JP4248583B2 - sFRPおよびsFRPと相互作用するペプチドモチーフならびにそれらの使用法 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年1月10日に出願された米国特許仮出願第60/260,908号の恩典を主張するものであり、これは本明細書に参照として組入れられている。
本開示は、破骨細胞分化、特に分泌されたフリッツルド(Frizzled)関連タンパク質ファミリーメンバーに結合することが可能である、ペプチドモチーフおよびそのモチーフを含むタンパク質に関する。
骨再構築、成人ヒト骨格の継続的再生に寄与する過程は、各々骨髄の造血前駆体および間葉系前駆体を起源とする2種の特定化された細胞種である、破骨細胞および骨芽細胞により実行される。破骨細胞または骨芽細胞の増加したまたは減少した生成および/またはそれらのアポトーシス速度の変化は、いくつかの全身性または局所的な骨疾患の基礎をなす骨の吸収と形成との間の不均衡に大きく寄与するので、これらの細胞の継続的かつ規則的な供給は、骨格の恒常性にとって必須である。
本明細書において開示されるのは、分泌されたフリッツルド関連タンパク質-1(-sFRP-1)に結合するタンパク質である。ある態様において、sFRP-1結合ペプチドは、精製されたペプチドである。具体的例において、このペプチドは、下記からなる群より選択される:(a)配列番号:9に示されるアミノ酸配列;(b)(a)に示されるアミノ酸配列の少なくとも1種の保存的アミノ酸置換;および、(c)(a)に示される配列と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列であり、ここでこのタンパク質は、sFRPに結合する能力を保持している。別の態様において、このペプチドは、下記式に示した配列を有する:
[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]y
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり;R3は、Val(V)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換の群より選択され;R4は、Asp(D)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R5は、Gly(G)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R6は、Arg(R)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R7は、Trp(W)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択される。)。これらのペプチドをコードしている核酸が、これらの核酸を含むベクターおよびこれらのベクターで形質転換された宿主細胞と同様に提供される。これらのペプチドおよびsFRPの相互作用をを妨害する物質またはそれを模倣する物質のスクリーニングの方法もまた開示される。
添付された配列表に列記された核酸配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に関する標準の文字略号、およびアミノ酸に関する3文字表記を用いて示されている。各核酸配列の1本鎖のみを示しているが、相補鎖は、示された鎖を参照することによりそこに含まれると理解される。
配列番号:2は、ヒトsFRP-1オープンリーディングフレームの核酸配列を示す。
配列番号:3は、ヒトsFRP-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号:4は、ヒトsFRP-1-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:5は、ヒトsFRP-Δ1-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:6は、ヒトsFRP-Δ2-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:7は、ヒトsFRP-Δ3-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:8は、ヒトsFRP-ΔCRD-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:9は、ペプチドモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号:10は、ANP受容体A(ヒト)由来のペプチドモチーフを示す。
配列番号:11は、A-E4ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:12は、A-F7ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:13は、sFRP-1のネトリン相同ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号:14は、A-C2ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:15〜26は、アラニンスキャニング実験において使用するために生成したペプチドを示す。
配列番号:27は、B-B9のアミノ酸配列を示す。
配列番号:28は、配列番号:9のアミノ酸配列に類似した配列を含むRANKLにおいて認められたアミノ酸配列を示す。
配列番号:29は、配列番号:9のアミノ酸配列に類似した配列を含むネトリン受容体において認められたアミノ酸配列を示す。
配列番号:30〜39は、様々な霊長類の核酸配列ならびにPCRおよびハイブリダイゼーション実験に使用したプライマーおよびプローブを示す。
配列番号:40は、A-D9ペプチドのアミノ酸配列を示す。
I.略号
BSA:ウシ血清アルブミン
CRD:システインリッチドメイン
ELISA:酵素結合免疫吸着アッセイ法
HSPG:ヘパリン硫酸プロテオグリカン
mAb:モノクローナル抗体
MDCK:マディンダービー(Madin-Darby)イヌ腎臓
M/H:Myc-Hisエピトープタグ
PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
sFRP:分泌されたフリッツルド関連タンパク質
Wnt:Wntタンパク質
特に記さない限りは、技術用語は従来の用途に従い使用する。分子生物学の一般的用語の定義は、Benjamin Lewinの「Genes V」(Oxford University Press社出版、1994年(ISBN 0-19-854287-9));Kendrewら(編集)の「The Encyclopedia of Molecular Biology」(Blackwell Science社出版、1994年(ISBN 0-632-02182-9));および、Robert A. Meyers(編集)の「Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference」(VCH Publishers社出版、1995年(ISBN 1-56081-569-8))で調べることができる。
本明細書に開示されるように、ペプチドモチーフは、sFRP-1(配列番号:3)に結合し、sFRP-1の破骨細胞形成をダウンレギュレーションする能力を阻害することが明らかにされている。ある態様において、このペプチドモチーフは、下記式を有する:
[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]y
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり;R1、R2、R8、およびR9は任意のアミノ酸残基であり;R3は、Val(V)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R4は、Asp(D)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R5は、Gly(G)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R6は、Arg(R)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;R7は、Trp(W)、Ala(A)、またはそれらの保存的置換からなる群より選択され;および、ここでペプチドは、sFRPに結合する能力を保持している。)。
sFRP断片およびそれらの変異体は、以下に説明しるように、sFRPをコードしているベクターでトランスフェクションしたMDCK細胞(ATCC番号CCL-34)から精製することができる。sFRP断片およびそれらの変異体は、従来の生化学的技術を用い組織給源から精製することも、または当技術分野において周知の方法(例えば、Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」コールドスプリングハーバー、NY、1989に説明されたようなもの)を用い原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて組換えにより作出することもできる。sFRP断片の組換え発現は、Urenら(J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))に記されている。更に、sFRPファミリーメンバーをコードしている核酸配列は、GenBankにおいて入手可能であり、配列番号:1に示されたcDNA配列を含む。
sFRPに結合するペプチドモチーフを用い、破骨細胞分化を増強することができる。破骨細胞は、能動的に骨を吸収する巨大な多核細胞であり、造血幹細胞に由来し、循環血中単球および組織マクロファージと表現型の特徴を共有している。これらは、血液から骨表面へ補充された循環血中単核細胞の集団から形成され、骨表面で分化および融合を受け多核化された細胞を形成する。
本明細書に説明されたsFRP結合ペプチドは、例えば、免疫系を阻害(または抑制)する状態(臨床治療を含む)のような、免疫系に関連する状態または疾患の治療に有効である。免疫調節化合物の治療的用途に関する一般的情報は周知であり、例えば米国特許第5,632,983号;第5,726,156号;および、第5,861,483号に開示されている。
ペプチドモチーフがsFRP-1/RANKL結合に影響を及ぼすことに加え、このペプチドモチーフを含有する組成物(例えば、配列番号:9に示されたペプチドを含有する組成物)も、sFRP-1の他のタンパク質との相互作用を破壊する点で有用性がある。例えば、ANP受容体Aに結合するsFRP-1は、腎臓および眼においてナトリウムおよび液体の放出を調節することができる。ナトリウム利尿ペプチドシステムの関連成分は、ヒト眼において機能的に発現され、そこで眼圧のモジュレーターとして利用されると考えられることが明らかにされている(J. OrtegoおよびM. Coca-Prados、Biochem. Biophys. Res. Commun.、258:21-28(1999))。眼において、sFRP-1またはその結合ペプチドは、結果として生じる眼圧の変化による液体の眼への放出において重要な影響を有し得る。ひとつの態様において、配列番号:9を含むポリペプチドのような、sFRPに結合するペプチドモチーフを含むポリペプチドは、眼圧を低下させるために対象に投与される。ある具体的な限定的でない例において、sFRPに結合するペプチドモチーフを含むポリペプチドは、緑内障を有する対象において眼圧を低下させるために投与される(JohnsonおよびR.C. Tschuniper、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.、28:945-953(1987)参照)。このペプチドは、眼内投与することができる(例えば、徐放型眼内インプラントにおいて)。あるいは、このポリペプチドは、前眼房において房水の生成を阻害するのに十分な治療有効量を、全身投与することができる。
sFRPに結合するペプチドモチーフを、模倣物のような、sFRPまたはその断片と結合する、さもなければ直接相互作用するようなタンパク質および他の化合物を同定するためのスクリーニングにおいて使用することができる。これらのタンパク質は、RANKL、TRAIL、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、およびNGFのようなタンパク質のTNFファミリーのメンバーを含む。ある態様において、細胞溶解液または組織ホモジネートは、sFRP/TNFまたはsFRP/ペプチドモチーフ結合を破壊するタンパク質または他の化合物についてスクリーニングすることができる。あるいは、天然および/または合成の両方の様々な外来性化合物のいずれか(例えば、小分子またはペプチドのライブラリー)を、sFRP/TNFまたはsFRP/ペプチドモチーフ結合を破壊する能力(例えば、配列番号:9に示した配列を有するペプチドのTNFまたはRANKLとの結合を破壊する能力)についてスクリーニングすることができる。この状況において、小分子が特に好ましく、その理由はこれらが、経口投与後に比較的容易に吸収され、抗原決定基である可能性がより小さく、および/または核酸もしくはタンパク質のような比較的大きい分子よりもはるかに容易に血液脳関門を通過するからである。
動物に投与するために、精製されたsFRP、sFRP断片、sFRP変異体、またはsFRPに結合するペプチドモチーフは、一般に薬学的に許容される担体と組合わせられる。薬学的調製物は、単独のペプチドのみを含有することができ、または複数の様々なsFRP断片および/もしくはペプチドモチーフで構成することができる。一般に担体の性質は、使用される投与の具体的様式に依存すると考えられる。例えば非経口処方は、賦形剤として、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール、ヒトアルブミンなどのような、薬学的または生理学的に許容される液体を含む注射用液体を含有する。固形組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形状)については、従来の無毒の固形担体を含むことができ、例えば医薬等級のマンニトール、乳糖、スターチ、またはステアリン酸マグネシウムを含む。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加え、少量の無毒の助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤などの、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含むことができる。
sFRP-1に結合するポリペプチドは、オープン末端法(open-ended approach)を用いて同定した。この方法は、組換えsFRP-1に結合した配列に関するペプチドファージディスプレイcDNAライブラリーのスクリーニングに関連している(Urenら、J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))。ファージディスプレイにより同定されたペプチドは、アルカリホスファターゼをコードしている配列に機能的に連結され、sFRP-1への結合時に検出され得る融合タンパク質を作出している。この方法論は、配列L/V-D-G-R-W-L/V(配列番号:9)を含むプレドミナントペプチドモチーフの同定を生じた。次にアラニンスキャンニングを用い、このペプチドモチーフ(配列番号:9および配列番号:14〜26)を更に特徴決定した。
材料および方法
1. 材料
組換えヒトsFRP-1は、Urenら(J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))により記載されたように調製した。マウスsFRP-2のコード配列を、給源として胚性マウスの腎臓からの総RNAを用い、RT-PCRにより増幅し、pcDNA3.1発現ベクターにサブクローニングし、MDCK細胞へトランスフェクションし、sFRP-1について本質的にUrenら(J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))の説明のようにこの組換えタンパク質をヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ウサギポリクローナル抗血清を組換えヒトsFRP-1に対して生じさせるために、精製されたタンパク質〜10μgをフロイントの完全アジュバントと共に鼠径部のリンパ節に注射し、引き続きフロイントの不完全アジュバントに溶解した同等量の抗原を2〜3週間の間隔で筋肉内に注射した。数回の追加免疫後、血清から免疫グロブリン分画を、プロテインG結合したSepharose(Pharmacia Biotech社、ウプスラ、スウェーデン)を用いたクロマトグラフィーにより得た。
MDCK細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC))を、10%ウシ胎児血清(Colorado Serum社、デンバー、CO)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(Life Technologies社、ロックビル、MD)において、5%CO2中、37℃で増殖した。
sFRP-1結合ペプチドセグメントをその表面に含むファージの単離を、本質的に先に説明されたように行った(Sparksら、ファージディスプレイしたランダムペプチドライブラリーのスクリーニング、「Phage Display Peptides and Proteins」、BK Kayら編集、Academic Press社、NY、227-253、1996年)。簡単に述べると、96ウェルELISAプレート(Costar社#3590、ポリスチレン表面)の1個のウェルを、精製された組換えsFRP-1(1μg/50μl)と共に1時間インキュベーションした。ELISAプレートによるこれおよび全ての他の操作は、室温で行った。引き続き、1%BSA150μlをウェルに添加し、2時間インキュベーションした。PBS/0.1%Tween20で3回洗浄した後、M13ランダム12merファージディスプレイライブラリーからの2.5x1010ファージを、予め被覆したウェルに添加し、3.5時間インキュベーションした。PBS/0.1%Tween20で1回洗浄した後、ウェルを、0.05Mグリシン(pH2)50μlと共に10分間インキュベーションし、その表面からファージを放出した。このファージ懸濁液を、ウェルから吸引し、0.2 Mリン酸ナトリウム(pH7.4)50μlで中和し、DH5aF'IQ細菌ブロス中で6〜8時間増幅した。
各ファージ単離体由来のM13遺伝子IIIコートタンパク質に連結したペプチドセグメントをコードしているDNA挿入配列を、隣接するベクター配列に対応する配列決定プライマーを用いて決定した。GenBankデータベースのアドバンストBLAST検索解析を行い、このペプチドファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって同定されたペプチド配列の一部に一致する配列を含むタンパク質を同定した。
対象とするペプチドをコードしている合成オリゴヌクレオチドを、SalIおよびXhoIで消化した細菌アルカリホスファターゼ融合ベクターpMY101にライゲーションした(YamabhaiおよびKay、Anal Biochem.、247:143-151(1997))。全ての組換え体を、DNA配列解析により確認した。このペプチド/AP構築体で形質転換した細菌(大腸菌株DH5αF')を、アンピシリン(50μg/mL)を含有するLuriaブロスにおいて光学濃度0.5(600nm)まで増殖させ、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドで処理し、その後37℃で一晩インキュベーションした。ペプチド/APキメラを含有する馴化培地を、7000gで15分間の遠心により回収した。馴化培地中のキメラタンパク質は、4℃で数週間、または-80℃で貯蔵した場合は数ヶ月間、安定していた。
ELISA実験を、試験されるsFRP結合のパートナーに応じて変更したが、全般的には先に説明されたように行った(Urenら、J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))。典型的には、ウェルを、0.5μlまたは1μgのsFRP-1で被覆し、BSA(0.2%、1%、または4%)で遮断し、その後推定される結合パートナーと共に一晩室温でインキュベーションした。ペプチド/APキメラの結合を調べる場合は、細菌ブロスの吸引後、ウェルを洗浄およびp-ニトロフェノールリン酸(pNPP)と共にインキュベーションした。ELISAリーダーにより、発色を405nmで決定した。競合実験のために、可溶性ペプチドを、ペプチド/APキメラと共に細菌ブロス中で室温で30分間プレインキュベーションし、その後sFRP-1またはBSAで被覆したELISAウェルへ移した。sFRP-1へのRANKL結合を試験する場合は、可溶性RANKLの連続希釈を、複数回アッセイした。一晩室温でインキュベーションした後、RANKL溶液を吸引し、結合したRANKLを、RANKLに対する一次抗体、APおよびpNPPに結合した二次抗体との逐次インキュベーションにより検出した。他のTNFαファミリーメンバーがsFRPへの結合について試験される場合、およびsFRP-1誘導体またはsFRP-2がRANKLについて結合標的である場合は、同様の実験計画を用いた。
ITC実験は、VP-ITC MicroCalorimeter (MicroCal, LLC社、ノースハンプトン、MA)により、製造業者の使用説明書に従い行った。簡単に述べると、A-C2(200μM、PBS中に溶解)の6μlアリコートを、sFRP-1(10μM、同じくPBS中に溶解)を含むチャンバーへ等間隔で注入した。A-C2およびsFRP-1の結合から生じたチャンバーの温度上昇を、結合反応により発生した熱の測定値として決定した。エンタルピーおよび解離定数を含むいくつかのパラメータを、これらの測定値から算出した。この技術は、通常タンパク質とペプチドとの間の結合相互作用の熱力学的特性を定量するために使用される。例えば、McNemarらの論文(Biochemistry、36:10006-10014(1997))を参照のこと。
細胞の総RNAを、細胞株またはマウス組織から、グアニジンチオシアネートフェノールクロロホルムを用いて抽出し、本質的に次に説明されたように、逆転写PCR(RT-PCR)に使用した(Southbyら、Endocrinology、137:1349-1357(1996)およびTraianedesら、J. Biol. Chem.、270:20891-20894(1995))。ddPCRは、総RNA 1μgを逆転写した以外は、本質的に次に説明されたように行った(Liangら、Science、257:967-971(1992)およびTraianedesら、J. Biol. Chem.、270:20891-20894(1995))。PCR産物を、pCRScriptII(Stratagene社、ラホヤ、CA)またはpGEM-T(Promega社、マディソン、WI)にクローニングした。DNA配列解析を、T7配列決定キット(Pharmacia Biotech社、ウプスラ、スウェーデン)を用いて行った。オリゴヌクレオチドを、Oligo 1000M DNA Synthesizer(Beckman Instruments社、フラートン、CA、米国)において合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下のものであった:ddPCRについて、DDMR-2 (5'-CTTGATTGCC-3';配列番号:37)およびT12VA(5-TTTTTTTTTTTT[A,C,G]A;配列番号:32-3')。
細胞株または組織から単離した総RNAを、オリゴdTで逆転写し、プライマーsfrp-1a
およびsfrp-1b
を用いて22サイクルでPCRを行い、これは骨芽細胞給源由来のsFRP-1転写産物の増幅の長い直線相内にあることがわかった。増幅は、製造業者の指示に従い行った。得られたPCR産物を電気泳動し、ナイロン膜に移し、α32P標識した内部検出オリゴヌクレオチドsfrp-1c
でハイブリダイズした。gapdh-2
ヌクレオチド640〜659位;Tsoら、Nucl. Acids Res.、13:2485-2502(1985))、およびgapdh-4を用いて、標準化(normalizing)遺伝子、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを、20サイクルのPCRで増幅し、産物をSudaら(J. Cell. Physiol.、166:94-104(1996))の記載するようにα32P標識したgapdh-1で検出した。
マウスのsFRP-1リボプローブを、tsJ2細胞由来のRNAを用いるPCRにより作製した。得られた750bpの断片を、pGEM-T(Promega社、マジソン、WI、米国)にクローニングした。このプラスミドは線状であり、T7またはSP6 RNAポリメラーゼにより転写され、アンチセンスまたはセンスリボプローブを作出した。このリボプローブを、RNA標識キット(Boehringer Mannheim, Mannheim GmbH、独国)を製造業者の指示に従い用い、RNA転写の間にジゴキシゲニン(DIG)で標識した。インサイチュハイブリダイゼーションを、先に記したように行った(Kartsogiannisら、Bone、21:385-392(1997))。
A. 共培養システム
骨芽細胞を、新生仔マウスの頭蓋冠から、0.1%コラゲナーゼ(Worthington Biochemical社、フリーフォールド、オーストラリア)および0.2%ジスパーゼ(合同酒精株式会社、東京、日本)による消化により調製した。骨髄細胞および脾細胞を、各々、成体および新生仔マウスから入手した(Udagawaら、J. Exp. Med.、182:1461-1468(1995))。骨芽細胞は、先に説明されたように(Udagawaら、J. Exp. Med.、182:1461-1468(1995))、骨髄細胞または脾細胞と共に共培養した。簡単に述べると、初代骨芽細胞(2x104/ウェル)および有核の脾細胞(1x106/ウェル)または骨髄細胞(5x105/ウェル)を、48ウェルプレート(Corning Glass社、コーニング、NY)において、10%ウシ胎児血清(Cytosystems社、キャッスルヒル、NSW、オーストラリア)を含有するα-MEM(GIBCO/BRL、グランドアイランド、NY)0.4mLと共に、被験化学物質の存在下で共培養した。培養物を、4つ組でインキュベーションし、3日目に細胞を新鮮な培地に補充した。破骨細胞形成は、6〜7日間の培養後に評価した。接着細胞を、固定および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)で染色し、TRAP陽性の破骨細胞の数を、Udagawaらの説明のようにスコアリングした(J. Exp. Med.、182:1461-1468(1995))。TRAP染色のために、接着細胞は、PBS中の4%ホルムアルデヒドで3分間固定した。エタノール-アセトン(50/50、容量/容量)による1分間の処理後、このウェル表面を風乾し、50mM酒石酸ナトウムの存在下で、反応生成物の基質として0.01%ナフトールAS-MXリン酸(Sigma社)および染色剤として0.03%レッドバイオレットLB塩(Sigma社)を含有する酢酸緩衝液(0.1M酢酸ナトリウム、pH5.0)中で10分間室温でインキュベーションした。TRAP陽性細胞は、暗赤色を現し、3個またはそれ以上の核を伴うものを多核化されたものとしてスコアリングし、破骨細胞とみなした。破骨細胞形成の確証は、カルシトニン受容体(CTR)発現および骨吸収の特異的マーカーを用いて実現した。CTR発現は、125I-サケカルシトニンによるオートラジオグラフィー、またはQuinnら(Bone、25:1-8(1999))の説明するような本発明者らが開発した抗体のアレイを使用する免疫組織化学的局在のいずれかにより決定した。
一部の場合において、実験は、成体マウス脾細胞、またはQuinnら(Endocrinology、139:4424-4427(1998))により説明されたようにM-CSFおよびRANKLで処理したRAW264.7細胞のいずれかにおいて行った。指摘したように、これらのアッセイ法は、脾T細胞の存在または非存在下で行った。T細胞分画を、Horwoodら(Journal of Clinical Investigation、101:595-603(1998))により説明されたように調製した。
sFRP-1に結合するペプチドの同定
sFRP-1に結合するペプチド配列を同定するために、M13ファージの遺伝子IIIコートタンパク質に連結した12個のアミノ酸残基セグメントの多様なレパートリーを含む、ライブラリー由来の〜25x109個のファージをスクリーニングした。sFRP-1と共にプレインキュベーションしたELISAウェルに結合したファージの3回の連続するパンニングの後、sFRP-1に結合するその能力について選択したファージ調製物を力価決定し、その後細菌叢上に播種した。溶解した細菌の200個の個別のコロニーに由来したファージを採取し、細菌ブロス中で一晩増殖させ、上清を回収し、ELISAにおいてBSAに対してsFRP-1が優先的に結合するそれらの能力について試験した。BSA被覆したウェルよりも、少なくとも5倍を超える効率でsFRP-1被覆したウェルに結合したファージに、ヌクレオチド配列分析を施し、この結合特異性に寄与するペプチド配列の同一性を決定した。
と称されるペプチドファージディスプレイ分析により同定された第二の最も頻繁に認められる配列について行った。
sFRP-1ペプチドモチーフ結合活性の確認
ペプチドモチーフ(配列番号:10、11、および27)を含むペプチドアルカリホスファターゼ融合タンパク質のセットを作出した。これらの融合タンパク質を、ELISA様式でsFRP-1(配列番号:3)への特異的結合について試験した。図1に図示したように、A-C2(配列番号:14)/アルカリホスファターゼ融合タンパク質の複数の単離体からのブロスは全て、sFRP-1と共にプレインキュベーションしたウェルに対する強力で高度に特異的な結合を示した。同様の結果が、A-E4(配列番号:11)/アルカリホスファターゼ融合タンパク質について得られた。しかしB-B9(配列番号:27)/アルカリホスファターゼ融合タンパク質は、sFRP-1に対する特異的結合を示さなかった。このA-C2(配列番号:14)、A-E4(配列番号:11)、およびB-B9(配列番号:27)誘導体の間の定量的差異は、各ファージのELISAスクリーニングの間に認められた定量的差異に一致した。A-C2-(配列番号:14)およびA-E4-(配列番号:11)を発現しているファージは、sFR2P-1結合について選択されたファージ調製物においてより豊富であり(表1)、B-B9(配列番号:27)ファージよりもより高い割合のsFRP-1:BSA結合を示した。融合タンパク質により観察されたより劇的な対比は、結合実体の結合価(valency)の差異に寄与し:各ファージ粒子は、その表面に見られるペプチドの5個のコピーを有するのに対し、ペプチドアルカリホスファターゼ融合タンパク質は溶液中に二量体として存在した。従って、5価(pentavalent)ファージ粒子で当初明らかにされたB-B9配列の相対的に弱い結合活性は、二量体試薬が試験された場合より明確になる。これらの結果は、ペプチドモチーフに関連した結合は、近傍のアミノ酸残基の組成により影響を受けることを示している。
ペプチドモチーフに類似した配列を有するタンパク質の同定
GenBankにおける配列のBLAST解析は、新規に発見されたペプチドモチーフ(配列番号:9)はいかなるWntタンパク質も存在しないことを示した。しかし表2に示したように、類似する配列が、一握りの他のタンパク質において認められた。
sFRP-1および骨における発現
マウス胚(19日目)、新生仔マウス(1日目)、および成体マウス(5週齢)の骨格構造内のsFRP-1転写産物(配列番号:1)のインサイチュハイブリダイゼーション分析を行い、骨発生におけるsFRP-1の役割を試験した。過形成性軟骨細胞は、マウス胚(E19)において強力に陽性であった。1日目のマウスの脊髄において、腰椎体の軟骨原基内の骨化中心および椎間板の中心部分の髄核内に非常に強力な発現があった。成体において、骨内層細胞に加え多くの単離された骨髄細胞が陽性であり、骨細胞は弱い陽性であった。sFRP-1 mRNAも、表皮において認められた。RANKLは、同様のパターンで発現された(Kartsogiannisら、Bone、25:525-534(1999))。骨格部位におけるsFRP-1の発現も検出された。ここで、恐らくsFRP-1は骨格の形態形成に関連しており、sFRP-1発現は成体期間を通じて多くの部位において継続するであろう。
およびsfrp-1b
のプライマー組合せを、sFRP-1増幅に使用し、かつgapdh-2
およびgapdh-4
のプライマー組合せを、GAPDH増幅に使用した。得られたPCR産物を、電気泳動し、ナイロン膜に移し、各々、[α-32P]標識した内部検出オリゴヌクレオチドであるsfrp-1c
およびgapdh-1
と、Southbyらにより説明されたように(Endocrinology、137:1349-1357(1996))ハイブリダイズした。RT-PCR分析は、3つ組で反復した。半定量的RT-PCR分析を、各RT反応について3回行い、2回の独立したRT反応を試験した。
細胞培養物バイオアッセイ法においてsFRP-1は破骨細胞発生を遮断する
sFRP-1(配列番号:3)およびRANKLが互いに直接相互作用する確率を、ELISAアッセイ法を用いて試験した。ELISAアッセイ法は、組換えsFRP-1(配列番号:3)で被覆し、引き続きBSAで遮断したウェルの使用を含んだ。その後RANKLを、これらのウェル、およびBSAで処理したのみの隣接ウェルと共にインキュベーションした。RANKL抗血清および二次試薬による引き続きの検出は、RANKLがsFRP-1に特異的に結合していることを明らかにした(図5)。この結果は、いくつかの個別の実験において確認した。組換え試薬の使用は、sFRP-1(配列番号:3)およびRANKLが互いに直接結合していることを示している。
A-C2合成ペプチドは破骨細胞形成を促進する
A-C2(配列番号:14)ポリペプチドはRANKLとの配列相同性を有し、またA-C2(配列番号:14)はsFRP-1に結合するので、A-C2(配列番号:14)がRANKLへのsFRP-1結合を遮断し、その結果破骨細胞発生を増大させるかどうかを決定するアッセイ法を行った。この仮説に一致するように、骨芽細胞および成体脾細胞共培養物のA-C2(配列番号:14)による処理は、TRAP+多核化された細胞において10倍の増加を生じた(図8)。A-C2(配列番号:14)は、共培養実験の0〜3日目に存在する場合にのみ、破骨細胞形成に対する作用を有した。RANKLの存在も、0〜3日目の間の破骨細胞発生に必要である(Sudaら、Endocrine Reviews、20:345-357(1999))。従ってこれらの結果は、A-C2(配列番号:14)は恐らくRANKL活性に影響を及ぼすであろうという概念に合致する。
構造解析はsFRP-1/RANKL結合がペプチドモチーフを超えて広がることを示す
sFRP-1/RANKL相互作用の構造機能解析は、RANKLのsFRP-1欠失変異体のセットに結合する能力を試験することにより行った(図12)。最も強い結合は、CRDを含んだ誘導体と共に認められ、強力な結合が引き続き細菌において発現されたCRDを含む類似の変異体と共に認められた。注目すべきことに本発明者らは、sFRP-1の、A-C2モチーフに対応する配列を欠いているRANKL誘導体(このRANKL変異体は残基158で始まるアミノ末端配列を有する)への結合も認めた。このことは、RANKLおよびsFRP-1の結合は、A-C2配列の存在に全般的に依存している訳ではないことを意味している。更にこれは、他のタンパク質がRANKLに構造的に関連しているが、A-C2様配列の欠損もsFRP-1に結合し得ることを意味している。本発明者らは、この仮説を検証し、現在、RANKL結合試験に関して上述したものと同等の条件を用い、ELISA様式においてTNFaもsFRP-1に結合することができるという証拠を有する。更に同様の実験をsFRP-2で行い、これはRANKLおよび他のTNFαファミリーメンバーであるTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)に結合することができることを示した。従って本発明者らは、sFRP-1およびRANKLに関連した相互作用に加え、追加の相互作用が、sFRPとTNFファミリーのメンバーの間に生じると現在考えている。
生物学的関係のあるペプチドモチーフの同定
ペプチドモチーフL/V-V-D-G-R-W-L/V(配列番号:9)は、sFRP-1に結合可能であるものとしてはこれまで同定されていない。この結合活性は、ペプチド/アルカリホスファターゼ融合タンパク質、アラニンスキャニング用突然変異誘発、および合成ペプチドを用いる一連のELISA実験の使用を通して特徴決定されている。これらの実験は更に、近隣残基の置換は、ペプチドモチーフ/sFRP-1結合を増強または減弱することができることを明らかにし、これは隣接残基の体系的置換およびペプチドモチーフ内の保存的変化は、sFRP-1との相互作用を増強し得ることを意味している。
sFRP-1は破骨細胞形成を遮断する
本明細書において明らかにしたように、sFRP-1は、破骨細胞発生における阻害作用を有し、これは恐らくRANKLとのその相互作用に起因するであろう。破骨細胞形成を刺激することが可能である骨芽細胞株における特異的なsFRP-1転写物の上昇した発現は、sFRP-1が破骨細胞発生を促進することを最初に示唆した。しかし、破骨細胞形成が進行した際骨芽細胞および造血前駆体の共培養において認められたsFRP-1転写物の増加は、sFRP-1は、破骨細胞形成の程度を制限する強化性(tonic)機序の代わりの部分であることを意味していた(図17)。これは、恒常性にとって重要であり、将来必要な場合に利用可能である破骨細胞前駆体の貯留と共に、骨芽細胞および破骨細胞集団の適当なバランスの維持を確実にすると考えられる。加えて、低濃度のsFRP-1は、破骨細胞形成における許容作用(permissive effect)を有することが可能である。
sFRPおよびTNFαファミリーメンバー間のその他の相互作用
前述の結果(実施例8)は、新たに同定されたペプチド結合モチーフに加え、RANKL内の追加の接触点が、sFRP-1(配列番号:3)およびRANKLの相互作用に関連していることを示している。これらの結果は更に、sFRPファミリーメンバーがTNFリガンドファミリーメンバーと相互作用することを示している。
sFRP-1/ペプチド結合
ELISA実験を、一連のsFRP-1欠失変異体により、本質的に前述のように行い(Urenら、J. Biol. Chem.、275:4374-4382(2000))、タンパク質のどの領域が、AC2/アルカリホスファターゼキメラへの結合に必要であるかを決定した。最適結合は、Δ3誘導体との間で認められ、これはFz CRDの全ておよびC末端領域の一部を含んでいる。CRDのみまたはC末端領域のみを含む誘導体との結合はほとんど検出されなかった。
Claims (29)
- 式[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]yを含む、sFRP1に結合する単離されたペプチドであり、
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり;
R1、R2、R8、およびR9は、任意のアミノ酸残基を含み;
R3は、Valであり;
R4は、Aspであり;
R5は、Glyであり;
R6は、Argであり;
R7は、Trpである。);
該ポリペプチドがsFRP-1に結合する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるペプチド。 - 請求項1記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
- 請求項2記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項3記載のベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号:9もしくは配列番号:40に示されたアミノ酸配列、または配列番号:9もしくは配列番号:40と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、sFRP1に結合する単離されたポリペプチドであり、該ポリペプチドがsFRP-1に結合する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるポリペプチド。
- 請求項5記載のポリペプチドをコードしている単離された核酸。
- 請求項6記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項7記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1記載のペプチドを有効成分として含んでなる破骨細胞分化を増強するための医薬組成物。
- R1が(a) Gln-Gly-Thr、(b)Ala-Gly-Thr、(c)Gln-Ala-Thr、または(d)Gln-Gly-Alaであり;
R2は、Leu、Val、またはAlaであり;
R8は、LeuまたはValであり;
R9は、(a)Gln、(b)Gln-Gly-Glu、(c)Gln-Leu、(d)Ala-Leu、(e)Gln-Ala、または(f)Thr-Asn-Pro-His-Hisであり;ならびに、
R3はValであり、R4はAspであり、R5はGlyであり、R6はArg であり、およびR7はTrpである、請求項9記載の医薬組成物。 - R3がValであり、R4がAspであり、R5がGlyであり、R6がArgであり、およびR7がTrpである、請求項9記載の医薬組成物。
- 請求項5記載のペプチドを有効成分として含んでなる破骨細胞分化を増強するための医薬組成物。
- 請求項1記載のペプチドを有効成分として含んでなる骨疾患治療用医薬組成物。
- 請求項5記載のペプチドを有効成分として含んでなる骨疾患治療用医薬組成物。
- 式[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]yを含む、sFRP-1に結合する単離されたペプチドであり、
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり;
R1、R2、R8、およびR9は、任意のアミノ酸残基を含み;
R3は、Valであり;
R4は、Asp であり;
R5は、Glyであり;
R6は、Arg であり;
R7は、Trpである。);
該ペプチドがsFRP-1に結合する能力を維持し、長さ20個未満のアミノ酸であるペプチド。 - 請求項15記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
- 請求項16記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項17記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項15記載のペプチドを有効成分として含んでなる骨疾患治療用医薬組成物。
- 式[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]yを含む、sFRP-1に結合する単離されたペプチドであり、
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり;
R1、R2、R8、およびR9は、任意のアミノ酸残基を含み;
R3は、Valであり;
R4は、Aspであり;
R5は、Glyであり;
R6は、Arg であり;
R7は、Trpである。);
該ペプチドがsFRP-1に結合し、かつ破骨細胞分化を増強する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるペプチド。 - 請求項20記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
- 請求項21記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項22記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項20記載の単離されたペプチドを有効成分として含んでなる骨疾患治療用医薬組成物。
- 配列番号:11、配列番号:14、配列番号:28、もしくは配列番号:40に示されたアミノ酸配列を含む、sFRP1に結合する単離されたポリペプチドであり、該ペプチドがsFRP-1に結合する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるポリペプチド。
- 請求項25記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
- 請求項26記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項27記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項25記載の単離されたペプチドを有効成分として含んでなる骨疾患治療用医薬組成物。
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