JP4220687B2 - Testosterone 5α-reductase inhibitor - Google Patents

Description

【００１０】
また、本発明は、上記式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体を有効量で含有するホウセンカ抽出物を有効成分として含有するテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、上記の本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤を有効成分として含有する育毛用組成物及びアクネ用組成物を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
前記本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤に利用されるホウセンカの起源は、わが国を含むアジア各国に自生するツリフネソウ科の一年草で、インパティエンスバルサミナ(Impatiens Balsamina L.)の学名を持つ植物である。
【００１３】
本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤は、その有効成分として前記ホウセンカ抽出物またはその成分である式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体を含有する。ホウセンカ抽出物は、例えば、ホウセンカの全草、あるいは、葉、茎、花弁のうち何れか１ヶ所以上(以下、「原体」という)を乾燥又は乾燥せずに裁断した後、常温もしくは加温下で溶剤により抽出することにより得られる。
【００１４】
ここで用いられる溶剤としては、水、有機溶媒及びこれらの混合物が挙げられる。これらの有機溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、ブタノール等の低級アルコール類、または、これら低級アルコール類と水の混合液(10〜90V/V％、好ましくは20〜70V/V％)、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、または、これらケトン類と水との混合液(10〜90V/V％、好ましくは20〜70V/V％)、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、石油エーテル等の炭化水素類、クロロホルム、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００１５】
原体からの好ましい抽出方法の具体例としては、原体を裁断した後、適当な有機溶媒(好ましくは、低級アルコール類、含水低級アルコール類、ケトン類、含水ケトン類、炭化水素類、または、エステル類)で抽出し、溶媒を留去する方法、あるいは、原体を裁断した後、無水あるいは含水低級アルコール等の溶媒で抽出し、次いで抽出物を酢酸エチル、ブタノール等の水と混和しない溶媒と水を用いる液-液抽出に付し、更に有機層または水層から溶媒を留去する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。尚、ホウセンカ成分の効率的抽出には、原体と溶剤の抽出比率が１〜80W/V％、好ましくは10〜60W/V％であるのが好適である。
【００１６】
また、抽出溶媒として例えば無水または含水エタノールまたは水を用いた場合は、溶媒を留去することなくそのまま用いることができ、更に溶媒の一部を留去して或いは留去することなく、エタノール、水等を適宜加えることによりアルコール濃度を調整して用いることもできる。
【００１７】
一方、ホウセンカ成分である式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、前記何れかの抽出方法、好ましくは含水低級アルコール(好ましくは含水メタノール、含水エタノール)、親水性有機溶剤(好ましくはメタノール、エタノール、アセトン)、疎水性有機溶剤(好ましくはブタノール、酢酸エチル、クロロホルム)の中から選ばれる１種以上により得られた当該抽出物から、更に適当な分離精製手段、好ましくは薄層クロマト法、カラムクロマト法、高速液体クロマト法または再結晶等を繰り返し行うことにより単離、精製され得る。
【００１８】
また、式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体、すなわち2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)は、有機合成により得ることもできる。すなわち、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン(ローソンと呼称されるときもある)とアセトアルデヒド又はアセタールとを適当な有機溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド又はアセトニトリルなどの溶媒中で、周囲温度あるいは加温下、好ましくは50〜80℃で縮合することにより製造される。次いで、得られる粗生成物から、通常用いられる分離精製手段、例えば抽出、濃縮、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、再結晶などにより単離、精製される。
【００１９】
本発明者らの研究により、テストステロン５α−リダクターゼ阻害作用が確認された式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、本発明のホウセンカ抽出物のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用における主要活性成分の１つであることがわかる。
【００２０】
本発明に含まれるホウセンカ抽出物のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用については、今まで全く報告されていない。更に、本発明者らによって初めてホウセンカから単離された式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、合成品としては公知物質であるが、これまで他の天然物成分として抽出、単離された例もなく、テストステロン５α−リダクターゼ阻害作用についても全く報告されていない。尚、ホウセンカに関しては、その白色花弁の抽出物に抗アレルギー作用があることが既に報告され［Phytotherapy Res. 6, 112 (1992).参照のこと］、また、式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体に関しては、抗エイズ作用(ＨＩＶ−１インテグラーゼ及びプロテアーゼ阻害作用)の検討がなされているが［J. Med. Chem., 39, 2472 (1996).参照のこと］、いずれも本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用とは作用メカニズムの異なるものである。従って、本発明のホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体が有するテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用は、本発明者らによって初めて見出された有用な薬理作用である。
【００２１】
なお、本発明の効果を損なわない範囲で、作用増強を目的として、上記の本発明のホウセンカ抽出物に式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体を別途添加することもできる。
【００２２】
また、本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤としては、前記式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体を有効量で含有するホウセンカ抽出物を有効成分とするものが含まれる。ここで、「有効量」とは、所望のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を得るのに充分な量を意味する。式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、本発明の有効成分であるホウセンカ抽出物の主要活性成分であり、ホウセンカ抽出物が式（Ｉ）の化合物を有効量で含む場合はこれをそのまま本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤として用いることができる。また、式（Ｉ）の化合物を含有していても所望のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を得るのに充分でない場合は、別途式（Ｉ）の化合物を添加したホウセンカ抽出物を用いることができる。
【００２３】
かくして得られるホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、いずれも望ましからぬホルモン様作用のない優れたテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を有しており、その応用としては、ＤＨＴの異常産生に起因する疾患、例えば、男性型脱毛症やアクネ等の皮膚疾患であれば外用剤の医薬品、医薬部外品、化粧品として、また、前立腺肥大症等の疾患であれば経口剤又は注射剤の医薬品として投与することにより、その予防または治療に用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明のホウセンカ抽出物は、通常成人一人当たり、外用剤の場合であれば、乾燥重量で１回に１mg〜１g、好ましくは10mg〜500mg、内服剤の場合であれば１回に0.1〜500mg、好ましくは0.5〜100mg配合することができる。また、本発明の式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、通常成人一人当たり、外用剤の場合であれば、0.1mg〜500mg、好ましくは1mg〜50mg、内服剤の場合であれば0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜50mg配合することができる。但し、投与量は年令、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分の場合もあるし、また範囲を越えて投与する必要のある場合もある。
【００２５】
本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤の剤形は、特に限定されるものではなく、例えば、男性型脱毛症用であればヘアローション、シャンプー、リンス、ヘアトニック、ヘアトリートメント、ヘアクリーム等の通常頭髪に用いられるものが、また、アクネ用であれば軟膏、ローション、クリーム、ジェル、乳液等の通常皮膚用として用いられるものが挙げられる。また、前立腺肥大症用であれば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤等の通常の経口剤あるいは注射剤とすることもできる。
【００２６】
本発明のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤には、上記必須成分であるホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体の他に、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲で、外用剤の場合であれば、通常適用される炭化水素類、ロウ類、油脂類、高級脂肪酸、低級あるいは高級アルコール、界面活性剤、香料、色素、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、pH調節剤、また、経口用製剤であれば、適当な賦形剤、例えば、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤等を添加することができる。
【００２７】
更に、本発明の有効成分であるホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体以外の他の薬効成分として、例えば、卵胞ホルモン(エストラジオール、エチニルエストラジオール等)、抗アンドロゲン剤(スピロノラクトン、プロゲステロン等)、消炎、鎮疹剤(グリチルリチン酸塩、アズレン等)、代謝・毛根賦活剤(パントテン酸、パントテニールアルコール等)、ビタミン類(ビタミンＡ,Ｂ₁,Ｅ,Ｂ₂,Ｂ₆,Ｂ₁₂,Ｃ,Ｅ等)、血流改善剤(dl-α-トコフェロール、γ-オリザノール等)、局所刺激剤(ショウキョウチンキ、トウガラシチンキ等)、角質溶解剤(サリチル酸、レゾルシン等)、抗脂漏剤(レシチン、イオウ等)、殺菌剤(塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール等)、保湿剤(レモンエキス、ヒアルロン酸、プロピレングリコール、グリセリン等)等を各種目的に応じてホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体と併せて用いることもできる。
【００２８】
また、本発明のホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体以外の薬効成分として、各種生薬、例えばセンブリ、オトギリソウ、チンピ、カシュウ、ショウガ、ニンジン、レイシ、タヒボ、ローズマリー、ニンニク等の抽出物を１種以上添加することもできる。かかる生薬の抽出、添加方法としては、通常生薬の抽出に用いられる方法、例えば、水および／または有機溶媒で抽出して得られる液、あるいは溶媒留去したものをホウセンカ抽出物又は式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体と混合する方法、あるいは、当該ホウセンカの抽出の際、これら生薬を同時抽出する方法、あるいは、ホウセンカ抽出液、好ましくは、無水または含水低級アルコール(更に好ましくは、10〜80V/V％エタノール)により得られるホウセンカ抽出液を用いて、これら生薬を再抽出する方法などが挙げられる。
【００２９】
また、本発明のホウセンカ抽出物を外用剤として用いる場合には、ホウセンカあるいは目的により併用する生薬抽出物由来の特異臭を和らげ、また、ビタミンＣ等の栄養成分を与える目的で、レモン、みかん、すだち、ゆず等柑橘類の果実成分を添加することができる。更に、ホウセンカ抽出液、好ましくは、無水または含水低級アルコール(更に好ましくは、10〜80V/V％エタノール)により得られるホウセンカ抽出液を用いて、これら果実を再抽出する方法が特に好適である。
【００３０】
以上説明した本発明は、ホウセンカ抽出物を含有する育毛用組成物を含むものであり、この場合において、ホウセンカ抽出物は、育毛効果と経済性の面から、本発明の育毛用組成物中に乾燥重量で0.001〜10W/V％、好ましくは0.01〜５W/V％配合することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例として本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
抽出例１
一昼夜日陰干しした後裁断したホウセンカの全草（地上部）（15kg）を35V/V％エタノール(30リットル)に漬け込み、１ヶ月間浸出した。次いで、全草をろ別し、更に２週間熟成した後、ろ過して抽出液(26リットル)を得た。
【００３３】
抽出例２
一昼夜日陰干しした後裁断したホウセンカの全草（地上部）（0.5kg）を50V/V％エタノール(１リットル)に漬け込み、１ヶ月間浸出した。次いで、全草をろ別し、更に２週間熟成した後、ろ過して抽出液(0.83リットル)を得た。
【００３４】
抽出例３
一昼夜日陰干しした後裁断したホウセンカの全草（地上部）（0.5kg）を70V/V％エタノール(１リットル)に漬け込み、１ヶ月間浸出した。次いで、全草をろ別し、更に２週間熟成した後、ろ過して抽出液(0.87リットル)を得た。
【００３５】
抽出例４
抽出例１で得られた抽出液(１リットル)を減圧下溶媒留去して、抽出物(19g)を得た。
【００３６】
実験例１(急性毒性試験)
５匹ずつ２群のICRマウス(雄性、５週齢、体重20〜25g)に、抽出例４のホウセンカ抽出物を５g/kg経口投与及び１g/kg腹腔内投与した。投与後14日目に至っても、いずれのマウスも死亡例を認めず、LD₅₀値は、経口投与：５g/kg以上、腹腔内投与：１g/kg以上であることがわかった。これより、本発明のホウセンカ抽出物の安全性が非常に高いことがわかる。
【００３７】
実験例２(皮膚10日間累積刺激性試験)
日本白色ウサギ(雄性、体重2.5〜３kg)10匹それぞれの背部を除毛し、更に除毛した部位を背骨を中心として左右２カ所(左：試験部位、右：無処置部位)に分けた。次に、これらの除毛したウサギを無作為に５匹ずつ２つの群に分け、一方を実施例群、他方をプラセボ(偽薬)群とした。次いで、実施例群のウサギ５匹の試験部位に１日１回の頻度で10日間、抽出例４のホウセンカ抽出物の10W/V％流動パラフィン溶液(0.5mL)を均一に塗布し、一定の条件下(気温：23±２℃、明暗サイクル12時間、但し照明時間7:00〜19:00)で飼育した。また、プラセボ群には、流動パラフィン(0.5mL)を実施例群と同様に塗布した。10日間経過後、すべてのウサギの試験部位を肉眼により観察した。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
上記表１において、Ａは発赤、炎症等の刺激性を示す所見が見られた個体数であり、Ｂは当該群の全個体数を示す。
本皮膚刺激性試験において、プラセボ群と実施例群に全く差異が認められなかったことから、本発明のホウセンカ抽出物には、皮膚に対する累積刺激性がほとんどないことがわかった。
【００４０】
抽出例５
抽出例１で得られた抽出液(26リットル)を約２リットルまで減圧濃縮した後、酢酸エチル(１リットル)で２回液−液抽出した。次いで、酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下溶媒留去して、酢酸エチル抽出物(8.6g)を得た。
【００４１】
＜2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)（Ｉ）の製造方法＞
製造例１
抽出例５の方法で得られたホウセンカの酢酸エチル抽出物(10.0g)にクロロホルムを加え、不溶物をろ別した。次いで、ろ液を減圧濃縮して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム)で２回分離精製した後、酢酸エチルで再結晶して黄色プリズム晶の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)（1.03g)を得た。
【００４２】
IR(KBr)cm^-1：3296, 1664, 1637, 1359, 1344, 1278, 729.
¹H-NMR(CDCl₃)：1.73(3H, d, J=7.5Hz, ＝CHCH ₃ ), 4.83(1H, q, J=7.5Hz,＝CHCH₃), 7.54-7.83(4H, m, 6,7-H of naphthoquinone), 7.96-8.14(4H, m, 5,8-H of naphthoquinone).ここで、「＝C」はアルキリデンの１位の炭素原子を意味する。
元素分析：C₂₂H₁₄O₆ 計算値 C%=70.59 H%=3.77, 実測値 C%=70.86 H%=3.93
ｍ．ｐ． １９６−１９８℃。
【００４３】
製造例２
アルゴン置換下、ローソン(10.0g)及びアセタール(14.28g)のジメチルホルムアミド(50mL)溶液を80℃で4.5時間撹拌した。冷後、反応液に酢酸エチルを加え、希塩酸及び飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣を酢酸エチルで結晶化し、更に、酢酸エチルで再結晶して、黄色プリズム晶の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)(9.10g)を得た。
【００４４】
本製造例で得られた化合物の物性データ(IR, ¹H-NMR, 元素分析, m.p.)は、ホウセンカから抽出、単離した製造例１で得られたものと一致した。
【００４５】
実験例３(急性毒性試験)
１群５匹ずつのICRマウス(雄性、５週齢、体重20〜25g)に、製造例１の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン）を250mg/kgから1000mg/kgの間の用量で経口投与した。化合物は0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液に分散させて用いた。その結果、LD₅₀値は514mg/kgであった。
【００４６】
実験例４(テストステロン５α-リダクターゼ阻害活性実験)
（酵素液の調製法)
ウイスター系雄性ラットより摘出した前立腺(湿重量15.038g)を小片にし、0.25Ｍ-スクロース含有0.1Ｍ-ＨＥＰＥＳ緩衝液(以下、「緩衝液」という)(45mL)を加え、ホモジネートした。次いで、900×gで５分間遠心分離し、沈渣を緩衝液(27.5mL)に懸濁し、再度900×gで５分間遠心分離した。この沈渣に緩衝液(11.25mL)を加えて懸濁し、これを酵素液として使用した。
【００４７】
(テストステロン５α-リダクターゼ阻害活性測定法)
各種濃度(10μg/mL〜１mg/mL)に調製した抽出例５のホウセンカ抽出物又は製造例１の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)のエタノール溶液(100μL)及びテストステロンのエタノール溶液(５μg/mL)(50μL)の混合物を窒素ガスで蒸発乾固した後、40ｍＭ-リン酸水素ナトリウム緩衝液(488μL)、28ｍＭ-ジチオトレイトール(20μL)、2.8ｍＭ-β-ＮＡＤＰＨ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型)(10μL)及び酵素液(50μL)を加え混合し、37℃で30分間インキュベートした。この混合液にn-ヘキサン(１mL)を加え10分間振とうした後、3000ｒｐｍで10分間遠心分離した。次いで、n-ヘキサン層を分取し減圧乾固した後、トリフルオロ酢酸(100μL)を加え40℃で30分間インキュベートした。続いて、混合液を減圧乾固した残渣に、内部標準物質としてヘキサクロロベンゼンのn-ヘキサン溶液(１μg/mL)(100μL)を加え溶解し、試料溶液とした。一方、ホウセンカ抽出物又は2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)を含まない上記と同様の方法で得られた溶液をコントロール溶液とした。
【００４８】
前記各試料溶液及びコントロール溶液につき、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて、テストステロン5α-リダクターゼにより還元されたジヒドロテストステロン(ＤＨＴ)の量を測定し、次式に従い各試料溶液のテストステロン5α-リダクターゼ阻害率を算出した。
【００４９】
【数１】

【００５０】
Ａ：コントロール溶液のＤＨＴピーク面積／内部標準物質のピーク面積
Ｂ：試料溶液のＤＨＴピーク面積／内部標準物質のピーク面積
更に、試料の各濃度における阻害率から、ホウセンカ抽出物及び2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)のテストステロン5α-リダクターゼに対する50％阻害濃度(IC₅₀値)を算出した。結果を表２、３に示す。
【００５１】
【表２】

【００５２】
【表３】

【００５３】
上記により、ホウセンカ抽出物及びホウセンカ成分である2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)にはテストステロン５α−リダクターゼ阻害活性があることが確認された。なお、比較としてローソンを用いて同様の試験を行ったところ、IC₅₀値は500μg/mL以上であった。
【００５４】
実験例５(抗アクネ菌活性試験)
２種類のアクネ菌(Propionibacterium acnes、Prpionibacterium avidum)に対する抗菌活性を寒天培養法により試験した。
【００５５】
(Propionibacterium acnesに対する抗菌活性)
各種濃度に調製した抽出例１のホウセンカ抽出液、抽出例５のホウセンカ抽出物及び製造例１の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)のエタノール溶液又は懸濁液(0.2mL)をGAM培地（日水製薬社製）(9.8mL)に溶解又は均一に懸濁し試験管に流し込み凝固させた（最終エタノール含量：２％）。各培地にPropionibacterium acnesを穿刺接種した後、培地上層にTryptic Soy Broth培地(DIFCO社製)(2mL)を重層した（嫌気培養）。次いで、30℃で７日間培養した後、各試料の各種濃度における菌の発育を観察し、その有無から最小発育阻止濃度(MIC)を測定した。結果を表４に示した。
【００５６】
尚、予め、試料の溶媒であるエタノール(0.2mL)のみを用いた培地でPropionibacterium acnesを培養したところ、問題なく菌の発育が認められたことから、本試験に対する溶媒の影響はないものとした。
【００５７】
(Propionibacterium avidumに対する抗菌活性)
各種濃度に調製した抽出例１のホウセンカ抽出液、抽出例５のホウセンカ抽出物及び製造例１の2,2'-エチリデンビス(3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)の５％エタノール溶液又は懸濁液(1mL)を1.5％寒天含有Tryptic Soy Broth培地(DIFCO社製)(9mL)に溶解又は均一に懸濁しシャーレに流し込み凝固させた（最終エタノール含量：0.5％）後、各培地にPropionibacterium avidumを接種した。次いで、30℃で３日間培養した後、各試料の各種濃度における菌の発育を観察し、その有無から最小発育阻止濃度(MIC)を測定した。
【００５８】
尚、予め、試料の溶媒である５％エタノール(1mL)のみを用いた培地でPropionibacterium avidumを培養したところ、問題なく菌の発育が認められたことから、本試験に対する溶媒の影響はないものとした。結果を表４に示した。
【００５９】
【表４】

【００６０】
上記より、ホウセンカ抽出物、特に脂溶性成分を多く含有する酢酸エチル抽出物に高い抗アクネ菌活性が認められた。このことから、当該ホウセンカ抽出物は、前述のテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用により皮脂の分泌を抑制するばかりでなく、アクネ毛嚢内菌に対する抗菌作用により皮膚炎症等を防ぐ働きを併せ持つ、優れたアクネ予防・治療用組成物を提供するものである。
【００６１】
抽出例６
抽出例１で得られた抽出液(10リットル)に輪切りしたレモン果実(0.5kg)を加え、２週間浸出した。次いで、レモン果実をろ別し、更に２週間熟成した後、ろ過してレモン／ホウセンカ抽出液(9.8リットル)を得た。
【００６２】
抽出例７
裁断した乾燥ホウセンカの全草(地上部)(160ｇ)をメタノール(１リットル)にて２回60℃で５時間加熱抽出した。冷後、全草をろ別し減圧下溶媒留去して、抽出物(18.9ｇ)を得た。
【００６３】
抽出例８
裁断した乾燥ホウセンカの全草(地上部)(160ｇ)を酢酸エチル(１リットル)にて２回60℃で５時間加熱抽出した。冷後、全草をろ別し減圧下溶媒留去して、抽出物(6.4ｇ)を得た。
【００６４】
実施例１(ヘアローション１−１〜１−３)
Ａ 抽出例１の抽出液 31.5mL
Ｂ 無水エタノール 12.0mL
Ｃ 精製水 適 量
Ａ及びＢを混合した後全量が100mLになるようにＣを加え、均一に混合攪拌してヘアローション（１−１）とした。
【００６５】
Ａ 製造例１の化合物 5.0mg
Ｂ 無水エタノール 20.0mL
Ｃ 精製水 適 量
ＡをＢに溶解した後全量が100mLになるようにＣを加え、均一に混合攪拌してヘアローション（１−２）とした。
【００６６】
Ａ 抽出例１の抽出液 31.5mL
Ｂ 製造例１の化合物 1.5mg
Ｃ 無水エタノール 12.0mL
Ｄ 精製水 適 量
ＢをＣに溶解し、Ａを加えた後全量が100mLになるようにＤを加え、均一に混合攪拌してヘアローション（１−３）とした。
【００６７】

Ｂの各成分をＣに溶解し、Ａと均一に混合した。次いで、Ｄの各成分をＥに溶解した溶液を先に調製したＡ、Ｂ、Ｃの混合液に加え、更に、全量が100mLになるようにＦを加えた後、均一に混合攪拌してヘアローションとした。
【００６８】
実施例３(ヘアシャンプー)
Ａ 抽出例１の抽出液 28.0mL
Ｂ 25V/V％エタノール 12.0mL
Ｃ ニッサンアノン5010〔日本油脂（株）製〕 360.0mL
Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ均一に混合攪拌して、ヘアシャンプーとした。
【００６９】

Ｃの各成分を均一に混合した後、Ｄを加え予備混合した。次いで、均一に混合溶解したＡ及びＢの各成分を加え更に混合した後、造粒乾燥(１m/m)して、顆粒剤の育毛用補助食品とした。
【００７０】
上記実施例１、３で得られたヘアローション及びヘアシャンプーを用いて下記の方法で育毛試験を行った。
【００７１】
＜育毛試験＞
被験者95名(うち女性９名)に、実施例１のヘアローション（１−１）(３ヶ月分：100mL×６本)及び実施例３のヘアシャンプー(３ヶ月分：400mL×３本)両者を３ヶ月間継続使用させた。３ヶ月経過後、まず、「効果あり」、「効果なし」、「効果の有無が不明」の３段階で評価させ、更に「効果あり」と答えた被験者には、その効果の内容及び発現時期についての回答を得た。結果を表５〜７に示す。
【００７２】
【表５】

【００７３】
下記表６は、上記表５の評価実験で「効果があった」と答えた人（有効群）の具体的な効果の内容を示すものである。
【００７４】
【表６】

【００７５】
下記表７は、前記表５の評価実験で「効果があった」と答えた人（有効群）の育毛用組成物の使用開始から効果発現までにかかった期間を示すものである。
【００７６】
【表７】

【００７７】
尚、本試験終了時、すなわち３ヶ月間連続使用後において、いずれの被験者も皮膚刺激等の異状は全く認められなかった。
【００７８】

上記処方に従い、Ａの成分を均一に溶解した後、Ｂの成分溶液に徐々に加え均一に混合溶解してスキンローションとした。
【００７９】

上記処方に従い、Ａ、Ｂ各成分をそれぞれ約80℃に加温し、撹拌下ＢにＡを徐々に加え均一に混合した後、冷却してスキンクリームとした。
【００８０】

上記処方に従い、Ａ、Ｂ各成分をそれぞれ約80℃に加温し、撹拌下ＢにＡを徐々に加え均一に混合した後、冷却して乳液とした。
【００８１】

上記処方に従い、Ａ成分をＢに均一に分散させた後、Ｃを加え混合して軟膏とした。
【００８２】

上記処方に従い、Ａ成分をＢに均一に分散させた後、Ｃを加え混合して軟膏とした。
【００８３】

１錠が上記割合になるように各成分を均一に混合した後、打錠して錠剤とした。
【００８４】

１カプセルが上記割合になるように各成分を均一に混合した後、カプセルに充填した。
【００８５】

１カプセルが上記割合になるように各成分を均一に混合した後、カプセルに充填した。
【００８６】
【発明の効果】
本発明のホウセンカ抽出物及び式（Ｉ）で表されるビスナフトキノン誘導体は、安全性が高くホルモン様作用のない優れたテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を有していることから、当該抽出物又は当該物質を有効成分として配合した組成物は、男性型脱毛症、アクネ、前立腺肥大症等のＤＨＴの異常産生に起因する疾患の予防及び治療に有効である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a testosterone 5α-reductase inhibitor, and more particularly, it is useful and highly safe, containing a natural bosenca extract or a specific bisnaphthoquinone derivative that is a component of the bosenca extract as an active ingredient. It relates to a testosterone 5α-reductase inhibitor.
[0002]
[Prior art]
Testosterone (male hormone) biosynthesized and secreted in the testis and adrenal gland is transferred to the sebaceous gland, hair follicle, prostate, etc. via blood, and then reduced by testosterone 5α-reductase, which is a metabolic enzyme present in each tissue, Converted to the more active dihydrotestosterone (DHT). It is known that DHT produced in each tissue promotes sebum secretion in the sebaceous glands and hair follicles and cell proliferation in the prostate.
[0003]
On the other hand, in diseases such as androgenetic alopecia, acne vulgaris, and benign prostatic hyperplasia, the action of male hormones is considered to be the cause of development or an aversion factor, and these are caused by abnormal production of DHT. It is considered. Accordingly, anti-androgenic agents including testosterone 5α-reductase inhibitors are widely used as therapeutic agents for these diseases. As anti-androgenic agents, powerful steroids such as progesterone, chlormadinone, and cyproterone are used, and extracts derived from natural products such as assembly, fennel, and licorice are used as testosterone 5α-reductase inhibitors. In addition, Lawson (henna leaf), shikonin (shikon), eugenol (clove) and the like have been reported to inhibit testosterone 5α-reductase [fragrance journal, No. 92, p. 78- (1988). See also].
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, these conventional anti-androgenic hormone agents, particularly steroid agents, have unfavorable side effects due to their strong hormonal action and have had problems with safety. Moreover, although the testosterone 5 (alpha) -reductase inhibitor derived from the natural product known until now has an effect | action recognized, there were many things with unknown the active component. Or, even if active ingredients are specified as in the fragrance journal described above, there are many that are weak in action.
[0005]
The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its object is to provide a testosterone 5α-reductase inhibitor having excellent male hormone inhibitory activity and high safety without hormone-like activity. Is to provide.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have used as an index the testosterone 5α-reductase inhibitory action of various plant extracts ranging from various herbal medicines commonly used in Kampo prescriptions to herbal medicines used in folk remedies. As a search. As a result, it has been found that spinach that has been known as a herbal medicine for a long time has a testosterone 5α-reductase inhibitory action. As a result of further intensive studies, a specific bisnaphthoquinone derivative was isolated from the spinach, and its inhibitory action on testosterone 5α-reductase was confirmed, thereby completing the present invention.
[0007]
That is, the present invention provides a testosterone 5α-reductase inhibitor containing a spinach extract as an active ingredient.
[0008]
The present invention also provides a testosterone 5α-reductase inhibitor containing a bisnaphthoquinone derivative represented by the following formula (I) as an active ingredient.
[0009]
[Chemical formula 2]

[0010]
The present invention also provides a testosterone 5α-reductase inhibitor containing as an active ingredient a spinach extract containing an effective amount of the bisnaphthoquinone derivative represented by the above formula (I).
[0011]
Furthermore, this invention provides the composition for hair growth and the composition for acne which contain the above-mentioned testosterone 5 (alpha) -reductase inhibitor of this invention as an active ingredient.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The origin of the spinach used for the testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention is an annual plant of the genus Coleoptera that grows naturally in Asian countries including Japan, and has the scientific name of Impatiens Balsamina L. It is a plant.
[0013]
The testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention contains, as an active ingredient thereof, the above-mentioned bosenca extract or a bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) as its ingredient. The botanical extract is, for example, cut at least one of the whole botanical plants, leaves, stems, and petals (hereinafter referred to as “the active ingredient”) without drying or at room temperature or with warming. It is obtained by extraction with a solvent under.
[0014]
Examples of the solvent used here include water, organic solvents, and mixtures thereof. Specific examples of these organic solvents include lower alcohols such as methanol, ethanol and butanol, or a mixed solution of these lower alcohols and water (10 to 90 V / V%, preferably 20 to 70 V / V%), Ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, or a mixture of these ketones and water (10 to 90 V / V%, preferably 20 to 70 V / V%), hydrocarbons such as hexane, benzene, toluene, and petroleum ether Halogenated hydrocarbons such as chloroform, dichloromethane and 1,2-dichloroethane, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and mixtures thereof.
[0015]
As a specific example of a preferred extraction method from the active ingredient, after cutting the active ingredient, an appropriate organic solvent (preferably lower alcohols, hydrous lower alcohols, ketones, hydrous ketones, hydrocarbons, or Esters) and then distilling off the solvent, or after cutting the active ingredient, extracting with a solvent such as anhydrous or hydrous lower alcohol, and then extracting the extract with a solvent that is not miscible with water such as ethyl acetate or butanol And a method of subjecting to liquid-liquid extraction using water and water and further distilling off the solvent from the organic layer or the aqueous layer, but are not particularly limited. In addition, it is suitable that the extraction ratio of the raw material and the solvent is 1 to 80 W / V%, preferably 10 to 60 W / V%, for efficient extraction of the spinach component.
[0016]
In addition, for example, when anhydrous or hydrous ethanol or water is used as an extraction solvent, it can be used as it is without distilling off the solvent, and ethanol, without distilling off or distilling off part of the solvent, The alcohol concentration can be adjusted by adding water or the like as appropriate.
[0017]
On the other hand, the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I), which is a spinach component, is any one of the above extraction methods, preferably a hydrous lower alcohol (preferably hydrous methanol, hydrous ethanol), a hydrophilic organic solvent (preferably methanol, Ethanol, acetone), a hydrophobic organic solvent (preferably butanol, ethyl acetate, chloroform) from the extract obtained by at least one selected from the above, further suitable separation and purification means, preferably thin layer chromatography, It can be isolated and purified by repeatedly performing column chromatography, high performance liquid chromatography or recrystallization.
[0018]
Further, the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I), that is, 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) can also be obtained by organic synthesis. That is, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (sometimes referred to as Lawson) and acetaldehyde or acetal in a suitable organic solvent, preferably a solvent such as dimethylformamide or acetonitrile, at ambient or elevated temperature. It is preferably produced by condensation at 50 to 80 ° C. Subsequently, it is isolated and purified from the resulting crude product by commonly used separation and purification means such as extraction, concentration, column chromatography, thin layer chromatography, recrystallization and the like.
[0019]
The bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) whose testosterone 5α-reductase inhibitory action has been confirmed by the inventors' study is one of the main active ingredients in the testosterone 5α-reductase inhibitory action of the spinach extract of the present invention. You can see that
[0020]
The testosterone 5α-reductase inhibitory action of the extract of spinach contained in the present invention has never been reported so far. Furthermore, the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I), which was first isolated from the spinach by the present inventors, is a known substance as a synthetic product, but has been extracted and isolated as another natural product component so far. No testosterone 5α-reductase inhibitory action has been reported. As for spinach, it has already been reported that the extract of the white petal has an antiallergic effect [Phytotherapy Res.6, 112 (1992).] Also, regarding the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I), anti-AIDS action (HIV-1 integrase and protease inhibitory action) has been studied [J Med. Chem.,392472 (1996). All of them are different in the mechanism of action from the testosterone 5α-reductase inhibitory action of the present invention. Therefore, the testosterone 5α-reductase inhibitory action possessed by the extract of the spinach of the present invention or the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) is a useful pharmacological action first discovered by the present inventors.
[0021]
In addition, in the range which does not impair the effect of this invention, the bisnaphthoquinone derivative represented by a formula (I) can also be separately added to the above-mentioned spinach extract of this invention for the purpose of an effect | action enhancement.
[0022]
In addition, the testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention includes those containing a spinach extract containing an effective amount of the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) as an active ingredient. Here, the “effective amount” means an amount sufficient to obtain a desired testosterone 5α-reductase inhibitory action. The bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) is a main active ingredient of the extract of the botanca that is an active ingredient of the present invention. If the bosenca extract contains an effective amount of the compound of the formula (I), this is used as it is. It can be used as a testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention. When the compound of formula (I) is contained but is not sufficient to obtain the desired testosterone 5α-reductase inhibitory action, a sesame extract to which a compound of formula (I) has been added can be used.
[0023]
Both the spinach extract thus obtained or the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) have an excellent testosterone 5α-reductase inhibitory action without an undesirable hormone-like action. For diseases caused by abnormal production of DHT, for example, skin diseases such as androgenetic alopecia, acne, etc., as an external medicine, quasi-drug, cosmetics, and for diseases such as prostatic hypertrophy, oral preparations Alternatively, it can be used for prevention or treatment by administration as a pharmaceutical preparation for injection, but is not particularly limited thereto.
[0024]
The spinach extract of the present invention is usually 1 mg to 1 g, preferably 10 mg to 500 mg at a dry weight at a time in the case of an external preparation, and 0.1 to 500 mg at a time in the case of an internal preparation. Preferably, 0.5 to 100 mg can be blended. In addition, the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) of the present invention is usually 0.1 mg to 500 mg, preferably 1 mg to 50 mg, preferably 0.01 mg for internal use per one adult. -100 mg, preferably 0.1 mg to 50 mg can be blended. However, since the dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., an amount smaller than the above dosage range may be sufficient, and it is necessary to administer beyond the range. In some cases.
[0025]
The dosage form of the testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention is not particularly limited. For example, for male pattern baldness, it is usually a hair lotion, shampoo, rinse, hair tonic, hair treatment, hair cream, etc. What is used for hair is used for normal skin such as ointments, lotions, creams, gels, and emulsions for acne. Moreover, if it is for prostatic hypertrophy, it can also be set as normal oral preparations or injections, such as a tablet, a capsule, a granule, a fine granule, a powder, a liquid.
[0026]
In the testosterone 5α-reductase inhibitor of the present invention, in addition to the above-described essential component extract of bosenca or bisnaphthoquinone derivative represented by formula (I), if necessary, within the range not impairing the effects of the present invention, In the case of external preparations, normally applied hydrocarbons, waxes, fats and oils, higher fatty acids, lower or higher alcohols, surfactants, fragrances, dyes, preservatives, antioxidants, UV absorbers, pH In the case of a regulator or an oral preparation, an appropriate excipient such as a disintegrant, a binder, a lubricant, a coating agent, a coloring agent, and the like can be added.
[0027]
Furthermore, as other medicinal components other than the sesame extract or the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) which is the active ingredient of the present invention, for example, follicular hormone (estradiol, ethinylestradiol, etc.), antiandrogen (spironolactone, Progesterone, etc.), anti-inflammatory, anti-rash agent (glycyrrhizinate, azulene, etc.), metabolism / hair root activator (pantothenic acid, pantotenyl alcohol, etc.), vitamins (vitamins A, B)₁, E, B₂, B₆, B₁₂, C, E, etc.), blood flow improving agents (dl-α-tocopherol, γ-oryzanol, etc.), local stimulants (such as ginger tincture, chili pepper tincture), keratolytic agents (salicylic acid, resorcin, etc.), antiseborrhea Agents (lecithin, sulfur, etc.), bactericides (benzalkonium chloride, hinokitiol, etc.), moisturizers (lemon extract, hyaluronic acid, propylene glycol, glycerin, etc.) etc. It can also be used in combination with a bisnaphthoquinone derivative represented by:
[0028]
In addition, as a medicinal component other than the extract of the spinach of the present invention or the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I), various herbal medicines such as emblem, hypericum, chimpi, gypsum, ginger, carrot, ganoderma, tahibo, rosemary, garlic One or more kinds of extracts such as these can also be added. As a method for extracting and adding such herbal medicine, a method usually used for extracting herbal medicine, for example, a liquid obtained by extraction with water and / or an organic solvent, or a solvent distilled away, is obtained from a sesame extract or formula (I) Or a method of simultaneously extracting these herbal medicines during the extraction of the botanca, or a botanca extract, preferably anhydrous or hydrous lower alcohol (more preferably, 10 to A method of re-extracting these herbal medicines using a botanca extract obtained by (80V / V% ethanol).
[0029]
In addition, when using the spinach extract of the present invention as an external preparation, lemon, mandarin orange, Citrus fruit components such as sudachi and yuzu can be added. Further, a method of re-extracting these fruits using a botanical extract, preferably a botanical extract obtained with anhydrous or hydrous lower alcohol (more preferably 10 to 80 V / V% ethanol) is particularly suitable.
[0030]
The present invention described above includes a hair-restoring composition containing a spinach extract. In this case, the hair-sensing extract is included in the hair-restoring composition of the present invention from the aspects of hair-restoring effect and economy. 0.001 to 10 W / V%, preferably 0.01 to 5 W / V% by dry weight can be blended.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
[0032]
Extraction example 1
The whole plant (above ground) (15kg) cut after shading in the shade for a day and night was soaked in 35V / V% ethanol (30 liters) and leached for one month. Next, the whole plant was filtered off, aged for another 2 weeks, and then filtered to obtain an extract (26 liters).
[0033]
Extraction example 2
The whole plant (above ground) (0.5 kg) cut after shading in the shade for a day and night was soaked in 50 V / V% ethanol (1 liter) and leached for 1 month. Next, the whole plant was filtered off, aged for another 2 weeks, and then filtered to obtain an extract (0.83 liter).
[0034]
Extraction example 3
The whole spinach (above ground) (0.5kg) cut after shading in the shade for a day and night was soaked in 70V / V% ethanol (1 liter) and leached for one month. Next, the whole plant was filtered off, aged for another 2 weeks, and then filtered to obtain an extract (0.87 liter).
[0035]
Extraction example 4
The extract (1 liter) obtained in Extraction Example 1 was evaporated under reduced pressure to give an extract (19 g).
[0036]
Experimental Example 1 (Acute toxicity test)
Two groups of 5 ICR mice (male, 5 weeks old, body weight 20-25 g) were treated with 5 g / kg orally and 1 g / kg intraperitoneally administered the spinach extract of Extraction Example 4. Even after day 14 of administration, none of the mice died, and LD₅₀The values were found to be oral administration: 5 g / kg or more and intraperitoneal administration: 1 g / kg or more. This shows that the safety of the spinach extract of the present invention is very high.
[0037]
Experimental Example 2 (Skin 10 day cumulative irritation test)
The hair of each of 10 Japanese white rabbits (male, body weight 2.5 to 3 kg) was depilated, and the depilation site was divided into two left and right sites (left: test site, right: untreated site) with the spine as the center. Next, these hair-removed rabbits were randomly divided into two groups of 5 each, with one group being an example group and the other being a placebo (placebo) group. Next, a 10 W / V% liquid paraffin solution (0.5 mL) of the extract of extraction example 4 was uniformly applied to the test sites of 5 rabbits in the example group at a frequency of once a day for 10 days. The animals were reared under the conditions (temperature: 23 ± 2 ° C., light / dark cycle 12 hours, lighting time 7: 00-19: 00). In addition, liquid paraffin (0.5 mL) was applied to the placebo group in the same manner as in the example group. After 10 days, all rabbit test sites were observed with the naked eye. The results are shown in Table 1.
[0038]
[Table 1]

[0039]
In Table 1 above, A is the number of individuals showing findings showing irritation such as redness and inflammation, and B is the total number of individuals in the group.
In the skin irritation test, no difference was observed between the placebo group and the example group, and thus it was found that the spinach extract of the present invention has almost no cumulative irritation to the skin.
[0040]
Extraction example 5
The extract (26 liters) obtained in Extraction Example 1 was concentrated to about 2 liters under reduced pressure, and then liquid-liquid extracted twice with ethyl acetate (1 liter). Next, the ethyl acetate extracts were combined, dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated under reduced pressure to give an ethyl acetate extract (8.6 g).
[0041]
<Method for producing 2,2'-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) (I)>
Production Example 1
Chloroform was added to the ethyl acetate extract (10.0 g) of bosenca obtained by the method of Extraction Example 5, and the insoluble material was filtered off. Next, the residue obtained by concentrating the filtrate under reduced pressure was separated and purified twice by silica gel column chromatography (developing solvent: chloroform), and then recrystallized from ethyl acetate to give 2,2'-ethylidenebis (2) -yellow prism crystals ( 3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) (1.03 g) was obtained.
[0042]
IR (KBr) cm^-1: 3296, 1664, 1637, 1359, 1344, 1278, 729.
¹H-NMR (CDCl_Three): 1.73 (3H, d, J = 7.5Hz, = CHCH _Three ), 4.83 (1H, q, J = 7.5Hz, = CHCH_Three), 7.54-7.83 (4H, m, 6,7-H of naphthoquinone), 7.96-8.14 (4H, m, 5,8-H of naphthoquinone), where “= C” is the first carbon of alkylidene Means an atom.
Elemental analysis: C_{twenty two}H₁₄O₆Calculated value C% = 70.59 H% = 3.77, measured value C% = 70.86 H% = 3.93
m. p. 196-198 ° C.
[0043]
Production Example 2
Under argon substitution, a solution of Lawson (10.0 g) and acetal (14.28 g) in dimethylformamide (50 mL) was stirred at 80 ° C. for 4.5 hours. After cooling, ethyl acetate was added to the reaction solution, washed in turn with diluted hydrochloric acid and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained residue was crystallized from ethyl acetate, and further recrystallized from ethyl acetate to obtain 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) (9.10 g) as yellow prism crystals. .
[0044]
Physical property data of compounds obtained in this production example (IR,¹1 H-NMR, elemental analysis, m.p.) were consistent with those obtained in Production Example 1 extracted and isolated from spinach.
[0045]
Experimental Example 3 (Acute toxicity test)
Each group of 5 ICR mice (male, 5 weeks old, body weight 20-25 g), 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) of Production Example 1 from 250 mg / kg to 1000 mg Orally administered at a dose between / kg. The compound was used by dispersing in a 0.5% sodium carboxymethylcellulose aqueous solution. As a result, LD₅₀The value was 514 mg / kg.
[0046]
Experimental Example 4 (Testosterone 5α-reductase inhibitory activity experiment)
(Method for preparing enzyme solution)
A prostate (wet weight 15.038 g) excised from a Wistar male rat was cut into small pieces, and 0.1 M-HEPES buffer solution (hereinafter referred to as “buffer solution”) (45 mL) containing 0.25 M-sucrose was added and homogenized. Subsequently, the mixture was centrifuged at 900 × g for 5 minutes, the precipitate was suspended in a buffer solution (27.5 mL), and centrifuged again at 900 × g for 5 minutes. A buffer solution (11.25 mL) was added to the sediment and suspended, and this was used as an enzyme solution.
[0047]
(Testosterone 5α-reductase inhibitory activity assay)
Ethanol solution (100 μL) of the extract of bosenka of Extraction Example 5 prepared in various concentrations (10 μg / mL to 1 mg / mL) or 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) of Preparation Example 1 And ethanol mixture of testosterone (5 μg / mL) (50 μL) were evaporated to dryness with nitrogen gas, 40 mM sodium hydrogen phosphate buffer (488 μL), 28 mM dithiothreitol (20 μL), 2.8 mM-β -NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form) (10 μL) and enzyme solution (50 μL) were added and mixed, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. N-Hexane (1 mL) was added to this mixed solution, shaken for 10 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. Next, the n-hexane layer was separated and dried under reduced pressure, trifluoroacetic acid (100 μL) was added, and the mixture was incubated at 40 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the n-hexane solution (1 μg / mL) (100 μL) of hexachlorobenzene was added as an internal standard substance to the residue obtained by drying the mixed solution under reduced pressure, and dissolved to obtain a sample solution. On the other hand, a solution obtained by the same method as described above, which does not contain a botanical extract or 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) was used as a control solution.
[0048]
For each sample solution and control solution, the amount of dihydrotestosterone (DHT) reduced by testosterone 5α-reductase was measured using a gas chromatograph mass spectrometer, and the testosterone 5α-reductase inhibition rate of each sample solution was determined according to the following formula: Was calculated.
[0049]
[Expression 1]

[0050]
A: DHT peak area of control solution / peak area of internal standard substance
B: DHT peak area of sample solution / peak area of internal standard substance
Further, from the inhibition rate at each concentration of the sample, 50% inhibitory concentration (IC) of testosterone 5α-reductase of bosenka extract and 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) was determined.₅₀Value). The results are shown in Tables 2 and 3.
[0051]
[Table 2]

[0052]
[Table 3]

[0053]
Based on the above, it was confirmed that 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone), which is a sesame extract and sesame component, has testosterone 5α-reductase inhibitory activity. As a comparison, the same test was conducted using Lawson.₅₀The value was over 500 μg / mL.
[0054]
Experimental Example 5 (Anti-acne activity test)
Antibacterial activity against two types of acne bacteria (Propionibacterium acnes, Prpionibacterium avidum) was tested by an agar culture method.
[0055]
(Antimicrobial activity against Propionibacterium acnes)
Extraction solution of suspension 1 of Extraction Example 1 prepared in various concentrations, Extract of spinach extract of Extraction Example 5 and ethanol solution or suspension of 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) of Preparation Example 1 (0.2 mL) was dissolved or uniformly suspended in GAM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical) (9.8 mL), poured into a test tube and coagulated (final ethanol content: 2%). After puncturing and inoculating Propionibacterium acnes on each medium, Tryptic Soy Broth medium (DIFCO) (2 mL) was overlaid on the upper layer of the medium (anaerobic culture). Subsequently, after culturing at 30 ° C. for 7 days, the growth of the fungus at various concentrations in each sample was observed, and the minimum growth inhibitory concentration (MIC) was determined from the presence or absence. The results are shown in Table 4.
[0056]
In addition, when Propionibacterium acnes was previously cultured in a medium using only ethanol (0.2 mL), which is the solvent of the sample, the growth of the bacteria was observed without any problem, so that the effect of the solvent on this test was not assumed. .
[0057]
(Antimicrobial activity against Propionibacterium avidum)
Extract 1 of Boseca extract prepared in various concentrations, Extract 5 of Boseca extract and Preparation 1 of 2,2′-ethylidenebis (3-hydroxy-1,4-naphthoquinone) in 5% ethanol solution or suspension The suspension (1 mL) was dissolved or uniformly suspended in Tryptic Soy Broth medium (DIFCO) (9 mL) containing 1.5% agar, poured into a petri dish and coagulated (final ethanol content: 0.5%), and then Propionibacterium avidum was added to each medium. Was inoculated. Next, after culturing at 30 ° C. for 3 days, the growth of bacteria at various concentrations in each sample was observed, and the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined from the presence or absence.
[0058]
In addition, when Propionibacterium avidum was cultured in advance in a medium using only 5% ethanol (1 mL), which is the solvent of the sample, the growth of the bacteria was observed without any problem, so that there was no effect of the solvent on this test. did. The results are shown in Table 4.
[0059]
[Table 4]

[0060]
From the above, high anti-acne fungal activity was observed in the spinach extract, particularly the ethyl acetate extract containing a large amount of fat-soluble components. Therefore, the extract of the spinach not only suppresses the secretion of sebum by the testosterone 5α-reductase inhibitory action described above, but also has an excellent anti-acne prevention function that has a function of preventing skin inflammation and the like by an antibacterial action against acne hair follicle bacteria. -To provide a therapeutic composition.
[0061]
Extraction example 6
Lemon fruit (0.5 kg) was added to the extract (10 liters) obtained in Extraction Example 1 and leached for 2 weeks. Next, the lemon fruit was filtered off, aged for another 2 weeks, and then filtered to obtain a lemon / scented extract (9.8 liters).
[0062]
Extraction example 7
The whole cut grass (above ground) (160 g) was cut and extracted twice with methanol (1 liter) at 60 ° C. for 5 hours. After cooling, the whole plant was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain an extract (18.9 g).
[0063]
Extraction example 8
The whole cut dry grass (above ground) (160 g) was extracted by heating twice with ethyl acetate (1 liter) at 60 ° C. for 5 hours. After cooling, the whole plant was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain an extract (6.4 g).
[0064]
Example 1 (hair lotions 1-1 to 1-3)
A 31.5 mL of extract liquid from extraction example 1
B Absolute ethanol 12.0mL
C Appropriate amount of purified water
After mixing A and B, C was added so that the total amount was 100 mL, and the mixture was uniformly mixed and stirred to obtain a hair lotion (1-1).
[0065]
A 5.0 mg of the compound of Production Example 1
B Absolute ethanol 20.0mL
C Appropriate amount of purified water
After dissolving A in B, C was added so that the total amount was 100 mL, and the mixture was uniformly mixed and stirred to obtain a hair lotion (1-2).
[0066]
A 31.5 mL of extract liquid from extraction example 1
B Compound 1.5 of Production Example 1
C absolute ethanol 12.0mL
D Appropriate amount of purified water
B was dissolved in C. After adding A, D was added so that the total amount was 100 mL, and the mixture was uniformly mixed and stirred to obtain a hair lotion (1-3).
[0067]

Each component of B was dissolved in C and mixed uniformly with A. Next, a solution in which each component of D is dissolved in E is added to the previously prepared mixture of A, B, and C. Further, F is added so that the total amount becomes 100 mL. Lotion.
[0068]
Example 3 (hair shampoo)
A 28.0mL of the extract from Extraction Example 1
B 25V / V% ethanol 12.0mL
C Nissan Anon 5010 [Nippon Yushi Co., Ltd.] 360.0mL
A, B, and C were mixed and stirred uniformly to obtain a hair shampoo.
[0069]

After each component of C was uniformly mixed, D was added and premixed. Next, the components A and B, which were uniformly mixed and dissolved, were added and further mixed, and then granulated and dried (1 m / m) to obtain a granule hair growth supplement.
[0070]
A hair growth test was performed by the following method using the hair lotion and hair shampoo obtained in Examples 1 and 3 above.
[0071]
<Hair growth test>
95 subjects (including 9 women) both hair lotion (1-1) of Example 1 (3 months: 100 mL × 6) and hair shampoo of Example 3 (3 months: 400 mL × 3) Was continuously used for 3 months. After 3 months, the subjects were first evaluated in three stages: “effective”, “ineffective”, “unknown effect”, and the subjects who answered “effective” Got an answer about. The results are shown in Tables 5-7.
[0072]
[Table 5]

[0073]
Table 6 below shows specific contents of effects of persons (effective group) who answered that “there was an effect” in the evaluation experiment of Table 5 above.
[0074]
[Table 6]

[0075]
Table 7 below shows the period of time from the start of use of the hair-restoring composition to the manifestation of the effect of the person (effective group) who answered “effective” in the evaluation experiment of Table 5.
[0076]
[Table 7]

[0077]
At the end of this test, that is, after continuous use for 3 months, none of the subjects showed any abnormalities such as skin irritation.
[0078]

In accordance with the above formulation, the component A was uniformly dissolved, then gradually added to the component solution B and mixed and dissolved uniformly to obtain a skin lotion.
[0079]

According to the above formulation, each of the A and B components was heated to about 80 ° C., A was gradually added to B with stirring and mixed uniformly, and then cooled to obtain a skin cream.
[0080]

In accordance with the above formulation, each of the A and B components was heated to about 80 ° C., A was gradually added to B with stirring, and the mixture was uniformly mixed, and then cooled to obtain an emulsion.
[0081]

According to the said prescription, after A component was uniformly disperse | distributed to B, C was added and mixed to make an ointment.
[0082]

According to the said prescription, after A component was uniformly disperse | distributed to B, C was added and mixed to make an ointment.
[0083]

Each component was uniformly mixed so that one tablet had the above ratio, and then tableted to obtain a tablet.
[0084]

Each component was uniformly mixed so that one capsule had the above ratio, and then filled into capsules.
[0085]

Each component was uniformly mixed so that one capsule had the above ratio, and then filled into capsules.
[0086]
【The invention's effect】
The spinach extract of the present invention and the bisnaphthoquinone derivative represented by the formula (I) are highly safe and have an excellent testosterone 5α-reductase inhibitory action without hormone-like action. A composition containing a substance as an active ingredient is effective for the prevention and treatment of diseases caused by abnormal production of DHT such as androgenetic alopecia, acne and benign prostatic hyperplasia.

Claims (3)

A testosterone 5α-reductase inhibitor containing, as an active ingredient , a bisnaphthoquinone derivative represented by the following formula (I) ( excluding those extracted and isolated from spinach) .

  A hair growth composition comprising the testosterone 5α-reductase inhibitor according to claim 1 as an active ingredient.   A composition for acne comprising the testosterone 5α-reductase inhibitor according to claim 1 as an active ingredient.