JP4193986B2 - Production method of gamma-glutamylcysteine - Google Patents
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Description
本発明はグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明はかかる遺伝子を挿入した組換えベクター、かかる遺伝子を導入した組換え生物、並びにかかる組換え生物を用いたγＥＣの効率的な生産方法に関する。 The present invention relates to an enzyme protein that catalyzes a reaction for producing gamma-glutamylcysteine (γEC) from glutathione and a gene encoding the same. The present invention also relates to a recombinant vector into which such a gene is inserted, a recombinant organism into which such a gene has been introduced, and a method for efficiently producing γEC using such a recombinant organism.
ガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）はアミノ酸の一種であるグルタミン酸（Ｅ）とシステイン（Ｃ）がガンマ結合したものであり、生活習慣病やアルツハイマー病の治療薬としての利用が期待されているチオール化合物の一つである。 Gamma-glutamylcysteine (γEC) is a gamma-linked form of glutamic acid (E) and cysteine (C), which are amino acids, and is a thiol compound that is expected to be used as a therapeutic agent for lifestyle-related diseases and Alzheimer's disease. One.
しかしながら、γＥＣは分子内にガンマ結合を有するため、化学的に合成することが困難である。また、γＥＣは高等植物、酵母、真核藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであるファイトケラチン（ＰＣ）の生合成の反応中間体であるが、これらの生物の有するＰＣ合成酵素を用いると、反応中間体であるγＥＣは生産されるとほぼ同時に最終生成物であるＰＣに変換されるため、γＥＣ自体を大量に得ることは不可能である（非特許文献１）。 However, since γEC has a gamma bond in the molecule, it is difficult to synthesize chemically. ΓEC is a reaction intermediate of biosynthesis of phytokeratin (PC), a heavy metal-conjugated peptide widely present in eukaryotes such as higher plants, yeast, and eukaryotes. When γEC is used, γEC, which is a reaction intermediate, is converted to PC, which is the final product, almost simultaneously with production. Therefore, it is impossible to obtain γEC itself in a large amount (Non-patent Document 1).
したがって、生活習慣病やアルツハイマー病の治療薬として有用なγＥＣを簡単に大量生産する方法は未だ知られていない。
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は生活習慣病やアルツハイマー病などの治療薬として有望視されるγＥＣを簡単に大量生産する方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the current state of the prior art, and its purpose is to provide a method for easily mass-producing γEC, which is promising as a therapeutic agent for lifestyle-related diseases and Alzheimer's disease.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、原核藻類に属する藍藻の一種であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０のゲノム中にＰＣ合成酵素遺伝子に相同性の高い配列（ａｌｒ ０９７５）が存在することを意外にも見出した。そして、この配列によりコードされるタンパク質の機能を調査したところ、このタンパク質はＰＣの生合成反応のうち、出発物質であるグルタチオンからγＥＣを生成させる反応のみを触媒することを見出し、遂に本発明を完成するに到った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that cyanobacteria Nosoc sp., A kind of cyanobacteria belonging to prokaryotic algae. It was surprisingly found that a sequence (alr 0975) highly homologous to the PC synthase gene exists in the genome of PCC 7120. And when the function of the protein encoded by this sequence was investigated, it was found that this protein catalyzes only the reaction of generating γEC from glutathione as a starting material in the biosynthesis reaction of PC. It came to completion.
即ち、本発明の第１の態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とするタンパク質が提供される。 That is, according to the first aspect of the present invention, there is provided a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, comprising glutathione Provided is a protein characterized by having an activity of an enzyme that catalyzes a reaction for producing gamma glutamylcysteine (γEC).
また、本発明の第２の態様によれば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とするタンパク質が提供される。 According to the second aspect of the present invention, there is provided a protein encoded by DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or DNA hybridized under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. A protein having the activity of an enzyme that catalyzes a reaction for producing gamma-glutamylcysteine (γEC) from glutathione is provided.
本発明の第３の態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とする遺伝子が提供される。 According to a third aspect of the present invention, there is provided a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, There is provided a gene characterized in that a protein comprising a sequence has an enzyme activity that catalyzes a reaction for producing gamma glutamylcysteine (γEC) from glutathione.
また、本発明の第４の態様によれば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とする遺伝子が提供される。 Further, according to the fourth aspect of the present invention, there is provided a gene consisting of DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or DNA hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1. There is provided a gene characterized in that the protein encoded by the gene has an enzyme activity that catalyzes a reaction for producing gamma-glutamylcysteine (γEC) from glutathione.
本発明の第５の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が挿入されていることを特徴とする組換えベクターが提供される。 According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector in which the gene of the third or fourth aspect of the present invention is inserted.
本発明の第６の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が導入されていることを特徴とする組換え生物が提供される。本発明の第６の態様による組換え生物の好ましい実施態様においては、遺伝子の導入は本発明の第５の態様の組換えベクターを用いて行われており、組換え生物は大腸菌である。 According to a sixth aspect of the present invention, there is provided a recombinant organism characterized by introducing the gene of the third or fourth aspect of the present invention. In a preferred embodiment of the recombinant organism according to the sixth aspect of the present invention, the gene is introduced using the recombinant vector of the fifth aspect of the present invention, and the recombinant organism is Escherichia coli.
本発明の第７の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が発現する条件下で本発明の第６の態様の組換え生物を培養し、これにより前記組換え生物の体内にガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を蓄積させ、そして前記組換え生物からガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を回収することを特徴とするガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）の生産方法が提供される。 According to the seventh aspect of the present invention, the recombinant organism of the sixth aspect of the present invention is cultured under conditions where the gene of the third or fourth aspect of the present invention is expressed, whereby the recombinant organism is There is provided a method for producing gamma glutamylcysteine (γEC), characterized in that gamma glutamylcysteine (γEC) is accumulated in the body of the mouse and gamma glutamylcysteine (γEC) is recovered from the recombinant organism.
本発明のタンパク質は本発明の遺伝子を常法に従い適当なホスト生物に導入して発現させ、そこからタンパク質を回収することにより得ることができる。ホスト生物としては組換えタンパク質を生産するのに好適な生物であればいかなる生物をも用いることができ、例えば大腸菌を用いることができる。 The protein of the present invention can be obtained by introducing the gene of the present invention into a suitable host organism according to a conventional method and expressing it, and recovering the protein therefrom. Any organism can be used as the host organism as long as it is suitable for producing a recombinant protein. For example, E. coli can be used.
本発明の遺伝子（配列番号１）はかずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトによりゲノム解読された数種のシアノバクテリアのうち、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０のゲノム中の塩基配列ａｌｒ ０９７５に相当する。上記ゲノムプロジェクトはゲノムの全塩基配列を解読することを目的とするものであり、解読された個々の塩基配列の機能までは明らかにしていない。本発明の遺伝子であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０の塩基配列ａｌｒ ０９７５の機能（即ち、グルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能）は本発明により初めて明らかにされたものである。なお、本発明の遺伝子の由来生物であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０はフランスのパスツール研究所からＰＣＣ ７１２０のカタログ番号で一般に購入することができる。 The gene of the present invention (SEQ ID NO: 1) is the cyanobacteria Nosoc sp. It corresponds to the base sequence alr 0975 in the genome of PCC 7120. The above-mentioned genome project is intended to decipher the entire base sequence of the genome, and the function of each deciphered base sequence is not clarified. The gene of the present invention, cyanobacteria Nosoc sp. The function of the base sequence alr 0975 of PCC 7120 (that is, the function as a gene encoding a protein having the activity of an enzyme that catalyzes a reaction for producing γEC from glutathione) was revealed for the first time by the present invention. In addition, cyanobacteria Nosoc sp., Which is an organism from which the gene of the present invention is derived. PCC 7120 can generally be purchased from the Pasteur Institute in France under the PCC 7120 catalog number.
本発明の遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０の塩基配列ａｌｒ ０９７５に相当する配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子をも包含する。また、本発明の遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０の塩基配列ａｌｒ ０９７５がコードするアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子のみならず配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子をも包含する。これは遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質を生ずることが多いからである。
これらのいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は、対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっており、かつデータベースに登録されている場合、かかるデータベースを用いて配列検索することにより得ることができるであろう。
実際、本発明者がＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を用いて配列検索したところ、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１，及びＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＭＩＴ９３１３においても本発明の遺伝子に類似する遺伝子が存在することが見出された（図６参照）。図６に示す通り、ａｌｒ ０９７５タンパク質とこれらの三つの遺伝子によりコードされる推定されるタンパク質は真核生物のＰＣ合成酵素のＮ末端領域と相同性が高く、かつ五つの保存的システインのうち一つしか有していないという共通の性質（後ほど詳細に説明する）を有する。従ってこれらの三つの遺伝子もグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が極めて高く、本発明の遺伝子に包含されうるものである。
対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっていない場合、いわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は以下の手順により得ることができるであろう。
The gene of the present invention is a cyanobacterium Nosoc sp. Under stringent conditions not only with DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 corresponding to the base sequence alr 0975 of PCC 7120, but also with DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1. It also includes a gene comprising a hybridizing DNA, wherein the protein encoded by the gene has an enzyme activity that catalyzes a reaction for producing γEC from glutathione. In addition, the gene of the present invention is a cyanobacterium Nosoc sp. A gene encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 as well as the gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the base sequence alr 0975 of PCC 7120 In addition, a gene having an enzyme activity that catalyzes a reaction in which the protein having the amino acid sequence generates γEC from glutathione is also included. This is because even if a part of the base sequence of a gene is mutated, and as a result, part of the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is mutated, a functionally equivalent protein is often produced. It is.
The genes included in these so-called equivalent ranges can be obtained by performing a sequence search using such a database when the genome sequence of the target gene source organism is known and registered in the database. It will be possible.
In fact, when the present inventor conducted a sequence search using NCBI-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), the cyanobacteria Nostoc punciforme, Trichodesmium erythraeum IMS101, and ProTroco13 were also used. It was found that there is a gene similar to the gene of the present invention (see FIG. 6). As shown in FIG. 6, the alr 0975 protein and the putative protein encoded by these three genes are highly homologous to the N-terminal region of eukaryotic PC synthase and are one of five conserved cysteines. Have the common property (described in detail later). Therefore, these three genes are very likely to be genes encoding a protein having the activity of an enzyme that catalyzes a reaction for producing γEC from glutathione, and can be included in the gene of the present invention.
When the genome sequence of the target gene source organism is not known, genes within a so-called equivalent range may be obtained by the following procedure.
即ち、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、配列番号１の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。 That is, the activity of an enzyme that catalyzes a reaction in which a protein encoded by the gene hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and the protein encoded by the gene generates γEC from glutathione Can be obtained by colony or plaque hybridization using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a probe. The term “stringent conditions” used in the present specification refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a base sequence and 60% or more, preferably 80% As mentioned above, it is more preferable that the conditions are such that only DNA having 90% or more homology specifically hybridizes. Stringent conditions can be created by adjusting the salt concentration, temperature, etc. of the hybridization solution.
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。 As a hybridization procedure, a library of DNA (chromosomal DNA or cDNA) obtained from a target gene source is first prepared. The library is cultured on a plate, and the grown colonies are transferred to a membrane such as nitrocellulose, and DNA is fixed to the membrane by denaturation treatment. This membrane is kept warm in a solution containing a probe labeled with 32P or the like (base sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof), and hybridization is performed between the DNA on the membrane and the probe. Hybridization is performed under stringent conditions, for example, in a solution containing 6 × SSC, 1% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, 5 × Denharz at 65 ° C. for 20 hours. After hybridization, the non-specifically adsorbed probe is washed away, and a clone hybridized with the probe is identified by autoradiography or the like. This operation is repeated until the hybridized clone becomes single. The target gene is inserted into the clone thus obtained. Whether the obtained gene is a gene encoding a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction for generating γEC from glutathione, for example, by introducing the obtained gene into E. coli and accumulating γEC in the transformant. Can be confirmed by measuring by chromatography or the like.
また、配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。 In addition, a gene encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, and an enzyme that catalyzes a reaction in which a protein comprising the amino acid sequence generates γEC from glutathione A gene having activity can be obtained, for example, by substituting the DNA base sequence using a commercially available kit such as a site-directed mutagenesis kit (manufactured by Takara Bio) or a quick change site-directed mutagenesis kit (manufactured by STRATAGENE). Whether the obtained gene is a gene encoding a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction for generating γEC from glutathione, for example, by introducing the obtained gene into E. coli and accumulating γEC in the transformant. Can be confirmed by measuring by chromatography or the like.
本発明のタンパク質はグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する。これはグルタチオンからのファイトケラチンの生合成反応の前半部分のみを触媒する酵素に相当する。 The protein of the present invention has the activity of an enzyme that catalyzes a reaction for producing γEC from glutathione. This corresponds to an enzyme that catalyzes only the first half of phytokeratin biosynthesis from glutathione.
ファイトケラチン（ＰＣ）は高等生物、酵母、藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであり、重金属と強く結合することによってこれを無毒化し、細胞内に蓄積する働きを有する。ＰＣの構造は（γＥＣ）ｎＧ（Ｅ＝グルタミン酸、Ｃ＝システイン、Ｇ＝グリシン、ｎ＝２〜１１）で表され、γＥＣを基本骨格とし、末端にグリシンが結合したペプチドである。 Phytokeratin (PC) is a heavy metal-conjugated peptide that is widely present in eukaryotes such as higher organisms, yeasts, and algae, and has a function of detoxifying it by binding to heavy metals and accumulating it in cells. The structure of PC is represented by (γEC) n G (E = glutamic acid, C = cysteine, G = glycine, n = 2 to 11), and is a peptide having γEC as a basic skeleton and glycine bound to the terminal.
高等植物等においてＰＣはグルタチオン（γＥＣＧ）を基質としてＰＣ合成酵素が触媒する以下の二段階の酵素反応により生合成される。
（１）γＥＣＧ→γＥＣ＋Ｇ
（２）（γＥＣ）ｎＧ＋γＥＣ→（γＥＣ）ｎ＋１Ｇ
一段階目の反応は基質であるグルタチオンからグリシンを切り離してγＥＣを生成する反応である。このγＥＣを二段階目の反応においてアクセプターであるＰＣｎと結合させることによってＰＣｎ＋１が合成される。この二つの反応を繰り返すことにより、重合度の高いＰＣが生合成される。
In higher plants and the like, PC is biosynthesized by the following two-stage enzymatic reaction catalyzed by PC synthase using glutathione (γECG) as a substrate.
(1) γECG → γEC + G
(2) (γEC) n G + γEC → (γEC) n + 1 G
The first-stage reaction is a reaction that generates γEC by separating glycine from glutathione as a substrate. PC n + 1 is synthesized by coupling a PC n is an acceptor in the γEC second stage of the reaction. By repeating these two reactions, PC with a high degree of polymerization is biosynthesized.
高等植物等において従来分離されているＰＣ合成酵素はこのように一つの酵素タンパク質が二つの反応を触媒するため、一段階目の反応で生成したγＥＣは直ちに二段階目の反応でＰＣｎと結合させるために用いられてしまう。従って、高等植物等において分離されているＰＣ合成酵素を用いると、反応中間体であるγＥＣを単独で取り出すことができない。 PC synthase conventionally separated in higher plants, etc., thus one enzyme protein catalyzes two reactions, so γEC produced in the first stage reaction immediately binds to PC n in the second stage reaction. It will be used to make it. Therefore, if a PC synthase separated in higher plants or the like is used, γEC that is a reaction intermediate cannot be taken out alone.
これに対し、本発明の酵素タンパク質は以下の実施例で示す通り、ＰＣ生合成反応の二段階の反応のうち、一段階目の反応を触媒する活性は高いが二段階目の反応を触媒する活性は極めて低く、実質的に一段階目の反応のみを触媒する。従って、本発明の酵素タンパク質を用いると、一段階目の反応で生成されるγＥＣはＰＣ合成に用いられることなく蓄積し、本来ＰＣ生合成反応の中間体であるγＥＣを単独で取り出すことができる。 On the other hand, the enzyme protein of the present invention catalyzes the second-stage reaction, although the activity of catalyzing the first-stage reaction is high among the two-stage reactions of the PC biosynthesis reaction as shown in the following examples. The activity is very low and catalyses only the first stage reaction. Therefore, when the enzyme protein of the present invention is used, γEC produced in the first-stage reaction accumulates without being used for PC synthesis, and γEC that is originally an intermediate of PC biosynthesis reaction can be taken out alone. .
ＰＣ生合成反応の一段階目の反応のみを触媒するという本発明の酵素タンパク質の活性は高等植物等のＰＣ合成酵素タンパク質の活性からは全く予想もしえないことである。そもそも、これまでＰＣ合成酵素は真核生物にのみ存在すると考えられており、原核生物であるシアノバクテリアにＰＣ合成酵素遺伝子と相同性の高い配列が存在するとは予想もされていなかった。また、真核生物のＰＣ合成酵素はいずれも一つの酵素がＰＣ合成の二つの反応を触媒するものであり、本発明の酵素のようにＰＣ合成の一段階目の反応のみを触媒するものは未だ発見されていない。 The activity of the enzyme protein of the present invention that catalyzes only the first-stage reaction of the PC biosynthesis reaction is completely unpredictable from the activity of the PC synthase protein of higher plants and the like. In the first place, it has been considered that PC synthase exists only in eukaryotes, and it has not been expected that cyanobacteria which are prokaryotes have a sequence highly homologous to the PC synthase gene. In addition, in any eukaryotic PC synthase, one enzyme catalyzes two reactions of PC synthesis. Like the enzyme of the present invention, one that catalyzes only the first step of PC synthesis. It has not been discovered yet.
アミノ配列を比較すると、以下の実施例及び図１に示す通り、本発明の酵素タンパク質はＰＣ合成酵素ファミリーの保存領域であるＮ末端領域とは相同性が高いが、ＰＣ合成酵素ファミリーの可変領域であるＣ末端領域に相当する部分は本発明の酵素タンパク質では完全に欠損している（図１中、Ａｌｒ ０９７５は本発明の酵素タンパク質のアミノ酸配列であり、ＡｔＰＣＳ１，ＧｍＰＣＳ，ＳｐＰＣＳ及びＣｅＰＣＳはそれぞれシロイヌナズナ、ダイズ、分裂酵母及び線虫のＰＣ合成酵素のアミノ酸配列である）。従って、本発明の酵素タンパク質はＰＣ合成酵素ファミリーとはアミノ酸レベルの相同性こそ３６％と高いがタンパク質の高次構造においてかなり異なるものと考えられる。 Comparing the amino sequences, as shown in the following examples and FIG. 1, the enzyme protein of the present invention is highly homologous to the N-terminal region, which is a conserved region of the PC synthase family, but the variable region of the PC synthase family. The portion corresponding to the C-terminal region is completely deleted in the enzyme protein of the present invention (in FIG. 1, Alr 0975 is the amino acid sequence of the enzyme protein of the present invention, and AtPCS1, GmPCS, SpPCS and CePCS are respectively Amino acid sequences of PC synthases of Arabidopsis, soybean, fission yeast and nematode). Therefore, it is considered that the enzyme protein of the present invention has a high homology of 36% at the amino acid level with the PC synthase family, but is considerably different in the higher order structure of the protein.
また、反応の依存性を比較すると、以下の実施例で示す通り、高等植物等のＰＣ合成酵素は重金属依存性であり、ＰＣ合成酵素の活性化に重金属の存在が不可欠であるのに対し、本発明の酵素タンパク質は重金属非依存性であり、重金属がなくても活性化される。これは酵素タンパク質中のシステイン残基の数の相違によるものであると考えられる。即ち、図１からわかる通り、ＰＣ合成酵素ファミリーはＮ末端領域に五つの保存的システイン（Ｃ）を有するが、本発明の酵素タンパク質はこれら五つの保存的システインのうち一つしか有していない。タンパク質と重金属との相互作用はタンパク質中のシステイン残基を介して行われる。従って、五つの保存的システインのうち一つしか有さない本発明の酵素タンパク質は重金属との相互作用が極めて弱く、このため本発明の酵素タンパク質は活性化に重金属を必要としないものと考えられる。 In addition, when comparing the dependence of the reaction, as shown in the following examples, PC synthases such as higher plants are heavy metal dependent, whereas the presence of heavy metals is essential for the activation of PC synthase, The enzyme protein of the present invention is independent of heavy metal and is activated even without heavy metal. This is thought to be due to the difference in the number of cysteine residues in the enzyme protein. That is, as can be seen from FIG. 1, the PC synthase family has five conserved cysteines (C) in the N-terminal region, but the enzyme protein of the present invention has only one of these five conserved cysteines. . The interaction between the protein and the heavy metal is performed via a cysteine residue in the protein. Therefore, it is considered that the enzyme protein of the present invention having only one of the five conserved cysteines has a very weak interaction with heavy metals, and therefore the enzyme protein of the present invention does not require heavy metals for activation. .
以上、本発明の酵素タンパク質はその触媒活性、高次構造、重金属依存性の有無において従来公知のＰＣ合成酵素ファミリーとは全く異なる新規のタンパク質である。特に、本発明の酵素タンパク質が重金属非依存性であることは本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え生物を用いてγＥＣを生産する際に生物にとって有毒な重金属を培地に添加する必要がないことを意味するので、極めて有利である。 As described above, the enzyme protein of the present invention is a novel protein which is completely different from the conventionally known PC synthase family in terms of its catalytic activity, higher order structure, and heavy metal dependency. In particular, the fact that the enzyme protein of the present invention is independent of heavy metal means that a heavy metal that is toxic to the organism is added to the medium when producing γEC using a recombinant organism into which the gene encoding the enzyme protein of the present invention has been introduced. This means that it is not necessary, which is very advantageous.
本発明の酵素タンパク質を用いてγＥＣを生産するには本発明の酵素タンパク質と基質であるグルタチオンをｉｎ ｖｉｔｒｏで反応させて化学的に生産する方法も考えられるが、基質として用いるグルタチオン自体が高価であるため、それほど実用的でない。それよりも本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え生物によりｉｎ ｖｉｖｏでｄｅ ｎｏｖｏ合成する方法の方がグルチオンを基質として培地に添加する必要がなく、実用的である。 In order to produce γEC using the enzyme protein of the present invention, a method of chemically producing the enzyme protein of the present invention and glutathione as a substrate by reacting in vitro is conceivable. However, glutathione used as a substrate is expensive. Because it is not so practical. The method of de novo synthesis in vivo by a recombinant organism into which a gene encoding the enzyme protein of the present invention has been introduced is more practical because it is not necessary to add glutathione as a substrate to the medium.
γＥＣを生産させるために本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入する生物としては取扱いが容易である限りいかなる生物をも対象とすることができるが、例えば大腸菌を対象とすることができる。本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子の生物への導入は生物の種類に応じた常法に従って行えばよい。先に挙げた大腸菌の場合、先ず遺伝子をプラスミド等の適当な組換えベクターに挿入し、次にこの組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換すればよい。なお、生物に導入する遺伝子には所望によりプロモーター、ターミネーター等の制御配列を付加することはいうまでもない。また、遺伝子を導入する生物で使用されている遺伝暗号に応じて本発明の酵素タンパク質が適切に発現されるように導入する遺伝子を改変することもできる。 As an organism into which the gene encoding the enzyme protein of the present invention is introduced to produce γEC, any organism can be used as long as it is easy to handle. For example, E. coli can be used. The gene encoding the enzyme protein of the present invention may be introduced into a living organism according to a conventional method corresponding to the type of the organism. In the case of E. coli mentioned above, the gene may be first inserted into a suitable recombinant vector such as a plasmid, and then E. coli may be transformed using this recombinant vector. Needless to say, control sequences such as promoters and terminators are added to genes to be introduced into organisms as desired. In addition, the introduced gene can be modified so that the enzyme protein of the present invention is appropriately expressed according to the genetic code used in the organism into which the gene is introduced.
このようにして調製した組換え生物を生物に導入した本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子が発現する条件下で培養すれば前記組換え生物の体内にγＥＣが蓄積するので、そこからγＥＣを回収することによりγＥＣをｉｎ ｖｉｖｏで生産することができる。この場合、本発明の酵素タンパク質の基質であるグルタチオンは培地中のＳＯ４ ２−等から生物により合成されるので、高価なグルタチオンを基質として培地に添加する必要はない。 When the recombinant organism prepared in this way is cultured under conditions where the gene encoding the enzyme protein of the present invention introduced into the organism is expressed, γEC accumulates in the body of the recombinant organism, and γEC is recovered therefrom. By doing so, γEC can be produced in vivo. In this case, since glutathione, which is a substrate for the enzyme protein of the present invention, is synthesized by living organisms from SO 4 2− etc. in the medium, it is not necessary to add expensive glutathione as a substrate to the medium.
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, description of an Example is given only for an understanding of invention, and this invention is not limited at all by this.
材料
使用株
Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０（Ｔｈｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより分与）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ＮＯＶＡＧＥＮより購入）
培養方法
Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０は以下に示す条件で培養を行った。
培地：ＢＧ１１ 培地
光照射条件：白色蛍光灯連続照射（１０Ｗ／ｍ２）
通気条件：１％ ＣＯ２連続通気（３０ｍｌ／分）
培養温度：３０℃
Materials Used strain Nostoc sp. PCC 7120 (distributed from The Pasture Culture Collection)
E. E. coli BL21 (DE3) cells (purchased from NOVAGEN)
Culture method Nostoc sp. PCC 7120 was cultured under the following conditions.
Medium: BG11 Medium light irradiation condition: white fluorescent lamp continuous irradiation (10 W / m 2 )
Aeration conditions: 1% CO 2 continuous aeration (30 ml / min)
Culture temperature: 30 ° C
実施例１：ａｌｒ ０９７５タンパク質の配列特性
最近、かずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトによりシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０の全ゲノム配列が決定され、公表された。本発明者はこのＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０の配列データベースを検索することにより、真核生物において見出されるＰＣ合成酵素の遺伝子と類似する予想される遺伝子ａｌｒ ０９７５（配列表の配列番号１；ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ ００３５８４）の存在を見出した。この遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ ０８５２３０）に対してアミノ酸レベルで３６％の相同性を有する仮想的なタンパク質をコードする。ａｌｒ ０９７５タンパク質は２４２個のアミノ酸残基からなる（配列表の配列番号２）。
Example 1: Sequence characterization of alr 0975 protein Recently, the cyanobacteria Nosoc sp. The entire genome sequence of PCC 7120 has been determined and published. The inventor of the present invention uses this Nosoc sp. By searching the sequence database of PCC 7120, the expected gene alr 0975 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; DDBJ / EMBL / GenBank accession No. AP 003584) similar to the gene of PC synthase found in eukaryotes. Found the existence of. This gene encodes a hypothetical protein having 36% homology at the amino acid level to the AtPCS1 gene (accession No. AF 085230) derived from Arabidopsis thaliana. The alr 0975 protein consists of 242 amino acid residues (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing).
ａｌｒ ０９７５の配列を真核生物のＰＣ合成酵素ファミリーの配列とアラインメントした結果を図１に示す。図１中、Ａｌｒ ０９７５はａｌｒ ０９７５のアミノ酸配列であり、ＡｔＰＣＳ１，ＧｍＰＣＳ，ＳｐＰＣＳ及びＣｅＰＣＳはそれぞれシロイヌナズナ、ダイズ、分裂酵母及び線虫のＰＣ合成酵素のアミノ酸配列である。図１からわかる通り、ａｌｒ ０９７５のアミノ酸配列はＰＣ合成酵素のＮ末端の保存領域と相同性が高いが、Ｃ末端の可変領域は欠損している。このことはシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．にはＰＣ合成酵素様タンパク質が存在している可能性を示す。ＰＣ合成酵素は今まで原核生物で同定されたことがないので、この発見は実に驚くべきことである。 The result of aligning the sequence of alr 0975 with the sequence of the eukaryotic PC synthase family is shown in FIG. In FIG. 1, Alr 0975 is the amino acid sequence of alr 0975, and AtPCS1, GmPCS, SpPCS and CePCS are the amino acid sequences of Arabidopsis thaliana, soybean, fission yeast and nematode PC synthase, respectively. As can be seen from FIG. 1, the amino acid sequence of alr 0975 is highly homologous to the N-terminal conserved region of PC synthase but lacks the C-terminal variable region. This indicates that the cyanobacterium Nosoc sp. Shows the possibility that a PC synthase-like protein exists. This discovery is truly surprising since PC synthase has never been identified in prokaryotes.
実施例２：Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．の重金属感受性及びＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．におけるＰＣ生産
ａｌｒ ０９７５遺伝子をゲノム中に有するＮｏｓｔｏｃ細胞が重金属によりＰＣを誘導生産するかどうか調べるため、Ｎｏｓｔｏｃ細胞を様々な濃度のＣｄＣｌ２及びＺｎＣｌ２で処理して細胞中のＰＣの検出を試みた。
Example 2: Nostoc sp. Heavy metal sensitivity and Nostoc sp. In order to investigate whether Nosoc cells having the alr 0975 gene in their genome induce the production of PC by heavy metals, the Nosoc cells were treated with various concentrations of CdCl 2 and ZnCl 2 to try to detect PC in the cells. It was.
重金属の不在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞（コントロール）、５μＭ ＣｄＣｌ２の存在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞及び１０μＭ ＺｎＣｌ２の存在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞のそれぞれについてＰＣを含むチオール化合物の含有量を以下の手順でＨＰＬＣシステムを用いて分析した。なお、このシステムはγＥＣ、ＧＳＨ及びＰＣｎ（ｎ＝２〜５）の分離及び測定を可能にするものである。 Nostoc cells cultured for 24 hours in the absence of heavy metals (control), Nostoc cells cultured for 24 hours in the presence of 5 μM CdCl 2 and Nosoc cells cultured for 24 hours in the presence of 10 μM ZnCl 2 The content of was analyzed using an HPLC system by the following procedure. This system enables separation and measurement of γEC, GSH and PC n (n = 2 to 5).
チオール化合物測定方法
サンプルの調製：藻細胞を遠心分離（１，５００×ｇ，１０分，４℃）により回収し、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で再懸濁した。細胞懸濁液を凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｏｎｅ １Ｌ，Ｌａｂｃｏｎｃｏ）を用いて２４時間凍結乾燥後、１．０ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４を含んだ０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液に懸濁し、超音波破砕した（ｏｕｔｐｕｔ：４．５，ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ：５０％，４分）。遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分，４℃）により得た上清を０．８ｍＬ回収し、塩酸によりタンパク質除去を行った。タンパク質除去は回収したサンプル０．８ｍＬに０．１６ｍＬの３．６Ｎ ＨＣｌを加え、ボルテックスにより撹拌し、氷上で１５分間放置した後、遠心（１０，０００×ｇ，１０分，４℃）により上清を回収することにより行った。
測定方法：上記の操作によって得たサンプルを０．０２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５ｍＭのオクタン硫酸で平衡化した逆相カラム（Ｈｉｂａｒ ＨＰＬＣ−ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ２５０−４ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ−１８（５μＭ））を用いて、グラジエントプログラムによりアセトニトリルの濃度を上昇させて流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで溶出した後、３ｍのサンプルループ中で流速１．５ｍＬ／分でＥｌｌｍａｎ試薬と混合し、５０℃で反応させ、４１２ｎｍでの吸光度を測定した。
Method for measuring thiol compound Sample preparation: Algae cells were collected by centrifugation (1,500 × g, 10 minutes, 4 ° C.) and resuspended in 30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The cell suspension was freeze-dried for 24 hours using a freeze dryer (Freezone 1L, Labconco), suspended in 0.5N NaOH solution containing 1.0 mL of 0.5 mg / mL NaBH 4 and sonicated. (Output: 4.5, duty cycle: 50%, 4 minutes). 0.8 mL of the supernatant obtained by centrifugation (10,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) was collected, and protein was removed with hydrochloric acid. To remove protein, add 0.16 mL of 3.6 N HCl to 0.8 mL of the collected sample, stir by vortexing, leave on ice for 15 minutes, and then centrifuge (10,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) It was done by recovering Qing.
Measurement method: reverse phase column (Hibar HPLC-cartridge 250-4 LiChrosphere 100RP-18 (5 μM)) equilibrated with 0.02% trifluoroacetic acid (TFA) and 5 mM octane sulfate. Was used to increase the concentration of acetonitrile by a gradient program and elute at a flow rate of 1.5 mL / min, and then mixed with Ellman reagent at a flow rate of 1.5 mL / min in a 3 m sample loop and reacted at 50 ° C., Absorbance at 412 nm was measured.
結果を図２Ａに示す。図２Ａ中、ａは重金属の不在下で培養したコントロールの細胞のＨＰＬＣプロファイルであり、ｂは５μＭ ＣｄＣｌ２の存在下で培養した細胞のＨＰＬＣプロファイル、ｃは１０μＭ ＺｎＣｌ２の存在下で培養した細胞のＨＰＬＣプロファイルである。図２Ａからわかる通り、いかなる濃度のＣｄ２＋又はＺｎ２＋の存在下で培養されたＮｏｓｔｏｃ細胞においてもＰＣの蓄積は全く観測されなかった。このことはＮｏｓｔｏｃ細胞は高等植物等とは異なり、たとえ重金属の存在下であってもＰＣを合成しないということを示す。ＧＳＨとγＥＣのレベルは両方とも重金属処理により影響を受けなかった。 The result is shown in FIG. 2A. In FIG. 2A, a is the HPLC profile of control cells cultured in the absence of heavy metal, b is the HPLC profile of cells cultured in the presence of 5 μM CdCl 2 , and c is the cell cultured in the presence of 10 μM ZnCl 2. Is the HPLC profile. As can be seen from FIG. 2A, no PC accumulation was observed in Nostoc cells cultured in the presence of any concentration of Cd 2+ or Zn 2+ . This indicates that Nostoc cells do not synthesize PC even in the presence of heavy metals, unlike higher plants. Both GSH and γEC levels were not affected by heavy metal treatment.
実施例３：Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．におけるａｌｒ ０９７５のノーザン解析
Ｎｏｓｔｏｃ細胞におけるａｌｒ ０９７５遺伝子の発現を測定するため、ａｌｒ ０９７５ＤＮＡフラグメントをプローブとして以下の手順でノーザン解析を行った。
Example 3: Nostoc sp. Northern analysis of alr 0975 in To determine the expression of the alr 0975 gene in Nostoc cells, Northern analysis was performed by the following procedure using the alr 0975 DNA fragment as a probe.
ノーザン解析
５μＭ ＣｄＣｌ２もしくは１０μＭ ＺｎＣｌ２に１２時間さらしたＮｏｓｔｏｃ細胞を遠心分離し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ＵＳＡ）とガラスビーズによるボルテックスを用いた撹拌によって抽出した。また、ネガティブコントロールとして重金属で処理していないＮｏｓｔｏｃ細胞から同様に全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ（各２０μｇ）をＡｍｅｒｓｈａｍのｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌｓに従い、電気泳動による分離、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）への転写、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブとしては、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０より抽出したゲノムＤＮＡ をテンプレートとし、以下のプライマーを用いて行ったＰＣＲによる増幅産物を用いた。
ＮｓＦ２（５’−ＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣ−３’：配列番号３）
ＮｓＲ２（５’−ＣＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＡ−３’：配列番号４）
Northern analysis Nostoc cells exposed to 5 μM CdCl 2 or 10 μM ZnCl 2 for 12 hours were centrifuged and total RNA was agitated using TRIzol® LS reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA) and vortexing with glass beads. Extracted by. Further, as a negative control, total RNA was similarly extracted from Nostoc cells that were not treated with heavy metals. The obtained total RNA (20 μg each) was subjected to electrophoretic separation, transfer to a nylon membrane (Hybond N +, Amersham, Piscataway, NJ USA), and hybridization according to Amersham's construction manuals. As a hybridization probe, Nosoc sp. Using a genomic DNA extracted from PCC 7120 as a template, an amplification product by PCR performed using the following primers was used.
NsF2 (5′-GTGATAGTTATGAAACTCTTTATC-3 ′: SEQ ID NO: 3)
NsR2 (5′-CTAATCTTGTGTTTTACTTACGAA-3 ′: SEQ ID NO: 4)
結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中、レーン１は重金属処理をしなかったネガティブコントロールの細胞であり、レーン２は５μＭ ＣｄＣｌ２で処理した細胞、レーン３は１０μＭ ＺｎＣｌ２で処理した細胞、レーン４はプローブを変性処理したものをサンプルとして用いたポジティブコントロールである。図２Ｂからわかる通り、非処理のＮｏｓｔｏｃ細胞から得たＲＮＡ（レーン１）及び重金属処理したＮｏｓｔｏｃ細胞から得たＲＮＡ（レーン２，３）の両方においてプローブとのハイブリダイゼーションは検出されなかった。このことは構成的に発現される高等植物等のＰＣ合成酵素遺伝子とは異なり、ａｌｒ ０９７５はＮｏｓｔｏｃ細胞中で構成的に発現されておらず、重金属の存在下でも誘導的に発現されないことを示す。実施例２及び３の結果からＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０におけるａｌｒ ０９７５遺伝子は偽遺伝子であり、Ｎｏｓｔｏｃ細胞においてＰＣ合成酵素として機能していないと考えられる。
The result is shown in FIG. 2B. In FIG. 2B,
実施例４：組換えａｌｒ ０９７５タンパク質の機能解析
（１）ａｌｒ ０９７５遺伝子のクローニング及び組換えａｌｒ ０９７５タンパク質の精製
ＰＣ合成酵素としてのａｌｒ ０９７５タンパク質の機能を調べるため、以下の手順でａｌｒ ０９７５遺伝子をクローニングし、組換えａｌｒ ０９７５タンパク質を精製した。
Example 4: Functional analysis of recombinant alr 0975 protein (1) Cloning of alr 0975 gene and purification of recombinant alr 0975 protein In order to examine the function of alr 0975 protein as a PC synthase, the alr 0975 gene was analyzed by the following procedure. Cloned and purified recombinant alr 0975 protein.
ａｌｒ ０９７５遺伝子のクローニング
クローニングおよび発現ベクターの構築：Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーを用いてａｌｒ ０９７５遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
ＮｓＦ１ （５’−ＣＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣ−３’：配列番号５）
ＮｓＲ１ （５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧ−３’：配列番号６）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて処理し、これをｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎより購入）に挿入し（ｐＥＴ２５ｂ−ａｌｒ ０９７５）、シークエンス解析を行い、ａｌｒ ０９７５配列であることを確認した。得られたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
Cloning of the alr 0975 gene Cloning and expression vector construction: Nostoc sp. Using genomic DNA extracted from PCC 7120 as a template, the alr 0975 gene was amplified by PCR using the primers shown below.
NsF1 (5′-CTTCATATGATAGTTATGAAACTCTTTATC-3 ′: SEQ ID NO: 5)
NsR1 (5′-ATCGGATCTCATATCTTGGTTTTTACTTAC-3 ′: SEQ ID NO: 6)
The obtained DNA fragment is treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, inserted into pET25b (+) vector (purchased from Novagen) (pET25b-alr 0975), sequence analysis is performed, and the sequence is alr 0975 It was confirmed. Using the resulting plasmid, E. coli was used. E. coli BL21 (DE3) cells were transformed.
組換えａｌｒ ０９７５タンパク質の精製
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ培地にて液体培養し、対数増殖期に０．１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、タンパク質合成を誘導した。ＩＰＴＧ処理後、６時間培養した細胞を遠心分離により回収し、バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ 及び １ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ バッファー（ｐＨ８．０））に懸濁した。細胞懸濁液を超音波破砕にかけ、可溶性画分を抽出し、これを１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ バッファー（ｐＨ８．０）を用いて、一晩かけて透析を行った。その後、サンプルをＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｃｏｌｕｍｎ （５ｃｍｘ１５ｃｍ；Ｔｏｓｈｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に供し、素通り画分を回収した。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、一晩かけて透析を行った。得られたタンパク質画分をＡＥＫＴＡタンパク質精製システムを備え付けたＨｉＴｒａｐ ＳＰ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に供し、精製を行った。２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）中において０から１０ｍＭ ＮａＣｌ のグラジエントプログラムによって精製タンパク質を得た。
Purification of recombinant alr 0975 protein The obtained transformant was liquid-cultured in LB medium containing 50 µg / mL carbenicillin, and isopropyl-β-D-thio was added to 0.1 mM in the logarithmic growth phase. Protein synthesis was induced by adding galactopyranoside (IPTG). After IPTG treatment, the cells cultured for 6 hours were collected by centrifugation and suspended in a buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM EDTA and 1 mM β-mercaptoethanol). The cell suspension is subjected to ultrasonic disruption to extract a soluble fraction, which is dialyzed overnight using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM EDTA and 1 mM β-mercaptoethanol. It was. Thereafter, the sample was subjected to DEAE-Toyopearl column (5 cm × 15 cm; Tosho, Tokyo, Japan), and the flow-through fraction was collected. This was dialyzed overnight using 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 mM EDTA. The obtained protein fraction was subjected to purification using HiTrap SP column (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) equipped with an AEKTA protein purification system. Purified protein was obtained by a gradient program of 0 to 10 mM NaCl in 20 mM phosphate buffer (pH 6.0).
得られた精製組換えタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその純度及び分子量を確認した。その結果を図３に示す。図３中、レーン１はＬＭＷマーカーであり、レーン２はａｌｒ ０９７５タンパク質である。図３からわかる通り、レーン２において一本の明確なバンドが得られた。このバンドの分子量は約２６ｋＤａであり、ａｌｒ ０９７５によってコードされるタンパク質の予測された分子量に該当する。
The purity and molecular weight of the obtained purified recombinant protein were confirmed by SDS-PAGE. The result is shown in FIG. In FIG. 3,
（２）組換えａｌｒ ０９７５タンパク質のＩｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣ合成酵素活性の調査
組換えａｌｒ ０９７５タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣ合成酵素活性は以下の手順で調査した。
(2) Investigation of in vitro PC synthase activity of recombinant alr 0975 protein The in vitro PC synthase activity of recombinant alr 0975 protein was investigated by the following procedure.
ＰＣ合成酵素活性
（１）の操作によって得られた組換えタンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。次に、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ バッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ グルタチオン、０．５ｍＭ ＣｄＣｌ２、２μｇ 組換えａｌｒ ０９７５タンパク質を含む酵素反応溶液（１２５μｌ）を調製し、３５℃で６０分間反応させ、１２５μＬの３．６Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られたサンプルについて実施例２で述べたＨＰＬＣ法により、生成物を分離した。
The concentration of the recombinant protein obtained by manipulation of PC synthase activity (1) was measured by the Bradford method. Next, an enzyme reaction solution (125 μl) containing 200 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM glutathione, 0.5 mM CdCl 2 , 2 μg recombinant alr 0975 protein was prepared at 35 ° C. The reaction was allowed to proceed for 60 minutes, and the reaction was stopped by adding 125 μL of 3.6 N HCl. The product was separated from the obtained sample by the HPLC method described in Example 2.
結果を図４に示す。なお、図４中の各酵素反応生成物の同定はＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた質量分析により行った（マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を含む０．１％ ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋Ｈ２Ｏ（１：１）溶液を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳのネガティブチャージイオンスペクトルを得た）。図４中、Ａは反応前のサンプルのＨＰＬＣプロファイルであり、Ｂは３５℃で６０分間反応させた後のサンプルのＨＰＬＣプロファイルである。図４からわかる通り、２μｇの精製組換えａｌｒ ０９７５タンパク質の存在下、１．２５μｍｏｌのグルタチオン（ＧＳＨ）は６０分でほぼ完全にγＥＣに変換された。なお、ＰＣ２及びγＥＣ２の生成も検出されたがこれらの濃度は極めて小さく、変換されたγＥＣの約４．９％に匹敵するのみであった。これらの結果は、ａｌｒ ０９７５によってコードされるタンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＣ合成酵素として作用するが、ＰＣ合成の二段階目の反応を触媒する活性は一段階目の反応を触媒する活性よりもずっと小さいことを示す。更に、驚くべきことに高等植物等のＰＣ合成酵素は活性化に重金属の存在を必要とするのに対し、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０のａｌｒ ０９７５タンパク質は重金属の不在下でもγＥＣ（及びＰＣ２）を精製する活性を示した（ｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータは示さず。ｉｎ ｖｉｖｏでのデータについては次の実施例５参照）。更に、β−メルカプトエタノールとＣｄ２＋の両者の存在下でのγＥＣ生成と比較して７４％のγＥＣが両者の不在下でも生成された（データは示さず）。 The results are shown in FIG. In addition, identification of each enzyme reaction product in FIG. 4 was performed by mass spectrometry using Voyager-DE STR (Applied Biosystems, Framingham, Mass., USA) (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid as a matrix) (The negative charge ion spectrum of MALDI-TOF MASS was obtained using a 0.1% TFA / MeCN + H 2 O (1: 1) solution containing (CHCA)). In FIG. 4, A is the HPLC profile of the sample before the reaction, and B is the HPLC profile of the sample after reacting at 35 ° C. for 60 minutes. As can be seen from FIG. 4, in the presence of 2 μg of purified recombinant alr 0975 protein, 1.25 μmol of glutathione (GSH) was almost completely converted to γEC in 60 minutes. Note that the production of PC 2 and γEC 2 was also detected, but these concentrations were very small and only comparable to about 4.9% of the converted γEC. These results indicate that the protein encoded by alr 0975 acts as a PC synthase in vitro, but the activity catalyzing the second step of PC synthesis is much less than the activity catalyzing the first step reaction. It shows that. Moreover, surprisingly, PC synthases such as higher plants require the presence of heavy metals for activation, whereas cyanobacteria Nosoc sp. The PCR 7120 alr 0975 protein showed activity to purify γEC (and PC 2 ) even in the absence of heavy metals (data not shown in vitro, see Example 5 below for in vivo data). Furthermore, 74% of γEC was produced in the absence of both compared to the production of γEC in the presence of both β-mercaptoethanol and Cd 2+ (data not shown).
実施例５：組換えａｌｒ ０９７５タンパク質を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのγＥＣ生産
組換えａｌｒ ０９７５タンパク質を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのγＥＣ生産を確認するため、実施例４の（１）で作成した組換え大腸菌（ａｌｒ ０９７５遺伝子で形質転換された大腸菌）を１００μＭ ＣｄＣｌ２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、実施例２と同様の手順でチオール化合物を測定した。コントロールとしてシロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１で形質転換した大腸菌を１００μＭ ＣｄＣｌ２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。また、ブランクとしてａｌｒ ０９７５遺伝子を挿入していない空のｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターを導入した大腸菌を１００μＭ ＣｄＣｌ２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。
Example 5: In vivo γEC production using recombinant alr 0975 protein In order to confirm in vivo γEC production using recombinant alr 0975 protein, the recombinant Escherichia coli prepared in (1) of Example 4 was used. (Escherichia coli transformed with the alr 0975 gene) was cultured in the presence and absence of 100 μM CdCl 2 for 8.5 hours, and the thiol compound was measured by the same procedure as in Example 2. As a control, E. coli transformed with the Arabidopsis thaliana PC synthase gene AtPCS1 was cultured in the presence and absence of 100 μM CdCl 2 for 8.5 hours, and thiol compounds were similarly measured. Further, E. coli into which an empty pET25b (+) vector into which the alr 0975 gene had not been inserted was introduced as a blank was cultured in the presence and absence of 100 μM CdCl 2 for 8.5 hours, and thiol compounds were similarly measured.
結果を図５に示す。図５中、ＡはコントロールのＨＰＬＣプロファイルであり、Ｂはａｌｒ ０９７５遺伝子で形質転換された大腸菌のＨＰＬＣプロファイルであり、ＣはブランクのＨＰＬＣプロファイルである。Ａ，Ｂ，Ｃとも上段はＣｄＣｌ２不在下でのＨＰＬＣプロファイルであり、下段はＣｄＣｌ２の存在下でのＨＰＬＣプロファイルである。また、ＨＰＬＣプロファイル中の数字１はＧＳＨであり、１′はγＥＣ、２はＰＣ２、３はＰＣ３、４はＰＣ４、５はＰＣ５を意味する。図５Ａ，Ｂ，Ｃの下段同士の比較からわかる通り、空ベクターを導入した細胞（Ｃ）ではＧＳＨはγＥＣ等に変換されることがない。一方、シロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１を発現する細胞（Ａ）ではＧＳＨは様々な重合度のＰＣに変換され、反応中間体であるγＥＣは極く少量しか存在しない。これに対し、ａｌｒ ０９７５を発現する細胞（Ｂ）ではＧＳＨはγＥＣに変換されるが、γＥＣからのＰＣ合成はほとんど進行せず、細胞中にγＥＣが高レベルで蓄積される（図５Ｂの下段（及び上段）においては１′のピークは途中で切れており、図に示した範囲より遙かに上にあることに注意されたい）。また、図５Ａ，Ｂそれぞれにおいて上段と下段を比較することにより、シロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１を発現する細胞ではＣｄ２＋の不在下ではＰＣ合成が起こらないのに対し、ａｌｒ ０９７５を発現する細胞ではＣｄ２＋の不在下でもＣｄ２＋の存在下と同様にＧＳＨはγＥＣに変換され、細胞中にγＥＣが高レベルで蓄積されることがわかる。
The results are shown in FIG. In FIG. 5, A is the HPLC profile of the control, B is the HPLC profile of E. coli transformed with the alr 0975 gene, and C is the blank HPLC profile. In each of A, B, and C, the upper row is an HPLC profile in the absence of CdCl 2 , and the lower row is an HPLC profile in the presence of CdCl 2 . The
本発明によればグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素タンパク質を提供することができる。かかる酵素タンパク質を利用すれば生活習慣病やアルツハイマー病などの治療薬として有望視されるγＥＣを簡単かつ大量に生産することが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the enzyme protein which catalyzes the reaction which produces | generates (gamma) EC from glutathione can be provided. By using such an enzyme protein, it becomes possible to easily and in large quantities produce γEC that is considered promising as a therapeutic agent for lifestyle-related diseases and Alzheimer's disease.
配列番号３〜６はプライマーの配列である。 SEQ ID NOs: 3 to 6 are primer sequences.
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