JP4175680B2 - Novel protein and its DNA - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ（Glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase、以下、ＧＦＡＴと略記）等の活性を示す新規タンパク質およびそれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は我が国に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点からも重要である。しかし、ＮＩＤＤＭはその成因が多様であり、予想されうる原因についての知見は乏しい。
ＮＩＤＤＭにおけるインスリン作用不足の原因として、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性を主徴とするが、我が国ではインスリン分泌不全を主徴とする場合も少なくない。最近、分子生物学の急速な進展によりインスリン感受性機構の知見が集積されてきた。インスリン受容体構造の解明にはじまり、受容体以降のシグナル伝達機構も次第に明らかとなってきた。また、この１０年の間に糖輸送担体遺伝子がクローニングされ、これらの遺伝子の変異と糖尿病発症との関連が検討されている。ただし、現在までに明らかになっているインスリン、グルコキナーゼ、ミトコンドリア遺伝子異常を合わせてもＮＩＤＤＭの１％に満たず、将来さらに他の遺伝子異常が明らかにされる必要がある。
近年、従来の経口血糖低下薬とは作用メカニズムの全く異なる糖尿病治療薬（α−グリコシダーゼ阻害薬：Acarbose, Voglibose〔ダイアビティース・フロンティア（Diabetes Frontier）, 3, 557-564 (1992); ドラッグス（Drugs）, 46, 1025-1054 (1994); 医学のあゆみ, 149, 591-618 (1989); 臨床と研究，67, 219-233 (1990); 臨床と研究, 69, 919-932 (1992); 臨床医21（増刊）, 578-587 (1995)〕、インスリン抵抗性改善薬：Troglitazone, Pioglitazone〔ダイアビティース（Diabetes）, 37, 1549-1558 (1998); 臨床医薬9（Suppl 3), 127-150 (1993); ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.）, 331, 1188-1193 (1994); 「新しい糖尿病治療薬」（後藤由夫編）, 医薬ジャーナル社, 大阪, (1994)〕）が登場し、発売されようとしている。
一方、アメリカでは１９９６年、１８年ぶりにBiguanide薬〔ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.）, 333, 541-549 (1995); ダイアビティース・スペクトラム（Diabetes Spectrum）, 8, 194-197 (1995)〕が糖尿病治療薬として認められ、日常診療での治療が可能となり注目を集めている。これらの薬剤はいずれも、日常診療において古くから汎用されているスルフォニル尿素（ＳＵ）薬とは異なり、膵β細胞からのインスリン分泌を促進することなく血糖を下げる働きをもっている。
【０００３】
現在、インスリン抵抗を改善する働きをもった糖尿病治療薬の作用メカニズムとしては、以下の９項目が考えられている。▲１▼インスリン受容体キナーゼの活性化，▲２▼糖輸送担体の細胞膜への移行促進，▲３▼糖代謝の律速酵素の働き、糖代謝異常の是正，▲４▼肝糖新生の抑制，▲５▼肝による糖取り込み促進，▲６▼肝グリコーゲン生成の亢進，▲７▼血中脂質の低下，▲８▼血中脂質の低下に伴う肝糖新生の減少，▲９▼血中脂質の低下に伴うインスリン感受性の亢進等である。
ＧＦＡＴはヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する重要な酵素である。ＧＦＡＴの活性を阻害する薬剤は細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができると考えられており、そのため糖尿病治療薬としての開発が期待される。作用メカニズムとしては、上記のうち▲２▼あるいは▲５▼等に関与するものと考えているが、以下のように説明できると思われる。
ヘキソサミン生合成経路はその代謝過程において、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン，ＣＭＰ-Ｎ-アセチルノイラミン酸等を産生するが、これらはタンパク質の糖化修飾やプロテオグリカンあるいはガングリオシド等への粗原料として流れていくものと考えられている。一方、インスリンが細胞表面のレセプターに結合することにより細胞内シグナルが活性化され、細胞内にプールされていた糖輸送担体（ＧＬＵＴ４など）が膜表層に移行し、グルコースの取り込みが促進される。取り込まれたグルコースは解糖系により代謝されエネルギー源としてのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキソサミン生合成経路へ流れることになる。流れたフルクトース−６−リン酸はＧＦＡＴによりグルコサミン−６−リン酸に変換される。詳細な機構は不明であるが、いろいろな状況証拠から、グルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグルコースの取り込みが抑制されることが判明している〔ファセブ・ジャーナル（FASEB J.）, 5, 3031-3036 (1991); ダイアビィトロジア（Diabetologia）, 38, 518-524 (1995); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 266, 10155-10161 (1991); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 266, 4706-4712 (1991); エンドクリノロジー（Endocrinology）, 136, 2809-2816 (1995)〕。
【０００４】
このことから、ヘキソサミン生合成経路は、その一つの役割として、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバック機構として機能するものと考えられる。ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として重要である。また糖尿病患者においてはこのＧＦＡＴ活性が一般的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原因であると考えられる〔ダイアビティース（Diabetes）, 45, 302-307 (1996)〕。
ＧＦＡＴのように主作用を膵外に求めた血糖低下薬は、いずれも標的組織におけるインスリン抵抗を解除する働きがある。これらの薬剤は単なる血糖降下作用以外にも種々の臨床的メリットがあり、さらに二次的効果が期待できる。また、他薬との併用療法での効果が期待される。
ヒト由来のＧＦＡＴ遺伝子は現在１種のみ知られており〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 267, 25208-25212 (1992)〕、６８１アミノ酸からなる７７kDaのタンパク質であることが報告されている。また、他の動物種からもＧＦＡＴ遺伝子がクローニングされており、例えばマウス由来のＧＦＡＴはヒト由来ＧＦＡＴと塩基レベルで９１％、アミノ酸レベルで９８.６％と高い相同性を示す〔ジーン（Gene）, 140, 289-290 (1994)〕。他に酵母由来ＧＦＡＴ〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 264, 8753-8758 (1989)〕や大腸菌由来ＧＦＡＴ〔バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）, 224, 779-815 (1984)〕も報告されているが、いずれもヒトＧＦＡＴに高い相同性を示し、新規なＧＦＡＴの存在については全く知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＦＡＴ活性を示す新たなタンパク質の単離は、ヘキソサミン生合成経路におけるＧＦＡＴによる調節機能の解明、また臓器特異的に発現していれば臓器別の糖代謝系機構の解明について一層詳細な究明を可能にし、また該ＧＦＡＴタンパク質に対して阻害活性を有する特異的な薬剤が見い出されれば、副作用の少ない糖尿病疾患の予防や治療に役立つ新たな作用メカニズムを有する血糖低下薬の開発が期待できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、それにコードされるタンパク質がＧＦＡＴ活性を示すことを見いだした。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：２もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列またはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第（１）項記載のタンパク質、
（３）グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ活性を有する第（１）項または第（２）項記載のタンパク質、
（４）第（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）第（１）項記載のタンパク質または第（４）項記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（６）配列番号：４で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（７）配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（８）第（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（９）第（８）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）第（９）項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパク質またはその塩を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方法、
（１１）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医薬、
（１２）低血糖症の治療・予防剤である第（１１）項記載の医薬、
（１３）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１４）低血糖症の治療・予防剤である第（１３）項記載の医薬、
【０００８】
（１５）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
（１６）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１８）第（１６）項記載のスクリーニング方法または第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩、
（１９）第（１６）項記載のスクリーニング方法または第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、および
（２０）糖尿病の治療・予防剤である第（１９）項記載の医薬を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、
（２１）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する第（４）項記載の部分ペプチド、
（２２）配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（２３）第（２２）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２４）第（２３）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（２５）第（２４）項記載の形質転換体を培養し、第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩の製造方法、
（２６）第（２５）項記載の製造法で製造される、第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩、
（２７）第（１５）項記載の抗体と、被検液および標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
（２８）被検液と担体上に不溶化した第（１５）項記載の抗体および標識化された別の第（１５）項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
【００１０】
（２９）第（１５）項記載の抗体（好ましくは、第（１）項記載のタンパク質の活性を中和する活性を有する第（１５）項記載の抗体）を含有してなる医薬、
（３０）糖尿病の治療・予防剤である第（３３）項記載の医薬、
（３１）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合と（ii）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触させた場合における、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の酵素活性を測定して、比較することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３２）第（５）項または第（２２）項記載のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ、
（３３）第（５）項または第（２２）項記載のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上（好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有する塩基配列である第（３２）項記載のアンチセンスＤＮＡ、
（３４）第（３２）項記載のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬、および
（３５）糖尿病の治療・予防剤である第（３４）項記載の医薬を提供する。
【００１１】
本発明のタンパク質は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列（配列番号：２もしくは図１で示されるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列、または、配列番号：３もしくは図２で示されるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列）またはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。
本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【００１２】
配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、もっとも好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１３】
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質のより好ましいものとしては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列（図１のアミノ酸配列）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号：３（図２のアミノ酸配列）で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質などが用いられる。
配列番号：２と表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられ、特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１４】
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられ、特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１６】
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失、付加または置換されている場合、その欠失、付加または置換の位置としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列）以外の位置などが挙げられる。
【００１７】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質ＴＧＣ０２８−３（図１）または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質ＴＧＣ０２８−４（図２）などが用いられる。
【００１８】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドであって、好ましくは、ＧＦＡＴ活性を有するものなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：７（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜第１４９番目のアミノ酸配列）、配列番号：８（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１５０番目〜第２７０番目のアミノ酸配列）または（および）配列番号：９（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第２７１番目〜第４２５番目のアミノ酸配列）で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドなどが用いられる。より具体的には、本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜２７０番目のアミノ酸配列（すなわち配列番号：７で表わされるアミノ酸配列および配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列）、または配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１５０番目〜４２５番目のアミノ酸配列などを有する部分ペプチドなどが用いられる。
【００１９】
また、本発明の部分ペプチドとしては、▲１▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有する部分ペプチドなども用いられる。
また、本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることができるので、必ずしもＧＦＡＴ活性を有する必要はない。
【００２０】
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらの塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質またはペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法またはこれに準じる方法に従って製造することもできる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらの塩をヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドもしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えばクロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質または部分ペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００２１】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に、樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ＤＭＦ、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類、あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００２２】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えばアルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【００２３】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２４】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖（タンパク質鎖）を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質または部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２５】
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、目的とするペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて、目的のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたは▲２▼配列番号：４で表わされる塩基配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２７】
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２９】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。 配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３０】
より具体的には、本発明の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１１で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１１で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３１】
本発明の配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
上記のなかでも、本発明の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、（１）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または（２）適当なベクターに組み込んだＤＮＡと、本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造することもできる。
ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付加・置換）は、公知のキット、例えば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００３３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子で形質転換された細胞をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入することによって形質転換体を製造することができる。
【００３５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２ ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.），４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン（Gene），２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（in Vivo）,１３巻, ２１３−２１７(１９７７)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞，２９３細胞，Ｃ１２７細胞，ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞，Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞、２９３細胞などが好ましい。
【００３７】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55（1988）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等が挙げられる。
このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
【００３８】
なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質またはその塩を製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４０】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（J. Amer. Med. Ass.）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proc. Soc. Biol. Med.），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
以上のようにして、形質転換体に本発明のタンパク質を生成せしることができる。
【００４１】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在または活性は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより検出または測定することができる。
【００４２】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。さらには、本発明のタンパク質等に対する抗体は、本発明のタンパク質等の活性を中和する活性を有するものであってもよい。
本発明のタンパク質等に対する抗体は、本発明のタンパク質等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質等は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が約１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４３】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４４】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４５】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質等の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカップルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記ハイブリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４６】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡまたはｍＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡと略記する）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的、または実質的に相補的な塩基配列を有し、本発明のタンパク質等の発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質等のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００４７】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、ヘキソサミン生合成経路においてフルクトース−６−リン酸とグルコサミン−６リン酸との変換反応を触媒するＧＦＡＴ活性などの作用を有しており、特に、フルクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸に変換するＧＦＡＴ活性が相対的に強いタンパク質である。したがって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩はさまざまな用途に用いることができる。
以下に、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）、本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する）、本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００４８】
（１）医薬
本発明のタンパク質等または本発明のＤＮＡは、例えば、ＧＦＡＴをコードする遺伝子の欠損やそれに起因する疾病あるいはＧＦＡＴの機能の低下やそれに起因する疾病（例、低血糖症など）などの治療・予防剤などの医薬として有用である。
例えば、生体内においてＧＦＡＴが減少あるいは欠損しているために、細胞における、ＧＦＡＴ活性が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、（ハ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のタンパク質等を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は、注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記の治療・予防剤には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液などの医薬組成物は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００５０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡも上記と同様にして使用することができる。
【００５１】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することにより、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡと略記）の異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、欠損、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などを検出するための遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いて上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４−８７９（１９８９）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），第８６巻，２７６６−２７７０（１９８９））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、糖尿病などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、低血糖症などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、低血糖症、糖尿病などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００５２】
（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のタンパク質等に対する抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００５３】
また、本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、抗タンパク質抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００５４】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられるモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離にはポリエチレングリコールを用いるが、これ以外に前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、さらに、第１抗体として固相化抗体を用いる固相化法、あるいは第１抗体に可溶性抗体を用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法などがある。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離し、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in Enzymology」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のようにして、本発明のタンパク質抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質等が関与する種々の疾病の診断をすることができる。
具体的には、本発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合は、例えば、低血糖症などの疾病の可能性が高いと診断することができる。
一方、本発明のタンパク質等の濃度の増加が検出された場合は、例えば、糖尿病などの疾病の可能性が高いと診断することができる。
このように、本発明の抗体は、上記疾患の診断剤として有用である。
さらに、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。
【００５７】
（４）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体のうち、本発明のタンパク質等に結合して本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和することができる抗体は、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を阻害することができるので、例えば、糖尿病などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予防のために使用する場合には、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和する抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和する本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００５８】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお、前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５９】
（５）各種疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。
一方、本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。
したがって、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク質の酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のタンパク質等を用いることを特徴とする本発明のタンパク質等の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、ＧＦＡＴ促進剤またはＧＦＡＴ阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明のタンパク質等に基質を接触させた場合と（ii）本発明のタンパク質等に基質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＧＦＡＴ促進剤またはＧＦＡＴ阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性などを測定して、比較することを特徴とするものである。
【００６０】
基質としては、本発明のタンパク質等の基質となり得るものであれば何れのものでもよく、通常、フルクトース−６−リン酸およびグルタミンが用いられる。フルクトース−６−リン酸としては、放射線標識（例、14Ｃ、3Ｈなど）したフルクトース−６−リン酸などを用いるのが好適である。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質等を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等と基質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性は公知の方法、例えば、Smithらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 98, 478-480(1979)〕に従って測定することができる。例えば、１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン、０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）からなる混合液に本発明のタンパク質等を添加した溶液を２５℃で３０分間保温する。同溶液に０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間反応させた後、２.５％ ＮａＮＯ2と１２.５％ ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、さらに０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ FeCl3を加えて、その溶液を６５０ｎｍで吸光度を測定し、生成されるグルコサミン−６−リン酸を定量する。
例えば、上記（ii）の場合におけるＧＦＡＴ活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進している場合、該試験化合物を本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を促進する化合物として選択することができる。一方、例えば、上記（ii）の場合におけるＧＦＡＴ活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害されている場合、該試験化合物を本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を阻害する化合物として選択することができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質等を含有するものである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液
０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）
▲２▼タンパク質標品
本発明のタンパク質またはその塩
▲３▼基質
１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン
▲４▼検出
６５０ｎｍでの吸光度を測定する。
〔測定法〕
１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン、本発明のタンパク質またはその塩および０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）からなる反応液に試験化合物を添加した後、２５℃で３０分間保温する。これに０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間加水分解する。２.５％ＮａＮＯ2と１２.５％ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、次いで０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ3を添加した後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物（例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進または阻害する化合物である。該化合物は、新規化合物であってもよいし、公知化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質等の酵素活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質等の酵素活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６４】
（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な、本発明のタンパク質等の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内において上記の作用を発揮する本発明のタンパク質等の機能を抑制することができる。したがって、該アンチセンスＤＮＡは、例えば糖尿病などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。
該アンチセンスＤＮＡを上記の医薬として使用する場合、前記した本発明のＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様にして製造し、哺乳動物に投与することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００６５】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【００６６】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病態動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ組織インヒビター１、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【００６８】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物由来ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３´下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ｍＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の遺伝子工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【００６９】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に本発明の外来性ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００７０】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来性ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常の遺伝子工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の外来性異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来性異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【００７１】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての利用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、または組織中のタンパク質を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
▲３▼本発明のＤＮＡを有する組織からの細胞が、標準的な組織培養技術により培養しうることがある場合の、これらの細胞を使用することによる、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体の作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞を株化することが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、糖代謝調節機能を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００７２】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（ii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iii）ネオマイシン耐性である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iv）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（ｖ）ゲッ歯動物がマウスである第（ii）項記載の胚幹細胞、
（vi）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（vii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（viii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（ix）ゲッ歯動物がマウスである第（viii）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（ｘ）第（vii）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００７３】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表例とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００７４】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えばＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００７５】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気、または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単一な細胞とし、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第２９２巻、１５４（１９８１）；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第７８巻、７６３４（１９８１）；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー（Journal of Embryology and Experimental Morphology）、第８７巻、２７（１９８５）〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける重要性を検討する上で有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００７６】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクター中の本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【００７７】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体の該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００７８】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、低血糖症など）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、低血糖症に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を低血糖症に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例、低血糖症など）に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８０】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が好適である。
本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【００８１】
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００８２】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、低血糖症などの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、糖尿病などの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００８３】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【００８４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
【００８５】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００８６】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Cl2Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
【００８７】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第１番目〜第１４９番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第１５０番目〜第２７０番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第２７１番目〜第４２５番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：７で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
配列番号：８で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
配列番号：９で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００８８】
〔配列番号：１３〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために、また実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために、また実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡに対するノーザンブロティングを行なうために、実施例３において使用したプローブの塩基配列を示す。
【００８９】
〔配列番号：１８〕
タンパク質ＴＧＣ０２８−２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００９０】
後述の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４２は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６２１として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６００３として寄託されている。
後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４３は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６２２として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６００４として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４４は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６２３として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６００５として寄託されている。
【００９１】
【実施例】
以下に、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法はモレキュラー・クローニング（Molecular cloning）２ｎｄ（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載されている方法に従った。
【００９２】
【参考例１】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−２タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−２タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて行なった。
ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコ・ビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific Broth（１２g/l Bacto−Tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto−Yeast Extract（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５g/l リン酸二カリウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェン・プラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコ・ビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ＭＰＧR−ストレプトアビジンマグネットビーズ（ギブコ・ビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットラック（ギブコ・ビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。
【００９３】
取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）を入れ、９５℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。
得られた形質転換株を用いて２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１４、配列番号：１５）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより６１２ｂｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして１株選択した。
選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑダイデオキシターミネーター・サイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行い、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクローンは、poly(Ａ)+鎖を含んでおり、配列番号：１９で表される１４５８個の塩基配列を有していた〔図３〕。このＤＮＡ断片には、配列番号：１８で表される４８６個のアミノ酸からなる新規タンパク質ＴＧＣ０２８−２がコードされており、予想される遺伝子産物はヒトＧＦＡＴとはアミノ酸レベルで６８％の相同性を有していた。
タンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４２を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４２を得た。
【００９４】
【実施例１】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて行なった。
ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコ・ビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific Broth（１２g/l Bacto−Tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto−Yeast Extract（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５g/l リン酸二カリウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェン・プラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコ・ビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１６）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットビーズ（ギブコ・ビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットラック（ギブコ・ビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。
【００９５】
取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１６）を入れ、９５℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。
得られた形質転換株を用いて２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１４、配列番号：１５）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより６１２ｂｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして１株選択した。
選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑダイオキシターミネーター・サイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行い、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクローンは、poly(Ａ)+鎖を含んでおり、配列番号：５で表される１８４５個の塩基配列を含む２７７３個の塩基配列を有していた〔図１〕。このｃＤＮＡ断片は、配列番号：２で表される６１５個のアミノ酸からなる新規ＧＦＡＴタンパク質ＴＧＣ０２８−３がコードされており、予想される遺伝子産物はヒトＧＦＡＴとはアミノ酸レベルで７４％、ＴＧＣ０２８−２とは８８％の相同性を有していた。
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４３を得た。
【００９６】
【実施例２】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードする遺伝子の構築
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３より、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで切り出される１７８８個の塩基配列を有する遺伝子断片を得た。一方、ＧＦＡＴ様遺伝子断片を保持するプラスミドから、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出されるＤＮＡ断片を回収した。各々の遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで処理したプラスミドベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（ノバジェン社）に挿入し、プラスミドｐＴＢ１９４４を構築した〔図４〕。このプラスミドベクターは、ＴＧＣ０２８−３には含まれない６５個のアミノ酸配列をＣ末端に含み、配列番号：６で表わされる２０４６個の塩基配列からなるオープンリーディング領域を保持しており、配列番号：３で表わされる６８２アミノ酸残基からなる遺伝子産物をコードしていることとなる〔図２〕。
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４４を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４４を得た。
【００９７】
【実施例３】
ノーザンブロット解析による遺伝子発現の組織特異性の解析
ノーザンブロッティングによる遺伝子の発現臓器の特異性の解析は、ヒューマンマルチプルティシュ・ノーザンブロット（クロンテック社）およびヒューマンマルチプルティシュ・ノーザンブロットII（クロンテック社）のメンブレンを用いて行なった。まず、このメンブレンをハイブリダイゼーションバックに入れた後、５ｍｌのハイブリダイゼーション用緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド，５×ＳＳＰＥ，２×Denhardt's液，２％ ＳＤＳ，１００μg/ml 熱変性ニシン精子ＤＮＡ）を添加した後、５０℃で３時間保温し、プレハイブリダイゼーションを行なった。一方、プローブとしては、１７９６個からなる配列番号：１７で表わされる本発明のタンパク質ＴＧＰ０２８−３の部分配列をコードするＤＮＡ断片を（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ（アマシャム社）とＢｃａベストラベリングキット（宝酒造）を用いて標識した。該標識プローブを上記ハイブリダイゼーションバックに添加した後、５０℃で２時間保温した。
保温後、メンブランをバックより取り出し、２×ＳＳＣ，０.０５％ ＳＤＳからなる洗浄液で、室温で２回洗浄し、さらに、０.１×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳからなる洗浄液で、５０℃で２回洗浄した。その後、該フィルターに対するオートラジオグラムをとってプローブが結合したバンドを調べた。その結果、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、平滑筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸および大腸のすべての臓器でバンドが検出され、ＲＮＡの大きさは、いずれも約４.０ｋｂであった〔図５〕。また、このメンブランを沸騰させた０.５％ ＳＤＳ溶液中で１０分間処理することで、結合したプローブをフィルターから除き、コントロールとしてヒトβ−アクチンプローブ（和光純薬工業（株））を用いてβ−アクチンに対するハイブリダイゼーションを行なった結果、β−アクチンも全臓器で検出された〔図６〕。
【００９８】
【実施例４】
大腸菌を用いた組換えＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の発現
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築については以下のように行なった。まず、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３を鋳型にし、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２０、配列番号：２１）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 2400（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９４℃，１分→６０℃，１分→７２℃，２分を３０サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない、該ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製した。該ＤＮＡ断片をｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）のＴクローニング部位にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、種々の合成オリゴＤＮＡをプライマーとし、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用いたサイクルシークエンス反応を、添付資料の条件にしたがってGeneAmp PCRR System 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー社）で分析した。得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で解析した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンを選択し、そのＤＮＡ断片の５'末端および３'末端を制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩを用いて消化した後、アガロースゲル電気泳動とキアクイックゲル抽出キットを用いてＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡ断片を回収・精製した。一方、ｐＥＴ３２ａ（＋）ベクター（ノバジェン社）を、制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩを用いて消化した後、回収・精製した。このｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターに、先に取得したＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして構築したプラスミドＤＮＡをｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３とした。
【００９９】
次に、ＴＧＣ０２８−３タンパク質を発現させるため、プラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３よりタンパク質をコードするＤＮＡ断片を単離し、ｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）への導入を行なった。すなわち、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片の、５'側に制限酵素ＮｄｅＩにより認識される部位を、３'側に制限酵素ＳａｌＩにより認識される部位を付加するため、ｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３を鋳型に、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２２、配列番号：２３）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 9600（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９８℃，１０秒→５５℃，１分→７２℃，２分を３５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製した。該ＤＮＡ断片をｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、前述と同様な方法でＤＮＡシークエンスを行なって確認した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンのＤＮＡを調製し、５'末端および３'末端を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩを用いて消化した後、前述と同様な方法で回収・精製した。一方、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて消化後、前述と同様な方法で回収・精製したｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）に、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−３−２とした。この結果、ＴＧＣ０２８−３は、Ｃ末端側にＶａｌ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓの８アミノ酸が付加された融合タンパク質として発現することになる。
【０１００】
一方、本発明のＴＧＣ０２８−４タンパク質の発現ベクターの構築については以下のように行なった。まず、ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４４を鋳型にし、ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡ断片の５'側に制限酵素ＮｄｅＩにより認識される部位を、３'側に制限酵素ＳａｌＩにより認識される部位を付加するため、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２４、配列番号：２５）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 9600（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９８℃，１０秒→５５℃，１分→７２℃，２分を３５回サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製し、ｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、前述と同様な方法でＤＮＡシークエンスを行なって確認した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンを選択し、そのＤＮＡ断片の５'末端および３'末端を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩを用いて消化した後、前述したのと同様な方法でＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡ断片を回収・精製した。一方、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて消化後、前述したのと同様な方法で回収・精製したｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）に、先に取得したＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−４−２とした。この結果、ＴＧＣ０２８−４は、Ｃ末端側にＶａｌ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓの８アミノ酸が付加された融合タンパク質として発現することになる。
【０１０１】
大腸菌を用いて組換えＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質を発現させるためには、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−３−２を保持する大腸菌またはｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−４−２を保持する大腸菌を、Ｌブロス培地５００mlで３７℃、３時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄチオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を０.１mMとなるように添加し、発現誘導をかけた後、２３℃で１５時間培養した。培養終了後、４，８００×ｇ、１０分間、４℃の遠心操作により菌体を回収後、１Ｍ 尿素、０.２５％ ザルコシル、０.５％ ＮＰ−４０および１mM フェニルメチルサルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むＰＢＳ１０mlに懸濁した後、菌体を超音波破砕した。該菌体破砕液を４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心して得た上清に、４０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加した。さらに、該破砕液を４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心し、得られた上清に５４％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加した。これを再度４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心して得た沈殿は、ＰＢＳ １０mlで溶解した後、大量のＰＢＳに対して透析を行なった。このようにして得られた組換えＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質の粗抽出液は、２.５ml容量Ｈｉｓ ｂｉｎｄカラム（ノバジェン社）に通した後、同カラムを２５mlのバインディングバッファー（５ｍＭイミダゾール、０.５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７.９）で洗浄、ついで１５mlの２０mM イミダゾールを含有する同バインディングバッファーで洗浄した後、組換えＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質を１５mlの６０mM イミダゾールを含有する同バインディングバッファーで溶出した。
【０１０２】
【実施例５】
ＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の有するＧＦＡＴ活性の測定
ＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の有するＧＦＡＴ活性は以下の方法により測定した。すなわち、ｐＨ７.５の次の組成からなる溶液（０.１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4、５０mM ＫＣｌ、５０mM ＨＥＰＥＳ、１mM ＥＤＴＡ、５mM ＤＴＴ）に、反応基質であるグルタミンおよびフルクトース−６リン酸をそれぞれ終濃度が６mMおよび１０mMになるように添加した反応液１００μｌに、ＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質を１μｌ添加し、室温で５時間反応させた。反応後、該反応液を遠心濾過器ウルトラフリーＣ３ＧＣ（分子量１万カット、ミリポア社）に供し、遠心して得た濾液にメタノール：水：トリエチルアミン（２：２：１）の混合液を等量加えた。該溶液を真空乾燥した後、メタノール：水：トリエチルアミン：フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）（７：１：１：１）の混合液２０μｌで溶解し、室温で２０分反応した。該溶液を真空乾燥させた後、５mM ＮａＨ2ＰＯ4、５％ アセトニトリルからなる混合液１００μｌに溶解させ、ＨＰＬＣ（日立 L-4200 UV-VIS ディテクター，L-6200 インテリジェントポンプ）を用いて、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸の生成率を調べた。コントロールには、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸を用いた。カラムにはTOSOH TSK-GEL ODS-80TM（東ソー社）を用い、２３２mM 酢酸ナトリウム、０.１％ トリエチルアミン、５％ アセトニトリル（ｐＨ６.０）からなる移動相を１ml／分の流速で流して分離を行ない、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸はＵＶ２５４nmで検出した。その結果、反応液にＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質をフルクトース−６リン酸とともに加えた場合にのみ、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸に相当する位置にピークが確認された。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、ＧＦＡＴ活性などの作用を有している。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、および本発明のタンパク質またはその部分をコードするＤＮＡは、例えば、低血糖症などの疾患の治療・予防剤などの医薬として有用である。さらに、本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡの発現異常を検出することができるので、低血糖症や糖尿病などの疾患の遺伝子診断剤として有用である。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量などに使用することができる。
さらに、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、本発明のタンパク質のＧＦＡＴ活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬として有用である。
【０１０４】
【配列表】
【配列番号：１】
【配列番号：２】
【配列番号：３】
【配列番号：４】
【配列番号：５】
【配列番号：６】
【配列番号：７】
【配列番号：８】
【配列番号：９】
【配列番号：１０】
【配列番号：１１】
【配列番号：１２】
【配列番号：１３】
【配列番号：１４】
【配列番号：１５】
【配列番号：１６】
【配列番号：１７】
【配列番号：１８】
【配列番号：１９】
【配列番号：２０】
【配列番号：２１】
【配列番号：２２】
【配列番号：２３】
【配列番号：２４】
【配列番号：２５】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例２で得られた本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３】参考例１で得られたタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４】本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＢ１９４４の構築図を示す。
【図５】本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをプローブとして用いて、本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするｍＲＮＡのヒトの各組織における発現量をノザンハイブリダイゼーションで調べた結果を示す（電気泳動写真図）。（１）は心臓を、（２）は脳を、（３）は胎盤を、（４）は肺を、（５）は肝臓を、（６）は平滑筋を、（７）は腎臓を、（８）は膵臓を、（９）は脾臓を、（１０）は胸腺を、（１１）は前立腺を、（１２）は精巣を、（１３）は卵巣、（１４）は小腸を、（１５）は大腸を示す。縦軸のｃｍは泳動距離を示す。
【図６】ヒトβ−アクチンプローブをプローブとして用いて、ヒトβ−アクチンをコードするｍＲＮＡのヒトの各組織における発現量をノザンハイブリダイゼーションで調べた結果を示す（電気泳動写真図）。（１）は心臓を、（２）は脳を、（３）は胎盤を、（４）は肺を、（５）は肝臓を、（６）は平滑筋を、（７）は腎臓を、（８）は膵臓を、（９）は脾臓を、（１０）は胸腺を、（１１）は前立腺を、（１２）は精巣を、（１３）は卵巣、（１４）は小腸を、（１５）は大腸を示す。縦軸のｃｍは泳動距離を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel protein exhibiting activities such as glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (hereinafter abbreviated as GFAT) and DNA encoding the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the number of patients with diabetes has increased, and has attracted attention as one of adult diseases. Non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) is a common type of diabetes in Japan, and early detection and early treatment are important from the viewpoint of prognosis. However, NIDDM has a variety of causes, and there is little knowledge about possible causes.
Causes of insufficient insulin action in NIDDM include abnormal insulin sensitivity mechanisms and decreased insulin secretion. In Europe and the United States, the former, ie, insulin resistance is the main feature, but in Japan, insulin secretion failure is often the main feature. Recently, knowledge of insulin sensitivity mechanism has been accumulated due to rapid progress of molecular biology. Beginning with the elucidation of the structure of the insulin receptor, the signal transduction mechanism after the receptor has gradually become clear. In addition, sugar transporter genes have been cloned over the past 10 years, and the relationship between mutations in these genes and the onset of diabetes has been studied. However, the combined insulin, glucokinase, and mitochondrial gene abnormalities that have been revealed to date are less than 1% of NIDDM, and other genetic abnormalities need to be revealed in the future.
In recent years, antidiabetic drugs with a completely different mechanism of action from conventional oral hypoglycemic drugs (α-glycosidase inhibitors: Acarbose, Voglibose [Diabetes Frontier, 3, 557-564 (1992); (Drugs), 46, 1025-1054 (1994); History of Medicine, 149, 591-618 (1989); Clinical and Research, 67, 219-233 (1990); Clinical and Research, 69, 919-932 (1992) ); Clinician 21 (extra number), 578-587 (1995)], insulin sensitizers: Troglitazone, Pioglitazone [Diabetes, 37, 1549-1558 (1998); Clinical medicine 9 (Suppl 3) , 127-150 (1993); New England Journal of Medicine (New Engl. J. Med.), 331, 1188-1193 (1994); "New diabetes treatment" (Yuo Goto), Pharmaceutical Journal , Osaka, (1994)]) has appeared and is about to be released.
On the other hand, in the United States, Biguanide (New England Journal of Medicine (New Engl. J. Med.), 333, 541-549 (1995); Diabetes Spectrum (1995); ), 8, 194-197 (1995)] has been recognized as an antidiabetic drug, and has been attracting attention because it can be treated in daily practice. Each of these drugs has a function of lowering blood glucose without promoting insulin secretion from pancreatic β cells, unlike sulfonylurea (SU) drugs that have been widely used in daily practice for a long time.
[0003]
At present, the following nine items are considered as the action mechanism of a therapeutic drug for diabetes having a function of improving insulin resistance. (1) Activation of insulin receptor kinase, (2) Promotion of transfer of sugar transporter to cell membrane, (3) Action of rate-limiting enzyme of sugar metabolism, correction of abnormal sugar metabolism, (4) Inhibition of hepatic gluconeogenesis, (5) Promotion of glucose uptake by the liver, (6) Increase in liver glycogen production, (7) Decrease in blood lipid, (8) Decrease in hepatic gluconeogenesis due to decrease in blood lipid, (9) Increase in blood lipid This includes an increase in insulin sensitivity associated with the decrease.
GFAT is an important enzyme that catalyzes the rate-limiting step from fructose-6-phosphate to glucosamine-6-phosphate in the hexosamine biosynthetic pathway. It is considered that a drug that inhibits the activity of GFAT can promote the uptake of glucose into cells and lower the blood glucose level, and therefore, it is expected to be developed as a therapeutic drug for diabetes. The mechanism of action is considered to be related to (2) or (5) among the above, but can be explained as follows.
The hexosamine biosynthetic pathway produces UDP-N-acetylglucosamine, CMP-N-acetylneuraminic acid, etc. in its metabolic process, but these flow as crude raw materials for protein glycation modification and proteoglycans or gangliosides It is considered a thing. On the other hand, when insulin binds to a receptor on the cell surface, an intracellular signal is activated, and a sugar transport carrier (such as GLUT4) pooled in the cell moves to the membrane surface layer to promote glucose uptake. The incorporated glucose is metabolized by the glycolytic system and accumulates ATP as an energy source. However, when excessively incorporated, fructose-6-phosphate, which is a glucose metabolite, flows into the hexosamine biosynthetic pathway. The flowing fructose-6-phosphate is converted to glucosamine-6-phosphate by GFAT. Although the detailed mechanism is unknown, evidence from various situations reveals that glucosamine-6-phosphate metabolites inhibit membrane transport of the sugar transporter, thereby inhibiting glucose uptake into cells. [FASEB J., 5, 3031-3036 (1991); Diabetologia, 38, 518-524 (1995); Journal of Biological Chemistry (J. Biol Chem.), 266, 10155-10161 (1991); Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 266, 4706-4712 (1991); Endocrinology, 136, 2809 -2816 (1995)].
[0004]
From this, it is considered that the hexosamine biosynthetic pathway functions as a feedback mechanism for excessive glucose uptake as one of its roles. GFAT is important as a rate-limiting enzyme in the pathway. In addition, it is known that this GFAT activity is generally high in diabetic patients, and is considered to be one cause of high blood glucose level [Diabetes, 45, 302-307 (1996)]. .
Each of the hypoglycemic drugs whose main action is required outside the pancreas like GFAT has a function of releasing insulin resistance in the target tissue. These drugs have various clinical merit other than a simple hypoglycemic action, and further secondary effects can be expected. In addition, the effect of combination therapy with other drugs is expected.
There is currently only one known GFAT gene derived from humans (J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992)), a 77kDa protein consisting of 681 amino acids. It has been reported. In addition, GFAT genes have been cloned from other animal species. For example, mouse-derived GFAT has a high homology of 91% at the base level and 98.6% at the amino acid level with human-derived GFAT [Gene , 140, 289-290 (1994)]. In addition, yeast-derived GFAT [Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 264, 8753-8758 (1989)] and E. coli-derived GFAT [Biochemical Journal (Biochem. J.), 224, 779-815 (1984)] have been reported, but all showed high homology to human GFAT, and the existence of novel GFAT was not known at all.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Isolation of a new protein exhibiting GFAT activity enables the elucidation of the regulatory function by GFAT in the hexosamine biosynthetic pathway, and further elucidation of the mechanism of glucose metabolism by organ if expressed specifically in the organ In addition, if a specific drug having an inhibitory activity on the GFAT protein is found, development of a hypoglycemic drug having a new action mechanism useful for the prevention and treatment of diabetic diseases with few side effects can be expected.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors succeeded in cloning a cDNA having a novel base sequence from a human brain-derived cDNA library, and the protein encoded thereby It was found to show GFAT activity. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
[0007]
That is, the present invention
(1) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof,
(2) the protein according to item (1), which has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(3) The protein according to item (1) or (2), which has glutamine: fructose-6-phosphate amidetransferase activity;
(4) a partial peptide of the protein according to item (1) or a salt thereof,
(5) DNA containing a DNA having a base sequence encoding the protein according to (1) or the partial peptide according to (4),
(6) the DNA according to item (5) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(7) DNA according to item (5) having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6,
(8) a recombinant vector containing the DNA according to item (5),
(9) A transformant transformed with the recombinant vector according to item (8),
(10) The transformant according to item (9) is cultured, and the protein or salt thereof according to item (1) is produced and accumulated, and then collected. A method for producing a protein or a salt thereof,
(11) A pharmaceutical comprising the protein according to (1), the partial peptide according to (4) or a salt thereof,
(12) The medicament according to item (11), which is a therapeutic / preventive agent for hypoglycemia
(13) A pharmaceutical comprising the DNA according to (5),
(14) The medicament according to item (13), which is a therapeutic / preventive agent for hypoglycemia
[0008]
(15) the protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or an antibody against a salt thereof,
(16) Use of the protein according to (1), the partial peptide according to (4) or a salt thereof, wherein the enzyme activity (eg, GFAT) of the protein or salt thereof according to (1) Activity), a method for screening a compound or a salt thereof,
(17) Inhibiting enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein or salt thereof according to item (1) containing the protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or a salt thereof A screening kit for a compound or a salt thereof,
(18) The enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein or salt thereof according to (1) obtained by using the screening method according to (16) or the screening kit according to (17). An inhibiting compound or a salt thereof,
(19) The enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein or salt thereof according to (1) obtained by using the screening method according to (16) or the screening kit according to (17). A medicament comprising an inhibiting compound or a salt thereof, and
(20) The medicament according to item (19), which is a therapeutic / preventive agent for diabetes.
[0009]
Furthermore, the present invention provides
(21) The partial peptide according to (4), which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9,
(22) DNA containing a DNA having a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 under highly stringent conditions;
(23) a recombinant vector containing the DNA according to item (22),
(24) A transformant transformed with the recombinant vector according to item (23),
(25) The transformant according to item (24) is cultured, the protein encoded by the DNA according to item (22) is produced, accumulated, and collected. A method for producing a protein encoded by the DNA or a salt thereof,
(26) a protein encoded by the DNA according to item (22) or a salt thereof, which is produced by the production method according to item (25);
(27) The antibody according to item (15) is allowed to react competitively with the test solution and the labeled protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or a salt thereof. Wherein the ratio of the labeled protein (1), the partial peptide described in (4) or a salt thereof bound to the antibody is measured (1) ) The protein according to item, the partial peptide according to item (4) or a salt thereof,
(28) After reacting the test solution and the antibody according to item (15) insolubilized on the carrier and the labeled antibody according to item (15) simultaneously or successively, on the insolubilized carrier A method for quantifying the protein according to item (1), the partial peptide according to item (4), or a salt thereof, wherein the activity of the labeling agent is measured
[0010]
(29) A medicament comprising the antibody according to item (15) (preferably the antibody according to item (15) having an activity of neutralizing the activity of the protein according to item (1)),
(30) The medicament according to item (33), which is a therapeutic / preventive agent for diabetes,
(31) (i) When the substrate is contacted with the protein according to (1), the partial peptide according to (4) or a salt thereof, and (ii) the protein according to (1), When the substrate and the test compound are contacted with the partial peptide according to item 4) or a salt thereof, the enzyme activity of the protein according to item (1) or the partial peptide according to item (4) or a salt thereof is measured. A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein or the salt thereof according to (1),
(32) an antisense DNA having a base sequence complementary or substantially complementary to the DNA according to item (5) or (22) and capable of suppressing the expression of the DNA;
(33) The base sequence substantially complementary to the DNA of item (5) or (22) is about 70% or more of the total or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA ( Preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more) antisense DNA according to item (32),
(34) A pharmaceutical comprising the antisense DNA according to (32), and
(35) The medicament according to item (34), which is a therapeutic / preventive agent for diabetes.
[0011]
The protein of the present invention is represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2 or the first to 425th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in FIG. 1, or SEQ ID NO: 3 or FIG. 2). Amino acid sequence of the first to 425th amino acid sequence) or a protein containing an amino acid sequence substantially identical to them.
The protein of the present invention can be used, for example, in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, human, warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) Pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer) Cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stroma Cells, or progenitors of these cells, stem cells or cancer cells), or any tissue in which these cells are present, eg, the brain, each part of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, cerebral base) , Hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver , Gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, It may be a protein derived from the uterus, bone, joint, skeletal muscle or the like, or may be a synthetic protein.
[0012]
The amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1 is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, most preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples include amino acid sequences having about 95% or more homology.
The protein containing the amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1 of the present invention has the amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1, and represented by SEQ ID NO: 1. A protein having substantially the same quality of activity as the contained protein is used.
Examples of substantially the same activity include GFAT activity. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the activity such as GFAT activity is the same (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
The GFAT activity can be measured according to a method known per se. For example, it can be measured according to a screening method for a pharmaceutical candidate compound described below.
The protein of the present invention includes (1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20, more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence in which about 10 to 10 amino acids, most preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted. (2) 1 or 2 or more (preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. ˜30, more preferably about 1-20, more preferably about 1-10, most preferably several (eg, 1-5) amino acid sequences added, (3) SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, most preferably several (for example 1 ~ 5)) Amino acid amino acid sequence are substituted with other amino acids, or ▲ 4 ▼ well as protein containing the amino acid a combination thereof is used.
[0013]
As a more preferable protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, for example, substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of FIG. 1) A protein having the same amino acid sequence, or a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence in FIG. 2).
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence having homology of about 95% or more is most preferably used, and in particular, it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 80 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. % Or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more amino acid sequences.
The protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 described above, A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
Examples of substantially the same activity include GFAT activity. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the activity such as GFAT activity is the same (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
The GFAT activity can be measured according to a method known per se. For example, it can be measured according to a screening method for a pharmaceutical candidate compound described below.
[0014]
The protein of the present invention includes (1) 1 or 2 or more (preferably about 1-30, more preferably about 1-20, and still more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. An amino acid sequence in which about 10 to 10 amino acids, most preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted. (2) 1 or 2 (preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. ˜30, more preferably about 1-20, more preferably about 1-10, most preferably several (eg, 1-5) amino acid sequences added, (3) SEQ ID NO: : 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 2 (preferably about 1-30, more preferably about 1-20, still more preferably about 1-10, most preferably several (eg, 1 ~ 5)) Amino acid amino acid sequence are substituted with other amino acids, or ▲ 4 ▼ well as protein containing the amino acid a combination thereof is used.
[0015]
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. The amino acid sequence having homology of about 95% or more is most preferably used, and in particular, it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 80 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. % Or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more amino acid sequences.
The protein containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the present invention has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 described above, A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
The substantially homogeneous activity includes, for example, GFAT activity. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the activity such as GFAT activity is the same (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
The GFAT activity can be measured according to a method known per se. For example, it can be measured according to a screening method for a pharmaceutical candidate compound described below.
[0016]
The protein of the present invention includes (1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20, more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence in which about 10 to 10 amino acids, most preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted, (2) 1 or 2 (preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 ˜30, more preferably about 1-20, more preferably about 1-10, most preferably several (eg, 1-5) amino acid sequences added, (3) SEQ ID NO: : 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 3 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, most preferably several (eg, 1 ~ 5)) Amino acid amino acid sequence are substituted with other amino acids, or ▲ 4 ▼ well as protein containing the amino acid a combination thereof is used.
When the amino acid sequence is deleted, added or substituted as described above, the position of the deletion, addition or substitution is not particularly limited. For example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 Examples include positions other than the first to 425th amino acid sequences of the sequence (that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1).
[0017]
The protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. The protein of the present invention, including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminus that is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO). - ) But the C-terminus is an amide (-CONH 2 ) Or ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 A cycloalkyl group such as phenyl, α-naphthyl and the like 6-12 Aryl groups such as phenyl-C such as benzyl, phenethyl and the like 1-2 Alkyl groups or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as alkyl group 7-14 In addition to the aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group that is widely used as an oral ester is used.
When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the protein of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) has a protecting group (for example, a C-form such as a formyl group or an acetyl group). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 An acyl group and the like, a glutamyl group produced by cleaving the N-terminal side in vivo, and pyroglutamylated, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C such as formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 Examples thereof include those protected with an acyl group or the like, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
Specific examples of the protein of the present invention include, for example, human-derived protein TGC028-3 (FIG. 1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or human-derived protein TGC028- having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. 4 (FIG. 2) or the like is used.
[0018]
The partial peptide of the protein of the present invention may be any peptide as long as it is a partial peptide of the above-described protein of the present invention. For example, at least 10 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention, preferably Is a peptide having an amino acid sequence of 50 or more, more preferably 100 or more, and preferably has a GFAT activity.
Specific examples of the partial peptide of the present invention include, for example, SEQ ID NO: 7 (the first to 149th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3), SEQ ID NO: 8 ( SEQ ID NO: 2 or amino acid sequence 150 to 270 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) or (and) SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 A partial peptide having an amino acid sequence represented by the 271st to 425th amino acid sequences) is used. More specifically, the partial peptide of the present invention includes the first to 270th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8). An amino acid sequence having the amino acid sequence represented), or a partial peptide having the 150th to 425th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like.
[0019]
In addition, the partial peptide of the present invention includes (1) 1 or 2 or more (for example, 1 to 20, preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. An amino acid sequence in which about 10 amino acids, more preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted, (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 An amino acid sequence to which one or two or more (for example, 1 to 20, preferably about 1 to 10, more preferably several (eg, 1 to 5)) amino acids are added; (3) SEQ ID NO: 7, 1 or 2 or more (for example, about 1 to 20, preferably about 1 to 10, more preferably several (eg, 1 to 5)) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 Of amino acids are replaced with other amino acids The amino acid sequence was, or ▲ 4 ▼ such partial peptides containing them The combined amino acids are also used.
In the partial peptide of the present invention, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO). - However, as in the protein of the present invention described above, the C-terminus is an amide (-CONH 2 ) Or ester (—COOR).
Further, in the partial peptide of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected with a protecting group, and the N-terminal side is the same as the above-described protein of the present invention. Complexes such as those in which the glutamyl group cleaved in the body is pyroglutamylated, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a so-called glycopeptide with a sugar chain attached Peptides are also included.
Since the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for preparing an antibody, it does not necessarily have GFAT activity.
[0020]
As the salt of the protein or partial peptide of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal) is used, and particularly physiologically acceptable. The acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The protein, partial peptide or salt thereof of the present invention can be produced from the aforementioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known method for purifying a protein or peptide, and encodes a protein or partial peptide described below. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA to be cultured. Moreover, it can also manufacture according to the peptide synthesis method mentioned later or the method according to this.
When the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention is produced from human or warm-blooded animal tissue or cells, the human or warm-blooded animal tissue or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract , Methods that utilize solubility, such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly using differences in molecular weight, ion exchange Methods that utilize differences in charge such as chromatography, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography, methods that utilize hydrophobic differences such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectric focusing, etc. It is possible to purify and isolate by combining methods utilizing the difference in isoelectric point.
For the synthesis of the protein of the present invention, partial peptide or salt thereof, or amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenyl. Examples include acetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. . Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various condensation methods known per se according to the sequence of the target protein or partial peptide. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein, partial peptide or their amides. To do.
[0021]
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOOBt ester. After that, it can be added to the resin.
The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and sulfoxides such as dimethyl sulfoxide. , Ethers such as DMF, pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or a suitable mixture thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reactions, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
[0022]
Examples of the protective group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, alkyl esterification (eg, linear, branched or cyclic alkyl esterification such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxycarbonyl It can be protected by hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of the group suitable for esterification include a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As a protecting group for imidazole of histidine, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0023]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane. Acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol. It is effective to add a cation scavenger such as 1,2-ethanedithiol. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the above 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0024]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide of the protein of the present invention or a partial peptide thereof, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then a peptide chain (protein chain) is desired on the amino group side. After extending to the chain length, a protein from which only the N-terminal α-amino protecting group of the peptide chain was removed and a protein from which only the C-terminal carboxyl protecting group was removed were prepared. Condensation in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method, and the desired crude protein can be obtained. This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or a partial peptide thereof.
In order to obtain an ester of the protein of the present invention or a partial peptide thereof, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the same as the amide of the protein or partial peptide, An ester of a desired protein or a partial peptide thereof can be obtained.
[0025]
The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the target peptide is condensed with the remaining part, and when the product has a protective group, the target peptide can be produced by removing the protective group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara,
▲ 5 ▼ Supervision by Yajima Haruaki, Development of follow-up
In addition, after the reaction, the target peptide can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained by a salt, a known method or a method analogous thereto Can be converted to the free form or other salts.
[0026]
The DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the protein of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
Specifically, as the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, for example, (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or (2) SEQ ID NO: : Encodes a protein that hybridizes to the base sequence represented by 4 under highly stringent conditions and has substantially the same activity (eg, GFAT activity) as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Any DNA may be used as long as it contains a base sequence to be processed.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 under highly stringent conditions is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. Is a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
[0027]
Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention include, for example, (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or (2) represented by SEQ ID NO: 5. A base sequence that encodes a protein that hybridizes under high stringency conditions and has substantially the same activity (eg, GFAT activity) as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Any DNA may be used as long as it contains DNA.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 under highly stringent conditions is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. Is a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, or (2) represented by SEQ ID NO: 6. A base sequence that encodes a protein that hybridizes under high stringency conditions with a protein having substantially the same activity (eg, GFAT activity) as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Any DNA may be used as long as it contains DNA.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 under highly stringent conditions is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 6. Is a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
[0028]
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is used. As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a DNA containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is used. As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used.
[0029]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can be directly amplified by RT-PCR using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
Specifically, as the DNA encoding the partial peptide of the present invention, for example, (1) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or (2) ▼ having a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 under highly stringent conditions, and substantially the same activity as the protein of the present invention (eg, GFAT activity, etc.) A DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a partial peptide having a phenotype is used. The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. Most preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more is used.
[0030]
More specifically, as the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention, for example, (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, or (2) A DNA having a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 under highly stringent conditions is used.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 under highly stringent conditions is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, most preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 For example, DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more is used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, or (2) SEQ ID NO: 11. A DNA having a base sequence that hybridizes under high stringency conditions with the represented base sequence is used.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 include, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11. A DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.
[0031]
Examples of the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, or (2) SEQ ID NO: 12. A DNA having a base sequence that hybridizes under high stringency conditions with the represented base sequence is used.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 under highly stringent conditions is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, most preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 For example, DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more is used.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
Among the above, as the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention, for example, the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is used. As the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 of the present invention, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 is used. As the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the present invention, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 is used.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a means for cloning DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), (1) having a partial base sequence of the DNA encoding the protein of the present invention A synthetic DNA primer is used to amplify the target DNA from the DNA library or the like by the PCR method, or (2) it encodes a DNA incorporated into an appropriate vector and a part or the entire region of the protein of the present invention. Screening by hybridization with a labeled DNA fragment or synthetic DNA. The hybridization method is performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
The DNA encoding the partial peptide of the present invention can also be produced according to a known oligonucleotide synthesis method.
DNA base sequence conversion (deletion / addition / substitution) can be carried out by using known kits such as Mutan TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used according to a method known per se, such as the Gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
Examples of the expression vector for the DNA encoding the protein of the present invention include (a) cutting out the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention, and (b) using the promoter in the appropriate expression vector. It can manufacture by connecting downstream.
[0033]
Examples of vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, the CMV promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is Bacillus, the promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc. are SPO1, SPO2, promoter, etc. When the host is yeast, the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
[0034]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r And neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like. In particular, when the dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO is used as a selection marker, cells transformed with the target gene can also be selected using a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein. When the host is Escherichia, alkaline phosphatase signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is an animal cell, for example, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced by introducing a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed into a cell.
[0035]
As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
As a specific example of the genus Escherichia, Escherichia coli K12 DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA] ), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol). )], 120, 517 (1978)], HB101 [J. Mol. Biol., 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39 Vol., 440 (1954)] or the like is used.
Examples of Bacillus bacteria include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R. - NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71, and the like.
[0036]
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, sputum-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, Vol. 13, 213-217 (1977)).
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cell COS-7, Vero cell, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr). - Abbreviated as cell), mouse L cell, mouse AtT-20 cell, mouse myeloma cell, rat GH3 cell, human FL cell, 293 cell, C127 cell, BALB / 3T3 cell, Sp-2 cell and the like. Among these, CHO cells, CHO (dhfr - ) Cells, 293 cells, etc. are preferred.
[0037]
To transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982), and the like.
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of -The method can be carried out according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects are transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). In order to transform animal cells, for example,
Examples of methods for introducing expression vectors into cells include the calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology 52, 456-467 (1973)], and electroporation [Nuemann, E. et al. Embo Journal (EMBO J.) 1, 841-845 (1982)].
Thus, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the protein of the present invention is obtained.
[0038]
In addition, as a method of stably expressing the protein of the present invention using animal cells, there is a method of selecting a cell in which the expression vector introduced into the animal cell is incorporated into a chromosome by clone selection. Specifically, a transformant is selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly selecting clones for the animal cells obtained using the selection marker. Further, when the dhfr gene is used as a selection marker, the MTX concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected to amplify the DNA encoding the protein of the present invention together with the dhfr gene in the cell, Furthermore, animal cell lines with high expression can be obtained.
The protein of the present invention or a salt thereof can be produced by culturing the above transformant under conditions capable of expressing the DNA encoding the protein of the present invention to produce and accumulate the protein of the present invention.
When culturing a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include inorganic salts such as ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract. Examples of organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
[0039]
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, in order to make the promoter work efficiently, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added. When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or stirring can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of Science. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proceedings of the National -Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
[0040]
When cultivating a transformant whose host is an insect cell or an insect, examples of the medium include 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) Those appropriately added with these additives may be used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)],
In particular, CHO (dhfr - ) When using cells and the dhfr gene as selectable markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal bovine serum that contains little thymidine.
As described above, the protein of the present invention can be produced in the transformant.
[0041]
Separation and purification of the protein of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. For example, a method of obtaining a crude extract of the protein of the present invention by centrifugation or filtration after destroying cells or cells by the method can be appropriately used. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer, Triton X-100 TM A surfactant such as may be contained.
When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the protein of the present invention contained in the culture supernatant thus obtained or in the extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used.
When the protein of the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or other salt by a method similar to that.
In addition, the protein of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The presence or activity of the protein of the present invention thus produced can be detected or measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody.
[0042]
If the antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention) is an antibody capable of recognizing the protein of the present invention, the partial peptide thereof or a salt thereof, polyclonal Either an antibody or a monoclonal antibody may be used. Furthermore, the antibody against the protein or the like of the present invention may have an activity to neutralize the activity of the protein or the like of the present invention.
The antibody against the protein or the like of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se, using the protein or the like of the present invention as an antigen.
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The protein or the like of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or a diluent, at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, collect spleen or
Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like. P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably
[0043]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as a protein is adsorbed directly or together with a carrier, and then radioactive. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A; Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, but can usually be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example,
[0044]
(B) Purification of monoclonal antibody
Separation and purification of monoclonal antibodies are the same as those for separation and purification of conventional polyclonal antibodies (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). ), A specific purification method in which only the antibody is collected with an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody. Can be done.
[0045]
[Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a protein) and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. From the immunized animal, an antibody against the protein of the present invention is contained. The product can be produced by collecting and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that antibodies are more effective against hapten immunized by cross-linking to carrier. As long as it is possible, any substance may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin and the like are about 0.1 to 20, preferably about 1 with respect to
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer of the hybridoma culture supernatant. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
[0046]
Antisense having a base sequence complementary to or substantially complementary to DNA or mRNA containing a base sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as DNA or mRNA of the present invention) The DNA may be any oligonucleotide or derivative thereof having a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA or mRNA of the present invention and having an action capable of suppressing the expression of the protein of the present invention. Any antisense DNA may be used.
The base sequence substantially complementary to the DNA or mRNA of the present invention is, for example, the entire base sequence or partial base of the base sequence complementary to the DNA or mRNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). Examples thereof include base sequences having about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of the sequence. In particular, of the total base sequence of the complementary strand of the DNA or mRNA of the present invention, about 80 and the complementary strand of the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, the base sequence near the start codon). Antisense DNA having a homology of at least%, preferably at least about 85%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
[0047]
The protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof has an action such as GFAT activity that catalyzes the conversion reaction between fructose-6-phosphate and glucosamine-6-phosphate in the hexosamine biosynthesis pathway. In particular, it is a protein with relatively strong GFAT activity that converts fructose-6-phosphate to glucosamine-6-phosphate. Therefore, the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof can be used for various applications.
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the DNA of the present invention), a book The use of antibodies against the proteins of the invention (hereinafter abbreviated as antibodies of the present invention) and antisense DNA will be described.
[0048]
(1) Medicine
The protein or the like of the present invention or the DNA of the present invention is used for the treatment / prevention of, for example, a defect in a gene encoding GFAT, a disease caused thereby, or a decrease in GFAT function or a disease caused thereby (eg, hypoglycemia). It is useful as a medicine such as an agent.
For example, when there is a patient whose GFAT activity in cells is not fully or normally exhibited because GFAT is decreased or deficient in vivo, (i) the DNA of the present invention is administered to the patient, By expressing the protein of the present invention in a living body, (b) inserting the DNA of the present invention into a cell and expressing the protein of the present invention, and then transplanting the cell into a patient (ha ) By administering the protein of the present invention to the patient, the role of the protein of the present invention in the patient can be fully or normally exhibited.
When the protein or the like of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical, for example, it is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., which is sugar-coated as necessary, or water or other pharmaceuticals. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with an acceptable liquid, or an injection such as a suspension. For example, the protein of the present invention is mixed with a physiologically recognized carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form generally required for the practice of a recognized formulation. Can be manufactured. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained. When the DNA of the present invention is used, it can be carried out according to conventional means after inserting the DNA alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector. The DNA of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the protein or the like of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, further preferably 99% or more is used. preferable.
[0049]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. .
As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
Examples of the therapeutic / prophylactic agent include a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared pharmaceutical composition such as an injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
A vector into which the DNA of the present invention has been inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
[0050]
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the protein of the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia, 60 kg), the protein and the like are administered at about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of treating hypoglycemia, the protein of the present invention is administered in the form of an injection for adults. When administered to a body weight of 60 kg, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the protein or the like is injected into the affected area per day. Is conveniently administered. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
The DNA of the present invention can also be used in the same manner as described above.
[0051]
(2) Gene diagnostic agent
By using the DNA of the present invention as a probe, the protein of the present invention in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.) can be used. Since an abnormality (gene abnormality) of the encoding DNA or mRNA (hereinafter abbreviated as the DNA or mRNA of the present invention) can be detected, for example, the DNA or mRNA of the present invention is damaged, deleted, mutated or decreased in expression. It is useful as a genetic diagnostic agent for detecting an increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
The above gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 874-879 (1989), Processings of the -National Academy of Sciences of USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 86, 2766-2770 (1989)).
For example, when excessive expression of the mRNA is detected by Northern hybridization, it can be diagnosed that the disease is, for example, a disease such as diabetes or is likely to be affected in the future.
On the other hand, when a decrease in the expression of the mRNA is detected by Northern hybridization, it can be diagnosed that the disease is, for example, a disease such as hypoglycemia or is likely to suffer in the future.
In addition, when a DNA mutation is detected by the PCR-SSCP method, it can be diagnosed that, for example, it is a disease such as hypoglycemia or diabetes, or it is highly likely to be affected in the future.
[0052]
(3) Quantification of the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof
Since the antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof can specifically recognize the protein of the present invention, the partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention). It can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention provides (i) a labeled present invention in which an antibody against the protein of the present invention is competitively reacted with a test solution and the labeled protein of the present invention and bound to the antibody. And (ii) the antibody of the present invention insolubilized on the test solution and the carrier and the labeled antibody A method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after reacting with the antibody of the present invention simultaneously or continuously.
In the quantification method (ii) above, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the protein of the present invention. desirable.
[0053]
In addition to quantification of the protein of the present invention using a monoclonal antibody (hereinafter sometimes referred to as anti-protein antibody) against the protein of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) of the antibody molecule. 2 , Fab ′, or Fab fractions may be used.
The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, the amount of protein) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by a chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ Three H], [ 14 C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
[0054]
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
In the method for measuring the protein or the like of the present invention by the sandwich method of the present invention, antibodies having different binding sites for the protein or the like of the present invention are preferably used as the monoclonal antibody used in the primary reaction and the secondary reaction. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody used in the primary reaction when, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of the protein of the present invention. For example, an antibody that recognizes the N end other than the C end is used.
[0055]
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( B / F separation), the amount of antigen in the test solution is quantified by measuring the amount of labeling of either B or F. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, and polyethylene glycol is used for B / F separation. In addition to this, a liquid phase method using a second antibody or the like for the antibody, and further, immobilization as a first antibody There are a solid phase method using an antibody or a solid phase method using a soluble antibody as a first antibody and a solid phase antibody as a second antibody.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the test solution in the test solution is separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, and then adding the solid-phased antigen and allowing the unreacted labeled antibody to bind to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Measure the amount of label and quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
[0056]
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system, such as protein of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For the details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books, etc. [For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, issued in 1974), Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical Shoin, published in 1978), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical Shoin, Showa 57 Published by Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1987), “Methods in Enzymology” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid. Antibodies and General Immunoassay Methods)), Vol. 121 (Immun ochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (see above, published by Academic Press).
As described above, the protein or the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the protein antibody of the present invention.
Furthermore, various diseases involving the protein of the present invention can be diagnosed by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention.
Specifically, when a decrease in the concentration of the protein or the like of the present invention is detected, for example, it can be diagnosed that there is a high possibility of a disease such as hypoglycemia.
On the other hand, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, it can be diagnosed that the possibility of a disease such as diabetes is high.
Thus, the antibody of the present invention is useful as a diagnostic agent for the above diseases.
Furthermore, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. Moreover, it can be used for producing the antibody column used for purifying the protein or the like of the present invention and detecting the protein or the like of the present invention in each fraction during purification.
[0057]
(4) Medicament containing the antibody of the present invention
Among the antibodies of the present invention, an antibody that can bind to the protein of the present invention and neutralize the GFAT activity of the protein of the present invention can inhibit the GFAT activity of the protein of the present invention. For example, it can be used as a medicament such as a therapeutic / preventive agent for diseases such as diabetes.
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as a solution or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form as a mammal (eg, human, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally.
The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but for example, when used for the treatment and prevention of diabetes in adults, the GFAT activity such as the protein of the present invention is neutralized. The antibody dose is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg /
The antibody of the present invention that neutralizes GFAT activity such as the protein of the present invention can be administered as it is or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules). Syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
[0058]
As a composition for parenteral administration, for example, an injection, a suppository and the like are used, and the injection is a dosage form such as an intravenous injection, a subcutaneous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection, or an infusion. Is included. Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-described antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and appropriate solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg,
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for injections, for each dosage unit dosage form. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as undesirable interactions are not caused by blending with the antibody.
[0059]
(5) Screening of drug candidate compounds for various diseases
The compound or its salt that promotes the enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein of the present invention can be used as a pharmaceutical agent such as a therapeutic / prophylactic agent for various diseases such as hypoglycemia.
On the other hand, the compound or salt thereof that inhibits the enzyme activity of the protein of the present invention can be used as a pharmaceutical agent for treating or preventing various diseases such as diabetes.
Therefore, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the enzyme activity of the protein of the present invention.
That is, the present invention
(1) A compound or a salt thereof (hereinafter abbreviated as GFAT promoter or GFAT inhibitor) that promotes or inhibits enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein of the present invention, which is characterized by using the protein of the present invention. And more specifically, for example, for example,
(2) A GFAT promoter characterized by comparing (i) a case where the substrate of the present invention is contacted with a substrate and (ii) a case where the substrate of the present invention is contacted with a substrate and a test compound Alternatively, a screening method for a GFAT inhibitor is provided.
Specifically, in the above screening method, for example, in the cases of (i) and (ii), the GFAT activity of the protein of the present invention is measured and compared.
[0060]
Any substrate can be used as long as it can be a substrate of the protein of the present invention, and fructose-6-phosphate and glutamine are usually used. Fructose-6-phosphate includes radiolabels (eg, 14 C, Three It is preferable to use fructose-6-phosphate and the like.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
In order to carry out the above screening method, a preparation such as the protein of the present invention is prepared by suspending the protein of the present invention in a buffer suitable for screening. As the buffer, any buffer that does not inhibit the binding between the protein of the present invention and the substrate, such as a phosphate buffer or a Tris-HCl buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably about
The GFAT activity of the protein of the present invention can be measured according to a known method, for example, the method of Smith et al. [Analytical Biochemistry, 98, 478-480 (1979)]. For example, a solution obtained by adding the protein of the present invention to a mixed solution composed of 12 μM fructose-6-phosphate, 5 μM glutamine, 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) is kept at 25 ° C. for 30 minutes. 0.5M hydrochloric acid was added to the solution and reacted at 98 ° C for 2 hours, and then 2.5% NaNO. 2 And 12.5% NH Four O Three SNH 2 And then add 0.25% 2-methyl-2-benzothiazolone. Next, 0.5% FeCl Three Then, the absorbance of the solution is measured at 650 nm, and the produced glucosamine-6-phosphate is quantified.
For example, when the GFAT activity in the case of (ii) promotes about 20% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of (i), the test compound Can be selected as a compound that promotes GFAT activity, such as the protein of the present invention. On the other hand, for example, when the GFAT activity in the case of (ii) is inhibited by about 20% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of (i), The test compound can be selected as a compound that inhibits GFAT activity, such as the protein of the present invention.
[0061]
The screening kit of the present invention contains the protein of the present invention. Examples of the screening kit of the present invention include the following.
[Reagent for screening]
(1) Measurement buffer
0.2M phosphate buffer (pH 8.0)
(2) Protein preparation
Protein of the present invention or salt thereof
(3) Substrate
12 μM fructose-6-phosphate, 5 μM glutamine
(4) Detection
Measure the absorbance at 650 nm.
[Measurement method]
A test compound is added to a reaction solution consisting of 12 μM fructose-6-phosphate, 5 μM glutamine, the protein of the present invention or a salt thereof, and 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0), and then incubated at 25 ° C. for 30 minutes. 0.5 M hydrochloric acid is added to this and hydrolyzed at 98 ° C. for 2 hours. 2.5% NaNO 2 And 12.5% NH Four O Three SNH 2 Followed by 0.25% 2-methyl-2-benzothiazolone. Next, 0.5% FeCl Three After adding, the absorbance is measured at 650 nm.
[0062]
The compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof may be the above-described test compound (for example, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract). A compound selected from animal tissue extracts and the like, and a compound that promotes or inhibits enzyme activity (eg, GFAT activity) of the protein of the present invention. The compound may be a novel compound or a known compound.
As the salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or a base (eg, alkali metal) is used, and particularly a physiologically acceptable acid addition salt is used. preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The compounds or salts thereof that promote enzyme activity such as the protein of the present invention are useful as pharmaceuticals such as safe and low-toxic therapeutic / preventive agents for various diseases such as hypoglycemia.
The compound or its salt which inhibits enzyme activity, such as protein of this invention, is useful as pharmaceuticals, such as a safe and low toxicity therapeutic / preventive agent with respect to various diseases, such as diabetes, for example.
[0063]
When the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out according to conventional means. For example, it can be made into a tablet, capsule, elixir, microcapsule, aseptic solution, suspension and the like in the same manner as the above-mentioned pharmaceutical containing the protein of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, for mammals (eg, humans, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) Can be administered.
The dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that promotes the enzyme activity of the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia In general, for an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, a compound that promotes the enzyme activity of the protein of the present invention is injected for the purpose of treating hypoglycemia. When administered to a normal adult (as 60 kg) in the form of a preparation, the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, when a compound that inhibits the enzyme activity of the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating diabetes, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg per day, preferably Is administered at about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like. For example, for the purpose of treating diabetes, a compound that inhibits the enzyme activity of the protein of the present invention is administered as an injection. In general, when administered to an adult (as 60 kg), the compound is intravenously injected at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Are conveniently administered. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0064]
(6) Medicine containing antisense DNA
Antisense DNA complementary to DNA or mRNA encoding the protein of the present invention and capable of suppressing the expression of the protein of the present invention has the function of the protein of the present invention that exhibits the above-mentioned action in vivo. Can be suppressed. Therefore, the antisense DNA can be used as a medicine such as a therapeutic / preventive agent for diseases such as diabetes.
When the antisense DNA is used as the above-mentioned pharmaceutical, it can be produced in the same manner as the above-mentioned therapeutic / preventive agents for various diseases containing the DNA of the present invention and administered to a mammal.
For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA can be carried out according to conventional means after being inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
[0065]
(7) DNA transfer animals
The present invention has a DNA encoding a foreign protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) Provided is a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in mammals.
A non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as a DNA-transferred animal of the present invention) can be used for embryos including unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and primordial cells thereof. Preferably, at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally prior to the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, It can be produced by transferring the target DNA by the microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like. Further, by the DNA transfer method, the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and can be used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a cell fusion method known per se.
[0066]
Examples of non-human mammals include cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like. Among them, rodents, particularly mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains) are relatively short in terms of ontogeny and biological cycle from the viewpoint of creating pathological animal model systems, and are easy to reproduce. As a system, B6C3F 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferred.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include human and the like in addition to the non-human mammal described above.
The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation or the like) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. The resulting DNA is used, and abnormal DNA is also included.
The abnormal DNA means DNA that expresses the abnormal protein of the present invention, and for example, DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, expression of DNA derived from various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology with the human DNA of the present invention. The DNA of the present invention is highly expressed by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, such as a mouse fertilized egg. DNA transfer mammals can be created.
[0067]
Examples of the expression vector for the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, and animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Etc. are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
Examples of promoters that regulate the above DNA expression include: (1) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ▼ Promoters from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) and birds (chicken, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine Kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain , Metallothionein I and IIA, metalloproteinase tissue inhibitor 1, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF- 1α), β actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin Promoters such as troponin C, smooth muscle α-actin, preproenkephalin A, and vasopressin are used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, a human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, a human and chicken β-actin promoter, and the like are preferable.
[0068]
The vector preferably has a sequence (generally referred to as a terminator) that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA-transferred mammal. For example, the sequence of each DNA derived from viruses, various mammals and birds Preferably, the SV40 terminator of simian virus or the like is used.
In addition, for the purpose of further expressing the target foreign DNA, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc., 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or It is also possible to connect 3 ′ downstream of the translation region depending on the purpose.
The normal translation region of the protein of the present invention includes liver, kidney, thyroid cell, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNA. As a raw material, a complementary DNA prepared by a known method can be obtained as a whole or a part of genomic DNA from these various genomic DNA libraries, or from mRNA derived from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblasts. In addition, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal protein translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by a conventional genetic engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured so that the exogenous DNA of the present invention is present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
[0069]
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. .
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured so that the exogenous DNA of the present invention is excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the germ cells of the produced animal after DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.
In the non-human mammal having the exogenous normal DNA of the present invention, the normal DNA of the present invention is highly expressed, and finally the function of the endogenous normal DNA is promoted to enhance the function of the protein of the present invention. It can be used as a model animal for the disease state. For example, the normal DNA-transferred animal of the present invention can be used to elucidate the hyperfunction of the protein of the present invention, the pathological mechanism of the disease associated with the protein of the present invention, and the examination of treatment methods for these diseases. Is possible.
In addition, since mammals transferred with the exogenous normal DNA of the present invention have increased symptoms of the released protein of the present invention, they can also be used in screening tests for therapeutic agents for diseases associated with the protein of the present invention. .
[0070]
On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. Furthermore, the desired exogenous DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material. A DNA construct with a promoter can be prepared by a normal genetic engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured so that the abnormal DNA of the present invention is present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA.
In the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention, the abnormal DNA of the present invention is highly expressed. It may become active refractory disease and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific applicability, the animal with high expression of the foreign abnormal DNA of the present invention is capable of inhibiting the function of the normal protein (dominant negative action by the abnormal protein of the present invention in the functional inactive refractory of the protein of the present invention. ). Moreover, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used in a therapeutic drug screening test for the functional inactive refractory disease of the protein of the present invention. Is possible.
[0071]
Further, as other applicability of the above-mentioned two kinds of DNA transfer animals of the present invention, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) Relationship with a protein that is specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing the protein in the tissue Sex analysis,
(3) Functions of cells from tissues that are generally difficult to culture by using these cells when cells from the tissue having the DNA of the present invention can be cultured by standard tissue culture techniques. Research,
(4) Screening for drugs that enhance cell function by using the cells described in (3) above, and
(5) Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of an antibody thereof can be considered.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including functional inactive refractories of the protein of the present invention, can be examined, and the protein of the present invention More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the disease can be obtained, and it is possible to contribute to the development of a new treatment method and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
In addition, each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after chopping, it is possible to obtain a free DNA-transferred cell, culture it, or establish the cultured cell with a proteolytic enzyme such as trypsin. Furthermore, the protein-producing cells of the present invention can be specified, the function of regulating sugar metabolism can be examined, and their abnormalities can be investigated, and the protein of the present invention and its action can be effectively studied.
Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for a disease related to the protein of the present invention, including the functional inactive refractory of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the above-described test method and quantification are performed. It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease using a method or the like. Moreover, it is possible to examine and develop a DNA therapy for a disease associated with the protein of the present invention using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.
[0072]
(8) Knockout animals
The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention.
That is, the present invention
(I) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(Ii) the embryonic stem cell according to item (i), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
(Iii) The embryonic stem cell according to item (i), which is neomycin resistant,
(Iv) the embryonic stem cell according to item (i), wherein the non-human mammal is a rodent;
(V) the embryonic stem cell according to item (ii), wherein the rodent is a mouse;
(Vi) the DNA expression-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention is inactivated,
(Vii) The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (vi) The non-human mammal according to Item,
(Viii) the non-human mammal according to item (vi), wherein the non-human mammal is a rodent;
(Ix) the non-human mammal according to paragraph (viii), wherein the rodent is a mouse; and
(X) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity against the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal described in item (vii) and detecting the expression of a reporter gene I will provide a.
[0073]
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted and another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.
Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Insert a reporter gene (typically a transferase gene) to disrupt the function of the exon, or insert a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates gene transcription into the intron between exons. Results in the inability to synthesize complete mRNA A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the DNA of the present invention is used for the obtained ES cells. Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the probe as a probe, or by a PCR method using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer, It can be obtained by selecting the knockout ES cell of the present invention.
[0074]
In addition, as the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. Or newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative purely immunologically genetic background For example, C57BL / 6 mice and BDF1 mice in which the number of eggs collected from C57BL / 6 is improved by crossing with DBA / 2 (for example, C57BL / 6 and DBA / 2) Those established using F1) can also be used favorably. The BDF1 mouse has C57BL / 6 mice in the background in addition to the advantage that the number of eggs collected is large and the eggs are strong. Therefore, when ES cells obtained using these mice were used to produce pathological model mice, It can be advantageously used in that the genetic background can be changed to C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
In addition, when establishing ES cells, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
As a method for determining sex of male and female ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned as an example. Using this method, it has traditionally been about 10 times for karyotype analysis. 6 In contrast to the number of cells required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by male / female discrimination. Yes, the early labor of the culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
[0075]
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast (preferably 5% carbon dioxide, 95% air, or 5% oxygen, 5% Culturing at about 37 ° C. with a carbon dioxide gas, 90% air), and at the time of passage, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA). , Preferably about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA) to form single cells and seed them on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1-3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and when morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154 (1981); GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci USA) 78, 7634 (1981); TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27 (1985)], book. The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the invention are useful for examining the importance in vitro. That.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
[0076]
In the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, for example, the targeting vector prepared as described above was introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the present invention in the targeting vector was inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by replacing the DNA sequence of the present invention on the chromosome of a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individuals thus obtained are usually individuals with deficient hetero-expression of the protein of the present invention, and individuals with deficient hetero-expression of the protein of the present invention are crossed and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Failure individuals can be obtained.
When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Mammals can be obtained by selecting those having mutations in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
[0077]
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the DNA of the animal individual obtained by mating has been knocked out.
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and a plurality of homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it is a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0078]
(8a) Screening method for compounds having therapeutic / preventive effects on diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for compounds having a therapeutic / prophylactic effect on diseases (eg, hypoglycemia) caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention. .
That is, the present invention is caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal. Provided is a screening method for a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
Specifically, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptom, etc. of the animal as an index. The therapeutic / prophylactic effect of the compound can be tested.
As a method for treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
For example, when screening for a compound having a therapeutic / prophylactic effect on hypoglycemia, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is subjected to a glucose tolerance treatment, and a test compound is administered before or after the glucose tolerance treatment, The blood glucose level and body weight change of the animal are measured over time.
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, if the blood glucose level of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is decreased. It can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect on blood glucose.
[0079]
The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and for diseases caused by deficiency or damage of the protein of the present invention (eg, hypoglycemia etc.) Since it has a therapeutic / prophylactic effect, it can be used as a pharmaceutical agent such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids), bases (eg, alkali metals) and the like. In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
A medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the protein of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia, generally an adult (with a body weight of 60 kg) is used. ), The compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of treating hypoglycemia, the compound is usually administered in the form of an injection (as 60 kg). ), It is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. is there. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0080]
(8b) Screening method for compounds that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof A salt screening method is provided.
In the above screening method, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene among the above-mentioned DNA expression-deficient non-human mammals of the present invention, A gene capable of expressing the reporter gene under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ) is preferable.
In the non-human mammal of the present invention in which the DNA of the present invention is substituted with a reporter gene, the reporter gene is present under the control of the promoter for the DNA of the present invention, so that the expression of the protein encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
[0081]
For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with the β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the protein of the present invention is originally replaced with the tissue expressing the protein of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate of β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), the present invention can be easily performed. The expression state of the protein in the animal can be observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or 7 ° C. After reacting in the vicinity for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
[0082]
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids), bases (eg, alkali metals), etc. And physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein, for example, it is safe and low for diseases such as hypoglycemia. It is useful as a medicine such as a toxic therapeutic / prophylactic agent.
On the other hand, the compound or its salt that inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, so that it is safe and low for diseases such as diabetes. It is useful as a medicine such as a toxic therapeutic / prophylactic agent.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
[0083]
The pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that promotes promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia In general, for an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, a compound that promotes promoter activity against the DNA of the present invention is injected for the purpose of treating hypoglycemia. When administered to a normal adult (as 60 kg) in the form of a preparation, the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered for the purpose of treating diabetes, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg per day. , Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc. For example, for the purpose of treating diabetes, a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is administered as an injection. In general, when administered to an adult (as 60 kg), the compound is intravenously injected at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Are conveniently administered. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
Thus, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic drugs.
[0084]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there are optical isomers with respect to amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
EIA: Enzyme immunoassay
[0085]
Gly: Glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: Cysteine
Met: Methionine
Glu: Glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: Lysine
Arg: Arginine
His: Histidine
Phe: Phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
[0086]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
DNP: dinitrophenol
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
TFA: trifluoroacetic acid
DIEA: Diisopropylethylamine
[0087]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The partial amino acid sequence which protein TGC028-3 and -4 of this invention has in common is shown.
[SEQ ID NO: 2]
1 shows the amino acid sequence of the protein TGC028-3 of the present invention.
[SEQ ID NO: 3]
2 shows the amino acid sequence of the protein TGC028-4 of the present invention.
[SEQ ID NO: 4]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 5]
This shows the base sequence of DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[SEQ ID NO: 6]
This shows the base sequence of DNA encoding the protein TGC028-4 of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[SEQ ID NO: 7]
This is a partial amino acid sequence that the proteins TGC028-3 and -4 of the present invention have in common and represents the first to 149th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 8]
This is a partial amino acid sequence that the proteins TGC028-3 and -4 of the present invention have in common and represents the 150th to 270th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 9]
This is a partial amino acid sequence that the proteins TGC028-3 and -4 of the present invention have in common, and shows the 271st to 425th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 10]
This shows the base sequence of DNA encoding the partial amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
[SEQ ID NO: 11]
This shows the base sequence of DNA encoding the partial amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
[SEQ ID NO: 12]
This shows the base sequence of DNA encoding the partial amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
[0088]
[SEQ ID NO: 13]
The base sequence of the probe used in order to clone DNA which codes protein TGC028-2 in the reference example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 14]
The base sequence of the probe used for cloning the DNA encoding the protein TGC028-2 in Reference Example 1 and for cloning the DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 15]
The base sequence of the probe used for cloning the DNA encoding the protein TGC028-2 in Reference Example 1 and for cloning the DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 16]
The base sequence of the probe used in order to clone DNA which codes protein TGC028-3 of this invention in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 17]
The base sequence of the probe used in Example 3 in order to perform Northern blotting on DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention is shown.
[0089]
[SEQ ID NO: 18]
The amino acid sequence of protein TGC028-2 is shown.
[SEQ ID NO: 19]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18.
[SEQ ID NO: 20]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-3 of the present invention in Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 21]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-3 of the present invention in Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 22]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-3 of the present invention in Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 23]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-3 of the present invention in Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 24]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-4 of the present invention in Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 25]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for construction of the expression vector of protein TGC028-4 of the present invention in Example 4 is shown.
[0090]
The transformant Escherichia coli DH10B / pTB1942 obtained in Reference Example 1 described later was deposited with the deposit number FERM at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) on August 9, 1996. As BP-5621, it has been deposited as Deposit No. IFO 16003 with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) since August 8, 1996.
The transformant Escherichia coli DH10B / pTB1943 obtained in Example 1 described later was deposited with the accession number FERM at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) from August 9, 1996. As BP-5622, the deposit number IFO 16004 has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) since August 8, 1996.
The transformant Escherichia coli DH10B / pTB1944 obtained in Example 2 to be described later was deposited with the accession number FERM at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) on August 9, 1996. As BP-5623, the deposit number IFO 16005 has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) since August 8, 1996.
[0091]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto. The genetic manipulation method using E. coli was in accordance with the method described in Molecular cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
[0092]
[Reference Example 1]
Cloning of a gene encoding a novel GFAT / TGC028-2 protein
Cloning of the cDNA encoding the novel GFAT • TGC028-2 protein was performed using the gene wrapper cDNA positive selection system (Gibco BRL).
Escherichia coli DH12S strain of cDNA library derived from human brain (Gibco BRL) was transferred to Terrific Broth (12 g / l Bacto-Tryptone (Difco), 24 g / l Bacto-Yeast Extract (Difco), 2.3 g / (1 potassium phosphate, 12.5 g / l dipotassium phosphate) was cultured at 30 ° C. for 16 hours, and a plasmid cDNA library was purified and extracted using Qiagen Plasmid Kit (Qiagen). The purified plasmid cDNA library was digested with Gene II and Exo III (both Gibco BRL) to prepare a single-stranded cDNA library.
On the other hand, a synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) was used as a probe for screening a cDNA library. The probe was labeled by biotinylating the 3 ′ end using TdT, biotin-14-dCTP (Gibco BRL). The single-stranded cDNA library was treated at 95 ° C. for 1 minute, then rapidly cooled in ice, a biotinylated probe was added, and hybridization was performed at 37 ° C. for 1 hour. MPG after hybridization R -Streptavidin magnetic beads (Gibco BRL) were added and left at room temperature for 30 minutes with stirring every 2 minutes. Thereafter, it was placed in a gene wrapper positive selection system magnet rack (Gibco BRL) and left for 2 minutes. The supernatant was discarded, and the magnetic beads were washed with a gene wrapper positive selection system wash buffer. Washing with this wash buffer was performed three times. Thereafter, the mixture was left in a magnetic rack, the supernatant was discarded, and the gene wrapper positive selection system / elution buffer was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. After being placed in a magnet rack and allowed to stand for 5 minutes, the supernatant DNA solution was recovered.
[0093]
A synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) was added as a primer to the obtained DNA solution and allowed to stand at 95 ° C. for 1 minute. The gene wrapper positive selection system / repair enzyme was added and left at 70 ° C. for 15 minutes to synthesize double-stranded DNA. The synthesized double-stranded DNA was introduced into Escherichia coli DH10B using an electroporation apparatus (Bio-Rad).
Using the resulting transformant, screening by colony PCR was performed using two synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15) as primers. One strain was selected as a positive clone from a colony in which an amplified fragment of 612 bp was formed by PCR.
After culturing the selected Escherichia coli, DNA is extracted, reacted using Taq dideoxy terminator cycle sequencing kit (PerkinElmer), and the nucleotide sequence of the cDNA fragment determined by 373A DNA sequencer (PerkinElmer) did. The obtained clone is poly (A) + It contained a chain and had a 1458 base sequence represented by SEQ ID NO: 19 [FIG. 3]. This DNA fragment encodes a novel protein TGC028-2 consisting of 486 amino acids represented by SEQ ID NO: 18, and the predicted gene product has 68% homology with human GFAT at the amino acid level. Had.
Plasmid pTB1942 carrying DNA encoding the protein TGC028-2 was introduced into Escherichia coli DH10B to obtain a transformant: Escherichia coli DH10B / pTB1942.
[0094]
[Example 1]
Cloning of a gene encoding a novel GFAT / TGC028-3 protein
Cloning of the cDNA encoding the novel GFAT • TGC028-3 protein was performed using the gene wrapper cDNA positive selection system (Gibco BRL).
Escherichia coli DH12S strain of cDNA library derived from human brain (Gibco BRL) was transferred to Terrific Broth (12 g / l Bacto-Tryptone (Difco), 24 g / l Bacto-Yeast Extract (Difco), 2.3 g / (1 potassium phosphate, 12.5 g / l dipotassium phosphate) was cultured at 30 ° C. for 16 hours, and a plasmid cDNA library was purified and extracted using Qiagen Plasmid Kit (Qiagen). The purified plasmid cDNA library was digested with Gene II and Exo III (both Gibco BRL) to prepare a single-stranded cDNA library.
On the other hand, a synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 16) was used as a probe for screening a cDNA library. The probe was labeled by biotinylating the 3 ′ end using TdT, biotin-14-dCTP (Gibco BRL). The single-stranded cDNA library was treated at 95 ° C. for 1 minute, then rapidly cooled in ice, a biotinylated probe was added, and hybridization was performed at 37 ° C. for 1 hour. After hybridization, Gene Trapper Positive Selection System magnetic beads (Gibco BRL) were added and left at room temperature for 30 minutes with stirring every 2 minutes. Thereafter, it was placed in a gene wrapper positive selection system magnet rack (Gibco BRL) and left for 2 minutes. The supernatant was discarded, and the magnetic beads were washed with a gene wrapper positive selection system wash buffer. Washing with this wash buffer was performed three times. Thereafter, the mixture was left in a magnetic rack, the supernatant was discarded, and the gene wrapper positive selection system / elution buffer was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. After being placed in a magnet rack and allowed to stand for 5 minutes, the supernatant DNA solution was recovered.
[0095]
A synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 16) was added as a primer to the obtained DNA solution and allowed to stand at 95 ° C. for 1 minute. The gene wrapper positive selection system / repair enzyme was added and left at 70 ° C. for 15 minutes to synthesize double-stranded DNA. The synthesized double-stranded DNA was introduced into Escherichia coli DH10B using an electroporation apparatus (Bio-Rad).
Using the resulting transformant, screening by colony PCR was performed using two synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15) as primers. One strain was selected as a positive clone from a colony in which an amplified fragment of 612 bp was formed by PCR.
After culturing the selected Escherichia coli, DNA was extracted, reacted using Taq dioxyterminator cycle sequencing kit (Perkin Elmer), and the base sequence of the cDNA fragment was determined by 373A DNA sequencer (Perkin Elmer). . The obtained clone is poly (A) + It contained a chain and had 2773 base sequences including 1845 base sequences represented by SEQ ID NO: 5 [FIG. 1]. This cDNA fragment encodes a novel GFAT protein TGC028-3 consisting of 615 amino acids represented by SEQ ID NO: 2, and the predicted gene product is 74% at the amino acid level of human GFAT, and TGC028-2. And 88% homology.
Plasmid pTB1943 carrying DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention was introduced into Escherichia coli DH10B to obtain a transformant: Escherichia coli DH10B / pTB1943.
[0096]
[Example 2]
Construction of a gene encoding a novel GFAT / TGC028-4 protein
A gene fragment having 1788 base sequences excised with restriction enzymes EcoRV and BamHI was obtained from plasmid pTB1943, which holds cDNA encoding the novel GFAT / TGC028-3 protein. On the other hand, a DNA fragment excised with restriction enzymes BamHI and SalI was recovered from the plasmid carrying the GFAT-like gene fragment. Each gene fragment was inserted into plasmid vector pET32a (+) (Novagen) treated with restriction enzymes EcoRV and SalI to construct plasmid pTB1944 [FIG. 4]. This plasmid vector contains 65 amino acid sequences not included in TGC028-3 at the C-terminus, and has an open reading region consisting of 2046 base sequences represented by SEQ ID NO: 6. It encodes a gene product consisting of 682 amino acid residues represented by 3 [FIG. 2].
Plasmid pTB1944 carrying DNA encoding the protein TGC028-4 of the present invention was introduced into Escherichia coli DH10B to obtain a transformant: Escherichia coli DH10B / pTB1944.
[0097]
[Example 3]
Analysis of tissue specificity of gene expression by Northern blot analysis
The analysis of the specificity of the gene expression organ by Northern blotting was performed using membranes of human multiple northern blot (Clontech) and human multiple northern blot II (Clontech). First, this membrane was placed in a hybridization bag, and then 5 ml of a buffer for hybridization (50% deionized formamide, 5 × SSPE, 2 × Denhardt's solution, 2% SDS, 100 μg / ml heat-denatured herring sperm DNA). After the addition, pre-hybridization was performed by incubating at 50 ° C. for 3 hours. On the other hand, as a probe, a DNA fragment encoding a partial sequence of the protein TGP028-3 of the present invention represented by SEQ ID NO: 17 comprising 1796 (α- 32 P) Labeling was performed using dCTP (Amersham) and Bca Best Labeling Kit (Takara Shuzo). The labeled probe was added to the hybridization bag and then incubated at 50 ° C. for 2 hours.
After the incubation, the membrane is taken out from the bag, washed twice with a washing solution consisting of 2 × SSC, 0.05% SDS at room temperature, and further washed with a washing solution consisting of 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. And washed twice. Thereafter, an autoradiogram for the filter was taken to examine the band to which the probe was bound. As a result, bands were detected in all organs including heart, brain, placenta, lung, liver, smooth muscle, kidney, pancreas, spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine and large intestine. Was about 4.0 kb (FIG. 5). In addition, the membrane was treated for 10 minutes in a boiled 0.5% SDS solution to remove the bound probe from the filter, and a human β-actin probe (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a control. As a result of hybridization to β-actin, β-actin was also detected in all organs [FIG. 6].
[0098]
[Example 4]
Expression of recombinant TGC028-3 and TGC028-4 proteins using E. coli
Construction of an expression vector for the protein TGC028-3 of the present invention was performed as follows. First, using plasmid pTB1943 holding DNA encoding TGC028-3 protein as a template, two synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21) as primers, TaKaRa Ex Taq TM Thermal cycler GeneAmp using (Takara Shuzo Co., Ltd.) R In PCR System 2400 (Perkin Elmer), PCR reaction was performed by repeating 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute for 1 cycle, 94 ° C., 1 minute → 60 ° C., 1 minute → 72 ° C., 2 minutes for 30 cycles, and the TGC028-3 A DNA fragment encoding the protein was amplified. The obtained DNA fragment was electrophoresed using a 1% agarose gel, and after confirming the target DNA fragment, it was recovered and purified with a Qiaquick gel extraction kit (Qiagen). The DNA fragment was ligated to the T cloning site of pT7 blue T-vector (Novagen) using DNA Ligation Kit Version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and then introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was selected and isolated. Regarding the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment, a cycle sequence reaction using a dye terminator cycle sequencing FS ready reaction kit (Perkin Elmer) with various synthetic oligo DNAs as primers was performed according to the conditions of the attached document. PCR R After performing with
[0099]
Next, in order to express the TGC028-3 protein, a DNA fragment encoding the protein was isolated from the plasmid pET32a (+) / TGC028-3 and introduced into the pET32b (+) vector (Novagen). That is, in order to add a site recognized by the restriction enzyme NdeI on the 5 ′ side and a site recognized by the restriction enzyme SalI on the 3 ′ side of the DNA fragment encoding the TGC028-3 protein, pET32a (+) / TGC028 -3 as a template, two synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23) as primers, and TaKaRa Ex Taq TM Thermal cycler GeneAmp using (Takara Shuzo Co., Ltd.) R PCR reaction was performed by PCR system 9600 (Perkin Elmer) by repeating a PCR reaction of 94 ° C. for 1 minute for 1 cycle, 98 ° C., 10 seconds → 55 ° C., 1 minute → 72 ° C., 2 minutes for 35 cycles. The obtained DNA fragment was electrophoresed using a 1% agarose gel, and after confirming the target DNA fragment, it was recovered and purified with a Qiaquick gel extraction kit (Qiagen). The DNA fragment was ligated to pT7 blue T-vector (Novagen) using DNA Ligation Kit Version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and then the target plasmid DNA was selected from the ampicillin resistant strain obtained by introduction into E. coli JM109. -Isolated. The nucleotide sequence of the cloned DNA fragment was confirmed by DNA sequencing in the same manner as described above. Among the plasmid DNAs thus obtained, a clone DNA having no difference in base sequence was prepared, and the 5 ′ end and 3 ′ end were digested with restriction enzymes NdeI and SalI, and then the same as described above. It was recovered and purified by the method. On the other hand, after digestion with restriction enzymes NdeI and XhoI, a DNA fragment encoding TGC028-3 protein was ligated to pET32b (+) vector (Novagen) recovered and purified in the same manner as described above by DNA ligation kit version 2 ( The desired plasmid DNA was selected and isolated from an ampicillin resistant strain obtained by ligation using Takara Shuzo Co., Ltd. and introduction into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The plasmid DNA thus obtained was designated as pET32b (+) / TGC028-3-2. As a result, TGC028-3 is expressed as a fusion protein in which 8 amino acids of Val, Glu, His, His, His, His, His, and His are added to the C-terminal side.
[0100]
On the other hand, the expression vector of the TGC028-4 protein of the present invention was constructed as follows. First, using the plasmid pTB1944 holding DNA encoding TGC028-4 protein as a template, the site recognized by the restriction enzyme NdeI on the 5 ′ side of the DNA fragment encoding TGC028-4 protein is the restriction enzyme SalI on the 3 ′ side. In order to add a site recognized by the above, two synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25) are used as primers, and TaKaRa Ex Taq TM Thermal cycler GeneAmp using (Takara Shuzo Co., Ltd.) R In PCR System 9600 (Perkin Elmer), a PCR reaction was performed by repeating 94 cycles of 94 ° C./min for 1 cycle, 98 ° C., 10 seconds → 55 ° C., 1 min → 72 ° C., 2 min for 35 cycles. A DNA fragment encoding the protein was amplified. The obtained DNA fragment was electrophoresed using a 1% agarose gel, and after confirming the target DNA fragment, it was recovered and purified with Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen), and pT7 blue T-vector. After ligation to Novagen using DNA ligation kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), it was introduced into Escherichia coli JM109, and the target plasmid DNA was selected and isolated from the resulting ampicillin resistant strain. The nucleotide sequence of the cloned DNA fragment was confirmed by DNA sequencing in the same manner as described above. Among the plasmid DNAs thus obtained, a clone having no difference in the base sequence was selected, and the 5 ′ end and 3 ′ end of the DNA fragment were digested with restriction enzymes NdeI and SalI, and then described above. A DNA fragment encoding TGC028-4 was recovered and purified in the same manner as described above. On the other hand, after digesting with the restriction enzymes NdeI and XhoI, the DNA fragment encoding the previously obtained TGC028-4 protein was added to the pET32b (+) vector (Novagen) recovered and purified by the same method as described above. The target plasmid DNA was selected and isolated from an ampicillin resistant strain obtained by ligation using DNA ligation kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and introduction into E. coli BL21 (DE3) pLysS. The plasmid DNA thus obtained was designated as pET32b (+) / TGC028-4-2. As a result, TGC028-4 is expressed as a fusion protein in which 8 amino acids of Val, Glu, His, His, His, His, His, and His are added to the C-terminal side.
[0101]
In order to express recombinant TGC028-3 and TGC028-4 proteins using E. coli, E. coli harboring pET32b (+) / TGC028-3-2 or E. coli harboring pET32b (+) / TGC028-4-2 After culturing at 37 ° C. for 3 hours in 500 ml of L broth medium, isopropyl-β-D thiogalactopyranoside (IPTG) was added to 0.1 mM to induce expression, and then 23 ° C. Cultured for 15 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation at 4,800 × g for 10 minutes at 4 ° C., and then 1M urea, 0.25% sarkosyl, 0.5% NP-40 and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. After suspending in 10 ml of PBS containing (PMSF), the cells were sonicated. Ammonium sulfate was added to a supernatant obtained by centrifuging the cell disruption solution at 4,800 × g for 10 minutes at 4 ° C. so as to be 40% saturated. Further, the crushed solution was centrifuged at 4,800 × g for 10 minutes at 4 ° C., and ammonium sulfate was added to the obtained supernatant so as to be 54% saturated. The precipitate obtained by centrifuging this at 4,800 × g for 10 minutes at 4 ° C. was dissolved in 10 ml of PBS and dialyzed against a large amount of PBS. The thus obtained crude extract of recombinant TGC028-3 or TGC028-4 protein was passed through a 2.5 ml His bind column (Novagen), and then the column was treated with 25 ml binding buffer (5 mM imidazole, After washing with 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) and then with the same binding buffer containing 15 ml of 20 mM imidazole, the recombinant TGC028-3 or TGC028-4 protein contains 15 ml of 60 mM imidazole. Elute with the same binding buffer.
[0102]
[Example 5]
Measurement of GFAT activity of TGC028-3 and TGC028-4 proteins
The GFAT activity of TGC028-3 and TGC028-4 proteins was measured by the following method. That is, a solution having the following composition at pH 7.5 (0.1 M K 2 HPO Four , 50 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM DTT), to which TGC028-3 or TGC028 or TGC028 was added to 100 μl of a reaction solution in which glutamine and fructose-6 phosphate as reaction substrates were added to final concentrations of 6 mM and 10 mM, respectively. 4 μl of -4 protein was added and reacted at room temperature for 5 hours. After the reaction, the reaction solution was subjected to a centrifugal filter Ultra Free C3GC (molecular weight 10,000 cut, Millipore), and an equal amount of a mixture of methanol: water: triethylamine (2: 2: 1) was added to the filtrate obtained by centrifugation. It was. The solution was vacuum dried, dissolved in 20 μl of a mixture of methanol: water: triethylamine: phenyl isothiocyanate (PITC) (7: 1: 1: 1), and reacted at room temperature for 20 minutes. The solution was vacuum dried and then 5 mM NaH. 2 PO Four It dissolved in 100 microliters of the liquid mixture which consists of 5% acetonitrile, and the production | generation rate of PITC coupling | bonding glucosamine-6 phosphate was investigated using HPLC (Hitachi L-4200 UV-VIS detector, L-6200 intelligent pump). For control, PITC-linked glucosamine-6 phosphate was used. TOSOH TSK-GEL ODS-80TM (Tosoh Corporation) is used for the column, and a mobile phase consisting of 232 mM sodium acetate, 0.1% triethylamine, 5% acetonitrile (pH 6.0) is flowed at a flow rate of 1 ml / min for separation. In practice, PITC-conjugated glucosamine-6 phosphate was detected at UV 254 nm. As a result, only when TGC028-3 or TGC028-4 protein was added to the reaction solution together with fructose-6 phosphate, a peak was confirmed at a position corresponding to PITC-bound glucosamine-6 phosphate.
[0103]
【The invention's effect】
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof has an action such as GFAT activity, for example.
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, and a DNA encoding the protein of the present invention or a portion thereof are useful as pharmaceuticals such as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as hypoglycemia. Furthermore, since the DNA of the present invention can detect abnormal expression of the DNA of the present invention, it is useful as a gene diagnostic agent for diseases such as hypoglycemia and diabetes.
Since the antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof can specifically recognize the protein of the present invention, the partial peptide thereof or a salt thereof, the protein of the present invention in the test solution, etc. It can be used for quantitative determination.
Furthermore, the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the GFAT activity of the protein of the present invention.
[0104]
[Sequence Listing]
[SEQ ID NO: 1]
[SEQ ID NO: 2]
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[SEQ ID NO: 19]
[SEQ ID NO: 20]
[SEQ ID NO: 21]
[SEQ ID NO: 22]
[SEQ ID NO: 23]
[SEQ ID NO: 24]
[SEQ ID NO: 25]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the base sequence of DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 2 shows the base sequence of the DNA encoding the protein TGC028-4 of the present invention obtained in Example 2 and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 3 shows the base sequence of DNA encoding protein TGC028-2 obtained in Reference Example 1 and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 4 shows the construction diagram of plasmid pTB1944 containing DNA encoding the protein TGC028-4 of the present invention.
FIG. 5 shows the results obtained by examining the expression level of mRNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention in each human tissue by Northern hybridization using the DNA encoding the protein TGC028-3 of the present invention as a probe. (Electrophoresis photograph). (1) is heart, (2) is brain, (3) is placenta, (4) is lung, (5) is liver, (6) is smooth muscle, (7) is kidney, (8) is the pancreas, (9) is the spleen, (10) is the thymus, (11) is the prostate, (12) is the testis, (13) is the ovary, (14) is the small intestine, (15 ) Indicates the large intestine. Cm on the vertical axis represents the migration distance.
FIG. 6 shows the results of examining the expression level of mRNA encoding human β-actin in human tissues by Northern hybridization using a human β-actin probe as a probe (electrophoresis photograph). (1) is heart, (2) is brain, (3) is placenta, (4) is lung, (5) is liver, (6) is smooth muscle, (7) is kidney, (8) is the pancreas, (9) is the spleen, (10) is the thymus, (11) is the prostate, (12) is the testis, (13) is the ovary, (14) is the small intestine, (15 ) Indicates the large intestine. Cm on the vertical axis represents the migration distance.
Claims (15)
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、またはこれらの塩。SEQ ID NO: protein containing the amino acid sequence represented by 2, or the <br/> SEQ ID NO: 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence represented by 2 is deleted, added, or substituted in the amino acid sequence A protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity, or a salt thereof.
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、またはこれらの塩。SEQ ID NO: protein containing the amino acid sequence represented by 3, or the <br/> SEQ ID NO: 1 to 5 amino acids are deleted in the amino acid sequence represented by 3, added, or substituted amino acid sequence A protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity, or a salt thereof.
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列、を含有する請求項１または２記載のタンパク質またはその塩。SEQ ID NO: 1 amino acid sequence represented by, or is <br/> SEQ ID NO: 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence represented by 1 is deleted, added, or comprising the amino acid sequence, which is substituted The protein or a salt thereof according to claim 1 or 2.
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