JP4214648B2 - Glycated protein measurement reagent - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は全血、血清、血漿、尿等の生体試料中に存在する特定の糖化蛋白質の測定法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
糖化蛋白質とは、蛋白質がグルコースと非酵素的に結合したものであり、全血、血清、血漿、尿等の生体試料中には、例えば、アルブミンとグルコースが結合した糖化アルブミン（以下GAと略記する）、グロブリンとグルコースが結合した糖化グロブリン、リポ蛋白質とグルコースが結合した糖化高比重リポタンパク（以下、糖化ＨＤＬと略記する）、糖化低比重リポ蛋白（以下、糖化ＬＤＬと略記する）、ヘモグロビンとグルコースが結合した糖化ヘモグロビン、トランスフェリンとグルコースが結合した糖化トランスフェリン等が存在する。また、これらのうち血清中に存在するものを総称してフルクトサミンという場合もある。
【０００３】
糖化蛋白質は、その量が先行期間の血糖値を反映するため、糖尿病のマーカーとして有用とされており、現在臨床検査の分野でも、糖化ヘモグロビン、GA、フルクトサミン等の測定が行われている。中でも、GAは、血漿蛋白質であるアルブミンが糖化したものであり、血球蛋白質であるヘモグロビンが糖化した糖化ヘモグロビンとは異なり他の生化学的検査項目と同時に測定可能であり、また、糖化蛋白質中の濃度が高く、種々の血清糖化蛋白質の混合物であるフルクトサミンと比較し蛋白質部分の構造が明らかになっているため、糖尿病マーカーとして好ましいものの一つとなっている。
【０００４】
また、どの時期の血糖値の指標となるかは、それぞれの蛋白質部分の半減期により異なり、GAは糖化ヘモグロビンより半減期が短いため、短期間の血糖値の指標としてその測定は有用であるといえる。
【０００５】
従来、糖化蛋白質の測定法としては、チオバルビツール酸法、フロシン法、アフィニティクロマトグラフィ−法、RIA法、ELISA法等様々な方法が報告されているが、測定手技の繁雑さ、測定精度の面で臨床検査法としては普及していない。
【０００６】
近年、上記した如き問題点を解消するために、プロテアーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等を用いる糖化蛋白質測定法、いわゆる酵素的測定法が開発されている（例えば特開平2-195899号公報、特開平2-195900号公報、特開平 5-192193号公報、特開平6-46846号公報、特開平7-289253号公報、特開平8-154672号公報、特開平8-336386号公報などに記載の方法）。しかしながら、糖化蛋白質の糖化部位はＮ末端アミノ基又はリジン残基のεアミノ基にあり、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等は当該部位の認識はできるが糖化蛋白質を識別することが出来ないため、酵素的測定法を用いても、アルブミン、グロブリン、トランスフェリン、リポ蛋白質等の各種血清蛋白質由来の糖化蛋白質が共存する試料中において特定の糖化蛋白質を特異的に測定することができない等の問題がある。
【０００７】
また、上記酵素法以外に用いられている一般的な方法として、高速液体クロマトグラフィー法があるが、この方法は、糖化蛋白質測定用の専用機を用いなければならず、また、測定に時間がかかる等の問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き状況に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中の特定の糖化蛋白質を特異的に測定する事を可能とする方法の提供にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、
「生体由来試料を、当該試料中の特定の糖化蛋白質以外の糖化蛋白質がプロテアーゼとの反応に関与するのを阻害する物質（以下、特定阻害物質と略記する）の存在下、プロテアーゼと接触させ、生成した糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドの量に基づいて特定の糖化蛋白質量を測定することを特徴とする、生体由来試料中の特定の糖化蛋白質の測定方法。」、及び
「特定阻害物質とプロテアーゼとを含んでなる、特定の糖化蛋白質測定用試薬。」に関する。
【００１０】
即ち、本発明者らは、生体試料中の特定の糖化蛋白質を特異的に測定する事を可能とする方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、従来の酵素的測定法に特定阻害物質を添加することにより、特定の糖化蛋白質のみをプロテアーゼと反応させ、生成した糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドの量を測定することにより特定の糖化蛋白質量の測定が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の測定方法は、全血、血清、血漿、尿等に含まれる糖化蛋白質の何れにも適用することができ、具体的には例えばGA、糖化グロブリン、糖化トランスフェリン、糖化ＨＤＬ、糖化ＬＤＬ、糖化アンチトリプシン等の測定、中でも血漿、血清中に多量に含まれるGAや糖化グロブリン、就中、GAの測定に有利に適用することが出来る。
【００１２】
本発明に於いて用いられる特定阻害物質としては、例えば特定の糖化蛋白質以外の糖化蛋白質に対する抗体、水溶性ポリマー等が挙げられる。
【００１３】
特定阻害物質としての特定の糖化蛋白質以外の糖化蛋白質に対する抗体としては、糖化蛋白質の糖鎖部分に結合する抗体でも蛋白質部分に結合する抗体でも、或いは糖鎖と蛋白質との結合部分に結合する抗体の何れでもよく、中でも抗全血清抗体から特定の糖化蛋白質に対する抗体を除いたものが好ましいが、血清中の含量が比較的多い糖化蛋白質に対する抗体、例えば、抗アルブミン抗体、抗グロブリン抗体、抗高比重リポ蛋白抗体、抗低比重リポ蛋白抗体、抗トランスフェリン抗体、抗アンチトリプシン抗体の中から目的に応じて適宜選択して用いることもでき、これら抗体は単独でも、適宜組み合わせて用いてもよい。例えば、特定の糖化蛋白質がGAの場合、特定阻害物質としての抗体としては、抗アルブミン抗体を除いた抗全血清抗体を用いることが好ましいが、抗グロブリン抗体、抗高比重リポ蛋白抗体、抗低比重リポ蛋白抗体、抗トランスフェリン抗体、抗アンチトリプシン抗体等の中から選択したもの、例えば、これら抗体の混合物や抗グロブリン抗体を単独で用いてもよい。
【００１４】
その濃度は、特定阻害物質と反応する糖化蛋白質がプロテアーゼと反応しなくなる濃度であればよいが、例えば、測定時の反応液中の濃度が、通常0.01〜10mgAb／ml、好ましくは0.01〜１mgAb／mlとなるように使用される。また、特定阻害物質を添加する時期としては、プロテアーゼ反応と同時又はそれ以前が好ましい。
これら抗体は、通常この分野で使用されているものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の区別なく全て使用可能であり、市販品でも、自体公知の調製方法（例えば、エンザイムイムノアッセイ、石川栄治著，１９８９，東京化学同人等に記載の方法）に準じて、調製されたものでもよい。また、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法により精製したものを用いてもよい。
【００１５】
特定阻害物質としての水溶性ポリマーとしては、例えばポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、並びに例えばデキストラン，デキストラン硫酸又はその塩，コンドロイチン硫酸又はその塩等の多糖類が挙げられるが、中でもポリエチレングリコール、デキストラン等が好ましい。また、その使用濃度は、特定の糖化蛋白質の種類により異なるが、測定時の反応液中の濃度として、通常５〜４０％、好ましくは５〜２０％である。また、これらは、自体公知の方法に従い調製したものを用いても、市販品を用いてもよい。
【００１６】
本発明に於いて用いられるプロテアーゼとしては、糖化蛋白質から、過酸化水素を生成させる性質を有する酵素（以下、過酸化水素生成酵素と略記する）の基質となり得る糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドを遊離させるものであれば特に限定されないが、通常この分野で使用されているもの、例えば、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＡ、ズブチリシン、ヒトカテプシン、プロテアーゼＰ、プロテアーゼＮ、プロナーゼ、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、プロレザー、パパイン、プロテアーゼＡ、プロメラインＦ等は全て使用可能であり、中でも、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ等が好ましい。また、これらは適宜組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
これらの使用量としては、特に制約はされないが、例えば、反応液中の濃度として、通常0.1〜100mg/ml、好ましくは0.1〜10mg/mlである。
【００１８】
本発明の生体由来試料中の特定の糖化蛋白質の測定法は、例えば以下の如く実施される。
即ち、生体由来試料を、特定阻害物質の存在下、プロテアーゼと反応させ、糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドを生成させる。その糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドの量に基づいて特定の糖化蛋白質量を測定する。
より具体的には、例えば以下の如く実施すればよい。
【００１９】
生体由来試料を、特定阻害物質の存在下、プロテアーゼと反応させ、糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドを生成させる。次いで、生成した糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドと過酸化水素生成酵素とを反応させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素にペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）と被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて色素を生成させ、生成した色素量を吸光度として測定し、得られた吸光度に基づいて生体由来試料中の特定の糖化蛋白質量を算出する。尚、被酸化性呈色試薬により色素を生成させ生体由来試料中の特定の糖化蛋白質量を算出する代わりに、公知の電極法により、ＰＯＤ反応の結果生成する過酸化水素量又は減少する酸素量を測定し、その結果に基づいて生体由来試料中の特定の糖化蛋白質量を算出しても良い。
【００２０】
本発明に於いて用いられる過酸化水素生成酵素としては、通常この分野で使用されているものは全て使用可能であるが、具体的には、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等があげられ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、例えば、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報）、アスペルギルス（Aspergills）属（特願平9-520371号再公表特許公報）、フサリウム属（特開平7-289253号公報）、カンジダ属（特開平6-46846号公報）等の微生物に由来するもの等が挙げられる。
【００２１】
また、その濃度は、試液中の濃度として、通常10〜50U/L、好ましくは10〜50 U/Lであり、反応液中の濃度として、通常0.25〜200 U/L、好ましくは2.5〜20 U/Lである。
【００２２】
本発明に於いて用いられるＰＯＤとしては、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例えば試液中の濃度として、通常0.1〜1000u／ml、好ましくは0.25〜400u／ml、より好ましくは0.5〜200u／mlであり、また、最終反応液中の濃度として、通常0.1〜250u／ml、好ましくは0.25〜100u／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。
【００２３】
本発明に於いて用いられる被酸化性呈色試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよいが、例えば４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物、ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンチジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。
【００２４】
カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なるが、例えば試液中の濃度として、通常0.01〜400mM、好ましくは0.1〜40mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲である。
【００２５】
本発明の特定の糖化蛋白質測定用試薬は、従来の糖化蛋白質の酵素的測定用試薬に本発明に係る特定阻害物質を含有させたものであり、上記した如き生体試料中の糖化蛋白質を測定する方法に使用される試薬類、例えば特定阻害物質、プロテアーゼ、過酸化水素生成酵素、POD及び被酸化性呈色試薬等を、通常使用される濃度範囲で含有するように調製されたものであればよく、それらの構成要件の好ましい実施態様や使用濃度等は上で述べたとおりである。また、当該試薬に、両性界面活性剤、陰性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤を含むものを用いてもよい。
【００２６】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
実施例１ GAおよび血清の測定
〔 試料 〕
試料としてのGA標準液は、ヒトアルブミンより臨床検査 34 493 1990記載の方法に従って調製したGAを用いて、５種の濃度（１：200μmol/l、２：304μmol/l、３：407μmol/l、４：510μmol/l、５：611μmol/l）のものを調製した。
ヒト血清５検体も試料として用いた。
【００２８】
〔 試薬 〕
第一試薬は、8mM 4-アミノアンチピリン、15IU/ｌ ペルオキシダーゼ、5IU/ｌアスコルビン酸オキシダーゼ、5000PU/ml プロナーゼ、30IU/ml アルカリプロテアーゼ、及び所定の抗体（▲１▼抗ヒトIg（G+A+M）、▲２▼抗ヒトIgG ＜MCA＞、▲３▼抗ヒトアルブミン抗体吸収済み抗ヒト全血清）を含む10mM HEPES（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）緩衝液（ｐH 8.0）である。第二試薬は、24IU/l フルクトシルアミンオキシダーゼ、及び12mM N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンを含む150mM HEPES緩衝液（ｐH 7.5）である。
【００２９】
〔 測定方法 〕
日立自動分析装置7070形を用い、以下の測定条件で実験を行った。その結果を表1に示す。尚、GA濃度（μmol/l）は、各試薬系で得られたGA標準液２（GAを304μmol/l含有）の吸光度を標準として求めた。
【００３０】
〔測定条件〕
測定方法 ２ポイントエンド法
試料量 ９μｌ
試薬量 第一試薬 240μl、第二試薬 90μl
測定波長 主波長 570nm、副波長 700nm
測定温度 ３７℃
【００３１】
【表１】
表１の結果から、GAの測定値はGAの濃度にかかわらず、抗体を添加した場合と添加しない場合とで差がないこと、言い換えれば、抗体添加によるGA測定への影響はないことが判る。また、血清に抗体を添加すると、添加しない場合と比較して測定値が低値となることから、抗体を添加することによりGAの測定値に誤差を与える可能性のある物質（例えば、糖化グロブリン等）の影響を回避し得ることが判る。
【００３３】
実施例２
血清中 GA の測定
実施例１と同様にして得られたGA測定値から下記の如くして求めたGA値＜％＞とHPLC法により得られたGA値＜％＞を比較した。
〔 試料 〕
試料は、ヒト血清３５検体を用いた。
〔 本発明によるGA値＜％＞の算出 〕
実施例１で使用した抗体▲３▼添加系試薬及び抗体無添加系試薬を用いて試料中のGA濃度（μmol/l）を、また、アルブミンII-HAテストワコー（BCG法、和光純薬工業（株）製）を用いて同一検体の総アルブミン濃度（μmol/l）を、夫々求め、両者よりGA値＜％＞［（GA濃度／総アルブミン濃度）×１００）］を算出した。
〔 HPLC法によるGA値＜％＞の算出 〕
自動グリコアルブミン測定装置GAA-2000（京都第一科学社製）を用いて、GA値＜％＞を求めた。
〔 結果 〕
抗体▲３▼添加系試薬を用いて得られたGA値＜％＞とHPLC法により得られたGA＜％＞値との相関図を図１に、抗体無添加系試薬を用いて得られたGA＜％＞値とHPLC法により得られたGA値＜％＞との相関図を図２に夫々示す。
【００３４】
図１及び図２の結果から、抗体▲３▼添加系試薬を用いて得られるGA値＜％＞は、抗体無添加系試薬を用いて得られるGA値＜％＞と比較して、HPLC法により得られる測定値とより良好な相関関係を示し、本発明の方法によりGAの測定値に誤差を与える物質の影響を回避でき、より精度の高いGA測定が出来ることが判る。
実施例３
〔 試料 〕
試料としてのGA標準液は、ヒトアルブミンより臨床検査 34 493 1990記載の方法に従って調製したGAを用いて、５種の濃度（１：248μmol/l、２：335μmol/l、３：437μmol/l、４：558μmol/l、５：670μmol/l）のものを調製した。
また、ヒト血清５検体も試料として用いた。
【００３５】
〔 試薬 〕
第一試薬は、8mM 4-アミノアンチピリン、15IU/ｌ ペルオキシダーゼ、5IU/ｌアスコルビン酸オキシダーゼ、5000PU/ml プロナーゼ、30IU/ml アルカリプロテアーゼ、及び所定の水溶性ポリマーを所定濃度含む10mM HEPES（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）緩衝液（ｐH 8.0）である。尚、水溶性ポリマーとしては以下のものを用いた。
▲１▼ポリエチレングリコール6000
（PEG6000；平均分子量7500、和光純薬工業（株）製）
▲２▼デキストラン100000-200000（和光純薬工業（株）製））
第二試薬は、24IU/l フルクトシルアミンオキシダーゼ、及び12mM N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンを含む150mM HEPES緩衝液（ｐH 7.5）である。
【００３６】
測定条件は実施例1と同様にして行った。その結果を表2に示す。尚、GA濃度（μmol/l）は、各試薬系で得られたGA標準液2（GAを335μmol/l含有）の吸光度を標準として、試料中のGA濃度（μmol/l）を求めた。
【００３７】
【表２】
表２の結果から、GAの測定値はGAの濃度にかかわらず、水溶性ポリマーを添加した場合と添加しない場合とで差がないこと、言い換えれば、水溶性ポリマーによるGA測定への影響はないことが判る。また、血清に水溶性ポリマーを添加すると、添加しない場合と比較して測定値が低値となることから、水溶性ポリマーを添加することによりGAの測定値に誤差を与える可能性のある物質（例えば、糖化グロブリン等）の影響を回避し得ることが判る。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、全血、血清、血漿、尿等の生体試料中に存在する特定の糖化蛋白質の測定をするに際し、従来の酵素的測定法に特定阻害物質を添加することを特徴とする発明であり、本発明によれば、特定の糖化蛋白質のみをプロテアーゼと反応させ、生成した糖化アミノ酸又は／及び糖化ペプチドの量を測定することにより特定の糖化蛋白質量を簡便・高精度に測定出来、且つ、従来の専用機を用いるHPLC法と比較し、汎用性があり、また短時間で測定できる点に顕著な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体▲３▼添加系試薬を用いて得られたGA値＜％＞とHPLC法により得られたGA＜％＞値との相関図を表した図である。
【図２】抗体無添加系試薬を用いて得られたGA＜％＞値とHPLC法により得られたGA値＜％＞との相関図表した図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for measuring a specific glycated protein present in a biological sample such as whole blood, serum, plasma and urine.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
A glycated protein is a protein that is non-enzymatically bound to glucose. In biological samples such as whole blood, serum, plasma, and urine, for example, glycated albumin (hereinafter abbreviated as GA) in which albumin and glucose are bound. Glycated globulin in which globulin and glucose are combined, glycated high density lipoprotein in which lipoprotein and glucose are combined (hereinafter abbreviated as glycated HDL), glycated low density lipoprotein (hereinafter abbreviated as glycated LDL), hemoglobin There are glycated hemoglobin in which glucose and glucose are bound, glycated transferrin in which transferrin and glucose are bound, and the like. Of these, those present in serum may be collectively referred to as fructosamine.
[0003]
Since the amount of glycated protein reflects the blood glucose level of the preceding period, it is considered useful as a marker for diabetes, and glycated hemoglobin, GA, fructosamine and the like are currently measured in the field of clinical examination. Among them, GA is a plasma protein albumin that is glycated, and can be measured simultaneously with other biochemical test items, unlike glycated hemoglobin in which hemoglobin, a blood cell protein, is glycated. Compared with fructosamine, which is a high concentration and a mixture of various serum glycated proteins, the structure of the protein portion has been elucidated, making it a preferred marker for diabetes.
[0004]
In addition, the timing of the blood glucose level depends on the half-life of each protein part, and GA has a shorter half-life than glycated hemoglobin. I can say that.
[0005]
Conventionally, various methods such as thiobarbituric acid method, furosine method, affinity chromatography method, RIA method and ELISA method have been reported as methods for measuring glycated protein. However, it is not widely used as a clinical test method.
[0006]
In recent years, a glycated protein measurement method using protease, fructosyl amino acid oxidase, or the like, a so-called enzymatic measurement method has been developed in order to solve the above-described problems (for example, Japanese Patent Laid-Open No. 2-195899 and Japanese Patent Laid-Open No. -195900, JP-A-5-192193, JP-A-6-46846, JP-A-7-289253, JP-A8-154672, JP-A-8-336386, etc.) . However, the glycosylation site of glycated protein is in the N-terminal amino group or the ε-amino group of lysine residue, and fructosyl amino acid oxidase can recognize the site but cannot identify the glycated protein. Even if this method is used, there is a problem that a specific glycated protein cannot be specifically measured in a sample in which glycated proteins derived from various serum proteins such as albumin, globulin, transferrin and lipoprotein coexist.
[0007]
As a general method used in addition to the above enzyme method, there is a high-performance liquid chromatography method, but this method requires the use of a dedicated machine for measuring glycated protein, and the measurement takes time. There are problems such as this.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the situation as described above, the problem to be solved by the present invention is to provide a method that allows specific glycated protein in a biological sample to be specifically measured.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to solve the above problems,
“A biological sample is brought into contact with a protease in the presence of a substance that inhibits glycated proteins other than the specific glycated protein in the sample from participating in the reaction with the protease (hereinafter abbreviated as a specific inhibitor) A method for measuring a specific glycated protein in a sample derived from a living body, characterized in that the amount of a specific glycated protein is measured based on the amount of the glycated amino acid and / or glycated peptide produced, "and" a specific inhibitor and protease. A specific reagent for measuring glycated protein, comprising:
[0010]
That is, as a result of intensive studies to find a method that enables specific measurement of a specific glycated protein in a biological sample, the present inventors have added a specific inhibitor to a conventional enzymatic measurement method. As a result, it was found that by reacting only a specific glycated protein with a protease and measuring the amount of the glycated amino acid and / or glycated peptide produced, the amount of the specific glycated protein can be measured, and the present invention was completed. It came to do.
[0011]
The measurement method of the present invention can be applied to any glycated protein contained in whole blood, serum, plasma, urine, and the like. Specifically, for example, GA, glycated globulin, glycated transferrin, glycated HDL, glycated LDL, It can be advantageously applied to the measurement of glycated antitrypsin and the like, particularly GA and glycated globulin contained in a large amount in plasma and serum, especially GA.
[0012]
Specific inhibitors used in the present invention include, for example, antibodies to glycated proteins other than specific glycated proteins, water-soluble polymers, and the like.
[0013]
As an antibody against a glycated protein other than a specific glycated protein as a specific inhibitor, an antibody that binds to a sugar chain portion of the glycated protein, an antibody that binds to a protein portion, or an antibody that binds to a binding portion of a sugar chain and a protein Of these, antibodies obtained by removing antibodies against specific glycated proteins from anti-whole serum antibodies are preferred, but antibodies against glycated proteins having a relatively high content in serum, such as anti-albumin antibodies, anti-globulin antibodies, anti-high antibodies A specific gravity lipoprotein antibody, an anti-low density lipoprotein antibody, an anti-transferrin antibody, or an anti-antitrypsin antibody can be appropriately selected and used according to the purpose, and these antibodies may be used alone or in appropriate combination. For example, when the specific glycated protein is GA, it is preferable to use an anti-whole serum antibody excluding the anti-albumin antibody as the antibody as the specific inhibitor, but anti-globulin antibody, anti-high density lipoprotein antibody, anti-low Those selected from a specific gravity lipoprotein antibody, an anti-transferrin antibody, an anti-antitrypsin antibody, etc., for example, a mixture of these antibodies or an anti-globulin antibody may be used alone.
[0014]
The concentration may be any concentration as long as the glycated protein that reacts with the specific inhibitor does not react with the protease. For example, the concentration in the reaction solution at the time of measurement is usually 0.01 to 10 mgAb / ml, preferably 0.01 to 1 mgAb / Used to be ml. In addition, the timing of adding the specific inhibitor is preferably the same as or before the protease reaction.
Any of these antibodies can be used regardless of whether they are usually used in this field, regardless of whether they are polyclonal antibodies or monoclonal antibodies. Commercially available preparation methods (for example, enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, 1989) are also available. , A method described in Tokyo Chemical Co., Ltd.). Moreover, you may use what was refine | purified by methods, such as an ammonium sulfate fraction, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and affinity chromatography as needed.
[0015]
Examples of the water-soluble polymer as the specific inhibitor include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, synthetic polymer compounds such as polyvinyl pyrrolidone and polyvinyl alcohol, and dextran, dextran sulfate or a salt thereof, chondroitin sulfate or a salt thereof, for example. Polysaccharides such as polyethylene glycol and dextran are preferred. Moreover, although the use density | concentration changes with kinds of specific glycated protein, it is 5 to 40% normally as a density | concentration in the reaction liquid at the time of a measurement, Preferably it is 5 to 20%. Moreover, these may use what was prepared according to the method known per se, or may use a commercial item.
[0016]
As a protease used in the present invention, a glycated amino acid and / or a glycated peptide that can serve as a substrate for an enzyme having a property of generating hydrogen peroxide (hereinafter abbreviated as hydrogen peroxide generating enzyme) is released from a glycated protein. Although it is not particularly limited as long as it can be used, for example, those commonly used in this field, such as trypsin, lysyl endopeptidase, proteinase A, subtilisin, human cathepsin, protease P, protease N, pronase, pronase E, proteinase K, Pro leather, papain, protease A, promeline F, etc. can all be used, and among them, pronase, proteinase K, etc. are preferable. These may be used in appropriate combination.
[0017]
The amount of these used is not particularly limited, but for example, the concentration in the reaction solution is usually 0.1 to 100 mg / ml, preferably 0.1 to 10 mg / ml.
[0018]
The method for measuring a specific glycated protein in a biological sample of the present invention is performed, for example, as follows.
That is, a biological sample is reacted with a protease in the presence of a specific inhibitor to produce a glycated amino acid and / or a glycated peptide. A specific glycated protein mass is measured based on the amount of the glycated amino acid and / or glycated peptide.
More specifically, for example, the following may be performed.
[0019]
A biological sample is reacted with a protease in the presence of a specific inhibitor to produce glycated amino acids and / or glycated peptides. Next, the produced glycated amino acid or / and glycated peptide is reacted with a hydrogen peroxide-producing enzyme to produce hydrogen peroxide. The produced hydrogen peroxide is peroxidase (hereinafter abbreviated as POD) and oxidizable color. A reagent (for example, a combination of a coupler and a developer, a color former that develops color itself by oxidation) is allowed to act to produce a dye, the amount of the dye produced is measured as an absorbance, and a biological sample based on the obtained absorbance Calculate the amount of the specific glycated protein in it. In addition, the amount of hydrogen peroxide produced or the amount of oxygen reduced as a result of the POD reaction by a known electrode method, instead of calculating the amount of a specific glycated protein in a sample derived from a living body by generating a dye with an oxidizable color reagent And the amount of a specific glycated protein in a biological sample may be calculated based on the result.
[0020]
As the hydrogen peroxide-producing enzyme used in the present invention, any of those usually used in this field can be used, and specific examples include fructosyl amino acid oxidase. as, for example, Corynebacterium (Corynebacterium) genus (KOKOKU 5-33997 and JP Kokoku 6-65300 discloses), Aspergillus (Aspergills) genus (Japanese Patent Application No. Hei 9-520371 republished Patent Publication), Fusarium Examples include those derived from microorganisms such as genera (Japanese Patent Laid-Open No. 7-289253) and Candida (Japanese Patent Laid-Open No. 6-46846).
[0021]
The concentration is usually 10 to 50 U / L, preferably 10 to 50 U / L, as the concentration in the test solution, and usually 0.25 to 200 U / L, preferably 2.5 to 20 as the concentration in the reaction solution. U / L.
[0022]
Examples of POD used in the present invention include those derived from plants such as horseradish and radish, those derived from microorganisms such as mold and yeast, those derived from animal leukocytes, thyroid gland and the like. . The amount of POD used is, for example, usually 0.1 to 1000 u / ml, preferably 0.25 to 400 u / ml, more preferably 0.5 to 200 u / ml as the concentration in the test solution, and the concentration in the final reaction solution is Usually 0.1 to 250 u / ml, preferably 0.25 to 100 u / ml, more preferably 0.5 to 50 u / ml.
[0023]
The oxidizable color reagent used in the present invention is not particularly limited as long as it reacts with hydrogen peroxide in the presence of POD to produce a color. For example, 4-aminoantipyrine (hereinafter referred to as 4-AA). A combination of a coupler such as 4-A and a phenolic compound, a naphtholic compound, or an aniline compound; 3-methyl-2- Combinations of benzothiazolinone hydrazone and aniline compounds, such as 2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), triphenylmethane leuco dyes, diphenylamine derivatives, benzidine derivatives, triallylimidazole Oxidation of derivatives, leucomethylene blue derivatives, o-phenylenediamine derivatives, etc. Examples of color formers that develop color themselves.
[0024]
When using a combination of a coupler and a developer, the amount of coupler used varies depending on the type of coupler used and the type of developer to be combined, but for example, the concentration in the test solution is usually 0.01 to 400 mM, preferably 0.1 to 40 mM. The concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 100 mM, preferably 0.1 to 10 mM.
[0025]
The specific glycated protein measurement reagent of the present invention is obtained by adding the specific inhibitor according to the present invention to a conventional enzymatic measurement reagent for glycated protein, and measures the glycated protein in a biological sample as described above. Reagents used in the method, for example, specific inhibitors, proteases, hydrogen peroxide-producing enzymes, PODs and oxidizable color reagents, etc., prepared so as to contain in the concentration range normally used Well, preferred embodiments and use concentrations of those constituent elements are as described above. In addition, a reagent containing a surfactant such as an amphoteric surfactant, a negative surfactant, and a nonionic surfactant may be used as the reagent.
[0026]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0027]
【Example】
Example 1 GA and Serum Measurement [Sample]
The GA standard solution as a sample was prepared using GA prepared from human albumin according to the method described in Clinical Examination 34 493 1990. Five concentrations (1: 200 μmol / l, 2: 304 μmol / l, 3: 407 μmol / l, 4: 510 μmol / l, 5: 611 μmol / l).
Five samples of human serum were also used as samples.
[0028]
[Reagents]
The first reagent was 8 mM 4-aminoantipyrine, 15 IU / l peroxidase, 5 IU / l ascorbate oxidase, 5000 PU / ml pronase, 30 IU / ml alkaline protease, and a predetermined antibody ((1) anti-human Ig (G + A + M), (2) anti-human IgG <MCA>, (3) anti-human albumin antibody-absorbed anti-human whole serum) 10 mM HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfone Acid) buffer (pH 8.0). The second reagent is 150 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 24 IU / l fructosylamine oxidase and 12 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine.
[0029]
〔 Measuring method 〕
Experiments were performed using the Hitachi automatic analyzer 7070 type under the following measurement conditions. The results are shown in Table 1. The GA concentration (μmol / l) was determined using the absorbance of GA standard solution 2 (containing GA of 304 μmol / l) obtained in each reagent system as a standard.
[0030]
〔Measurement condition〕
Measurement method 2 point end method Sample volume 9μl
Reagent volume 1st reagent 240μl, 2nd reagent 90μl
Measurement wavelength Main wavelength 570nm, Sub wavelength 700nm
Measurement temperature 37 ℃
[0031]
[Table 1]
From the results in Table 1, it can be seen that there is no difference in GA measured value between the case where the antibody is added and the case where the antibody is not added regardless of the GA concentration, in other words, the addition of the antibody does not affect the GA measurement. . In addition, when an antibody is added to serum, the measured value becomes lower than when no antibody is added. Therefore, a substance that may give an error to the GA measured value by adding an antibody (for example, glycated globulin) It can be seen that the influence of the above can be avoided.
[0033]
Example 2
Measurement of serum GA The GA value <%> obtained as described below from the GA measurement value obtained in the same manner as in Example 1 was compared with the GA value <%> obtained by the HPLC method. .
[Sample]
As samples, 35 human serum samples were used.
[Calculation of GA value <%> according to the present invention]
The GA concentration (μmol / l) in the sample using the antibody (3) added system reagent and the antibody-free system reagent used in Example 1, and the albumin II-HA test Wako (BCG method, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The total albumin concentration (μmol / l) of the same specimen was obtained using the product, and the GA value <%> [(GA concentration / total albumin concentration) × 100)] was calculated from both.
[Calculation of GA value <%> by HPLC method]
GA value <%> was calculated | required using automatic glycoalbumin measuring apparatus GAA-2000 (made by Kyoto Daiichi Kagaku).
[Result]
The correlation between the GA value <%> obtained using the antibody (3) additive system reagent and the GA <%> value obtained by the HPLC method is shown in FIG. 1 and obtained using the antibody-free reagent. FIG. 2 shows a correlation diagram between the GA <%> value and the GA value <%> obtained by the HPLC method.
[0034]
From the results shown in FIGS. 1 and 2, the GA value <%> obtained using the antibody (3) -added reagent is higher than the GA value <%> obtained using the antibody-free reagent. Thus, it can be seen that the measurement value obtained by the above method shows a better correlation, and that the method of the present invention can avoid the influence of a substance that gives an error to the GA measurement value, and can perform GA measurement with higher accuracy.
Example 3
[Sample]
The GA standard solution as a sample was prepared using GA prepared from human albumin according to the method described in Clinical Examination 34 493 1990. Five concentrations (1: 248 μmol / l, 2: 335 μmol / l, 3: 437 μmol / l, 4: 558 μmol / l, 5: 670 μmol / l).
In addition, 5 samples of human serum were also used as samples.
[0035]
[Reagents]
The first reagent was 8 mM 4-aminoantipyrine, 15 IU / l peroxidase, 5 IU / l ascorbate oxidase, 5000 PU / ml pronase, 30 IU / ml alkaline protease, and 10 mM HEPES (2- [ 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) buffer (pH 8.0). The following water-soluble polymers were used.
(1) Polyethylene glycol 6000
(PEG6000; average molecular weight 7500, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
(2) Dextran 100000-200000 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))
The second reagent is 150 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 24 IU / l fructosylamine oxidase and 12 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine.
[0036]
Measurement conditions were the same as in Example 1. The results are shown in Table 2. The GA concentration (μmol / l) was determined as the GA concentration (μmol / l) in the sample with the absorbance of GA standard solution 2 (containing 335 μmol / l GA) obtained in each reagent system as a standard.
[0037]
[Table 2]
From the results in Table 2, the measured GA value is the same regardless of the GA concentration, with or without the addition of the water-soluble polymer, in other words, there is no effect on the GA measurement by the water-soluble polymer. I understand that. In addition, when water-soluble polymer is added to serum, the measured value becomes lower than when water-free polymer is not added. Substances that may give an error to GA measured value by adding water-soluble polymer ( For example, it is understood that the influence of glycated globulin and the like can be avoided.
[0039]
【The invention's effect】
The present invention is an invention characterized by adding a specific inhibitor to a conventional enzymatic measurement method when measuring a specific glycated protein present in a biological sample such as whole blood, serum, plasma, urine or the like. According to the present invention, only the specific glycated protein is reacted with the protease, and the amount of the glycated amino acid and / or glycated peptide produced can be measured easily and with high accuracy by measuring the amount of the glycated amino acid and / or glycated peptide. Compared with the conventional HPLC method using a dedicated machine, it is versatile and has a remarkable effect in that it can be measured in a short time.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a correlation diagram between a GA value <%> obtained using an antibody (3) added reagent and a GA <%> value obtained by an HPLC method.
FIG. 2 is a diagram showing a correlation between a GA <%> value obtained using an antibody-free reagent and a GA value <%> obtained by an HPLC method.
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