Digital Instruments社製。NanoScope IIIaモデル）を用いて観察する。
【００３３】
先ず、上述のステップ４のみ適用して処理したサファイア基板表面のＡＦＭ像を図１に示す。図１に示すように、基板表面には、高濃度のコイル状ＤＮＡ分子が確認されるが、これらは有効に固定化されてない。そのため、このＤＮＡ分子は、水で洗浄することによって容易に除去される。
【００３４】
また、図１に示すように、数分子が伸長されているのみであり、殆どの分子が伸長せずにコイル状となっていることから、基板にＤＮＡ分子が有効に結合していないことが分かる。
【００３５】
次に、上述した表１に示すパラメータを用いてステップ１からステップ４まで実施して処理したサファイア基板表面のＡＦＭ像を図２に示す。図２に示すように、十分に伸張したＤＮＡ分子が確認される。このＤＮＡ分子は、コイル状となっておらず、また、水で洗浄しても容易に除去できないことから、ＤＮＡ分子が基板表面に強く結合していることが分かる。
【００３６】
以上と同様に、シリコン基板表面及びガラス基板表面についてもＡＦＭ像が観察された。以下では、シリコン基板表面についての結果のみ説明する。
【００３７】
先ず、上述のステップ４のみ適用して処理したシリコン基板表面のＡＦＭ像を図３に示す。図３に示すように、図１と同様の状態が観察され、基板にＤＮＡ分子が有効に固定化されていないことが分かる。
【００３８】
次に、上述の表１に示すパラメータを用いてステップ１からステップ４まで実施して処理したシリコン基板表面のＡＦＭ像を図４に示す。図４に示すように、ＤＮＡが有効に固定化されていることが確認され、この結果は、上述したサファイア基板の例とも一致するものである。
【００３９】
ここで、プラズマの処理時間ｔ及び酸素圧力ｐｏ２を変えた場合における核酸の固定化傾向について、図５に概略的に示す。
【００４０】
ここで図５において、ＤＮＡ分子は、領域Ａ及び領域Ｃでは基板表面に殆ど結合せず、領域Ｂでは基板表面に有効に結合する。
【００４１】
図５から分かるように、基板上に核酸を有効に固定化するためには、最短処理時間ｔｍｉｎがある。この最短処理時間ｔｍｉｎ以下では、核酸は、有効に基板上に固定化されない。さらに、この最短処理時間ｔｍｉｎ以上であっても、酸素圧力が高すぎるか低すぎる場合には、ＤＮＡ分子は、有効に固定化されない。
【００４２】
つまり、領域Ｂで示すように、ＤＮＡが有効に固定化される中間範囲が存在し、この範囲内では、処理時間及び酸素圧力に従って結合の強さが増大する。
【００４３】
この点について、図６及び図７を用いて説明する。なお、何れの場合もＤＮＡは、シリコン基板に固定化される。
【００４４】
短時間／低圧状態（ｐｏ２＝０．４ｍｂａｒ、ｔ＝４分）で処理した場合における、基板表面のＤＮＡのＡＦＭ像を図６に示す。また、長時間／高圧状態（ｐｏ２＝０．８ｍｂａｒ、ｔ＝８分）で処理した場合における、基板表面のＤＮＡのＡＦＭ像を図７に示す。
【００４５】
図７では、図６と比較して単位面積当り１層多いＤＮＡ分子が得られており、また、ＤＮＡ分子があまり伸張されずにジグザク形態に結合している。これにより、図７では高い結合エネルギが得られ、ＤＮＡが一層有効に固定化される。
【００４６】
なお、図６及び図７におけるパラメータは、５０Ｈｚの周波数で３３ワットの高電圧電力に相当する。このパラメータは、時間／電力／費用対効果を考慮して最適に設定したものである。このパラメータは、種々の値を設定することができ、処理時間を短縮するために比較的高い電力を用いることもできる。
【００４７】
以上説明したように、本実施の形態における核酸固定化方法では、原子状酸素プラズマを用いることによって、種々の固体表面に対して、核酸分子を長期間安定に結合することができる。また、処理時間及び酸素圧力といったパラメータを調整することによって、核酸分子の固定化の程度を制御することができる。
【００４８】
なお、固定化の程度は、表面に有効に固定化された核酸の濃度及び結合部位の密度によって評価することができる。ここで、濃度及び結合部位の密度は、ＡＦＭ像を観察することによって評価できる。さらに、固定化の程度は、基板表面における核酸分子の形態に基づいて評価することもできる。
【００４９】
また、本実施の形態における核酸固定化方法は、安価であり、核酸を固定化する前に基板表面を化学処理する必要がないため、化学性廃棄物が発生することもない。
【００５０】
また、この核酸固定化方法によって作製された固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップ等のナノエレクトロニクスといった核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【００５１】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００５２】
例えば、上述した説明では、マイクロ波によって酸素プラズマを発生させ、これにより原子状酸素を発生させるものとして説明したが、これに限定されるものではなく、高電圧若しくはＵＶ光放出源によって酸素プラズマを発生させるようにしても構わない。また、その際、酸素のみではなく、酸素を含むガス混合物を用いるようにしても構わない。なお、酸素に添加するガスとしては、希ガスが好ましい。このように希ガスを加えることによって、圧力を略々一定に保つことができ、また、同時に基板を洗浄することができる。
【００５３】
また、レーザ光を用いることにより、原子状酸素プラズマを発生させるために必要なエネルギを数ナノ秒という短時間で得ることも可能である。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明に係る核酸固定化方法は、基板上に核酸を固定化する核酸固定化方法であって、当該固定化前に上記基板を原子状酸素プラズマで処理することを特徴としている。
【００５５】
このような核酸固定化方法によれば、基板を原子状酸素プラズマで処理することにより基板状に核酸の結合部位が形成され、この結合部位に核酸が固定化される。また、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間を変えることにより、固定化の程度を制御することができる。
【００５６】
また、本発明に係る固定化核酸は、本発明に係る核酸固定化方法によって作製されることを特徴としている。
【００５７】
このような固定化核酸は、原子状酸素プラズマで処理された基板状に核酸が結合したものであり、プラズマ処理の際の酸素圧力及び処理時間によって固定化の程度が異なる。また、この固定化核酸は、微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップを含むナノエレクトロニクスを含む核酸に基づくナノテクノロジに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】未処理のサファイア表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図２】原子状酸素プラズマで処理したサファイア表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図３】未処理のシリコン表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図４】原子状酸素プラズマで処理したシリコン表面におけるＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図５】酸素圧力及び処理時間を変化させた場合におけるＤＮＡの固定化効果を概略説明する図である。
【図６】低酸素圧力且つ短時間処理でシリコン上に固定化したＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
【図７】高酸素圧力且つ長時間処理でシリコン上に固定化したＤＮＡのＡＦＭ像を説明する図である。
Claims (12)
- 基板上に核酸を固定化する核酸固定化方法であって、
上記基板が単結晶表面またはアモルファス表面であり、
上記基板を原子状酸素プラズマで処理する工程と、
上記基板のプラズマ処理工程の後に湿潤化学的処理を行うことなく、上記基板上へ直接上記核酸を固定化する工程と
を有することを特徴とする核酸固定化方法。 - 上記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ｐ−ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡのオリゴヌクレオチド、ＲＮＡのオリゴヌクレオチド、プライマ、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、ＤＮＡのポリヌクレオチド、ＲＮＡのポリヌクレオチド、核酸のＴジャンクション、非核酸ポリマのドメインと核酸とのブロックコポリマ及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化方法。
- 上記核酸は、２本鎖又は１本鎖であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の核酸固定化方法。
- 上記核酸は、官能基で置換することを含む変更が加えられた、若しくは何も変更されていない天然のもの、又は人工的に合成されたものであることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 上記表面の材料が、酸化ケイ素、ガラス、酸化アルミニウム、サファイア、ＳｒＴｉＯ３、ＬａＡｌＯ３、ＮｄＧａＯ３及びＺｒＯ２及びそれらの誘導体を含む灰チタン石、並びにドープ処理された及び／又は安定化されたそれらの誘導体のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化方法。
- 酸素又は酸素を含むガス混合物にマイクロ波を照射し、生成した酸素プラズマによって原子状酸素を発生させることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 酸素又は酸素を含むガス混合物に高電圧を加え、及び／又はＵＶ光を照射し、生成した酸素プラズマによって原子状酸素を発生させることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 上記基板が、０．１分間乃至１０分間、原子状酸素プラズマで処理されることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 上記原子状酸素プラズマによる処理が、０．１乃至１．０ミリバール、好ましくは０．２乃至０．８ミリバールの酸素圧力を用いて実施されることを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 上記核酸が水溶液中に存在することを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の核酸固定化方法。
- 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の核酸固定化方法によって作製されることを特徴とする固定化核酸。
- 微細ワイヤ、バイオセンサ及びチップを含むナノエレクトロニクスを含む核酸に基づくナノテクノロジに用いられることを特徴とする請求項１１記載の固定化核酸。
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