JP4202763B2 - マクロファージ遊走阻止因子レセプターとしてのmhcクラスii不変鎖ポリペプチド使用のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
【0001】
発明分野
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)レセプターとしてMHCクラスII不変鎖ポリペプチド、Ii(また、CD74として知られる)使用のための方法及び組成物に関するものであって、局所的又は全身的に変化するMIFレベルで特徴付けられる状態、特に炎症状態及びガンの治療のための方法において、このレセプターの使用、並びにこのレセプターに結合する又はそれ以外のCD74とMIFとの相互作用又はそのような相互作用の結果を変調させるMIFのアゴニスト及びアンタゴニストの使用のための方法及び組成物を含む。
【0002】
技術の背景
記述された最初のサイトカイン活性であるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、先天性及び適応性免疫応答の重要な調節因子として見れらることがわかってきた1-3。MIFは、単一の遺伝子によりコードされ、結晶化研究は、MIFを新規たんぱく質ホールド及び構造のスーパーファミリーに定義することを示した4。MIFによる生物活性は、ほぼ30年前に最初に記述されたにもかかわらず、細胞生理及び免疫におけるMIFの正確な役割に関する情報は、ごく最近現れてきたに過ぎない1-9,18。MIFは、マクロファージやT細胞の活性化そして敗血症ショック、関節炎、及び他の炎症状態の進行において中心的に関与している2。また、ガンとも結びついている32。
【0003】
MIFは、自然及び獲得性免疫の発現と重要な関係がある。MIFはさまざまな細胞より放出されマクロファージ18、T細胞6そして繊維芽細胞7の活性化又は増殖応答に必須の因子である。MIFの遊走効果は、p44/p42(ERK−1/2)マイトジェン活性化たんぱく質(MAP、mitogen-activated protein)キナーゼカスケードに関与するオートクライン/パラクライン活性化経路を経て進行する7。MIF−/−マウスは、高度にエンドトキシンショックに耐性であり3、そしてMIFの免疫中和は、敗血症ショック25そして遅延型過敏症26、関節炎27そして糸球体腎炎28のようなさまざまな免疫性炎症症状に対する予防を与える。細胞でのMIFの働きはまた多くの特徴を見せる。これらには、グルココルチコイド誘導免疫抑制での全逆調節活動(counter-regulatory action)5,6、ERK−1/2活性化持続性パターン(a sustained pattern)の誘導7そしてp53−依存性アポトーシスの機能的拮抗6を含む。
【0004】
MIFの前炎症特性は、グルココルチコイドの免疫抑制効果を逆調節する能力と結びついている5,6、そしてその細胞との相互反応はレセプターを基礎とする活性化機構を必要とするか7,8、又は特別な細胞内活性化様式を反映している9と推測されている。多くのインビトロ又はインビボの研究は、細胞表面レセプターの関与によるMIF働きとが一致している、しかしながら、候補レセプターの同定に向けた進捗の欠如が、特別な細胞内活性化様式9かあるいはMIFのトートメラーゼ活性の潜在的な生物学的役割2,21かのどちらかなのかの興味を刺激している。また、MIFが、イソメラーゼとしての機能を有するかもしれないこともわかっている4。
【0005】
MHCクラスII関連不変鎖、Ii(CD74)10、小胞体からゴルジへのMHCクラスIIたんぱく質のプロセッシング及び輸送で重要な役割を果たすことが確立されている10。ほとんどのIiは、クラスII結合部位上に搭載された抗原ペプチドとしてクラスII複合体から解離している。全細胞内Iiのおおよそ2−5%は、また細胞表面上で発現しており17、そこでT細胞活性化のためのアクセサリー分子として機能することが示されている11。Iiは免疫細胞活性化のためのシグナリング及びアクセサリー機能において以前に示唆されている11-13。
【0006】
Humphreys等の米国特許No. 5,559,028は、組換え細胞での野生型及び変異型Iiの発現のための遺伝子構造を公開している。Humphreys等の米国特許No. 5,726,020は、Ii mRNA分子とハイブリダイズし、それによりIi mRNA分子の翻訳を阻害する発現可能な逆遺伝子構造及びオリゴヌクレオチドを公開及び特許請求している。
【0007】
発明の概要
本発明は、クラスII関連不変鎖ポリペプチドIi(又はCD74)10がMIFの細胞レセプターであるという同定、発現クローニングの使用そして機能解析に一部分基づく。故に、MIFは、タイプII膜たんぱく質であるIiの細胞外ドメインに結合し、Iiは、MIF誘導細胞活性化そして/又は、たとえば細胞外シグナル関連キナーゼ(ERK)−1/2MAPキナーゼカスケードを経たシグナリングや細胞増殖を含む表現型の変化のために必要である。本発明の関連では、サイトカインとしてのMIF活性化のための機構やIiの本来のリガンドとしての同定を提供する、これは、以前に免疫細胞の活性化のためのシグナリング及びアクセサリー機能において示唆されている。
【0008】
したがって、本発明の1つの態様は、CD74に結合するMIFのポジティブ又はネガティブモジュレーターを同定するための化合物又はCD74への結合に結びついた活性をスクリーニングするための方法に関する。最初の例では、そのような方法には、試験化合物の存在下及び非存在下でのMIFとMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドとの接触、そして試験化合物の存在下でのMIFとIiポリペプチドの結合相互作用と試験化合物の非存在下でのそれらの相互作用との比較:を含む生化学(すなわち、無細胞の)結合試験を含む、そこで、MIFとIiポリペプチドとの相互作用をポジティブに変調させる化合物がMIF結合活性の増強剤として同定され、MIFとIiポリペプチドとの相互作用をネガティブに変調させる化合物はMIF結合活性の阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、MIFの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、MIFの候補治療用アンタゴニスト又阻害剤である。たとえば、試験化合物は、IiポリペプチドへのMIFの結合性(たとえば、相互作用の親和性を増加)を強化してもよいし、それによってMIFとIiポリペプチドの相互作用を増強してもよい。そのような増強剤は、それゆえ、MIFのアゴニスト又は増強剤として同定され、そして、内在性又は外来性MIFと独立に又は結びついて、そのような増大を必要とする対象でのMIFの効果を増強のための候補治療薬として同定される。
【0009】
他に、Iiポリペプチドへの結合でMIFと競合又はそれ以外にIiポリペプチドとMIFとの相互作用を阻害する試験化合物は、MIFのアンタゴニストととして同定され、そしてそのような拮抗効果を必要とする対象でのMIFの効果を中和する候補治療薬として同定される。この生化学結合試験では、Iaポリペプチドは、完全なIa配列又はそのMIF結合断片を含みそしてその分析では、組換え的に調製されたMIFとIiペプチドで好都合に実施され、1つは、場合により固相支持体に固定化され、そして1つ(又は、抗体のようなその結合相手)は、MIF:Ii結合相互作用の検出及び測定を促進するために標識される。
【0010】
第2の態様は、結合試験は、典型的には細胞表面上で、細胞(原核細胞又は真核細胞)によって発現されたCD74(天然又はIi発現のための遺伝子工学の結果としてのどちらか)を含む細胞結合試験であってもよく、そしてそのMIF結合が、試験化合物の存在下又は非存在下で検出そして測定される。上述の生化学又は無細胞系試験で、試験化合物存在下でのMIFと細胞提示Iiポリペプチドの結合相互作用と試験化合物非存在下でのそれらの相互作用とが比較され、そこで、MIFとIiポリペプチドとの相互作用をポジティブに変調させる化合物(すなわち、それらの親和性を増加させる)が、MIF結合活性の増強剤として同定され、そしてMIFとIiポリペプチドとの相互作用をネガティブに変調させる化合物(すなわち、それらの親和性を減少させる)は、MIF結合活性の阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、MIFの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、MIFの候補治療用アンタゴニスト又阻害剤である。
【0011】
第3の態様では、細胞試験は、シグナリング試験である、これは、細胞内シグナリングカスケードの活性が、試験化合物の存在下又は非存在下のどちらかでMIFが細胞提示CD74ポリペプチドに接触する前後で測定される。好ましくは、シグナリング試験は、ERK−1/2活性化試験である。Iiポリペプチドとの相互作用を経てMIFのシグナリング活性をポジティブに変調させる試験化合物は、MIFシグナリング活性増強剤として同定され、そして、Iiポリペプチドとの相互作用を経てMIFのシグナリング活性をネガティブに変調させる化合物は、MIFシグナリング活性阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、MIFの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、MIFの候補治療用アンタゴニストである。
【0012】
第4の態様では、細胞試験は、細胞活性又は細胞表現型試験である、これは、標的細胞の活性又は表現型が、試験化合物の存在下又は非存在下のどちらかでMIFが細胞提示CD74ポリペプチドに接触する前後で測定される。好ましくは、活性又は表現型試験は、細胞増殖試験又はp−53依存性アポトーシスの機能的拮抗効果に対する試験である。Iiポリペプチドとの相互作用を経てMIFにより仲介される選ばれた細胞活性又は表現型変化をポジティブに変調させる試験化合物は、MIF細胞活性増強剤として同定され、そして、Iiポリペプチドとの相互作用を経てMIFにより仲介される選ばれた細胞活性又は表現型変化をネガティブに変調させる化合物は、MIF細胞活性阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、MIFの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、MIFの候補治療用アンタゴニストである。
【0013】
本発明は、上記方法のいずれかにより同定されたアゴニストを含むMIFの増強剤又はMIFのアンタゴニストを含む阻害剤をまた提供する。
【0014】
そのようなアゴニスト又はアンタゴニストの1つの形は、抗CD74抗体のような抗体又はその抗原結合断片である。抗CD74抗体及びそのCD74結合断片は、技術的に周知である。たとえば、抗CD74抗体は、従来の方法で作成されるモノクロナール抗体でもよいし又ヒト、ヒト化又はキメラ抗体でもよい。
【0015】
本発明の別の態様は、その表面上にMIFと結合しそれゆえMIFの効果を仲介するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドを含む細胞のMIFの効果を阻害する方法に関するものである。この方法は、MIFのアンタゴニスト又は他の阻害剤と細胞との接触を含む;アンタゴニスト又は阻害剤が、最初の実施例では、IiポリペプチドへのMIFの結合を;第2実施例では、MIF:Ii相互作用により始まるシグナリングを;第3実施例では、MIF:Ii相互作用により左右される細胞活性、代謝又は表現型の変化を阻害する。これら方法のいづれにおいて、アンタゴニスト又は阻害剤は、Iiポリペプチドに結合する抗体又はその断片であってもよい。他に、阻害剤は、細胞表面上でMIFに結合する又はIiとの相互作用によってMIFとIaポリペプチドの相互作用(又はそのような相互作用の細胞結果)を阻害する可溶性Iiポリペプチド又はその可溶性MIF結合断片でもよい。ある場合には、Iiポリペプチドを含む細胞が、哺乳動物に存在しアンタゴニスト又は他の阻害剤が、医薬組成物で哺乳動物に投与される。この方法から利益を得る哺乳動物は、以下のような状態を患っていない哺乳動物で見られる正常レベルを超えて局所的又は全身的に上昇したMIFレベルによって特徴付けられる状態又は疾患を患っている哺乳動物である。そのような場合、アンタゴニスト又は阻害剤は、状態や疾患を治療するために効果的な量を投与される。たとえば、哺乳動物は、ガンや炎症の疾患を患っていてもよいし、そしてアンタゴニスト又は阻害剤は、ガンや炎症の疾患を治療するために効果的な量を投与される。たとえば、炎症疾患は、敗血症ショックや関節炎でもよい。
【0016】
より特別には、本発明の1つの態様は、MIFの活性を阻害する方法である、この方法は、MIFに結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はその断片とMIFとの接触すること:を含む。MIFに結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)の断片は、ポリペプチドの可溶性形態、特にこのタイプII膜貫通ポリペプチドの細胞外結合ドメインを含む可溶性形態であってもよい。いくつかの場合、阻害されるMIFは、哺乳動物内にありそしてIiポリペプチド又はその断片は、医薬組成物で哺乳動物に投与される。哺乳動物が、ガン又は、敗血症ショック又は関節炎のような炎症性疾患を患っている場合、Iiポリペプチド又はその断片が、その疾患を治療するために効果的な量を投与される。更なる例では、MIFアンタゴニスト又は阻害剤が、感染性疾患を治療するために効果的な量を投与される、そこには、感染性病原(ウイルス、細菌、真菌、又は特に寄生虫であろうとなかろうと)から誘導されるMIF(配列相同性によって明らかにされる)に進化的に関連する疾患性MIF又はポリペプチドが、局所的、全身的に又は宿主:病原体境界面に存在する。
【0017】
本発明のさらに他の態様には、Iiポリペプチド又はその断片へのMIFの特異的結合を促進する条件下でのMIFに結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はその断片とMIFを含む試料との接触、及びそれにより形成されたMIF:Iiポリペプチド複合体をIiポリペプチド又はその断片に結合していないものから分離すること:を含むMIFの精製の方法に関するものである。この方法ではIiポリペプチドは、固相支持担体に固定されてもよい。本発明はまた、Iiポリペプチド又はその断片へのMIFの特異的結合を促進する条件下でのMIFに結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はその断片と試料との接触、及びそれにより形成されたMIF:Iiポリペプチド又はMIF:Iiポリペプチド断片複合体のいずれを検出すること:を含むMIFの存在を分析する方法を提供する。
【0018】
本発明により提供されるさらなる他の方法は、MIFに結合し、それゆえMIFの効果を仲介するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はその断片を表面上に含む細胞へのMIFの効果を減少させる方法である。この方法は、細胞により生産されるIiポリペプチドの量を減少させるために効果的な量でアンチセンス核酸分子を細胞に与えることを含む。アンチセンス核酸分子は特にMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるmRNAの部分に結合し、それゆえ細胞でのmRNAの翻訳を減少させ、最終的に細胞表面上のIiポリペプチドのレベルを減少させる。この方法においては、Iiポリペプチドを含む細胞は、哺乳動物で、たとえば以下のような状態又は疾患を患っていない哺乳動物の正常レベルを超えた局所的又は全身的に上昇したMIFレベルにより特徴付けられる状態又は疾患を患っている哺乳動物であってもよい。たとえば、哺乳動物は、ガンまたは敗血症ショック又は関節症のような炎症性疾患を患っていてもよい。そのような場合、アンチセンス核酸は、その状態や疾患を治療するための効果的な量で医薬組成物で投与される。
【0019】
詳細な説明
次の略号がここで使われる:Alexa−MIF:Alexa488−MIF結合物、ERK:細胞外シグナル制御キナーゼ、Ii:MHCクラスII関連不変鎖(CD74)、IFNγ:インターフェロンγ、mAB:モノクロナール抗体、MIF:マクロファージ遊走阻止因子。
【0020】
発現クローニング及び機能分析に使用するために、我々はMIFの細胞レセプターとしてクラスII関連不変鎖、Ii(CD74)10を同定した。MIFはII型膜たんぱく質であるIiの細胞外ドメインと結合する、そしてIiは、たとえばERK−1/2 MAPキナーゼカスケードや細胞増殖の活性化を含むMIF誘導性細胞効果に必要である。これらのデータが、サイトカインとしてのMIFの活性に関する機構を提供しIiの天然のリガンドとしてそれを同定させた、これは以前に免疫細胞活性化のためのシグナルリング及びアクセサリー機能において示唆されていた11−13。我々は、標準的な方法で組換えMIFに蛍光色素Alexa48814を結合させ、結合物の生物活性の保持を証明し(図.1A、B)、MIFへの応答が知られている細胞タイプのパネルで結合実験を実施した。例証のために、フローサイトメトリーを使用して、我々はヒト単球細胞株、THP−1の表面へのAlexa−MIFの高親和性結合を観察した。この結合活性は、インターフェロンγ(IFNγ)での単球の活性化により誘導され、過剰の未標識MIFの添加により競合される(図.1C)。4℃でのIFNγ処理単球の共焦点顕微鏡及び直接的視覚化は、Alexa−MIFの表面結合及び細胞結合Alexa−MIFが37℃への温度シフトで内部化することを示した(図.1D)。増加した濃度のAlexa−MIFでなされた定量結合研究は、2つの明白なクラスの細胞表面レセプターを示した(図.1E)。高親和性結合活性は、3.7×10−8MのKd及び細胞当り3.1×104結合部位、そして低親和性結合は、3.5×10−7MのKd及び細胞当り4.9×104部位を示した。
【0021】
MIFレセプターの同定のために、我々はIFNγ活性化THP−1単球からcDNAを調製しラムダZAP−CMVベクターで哺乳動物の発現ライブラリーを構築した15。合計1.5×107の組換え体を示すライブラリーのアリコートが、MIFに対してはほとんど検出できない結合活性を示すことを以前に我々が証明したCOS−7にトランスフェクトされた、そしてトランスフェクタントがAlexa−MIF結合に関してフローサイトメトリーで分析された。陽性染色細胞が、細胞採取操作により単離されそして集められたcDNAクローンは、増幅され、細胞採取のさらなるラウンド実施のためにCOS−7細胞に再度トランスフェクトされた(図.2A)。4ラウンドの選択後、単一コロニー群が大腸菌で調製され、250コロニーが任意に分析のために拾い上げられた。≧1.6 kBの挿入cDNAを有する50クローンをシークエンスし10個が31−41kDのII型膜貫通たんぱく質のIi(CD74)であるクラスII関連不変鎖をコードしていることを観察した16。単離されたクローンは全長に関して異なっていたが、それぞれはセンス方向で完全な細胞外及び膜貫通ドメインをコードしていた(図2B)。
【0022】
Iiが、MIFに対する細胞表面結合たんぱく質であることを確認するために、Ii発現プラスミドでトランスフェクトされたCOS−7細胞へのAlexa−MIFの結合を調べた(図.2C)。結合は、過剰の未標識MIF(データは示していない)及びたんぱく質の細胞外部分に対して向けられた抗Iiモノクロナール抗体により阻害された。抗Iiモノクロナール抗体は、またIFN−γ刺激THP−1単球へのAlexa−MIFの結合を阻害した。THP−1単球へのAlexa−MIF結合の抗Iiモノクロナール抗体による阻害は、顕著であるが、部分的であり、Iiがスキャッチャード分析(図.1E)によって示されるMIFに対する細胞表面レセプター2つのクラスの1つを表すという解釈と一致する。転写と翻訳の連動した網状赤血球溶解物システムにより調製された[35S]−Iiたんぱく質はインビトロでMIFに結合し、そして主要な結合エピトープは、Ii細胞外ドメインに含まれる40アミノ酸領域に局在化していた(図.2D)。
【0023】
典型的なシステムでのIiへのMIF結合の機能的重要性を証明するために、我々は様々なIi発現細胞での細胞増殖及びERK−1/2活性化を刺激するためのMIF活性を調べた。我々は、IiトランスフェクトCOS−7細胞のERK−1/2リン酸化でのMIF媒介増加、及びドース依存的(dose-dependent)抗Iiモノクロナール抗体媒介減少を観察した(図.3)。しかしながら、我々はIi遺伝子のトランスフェクションと関係なしにこのサル上皮細胞株へのMIFの増殖効果を検出できなかった(データは示していない)。我々はその後、高レベルのIiを発現するヒトRaji B細胞株でのERK−1/2活性化およびその下流にある増殖応答を誘導するためのMIF活性を調べた19。MIFは静止期のRaji細胞のERK−1/2リン酸化を刺激し、2つの抗Iiモノクロナール抗体がMIFのこの刺激効果を阻害する(図.4A、B)。注目すべきは、ERK−1/2リン酸化への抗Iiの効果が、これら細胞のMIF刺激増殖の著しい減少と関係していることである(図.4C)。加えて、免疫システムの外側にある細胞のMIF−Ii刺激経路の役割を確認した。MIFはマウスの初代繊維芽細胞の寿命を延ばし、そしてMIFの細胞分裂誘起効果及びERK−1/2シグナル伝達カスケードの誘導は、この細胞タイプにおいてもっとも特徴的である7。繊維芽細胞は、低レベルのIiを発現し、我々は抗Iiが培養繊維芽細胞でのMIFのERK−1/2リン酸化及び細胞分裂誘起効果の両方を阻害することを観察した(図.4D及びデータは示していない)。
【0024】
先の実験において、我々は生物活性な、125I放射性標識MIFを調製することがかなり困難であることを経験し、そしてたんぱく質がビオチン結合で用いられるpH条件には不安定であることを観察した。対照的に、低モル濃度でのAlexa 488によるMIFの修飾では、ヒト単球上のMIFレセプターを同定でき、そして細胞表面MIFレセプターとしてIiの発現クローニングできる完全に生物活性なたんぱく質を作製した。これらのデータは、クラスIIたんぱく質の輸送における役割の外でのIiの我々の理解を著しく拡大し、B及びT細胞の生理学におけるIiのアクセサリーシグナル機能を述べている最近の研究を支持した10-13。
【0025】
さらなるたんぱく質がMIF媒介活性には関与するらしいけれども、これらの発見は長く求められていたMIFレセプターへの最初の洞察を提供する。たとえば、MIFのようにIiはホモ3量体で23、Iiの細胞内ドメインは30−46アミノ酸からなる、これは使用される2つの同位相の開始コドンに依存する16。単球にコードされるIiは、T細胞増殖応答を増強することが示されておりIiのこのアクセサリー機能は、IiとCD44間の特異的コンドロチン硫酸依存性相互作用と結びついている11。我々は、Ii発現細胞でのERK−1/2リン酸化への抗CD44の阻害効果を観察したが、MIF結合を観察しなかった。これは、MIF結合IiがCD−44媒介MAPキナーゼ活性化のための促進リガンドであるという推論と一致する。CD44は高度に多型のI型膜貫通糖たんぱく質であり24、CD44はIiへのMIF結合の結果により下流のあるものを媒介するらしい。
【0026】
たとえば、MIF−Ii相互作用の阻害剤やアンタゴニストを供与することによるMIF−Ii相互作用で誘導されるシグナル伝達経路の干渉は、しばしばMIFへの細胞性免疫や活性化応答の変調への新規なアプローチを提供する。これに関する活性試薬(アゴニスト及びアンタゴニスト並びに他の阻害剤)は、MIFレベルの局所的又は全身的変化で典型とされる状態及び疾患での治療利用を予測させる。
【0027】
またMIFとクラスII不変鎖ポリペプチドIi間の特異的結合相互作用は、細胞表面Iiを提示している細胞に希望の標識物又は毒物を濃縮するための“トロイの木馬型”ビークルとして標識化MIF試薬の使用に都合よい。簡単には、希望の標識物又は毒物が、MIFリガンドと結合(たとえば、共有結合により)され、次にこの修飾MIFリガンドが、細胞表面局在化Iiを提示している細胞に提供され、クラスII不変鎖ポリペプチドはこれに結合し、修飾MIFリガンドの内部化を引き起こし、ゆえに作用細胞に特異的標識化又は毒性化を引き起こす。Ii提示細胞は、インビトロ又はインビボで修飾MIFリガンドにさらされ、後者の場合にはIi提示細胞は、患者内で特異的に特定化又は毒性化されるかもしれない。多種多様な診断用及び治療用試薬が、MIFリガンド(生物学的に活性なMIF全長又はそのIi結合断片、又は前述のどちらかの突然変異体、及び特に生物学的に不活性に、及び/又は標識物又は毒性物へより都合よく結合するように適合させたような突然変異体)に有利的に結合され得、そして本発明の修飾MIFリガンドを提供する。MIFに結合させる典型的な望ましい試薬は、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどのような化学治療薬;重金属又は放射性核種のような細胞毒性物又は蛍光分子のような検出可能標識物を錯体化できるDTPAのようなキレーター;シュードモナスの外毒素のような毒物などを含む。
【0028】
方法
MIF及び抗体
ヒト組換えMIFは先に記述されているように大腸菌の発現システムから精製され22、製造業者のプロトコール(Molecular Probes, Eugene OR)によりAlexa 488に結合された14。マトリクス−補助レーザー脱離イオン化質量分析(Kompact probe/SEQ, Kratos Analytical Ltd, Manchester, UK)により決定されたMIFホモ3量体に対する色素リガンドの平均比は、1:3であった。抗ヒトIiモノクロナール抗体(クローンLN2及びM−B741)は、ファルミンゲン(PharMingen、(San Jose CA))から得られた。
【0029】
フローサイトメトリー、スキャッチャード分析、及び共焦点顕微鏡
THP−1細胞(2.5×105細胞/ml)がIFNγ(1ng/ml、R&D Systems、Minneapolis、MN)を含む又は含まないDMEM/10%FBS中で72時間培養された。洗浄後、5×105細胞は、0.1mlの培地に再懸濁され、200ngのAlexa−MIFとともに4℃で45分間培養された。その後、細胞は氷冷PBS(pH7.4)で洗浄されフローサイトメトリー分析(FACSalibur、Becton Dickinson、San Jose、CA)に供された。選択された実験では、THP−1単球又はCOS−7トランスフェクタントが、Alexa−MIFと一緒に50μg/mlの抗Iiモノクロナール抗体又はアイソタイプのコントロールモノクロナール抗体とともに培養された。スキャッチャード分析では、3個のIFNγ処理THP−1細胞(1×106)試料がAlexa−MIF(MIF3量体として計算して0−1.5μM)を伴うPBS/1%FBS中で4℃、45分間培養され、冷PBS/1%FBSで3回洗浄され、そしてセルクエストソフトウェア−(CellQuest Software、Becton Dickinson、San Jose、CA)29を使用してフローサイトメトリーで分析された。特異的結合曲線は、全結合から非特異的結合(過剰の未標識MIFの存在下で測定された)を差し引くことにより計算された。細胞へのAlexa−MIF結合の共焦点蛍光顕微鏡は、LSM 510レーザースキャニング装置(Carl Zeiss、Jena Germany)で成された。THP−1細胞は、72時間IFNγと共に培養され、PBS/1%FBSで3回洗浄され、その後2ng/μlのAlexa−MIF又は50ng/μlの未標識rMIF+Alexa−MIFで30分間染色された。
【0030】
cDNAライブラリーの構築、発現及び細胞ソーティング
cDNAは、IFNγ活性化THP−1単球のポリ(A)+RNAから調製され、ラムダZAP−CMVベクター(Stratagene、La Jolla、CA)にクローン化され、そしてDNAのアリコート(2.5μg/ml)が15×106COS−7細胞にDEAE−デキストラン法30でトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞は、4℃で45分間Alexa−MIFと共に培養され、洗浄されそして陽性染色細胞がMoflo細胞ソーター(Cytomation、Fort Collins、CO)で単離された。典型的な実施は、1.5×107細胞/mlが注入され、1×104細胞/秒の流速で分析された。回収は一般には≧90%である。プラスミドDNAは分別された細胞からEasy DNAキット(Invitrogen、Carlsbad、CA)で抽出され、更なる増幅のために大腸菌XL−10 gold(Stratagene、La Jolla、CA)に形質転換された。精製プラスミドDNAはそれからさらなるソーティングで回すためにCOS−7細胞に再トランスフェクトされた。4回の細胞ソーティング後、250の単一コロニーが任意に拾い上げられ、挿入サイズがPCRにより分析された。>1.6Kbの挿入物を有するコロニーが個々にCOS−7細胞に形質転換され、MIF結合活性がフローサイトメトリーで再分析された。
【0031】
インビトロ転写及び翻訳
鋳型として全長のIi cDNAクローンを使用して、3つの不完全(1−72aa、1−109aa、1−149aa)及び1つの完全(1−232aa)Ii産物がPCRにより作製されpcDNA 3.1/V5−HisTOPO発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングされた。典型的なIi cDNAクローンの完全ヌクレオチド配列及びそれがコードする推定Iiポリペプチドの形式は、図5に提供される。ベクター構造の保証は自動DNAシークエンシングにより確認され、その後その構造物がTNT網状赤血球溶解物システム(Promega、MadisonWI)を使用した連動した転写及び翻訳のための鋳型として使用された。固定化MIFへの[35S]−標識Iiの結合は、TNTプロトコールの推奨どおりに、室温で3時間のインキュベーションにより評価された。
【0032】
活性測定
ERK−1/2のドース依存的リン酸化は、先に記述された方法7に従い全p44/p42又はリン酸化p44/p42に対して向いた特異抗体を使用したウェスタンブロッティングによって測定された。MIF媒介アポトーシス抑制が、細胞質ヒストン関連DNA断片の免疫分析(Roche Biochemicals、Indianapolis、IN)により血清飢餓状態のマウス胚性繊維芽細胞で評価された。増殖研究は先に公開した方法7,8の改良で成された。ヒトRaji B細胞(American Type Tissu Culture、Rockville、MD)は、10%FBS/RPMIで培養され、96穴プレート(500−1000細胞/穴)に蒔かれ、そして0.5%血清/RPMI中での終夜培養により休止にされた。細胞は洗浄され、0.5%血清/RPMIが置換され、そしてMIF及び抗体が示されたように加えられた。さらなる終夜培養後、1μCiの[3H]チミジンが加えられ、そして細胞は12時間後に回収された。繊維芽細胞の細胞分裂誘起は、10%FBS/DMEM中で培養された、2%血清/DMEM中で再懸濁された、そして示されたようなrMIF及び抗体と共に96穴プレート(150細胞/穴)に蒔かれた正常ヒト肺繊維芽細胞(CCL210、American Type Tissu Culture)において調べられた。アイソタイプのコントロール又は抗Iiモノクロナール抗体が、50μg/mlの終濃度で加えられた。増殖はDNAへの[3H]チミジンの終夜取り込み後5日で評価された。
【0033】
本発明の当業者には周知のように、本発明の多くの改良及び変更が上記教示の観点から可能である。従って本発明が、ここで特に記述された以外で実行されるかもしれないことは解される。
【0034】
【表1】
【0035】
個々の刊行物及び特許出願のそれぞれが、特異的にそして個別に引用されてきたように明細書に記述された全ての刊行物及び特許出願が同範囲でここの参照資料で示される。本発明への背景のディスカッションが、本発明の事情を説明するためにここに挙げられている。そのような説明は、先に記載されたいずれの態様の優先日においても、言及された素材のいずれもが、公開、周知又は世界のいづこかでの優先技術又は共通した一般知識の一部分であるということを認めるものではない。
【0036】
本発明はその特異的な実施態様と結びついて記述されているが、さらなる改善は可能であり、そして、本出願は、全てのバリエーション、使用又は、一般的には発明の本質に従い、そして発明が関係する技術内での常習的な実施又は周知内にあるような、そして先に述べた本質的な特徴に当てはまるような本公開からの逸脱を含む発明の適合化をカバーするように意図されるものであることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1A】 図1は、THP−1単球へのMIF高親和性結合を例証する。
a、Alexa−MIFは、リン酸化p44/p42又は全p44/p42に対する特異的抗体を使用した細胞溶解物のウェスタンブロットにより視覚化されたp44/p42(ERK−1/2)MAPキナーゼカスケードの活性化により評価した用量依存的MIFの生物活性の保持全体を示す。
【図1B】 図1は、THP−1単球へのMIF高親和性結合を例証する。
b、血清飢餓により誘導されたp53依存性アポトーシスの抑制(CM:完全培地、SFM:無血清培地)を示す。MIF又はAlexa−MIFは、50ng/mlで加えられる。データは、3つのウェルの平均±標準偏差を示し、3回の独立実験を代表する。さらなるAlexa−結合による天然の構造の保持の証拠が、基質としてL−ドーパクロムメチルエステルを使用したMIFのトートメラーゼ活性の測定により与えられている25。Alexa−MIF対未共役MIFのトートメラーゼ活性に違いはないことが観察された(Alexa−MIF:ΔOD475=0.275sec−1μg−1たんぱく質、対rMIF:ΔOD475=0.290sec−1μ−1;P=NS)。
【図1C】 図1は、THP−1単球へのMIF高親和性結合を例証する。
c、フローサイトメトリーの分析は、THP−1単球へのAlexa−MIFの結合が、IFN−δ処理により著しく増強されたことを示す。Alexa−MIF結合に対する競合が、1μg/mlの未標識rMIFの存在下でなされた。
【図1D】 図1は、THP−1単球へのMIF高親和性結合を例証する。
d、共焦点顕微鏡によるTHP−1単球へのAlexa−MIF結合の直接的な視覚化。THP−1細胞は、カバースリップ上で増殖され、IFNγ(1ng/ml)で72時間培養され、Alexa−MIF(左パネル)又はAlexa−MIF+過剰の未標識rMIF(右パネル)で染色された。細胞結合Alexa−MIFは15分間で4°から37°へシフトした細胞では急速に内部化された(右パネル)。倍率:630×。
【図1E】図1は、THP−1単球へのMIF高親和性結合を例証する。e、IFNγ活性化THP−1単球へのAlexa−MIFの結合特性。差し込み図は、スキャッチャード分析で変換された結合データを示す、これは、2つの別個の結合活性;1つはKd=3.7×10-8m、残りはKd=3.5×10-5を示し、データは3回の独立実験を代表する。
【図2A】図2は、IiがMIFの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。a、COS−7細胞トランスフェクタントの蛍光標示式細胞分取操作の連続サイクルは、MIF結合活性の濃縮化を示す。
【図2B】図2は、IiがMIFの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。b、線図は、Ii(35kDaアイソフォーム)の構造、及びMIF結合活性を有する10個の代表的なcDNAクローンのうちの3個を示す。IC、TM及びECは細胞内、膜貫通及び細胞外ドメインである。M1及びM17は別の2つの翻訳開始部位をいう。
【図2C】 図2は、IiがMIFの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。c、Ii−発現細胞へのMIF結合のフローサイトメトリー分析。Iiトランスフェクト対コントロールベクタートランスフェクトCOS−7細胞へのAlexa−MIFの結合増強(左パネル)、抗Iiモノクロナール抗体(クローンLN2)対アイソタイプのモノクロナール抗体コントロール(con mAb)と共に培養されたIiトランスフェクトCOS−7細胞へのAlexa−MIFの結合阻害(中央パネル)、抗Iiモノクロナール抗体(クローンLN2)対アイソタイプのモノクロナール抗体コントロールと共に培養されたIFNγ刺激THP−1単球へのAlexa−MIFの結合増強(右パネル)。示されたデータは、少なくとも3回の独立実験を代表する。抗Ii モノクロナール抗体、LN2(ファルミンゲン(PharMingen)は、蛋白質のC末端、細胞質外60アミノ酸内にあるエピトープと反応する。
【図2D】図2は、IiがMIFの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。d、MIFはインビトロでIiの細胞外ドメインと結合する。[35S]−Iiたんぱく質が、様々な長さのIi断片をコードしたプラスミドを用い連動した転写と翻訳反応で調整された。たんぱく質−たんぱく質相互作用は、MIFで予め覆われた96穴プレートの結合放射活性を測定することで評価された(実験当りn=6穴)。示されたデータは3回の実験の代表で、MIF結合が、Iiの1−149または1−232(全長)アミノ酸断片を発現するベクターとは強固な結合であるのに対し、Iiの1−72または1−109アミノ酸断片を発現するベクターとはひどく危ういものであることを示した。
【図3A】 図3はCOS−7細胞でのERK−1/2(p44/p42)
リン酸化のMIF刺激のIi媒介を例証する。a、ERK−1/2リン酸化は、Iiベクター(COS−7/Ii)またはコントロールベクター(COS−7/V)でトランスフェクトされたCOS−7細胞においてMIFにより誘導される。細胞は、2.5時間、未処理または様々な用量のrMIFで処理され、ウェスタンブロットによりリン酸化p44/p42及び全p44/p42に関して分析された。
【図3B】 図3はCOS−7細胞でのERK−1/2(p44/p42)
リン酸化のMIF刺激のIi媒介を例証する。b、抗Iiモノクロナール抗体によるMIF誘導性ERK−1/2リン酸化の用量依存的阻害がある。COS−7細胞は、Iiベクターでトランスフェクトされ、様々な用量の抗Iiモノクロナール抗体(クローンLN2)またはアイソタイプのコントロールモノクロナール抗体の存在下で2.5時間、50ng/ml MIFで刺激された。コントロール実験では、抗Iiは、添加MIFの不在下ではERK−1/2リン酸化に効果を示さなかった(データは示していない)。
【図4A】 図4は、MIF誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する
。a、用量依存的にMIFは、リン酸化p44/p42のウェスタンブロットで視覚化されるようにヒトRaji B細胞のERK−1/2(p44/p42)リン酸化を刺激する。
【図4B】 図4は、MIF誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する
。b、また抗Iiモノクロナール抗体によりRaji細胞のMIF誘導性ERK−1/2リン酸化の阻害がある。Raji細胞は、各々50μg/mlで加えられた2つの抗Iiモノクロナール抗体、−B741又はLN2、またはアイソタイプのコントロール抗体(Con Ab)の存在下で2.5時間、50ng/mlのMIFで刺激された。
【図4C】図4は、MIF誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。c、抗Iiは、3Hチミジン取り込みにより定量化されるMIF誘導性細胞増殖を阻害する。
【図4D】図4は、MIF誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。d、また抗Iiは、ヒト繊維芽細胞のMIF誘導性増殖を阻害する。抗体は、終濃度50μg/mlで加えられる。示された結果は3回の分析の平均±標準偏差で、少なくとも3回の別個の実験の代表である。抗Ii抗体は、添加MIFの不在下では細胞増殖に効果を示さなかった(データは示していない)。
【図5】図5は、全ヌクレオチド配列(配列番号1)及びStrubin, Mらで報告されるようにヒトIiポリペプチド(HLA−DR抗原関連不変鎖p33 [ジーンバンクアクセッションNr.X00497 M14765])mRNAの最長の翻訳アミノ酸配列(8 ntで始まる;配列番号2)を示す。HLA−DR抗原関連不変鎖のmRNA全配列は、珍しい膜貫通極性を有するポリペプチドを示す。EMBO J., 3, 869-872(1984)。
Claims (10)
- MIFのアゴニスト又はアンタゴニストに関して化合物をスクリーニングする方法であって、MHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドを候補化合物の存在下及び非存在下でMIFと接触させること、及び該候補化合物の存在下でのMIFと該Iiポリペプチドとの相互作用を候補化合物の非存在下でのそれらの相互作用と比較し、これにより該MIFと該Iiポリペプチドとの相互作用を増強する候補化合物をMIFのアゴニストとして同定し、該MIFと該Iiポリペプチドとの相互作用を阻害する候補化合物をMIFのアンタゴニストとして同定することを含み、ここで該Iiポリペプチドは図5(配列番号2)の完全Iiアミノ酸配列又はそのMIF結合性断片を含む方法。
- MIFと結合しそれによりMIFの効果を媒介するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドを表面上に含む細胞へのMIFの該効果を生体外で阻害する方法であって、該細胞を該IiポリペプチドへのMIFの結合を阻害するMIFのアンタゴニストと生体外で接触させることを含む方法。
- アンタゴニストが該Iiポリペプチドに結合する、抗体又はその抗原結合性断片である請求項2記載の方法。
- MIFを、MIFと結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はそのMIF結合性断片を含むMIFのアンタゴニストと生体外で接触させることを含むMIFの活性を生体外で阻害する方法。
- MHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はそのMIF結合性断片が該ポリペプチド又はそのMIF結合性断片の可溶性形態である請求項4記載の方法。
- ポリペプチド又はそのMIF結合性断片の可溶性形態が該ポリペプチド又はその部分の細胞外結合ドメインを含む請求項5記載の方法。
- Iiポリペプチド又はそのMIF結合性断片へのMIFの特異的結合を促進する条件下で、MIFと結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はそのMIF結合性断片とMIFを含む試料とを接触させること、及び形成されたMIF:Iiポリペプチド複合体又はMIF:IiポリペプチドMIF結合性断片複合体をIiポリペプチド又はそのMIF結合性断片に結合しない材料から分離することを含むMIFの精製方法。
- Iiポリペプチド又はそのMIF結合性断片が、固体支持マトリックス上に固定化されている請求項7記載の方法。
- Iiポリペプチド又はそのMIF結合性断片へのMIFの特異的結合を促進する条件下で、MIFと結合するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチド又はそのMIF結合性断片と試料とを接触させること、及びそれにより形成されたMIF:Iiポリペプチド複合体又はMIF:IiポリペプチドMIF結合性断片複合体を検出することを含むMIFの存在を検定する方法。
- 生体外でMIFと結合しそれによりMIFの効果を媒介するMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドを表面上に含む細胞へのMIFの該効果を生体外で減少させる方法であって、該細胞により生産される該Iiポリペプチドの量を減少させるのに有効な量のアンチセンス核酸分子を該細胞へ生体外で提供することを含み、該アンチセンス核酸分子はMHCクラスII不変鎖(Ii)ポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるmRNAの部分に特異的に結合し、それによって該細胞の該mRNAの翻訳を減少させることを特徴とする方法。
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