JP2004113014A - Method for scavenging saccharified amino acid - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。より詳細には、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量に有効な、遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。本発明によると、ケトアミンオキシダーゼの消去能力を最大限に引き出すことができ、臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン、１．５アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカーの測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）や免疫法で測定されてきたが、最近、大量検体を迅速に処理することか可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献１〜４）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献５）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献６）を開発してきた。
【０００３】
これらの方法は、プロテアーゼにてタンパク質をアミノ酸、若しくはペプチドのレベルまで断片化し、生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドをケトアミンオキシダーゼ等のケトアミンオキシダーゼを用いて測定する。よって何らかの原因で試料中に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが混入すると測定値が異常に高値を示すことになる。本発明者らは酵素法の研究の過程で一定の割合で血中にケトアミンオキシダーゼの基質、つまり遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを高濃度に含有するものが存在することを見出し、酵素法の測定上大きな問題であることを確認した。一方これらの問題は特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者で頻出し、輸液により高濃度の糖及びアミノ酸が体内に補充された場合に、血中若しくは輸液バック中で遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが生成するのではないかと考えられた。
【０００４】
そこで本発明者らは糖化アミノ酸の消去系を構築することにより、より正確に糖化タンパク質を測定できることを見出し、正確に糖化タンパク質を測定する方法（特許文献７）を開発してきた。しかしながらこれらの方法は比較的低濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを消去することは可能であるが、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合には消去が不十分になる傾向にあった。
糖化アミノ酸の消去法に於いて、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合にも問題なく消去反応を行う方法についてはこれまで知られていなかった。
【０００５】
特許文献１ 特開平６−４６８４６号公報
特許文献２ 特開平５−１９２１９３号公報
特許文献３ ＷＯ９８／４８０４３号公報
特許文献４ ＷＯ９７／１３８７２号公報
特許文献５ 特開２００１−５４３９８号公報
特許文献６ 特開２００１−２０４４９号公報
特許文献７ ＰＣＴ／ＪＰ０２／００７２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定する場合に、血中に存在する遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する必要がある。
本発明の課題は、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定するにあたり、効率的に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することにある。さらに具体的には本発明の課題は、臨床生化学検査において糖化タンパク質を測定するにあたり、検体中に存在し、測定値の誤差のもととなる遊離の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを消去する方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを除いた検体中に存在する糖化たんぱく質の測定方法及びこれらの方法に用いられる試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明者は、如何にすれば効果的にケトアミンオキシダーゼを用いて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去できるか検討を行った。
その結果、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いることにより、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを効果的に消去出来ることを見出した。これはケトアミンオキシダーゼが糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを酸化する際に過酸化水素を生じ、その過酸化水素の分解を水素供与体が助けるものと考えられる。
【０００８】
さらに、消去反応後の反応溶液にカップラーおよびプロテアーゼを添加して、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定すると糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを正確に測定出来ることを見出した。
そして、消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドがα及びε糖化物の混合物であることから、ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸若しくはε糖化アミノ酸のどちらかに特異性の高いものを用いればさらに効率的にこの消去反応を行えることを見出し本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次のとおりの遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去した試料中の糖化タンパク質より生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法、これらの方法に使用する試薬及び試薬キットに関する。
すなわち、本発明は、
（１） 水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法。
（２） 試料に、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ試薬を混合して試料中の遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を行い、次いでカップラー及びプロテアーゼを添加して、糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。
（３） ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであることを特徴とする（２）又は（３）に記載の方法。
（５） ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する試薬。
（６） 糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（５）に記載の試薬。
（７） ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の試薬。
（８） 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（６）又は（７）に記載の試薬。
（９） ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬とカップラー及びプロテアーゼを含有する試薬とを組み合わせてなることを特徴とするキット。
（１０） 試薬キットが糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（９）に記載のキット。
（１１） 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（１０）に記載のキット。
に関する。
【００１０】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる水素供与体としては、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する方法において、ケトアミンオキシダーゼの作用を助けるものであればいずれの水素供与体を用いても良いが、例えばトリンダー試薬を用いると良い。
水素供与体の例としては、フェノール及びその誘導体、例えば４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリブロモフェノール、３−ヒドロキシン−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸や、アニリン類例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ）−３−ホスホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＨＳＰＴ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−ｍ−トルイジン（ＥＳＥＴ）等を用いることが出来る。なかでもＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、 Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）は測定の感度が高く好ましい。
【００１１】
本発明に使用しうるケトアミンオキシダーゼとしては糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良いが、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００１２】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）由来の酵素が挙げられる。
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（ＦＯＤＶＩＩ；旭化成社製；ＰＣＴ／ＪＰ０２／００７２）が知られている。
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（ＦＯＤＩＩ；旭化成社製）が挙げられる。
【００１３】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開２００１−２０４４９号公報（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、３７℃−１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００１４】
本発明で消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドは、血液、血漿、血清等の測定対象の中に含まれている遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを示しているのであり、糖化蛋白質中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドのことではない。本発明者らの検討では特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者血液中に高確率に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが確認されている。
【００１５】
本発明に使用し得るカップラーとしては４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン誘導体等が挙げられるがこれ以外のものを用いても良い。
【００１６】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を測定する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良いが、例えばトリプシン（Ｔｒｉｐｓｉｎ）、キモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｉｐｓｉｎ）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００１７】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ） 等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−ｃ（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａ；シグマ社製） 等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ；シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ；和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例の１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００１８】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法はカゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、３７℃−１分間において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
【００１９】
本発明の糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法及び試薬に於ける測定対象である糖化タンパク質としては、例えば糖化アルブミンまたは糖化ヘモグロビンが挙げられるが、測定対象となる糖化タンパク質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化タンパク質を測定しても良い。
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬については、水素供与体及びケトアミンオキシダーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。
【００２０】
また糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合、例えば第一試薬に水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。またアスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む目的で第１試薬の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方してもよい。
【００２１】
本発明に使用し得る水素供与体の濃度としては０．１〜５００ｍＭの濃度で使用すれば良く、好ましくは０．５〜２００ｍＭ、最も好ましくは１．０〜１００ｍＭであるがこれ以外の量を用いても良い。本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼの濃度としては０．１〜５００Ｕ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは０．５〜２００ Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００ Ｕ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２２】
本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のカップラーの濃度としては０．１〜５００ｍＭの濃度で使用すれば良く、好ましくは０．５〜２００ｍＭ、最も好ましくは１．０〜１００ｍＭであるがこれ以外の量を用いても良い。同様に本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のプロテアーゼの濃度としては０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２３】
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて糖化アミノ酸を消去する場合には、一定量の被検液０．１〜１０００μｌ程度に、糖化アミノ酸を消去するに十分な量の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば１．０〜５０００μｌ程度を１〜６０分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。さらに被検液中の糖化タンパク質を測定するには前記の被検液と水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に、カップラー及びプロテアーゼを含有する試薬例えば１．０〜５０００μｌ程度を１〜６０分程度作用させれば良く、糖化タンパク質より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを水素供与体とカップラーの結合によリ生じる色素の吸光度変化を測定すればよい。
【００２４】
以上のことから、本発明に於ける水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を含む糖化タンパク質測定キットとしては、水素供与体、ケトアミンオキシダーゼを含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
また本発明を、電極等を用いた、過酸化水素の定量等に応用することも可能である。
さらに本発明に基づく糖化タンパク質を定量する酵素反応試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００２５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
＜ケトアミンオキシダーゼを用いた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応に於ける水素供与体添加の効果＞
＜反応液組成Ａ＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（ＫＡＯＤＩＩ；旭化成社製）若しくはケトアミンオキシダーゼＶＩＩ（ＫＡＯＤＶＩＩ；旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ；シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
＜反応液組成Ｂ＞
反応液組成のＴＯＯＳを４−アミノアンチピリンに入れ替えたもの。
＜試料＞
糖化−Ｚ−リジン水溶液（ＦＺＬ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ
糖化−バリン水溶液（ＦＶ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ（糖化アミノ酸はハシバらの方法により合成、精製した。Ｈａｓｈｉｂａ Ｈ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２４：７０、１９７６）
市販のアミノ酸輸液 アミノフリード （大塚製薬社製）
（調製直後のもの、調製後３７℃−１日放置したもの。糖化アミノ酸約０．５ｍＭ含有。
糖化アミノ酸はケトアミンオキシダーゼＩＩを用いて測定した。）
乖離血清（ＨＰＬＣ法測定値１８．３％ 消去系のない酵素法６５．７％）ΔＡ＝Ａ１−Ａ０
【００２６】
＜反応手順＞
上記消去試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）し、試料の吸光度変化を計算する（ΔＡ＝Ａ１−Ａ０）。一方、蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、試料のブランク引き感度を求めた（ΔＡ−ブランクΔＡ）。
その結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
表１から分かるように、ケトアミンオキシダーゼと組み合わせるのは水素供与体のほうが、各サンプルのブランク引き感度が低く良く消去が進行している。水素供与体とケトアミンオキシダーゼを組み合わせた場合には、ＫＡＯＤＩＩ及びＶＩＩのどちらを用いても、０．５ｍＭの糖化アミノ酸が消去できていることが分かる。この効果はＴＯＯＳの代わりにＴＯＤＢを用いても同様の結果であり、どのような水素供与体を用いてもよいことは明白であった。
【００２９】
一方、カップラーと組み合わせた場合には消去能は不十分ではあるがＫＡＯＤＶＩＩの方がＫＡＯＤＩＩに比べて感度が小さく消去が進んでいる。ＫＡＯＤＶＩＩはε糖化アミノ酸にしか作用しないＫＡＯＤであり、ＫＡＯＤＩＩはα、ε糖化アミノ酸両方に作用するＫＡＯＤである。生体内や輸液中に存在する糖化アミノ酸はα、ε糖化アミノ酸の約１：１の混合物であるから、片方に特異的に作用するＫＡＯＤを用いた場合には消去する糖化アミノ酸が少なくてすむことから、消去が楽になると考えられた。α糖化アミノ酸に特異的なＫＡＯＤを用いても同様に効果的に消去反応が進むとは容易に推定できる。
【００３０】
実施例２
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化アルブミンの測定試薬＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
４０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ（シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
Ｒ−３ アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー； 和光純薬社製）にて測定した。
【００３１】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
Ｒ−１ タンパク質分解試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−３ アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー； 和光純薬社製）にて測定した。
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）使用
【００３２】
＜試料＞ 健常者血清５検体、患者血清（糖尿病患者・血清）５検体、乖離検体３検体
【００３３】
＜反応手順＞
上記Ｒ１試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いてＲ２試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）。試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、また試料は、検体とグリコアルブミン濃度既知の管理血清を用いて感度（感度ΔＡ＝（Ａ１−Ａ０）−（Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を求め、グリコアルブミン濃度を算出した。一方アルブミンの測定はアルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー； 和光純薬社製）の用法用量に従って測定した。ＧＡ値はグリコアルブミン濃度をアルブミン濃度で除し、割合換算した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
表２から分かるように、消去系を組み込んだ糖化アルブミン測定試薬は、健常者、患者血清の測定はもちろん、乖離検体についてもＨＰＬＣ法と同等の測定結果が得られる事が明白であった。
【００３６】
実施例３
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化ヘモグロビンの測定＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 蛋白質分解試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
８０００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＩＶ；シグマ社製）
Ｒ−３ 糖化アミノ酸定量試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２４Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
【００３７】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
反応液組成Ａ Ｒ−１ 消去試薬からケトアミンオキシダーゼを除いた試薬を、消去系のない試薬；反応液組成Ｂとした。
【００３８】
＜試料＞ ヘモグロビン（シグマ社製）５０ｍｇ／ｍｌ（ＨｂＡ１ｃ値 ４．５％；ＨｂＡ１ｃ測定装置；アークレイ社製）及びヘモグロビン（シグマ社製）にＦＺＬ、２５０μＭを添加した試料
【００３９】
＜反応手順＞
上記Ｒ１試薬０．９ｍｌおよび試料９０μｌを混合し、３７℃１０分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過した。ろ液８００μｌ にＲ２試薬０．９ｍｌを混合し、３７℃−２時間反応させ、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液１８９μｌをセルに分注し５５５ｎｍを測光し（Ａ０）、続いてＲ３試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、一方、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。試料に検体及び糖化ヘモグロビン濃度既知の試料を用いてブランク引き感度（Ａ１−Ａ０）−ブランクΔＡを求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。糖化ヘモグロビン値は糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除して算出した。
その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
表３から分かるように、消去系を組み込んだ糖化ヘモグロビン測定試薬は、ＦＺＬ添加の有無に係わらず同じ測定結果が得られる事が明白であった。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method, a reagent and a kit for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides using ketoamine oxidase. More specifically, the present invention relates to a method, a reagent and a kit for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides, which are effective for quantifying glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin. According to the present invention, the elimination ability of ketoamine oxidase can be maximized, and it is useful in the field of clinical testing.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the number of diabetic patients has increased explosively, and the demand for measurement of blood sugar control markers such as hemoglobin A1c (HbA1c), glycoalbumin, fructosamine, and 1.5 anhydroglucitol has been increasing. Among them, HbA1c and glycoalbumin, which are indicated by the ratio of glycated protein in the protein, are frequently used because there are few individual differences and there is no influence of the protein concentration. HbA1c and glycoalbumin have been measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and immunoassay, but recently, accurate enzymatic methods have been developed that can rapidly process large amounts of samples. (Patent Documents 1 to 4). In addition, the present inventors have also developed a method for selectively inhibiting the action of a protease on a globulin component (Patent Document 5) and a method for measuring the glycated protein ratio (Patent Document 6) for the purpose of accurately measuring glycated protein. I've been.
[0003]
In these methods, a protein is fragmented to the amino acid or peptide level by a protease, and the resulting glycated amino acid and / or glycated peptide is measured using a ketoamine oxidase such as ketoamine oxidase. Therefore, if free glycated amino acids and / or glycated peptides are mixed into the sample for some reason, the measured value will show an abnormally high value. The present inventors have found that in the course of the study of the enzymatic method, at a certain rate, a substrate of ketoamine oxidase, that is, a substance containing a high concentration of free glycated amino acid or glycated peptide exists in the blood, It was confirmed that this was a major problem in measurement. On the other hand, these problems occur frequently in patients receiving high-calorie amino acid infusions, and when high concentrations of sugars and amino acids are replenished into the body by infusion, free glycated amino acids or glycated peptides in the blood or infusion bags are increased. Was thought to be generated.
[0004]
Therefore, the present inventors have found that a glycated protein can be measured more accurately by constructing a system for eliminating glycated amino acids, and have developed a method for accurately measuring glycated protein (Patent Document 7). However, although these methods can eliminate relatively low concentrations of free glycated amino acids or glycated peptides, the elimination tends to be insufficient when high concentrations of free glycated amino acids or glycated peptides are mixed. Was in
In the elimination method of glycated amino acids, there has not been known a method of performing the elimination reaction without any problem even when a high concentration of free glycated amino acid or glycated peptide is mixed.
[0005]
Patent Document 1 JP-A-6-46846
Patent Document 2 JP-A-5-192193
Patent Document 3 WO98 / 48043
Patent Document 4 WO97 / 13872
Patent Document 5 JP 2001-54398 A
Patent Document 6 JP 2001-20449 A
Patent Document 7 PCT / JP02 / 0072
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, when measuring a glycated protein using ketoamine oxidase, it is necessary to eliminate free glycated amino acids and / or glycated peptides present in blood.
An object of the present invention is to efficiently eliminate free glycated amino acids and / or glycated peptides when measuring a glycated protein using ketoamine oxidase. More specifically, an object of the present invention is to measure a glycated protein in a clinical biochemical test, a method for eliminating free glycated amino acids and glycated peptides present in a sample and causing a measurement error, An object of the present invention is to provide a method for measuring a glycated protein present in a sample from which free glycated amino acids and / or glycated peptides have been removed, and a reagent used in these methods.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors studied how to effectively use ketoamine oxidase to eliminate glycated amino acids and / or glycated peptides.
As a result, they have found that glycated amino acids and / or glycated peptides can be effectively eliminated by using a ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with a hydrogen donor. This is thought to be because hydrogen peroxide is generated when ketoamine oxidase oxidizes glycated amino acids and / or glycated peptides, and the hydrogen donor assists the decomposition of the hydrogen peroxide.
[0008]
Furthermore, it has been found that a glycated amino acid and / or a glycated peptide produced from a glycated protein can be accurately measured by adding a coupler and a protease to the reaction solution after the elimination reaction and measuring the glycated amino acid and / or the glycated peptide.
Since the glycated amino acid and / or glycated peptide to be erased is a mixture of α and ε glycated compounds, ketoamine oxidase is used which has high specificity for either α glycated amino acid or ε glycated amino acid. It has been found that this elimination reaction can be performed even more efficiently, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention provides a method for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides as described below, and a glycated amino acid and / or glycated amino acid produced from a glycated protein in a sample from which the free glycated amino acids and / or glycated peptides have been eliminated. The present invention relates to methods for measuring glycated peptides, reagents and reagent kits used in these methods.
That is, the present invention
(1) A method for erasing free glycated amino acids and / or peptides, which comprises elimination of free glycated amino acids and / or glycated peptides using a ketoamine oxidase-containing reagent in the presence of a hydrogen donor.
(2) The sample is mixed with a ketoamine oxidase reagent coexisting with a hydrogen donor to carry out a reaction for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides in the sample. A method for measuring a glycated protein, comprising measuring a glycated amino acid and / or a glycated peptide produced from the glycated protein.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the ketoamine oxidase is an enzyme having high specificity for α-glycated amino acids or ε-glycated amino acids.
(4) The method according to (2) or (3), wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.
(5) A reagent for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides, which comprises ketoamine oxidase and a hydrogen donor.
(6) The reagent according to (5), which is used for quantifying a glycated protein.
(7) The reagent according to (5) or (6), wherein the ketoamine oxidase is an enzyme having high specificity for α-glycated amino acids or ε-glycated amino acids.
(8) The reagent according to (6) or (7), wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.
(9) A kit comprising a combination of a ketoamine oxidase-containing reagent containing ketoamine oxidase and a hydrogen donor and a reagent containing a coupler and a protease.
(10) The kit according to (9), wherein the reagent kit is used for quantifying a glycated protein.
(11) The kit according to (10), wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.
About.
[0010]
Hereinafter, the configuration and preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
As the hydrogen donor that can be used in the present invention, any hydrogen donor that assists the action of ketoamine oxidase in the method for eliminating free glycated amino acids and / or glycated peptides using ketoamine oxidase can be used. Although it may be used, for example, a Trinder reagent is preferably used.
Examples of hydrogen donors include phenol and its derivatives such as 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,6-dichlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, 3,5-dichloro-2- Hydroxybenzenesulfonic acid, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-tribromophenol, 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoyl acid, and anilines such as N-ethyl-N-sulfo Propyl-3-methoxyaniline (ADPS), N-ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-sulfopropyl-3,5 -Dimethoxyaniline (HDAPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline ( APS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline (TOPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (ADOS), N-ethyl-N -(2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N- (2-hydroxy- 3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAOS), N-ethyl -N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3 Sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS), N-sulfopropylaniline (HALPS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N-acetylethylenediamine (EMAE), N-ethyl-N- (3 -Methylphenyl) -N-succinylethylenediamine (EMSE), N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl-m-toluidine (CEMB), N-ethyl-N- (2-hydroxy) -3-phosphopropyl- Use m-toluidine (EHSPT), N, N-bis- (4-sulfobutyl) -3-methylaniline (TODB), N-ethyl-N- (2-succinylaminoethyl) -m-toluidine (ESET) and the like. I can do it. Among them, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS) and N, N-bis- (4-sulfobutyl) -3-methylaniline (TODB) are sensitivity of measurement. Is preferred.
[0011]
As the ketoamine oxidase that can be used in the present invention, any enzyme may be used as long as it acts well on glycated amino acids and / or glycated peptides and generates hydrogen peroxide. In this case, an enzyme that acts on an ε-glycated amino acid or peptide whose ε-amino group is glycated is preferable, and when glycated hemoglobin is to be measured, an enzyme that acts on an α-glycated amino acid or peptide whose α-amino group is glycated is preferred. Enzymes are preferred.
[0012]
Examples of enzymes that act on glycated amino acids whose ε-amino group is saccharified include Gibberella, Aspergillus, Candida, Penicillium, Fusarium, Acremonium Examples include ketoamine oxidase derived from the genus (Acremonium) or the genus Debaryomyces.
Examples of enzymes that act on saccharified amino acids or peptides in which the α-amino group is saccharified include enzymes that act on saccharified amino acids in which the ε-amino group is saccharified and enzymes derived from Corynebacterium.
As an enzyme which specifically acts on a glycated amino acid or peptide having an α-amino group and which does not substantially act on a glycated amino acid having a ε-amino group, an enzyme derived from Corynebacterium is known. Have been. On the other hand, the enzyme specifically acting on a glycated amino acid or peptide having an ε-amino group and not substantially acting on a glycated amino acid having a glycated α-amino group is a genetically modified fructosamine oxidase (FODVII; manufactured by Asahi Kasei Corporation; PCT). / JP02 / 0072) are known.
Examples of enzymes that act on glycated amino acids or peptides in which the α-amino group and ε-amino group are glycated and have sufficient activity even in the presence of a protease include recombinant fructosamine oxidase (FODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation) ).
[0013]
The activity of the enzyme acting on the glycated amino acid is measured by the method described in JP-A-2001-20449 (method for measuring the ratio of glycated protein), and the amount of the enzyme that produces 1 μmol of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C. is defined as 1 U. Defined.
[0014]
The glycated amino acids and / or glycated peptides to be deleted in the present invention indicate free glycated amino acids and / or glycated peptides contained in the measurement target such as blood, plasma, and serum. It does not refer to glycated amino acids and / or glycated peptides in proteins. In the study of the present inventors, free glycated amino acids and / or glycated peptides have been identified with high probability especially in the blood of patients receiving high-calorie amino acid infusions.
[0015]
Examples of couplers that can be used in the present invention include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH), and aminodiphenylamine derivatives. good.
[0016]
As the protease that can be used in the present invention, any protease can be used as long as it can be used for clinical tests. In particular, when measuring a glycated protein, any substance can be used as long as it effectively acts on the glycated protein contained in the test solution and effectively produces glycated amino acids and / or glycated peptides derived from the protein. Examples thereof include animal-derived proteases such as trypsin and chymotrypsin, plant-derived proteases such as papain and bromelain, and microorganism-derived proteases.
[0017]
Examples of proteases derived from microorganisms include proteases derived from the genus Bacillus represented by subtilisin, proteases derived from Aspergillus represented by protease type-XIII (manufactured by Sigma), PD enzymes (produced by Aspergillus), and the like. Penicillium-derived protease represented by Kikkoman), Streptomyces-derived protease represented by pronase, etc., and lysobacter represented by endoproteinase Lys-c (Sigma). (Lybacter) -derived protease, yeast (Yeast) -derived protea represented by proteinase A (Sigma) and the like. , A protease derived from Tritirachium typified by Proteinase K (Proteinase K; manufactured by Sigma), a protease derived from Thermus typified by aminopeptidase T (Aminopeptidase T; manufactured by Boehringer Mannheim), and an endoprotease Pseudomonus derived from proteinase Asp-N (Endoproteinase Asp-N; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and achromobacter protease (Achrobactor bacterium) derived from achromobacter, represented by lysyl endopeptidase (Lysylendopeptidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Is mentioned. This is just one example of these specific examples, and is not limited in any way.
[0018]
The caseinulin method was used as a protease activity measuring method that can be used in the present invention. The activity was defined as 1 U of color development corresponding to 1 μg of tyrosine at 37 ° C. for 1 minute.
[0019]
The glycated protein to be measured in the method and the reagent for measuring the glycated amino acid and / or glycated peptide produced from the glycated protein of the present invention includes, for example, glycated albumin or glycated hemoglobin. Is not limited to these, and any glycated protein may be measured.
The composition of the ketoamine oxidase-containing reagent of the present invention in which the hydrogen donor coexists may be determined so that the hydrogen donor and the ketoamine oxidase are contained in the same reagent.
[0020]
When glycated protein is measured after elimination of glycated amino acids, for example, a ketoamine oxidase-containing reagent in which a hydrogen donor coexists in the first reagent may be used, and a protease and a coupler may be prescribed in the second reagent. Further, for the purpose of incorporating an ascorbic acid and hydrogen peroxide elimination system, for example, ascorbate oxidase, peroxidase and the like may be formulated in a ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with a hydrogen donor of the first reagent.
[0021]
The concentration of the hydrogen donor that can be used in the present invention may be a concentration of 0.1 to 500 mM, preferably 0.5 to 200 mM, and most preferably 1.0 to 100 mM. May be used. The concentration of the ketoamine oxidase that can be used in the present invention may be 0.1 to 500 U / ml, preferably 0.5 to 200 U / ml, and most preferably 1.0 to 100 U / ml. However, other amounts may be used.
[0022]
When measuring a glycated protein using the present invention, the concentration of the coupler may be 0.1 to 500 mM, preferably 0.5 to 200 mM, and most preferably 1.0 to 100 mM. Other amounts may be used. Similarly, when measuring a glycated protein using the present invention, the protease concentration may be 0.1 U to 1 MU / ml, preferably 1 U to 500 KU / ml, and most preferably 5 U to 100 KU / ml. However, other amounts may be used.
[0023]
When the glycated amino acid is eliminated using the ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with the hydrogen donor of the present invention, a fixed amount of the test solution of about 0.1 to 1000 μl is sufficient to eliminate the glycated amino acid. A ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with a hydrogen donor of, for example, about 1.0 to 5000 μl may be allowed to act for about 1 to 60 minutes, and other amounts and times may be selected. Further, in order to measure the glycated protein in the test solution, a reagent containing a coupler and a protease, for example, about 1.0 to 5000 μl is added to the ketoamine oxidase-containing reagent in which the test solution and a hydrogen donor coexist with each other. The action may be performed for about 60 minutes, and the change in the absorbance of the dye that is generated by the coupling of the glycated amino acid and / or glycated peptide generated from the glycated protein with the hydrogen donor and the coupler may be measured.
[0024]
From the above, the ketoamine oxidase-containing reagent in the presence of a hydrogen donor and the glycated protein measurement kit containing the ketoamine oxidase-containing reagent in the presence of a hydrogen donor according to the present invention include a hydrogen donor, a ketoamine What is necessary is just to prepare as a thing containing oxidase, for example, it can provide as a liquid product and a frozen product or a freeze-dried product of a liquid product.
Further, the present invention can be applied to the determination of hydrogen peroxide using an electrode or the like.
Further, to the enzyme reaction reagent for quantifying a glycated protein according to the present invention, for example, a surfactant, a salt, a buffer, a pH adjusting agent, a preservative, and the like may be appropriately selected and added.
[0025]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, examples of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
<Effect of addition of hydrogen donor on elimination reaction of glycated amino acid and / or glycated peptide using ketoamine oxidase>
<Reaction solution composition A>
R-1 Elimination reagent
30 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
1.3 mM TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories)
20U / ml peroxidase (POD) (manufactured by Sigma)
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; Asahi Kasei) or ketoamine oxidase VII (KAODVII; Asahi Kasei)
R-2 coloring reagent
150 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
4000 U / ml Bacillus-derived protease (protease type XXVII; manufactured by Sigma)
5 mM 4-AA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
<Reaction liquid composition B>
What replaced TOOS of reaction liquid composition with 4-aminoantipyrine.
<Sample>
Saccharified-Z-lysine aqueous solution (FZL) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mM
Saccharified-valine aqueous solution (FV) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mM (Saccharified amino acids were synthesized and purified by the method of Hashiba et al. Hashiba H, J. Agric. Food Chem. 24:70, 1976)
Amino Freed, a commercially available amino acid infusion (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)
(Those immediately after preparation, left for one day at 37 ° C. after preparation. Contains about 0.5 mM glycated amino acid.
Glycated amino acids were measured using ketoamine oxidase II. )
Separated serum (HPLC measurement 18.3% Enzyme method without elimination system 65.7%) ΔA = A1-A0
[0026]
<Reaction procedure>
180 µl of the erasing reagent and 9 µl of the sample are dispensed into a cell, incubated at 37 ° C for 5 minutes, and measured at 555 nm (A0). Subsequently, 180 μl of a coloring reagent is added, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, photometry at 555 nm is performed (A1), and change in absorbance of the sample is calculated (ΔA = A1-A0). On the other hand, the absorbance change of the blank (blank ΔA = A1 blank−A0 blank) was measured using distilled water, and the blanking sensitivity of the sample was determined (ΔA−blank ΔA).
Table 1 shows the results.
[0027]
[Table 1]
As can be seen from Table 1, when combined with ketoamine oxidase, the hydrogen donor has a lower blanking sensitivity of each sample, and the erasure proceeds well. When the hydrogen donor and ketoamine oxidase were combined, it was found that 0.5 mM of the glycated amino acid could be eliminated using either KAODII or VII. This effect is the same when TODB is used instead of TOOS, and it is clear that any hydrogen donor may be used.
[0029]
On the other hand, when combined with a coupler, the erasing ability is insufficient, but KAODVII has lower sensitivity than KAODII and the erasing proceeds. KAODVII is a KAOD that acts only on ε-glycated amino acids, and KAODII is a KAOD that acts on both α and ε-glycated amino acids. Since the glycated amino acids present in the living body and in the infusion are a mixture of α and ε glycated amino acids at a ratio of about 1: 1. It was thought that erasing would be easier. It can easily be estimated that the elimination reaction proceeds similarly effectively even when KAOD specific to α-glycated amino acid is used.
[0030]
Example 2
<Measuring reagent for glycated albumin incorporating elimination reaction of glycated amino acid and / or glycated peptide>
<Reaction solution composition A: Reagent incorporating erasure system>
R-1 Elimination reagent
30 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
0.12% TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories)
20U / ml POD (Sigma)
10U / ml ketoamine oxidase II (manufactured by Asahi Kasei Corporation)
R-2 coloring reagent
150 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 8.0
4000 U / ml protease type XXVII (manufactured by Sigma)
5 mM 4-AA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
R-3 albumin measurement reagent The albumin measurement kit (albumin II-HA Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
[0031]
<Reaction solution composition B; reagent without erasure system>
R-1 proteolytic reagent
30 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
4000 U / ml protease type XXIV (manufactured by Sigma)
5 mM 4-AA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
R-2 coloring reagent
150 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 8.0
0.12% TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories)
20U / ml POD (Sigma)
10U / ml ketoamine oxidase II (manufactured by Asahi Kasei Corporation)
R-3 albumin measurement reagent The albumin measurement kit (albumin II-HA Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
<HPLC method>
Glycoalbumin meter (GAA-2000; manufactured by ARKRAY)
[0032]
<Sample> 5 healthy serum samples, 5 patient serum samples (diabetic patients / serum), 3 sample samples
[0033]
<Reaction procedure>
180 μl of the R1 reagent and 9 μl of the sample are dispensed into a cell, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and measured at 555 nm (A0). Subsequently, 180 μl of R2 reagent is added, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and photometry at 555 nm is performed (A1). For the sample, the change in absorbance of the blank (blank ΔA = A1 blank−A0 blank) was measured using distilled water, and the sample was subjected to sensitivity (sensitivity ΔA = (A1− A0)-(A1 blank-A0 blank) was determined, and the glycoalbumin concentration was calculated, while albumin was measured according to the dosage of an albumin measurement kit (albumin II-HA Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The values were converted to percentages by dividing the glycoalbumin concentration by the albumin concentration, and the results are shown in Table 2.
[0034]
[Table 2]
As can be seen from Table 2, it was evident that the glycated albumin measuring reagent incorporating the elimination system can obtain the same measurement results as in the HPLC method, not only for the measurement of serum from healthy subjects and patients, but also for separated samples.
[0036]
Example 3
<Measurement of glycated hemoglobin incorporating elimination reaction of glycated amino acids and / or glycated peptides>
<Reaction solution composition A: Reagent incorporating erasure system>
R-1 Elimination reagent
30 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
0.12% TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories)
20U / ml ketoamine oxidase II (manufactured by Asahi Kasei Corporation)
R-2 proteolytic reagent
30 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 7.5
8000 U / ml Streptomyces genus protease (protease type XIV; manufactured by Sigma)
R-3 Saccharified amino acid determination reagent
150 mM Tris buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) pH 8.0
5 mM 4-AA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
0.12% TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories)
24U / ml ketoamine oxidase II (manufactured by Asahi Kasei Corporation)
20U / ml POD (Sigma)
[0037]
<Reaction solution composition B; reagent without erasure system>
Reaction solution composition A R-1 A reagent obtained by removing ketoamine oxidase from the elimination reagent was designated as a reaction solution composition B having no elimination system.
[0038]
<Sample> Sample obtained by adding FZL and 250 μM to hemoglobin (manufactured by Sigma) 50 mg / ml (HbA1c value 4.5%; HbA1c measuring device; manufactured by Arkray) and hemoglobin (manufactured by Sigma)
[0039]
<Reaction procedure>
0.9 ml of the R1 reagent and 90 μl of the sample are mixed and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the mixture was filtered through a 10,000 molecular weight cut-off membrane. To 800 μl of the filtrate, 0.9 ml of the R2 reagent was mixed, reacted at 37 ° C. for 2 hours, filtered through a 10,000 molecular weight cut-off membrane, and the filtrate was used as a protease reaction solution. 189 μl of the protease reaction solution was dispensed into the cell and photometry was performed at 555 nm (A0). Subsequently, 180 μl of R3 reagent was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and photometry was performed at 555 nm (A1). On the other hand, the blank was measured by measuring a change in absorbance of the blank (blank ΔA = A1 blank−A0 blank) using distilled water as a sample. Blanking sensitivity (A1-A0) -blank [Delta] A was determined using a specimen and a sample having a known glycated hemoglobin concentration as a sample, and the glycated hemoglobin concentration was calculated. The glycated hemoglobin value was calculated by dividing the glycated hemoglobin concentration by the hemoglobin concentration.
Table 3 shows the results.
[0040]
[Table 3]
As can be seen from Table 3, it was clear that the same measurement result was obtained with the glycated hemoglobin measurement reagent incorporating the elimination system regardless of the presence or absence of FZL addition.
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