【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な電位依存性Ca2+チャネルタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内Ca2+濃度上昇は細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出、および細胞外からのCa2+流入により達成される。これらの細胞内Ca2+濃度の変化は細胞内シグナルの制御や膜電位の脱分極など、生理的に重要な現象である。細胞外からのCa2+流入には多くのCa2+チャネルが関与することが知られており、代表的なものとして電位依存性Ca2+チャネル（Cav:voltage-dependent Ca2+ channel）、受容体活性化Ca2+チャネル（receptor-activated Ca2+channel）などのファミリーが挙げられる。
精子は受精までの過程で、受精能獲得（capacitation）と呼ばれる成熟化により、精子運動性の活性化が起こり、先体反応（acrosome reaction）が可能となる。受精能獲得にはサイクリックヌクレオチド、Ca2+イオン、細胞内pHなどが、その制御に関わると考えられており、実際、精子には電位依存性Ca2+チャネル（J. Biol. Chem.、第275巻、21210頁、2000年）、サイクリックヌクレオチド依存性Ca2+チャネル、TRP（transient receptor potential）（Nature Cell Biol.、第3巻、499頁、2001年）などのチャネルが発現している。しかし、これらのチャネルが具体的にどのようにして精子の機能に関わっているかについては、不明な点も多い。
最近、CatSper（非特許文献１ Nature、第413巻、603頁、2001年）やCatSper2（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第98巻、12527頁、2001年）という新規のタンパク質が同定された。これらは、6回膜貫通型で、第5膜貫通ドメインと第6膜貫通ドメインの間にポア領域が存在するという電位依存性K+チャネル（Kv）に類似した構造を有する。しかし、第4膜貫通ドメインに複数の塩基性アミノ酸（Arg、Lys）が存在し、ポア領域では電位依存性Ca2+チャネル（Cav）ファミリーで保存されているアミノ酸が保存されていることから、電位依存性Ca2+チャネルとして機能することが推測される。従来のCavは6回膜貫通領域の1ユニットを4ユニット有する24回膜貫通型の構造を持つが、CatSper、およびCatSper2はKvと同様に6回膜貫通型サブユニットがホモ、またはヘテロ4量体を形成することでチャネルとして機能すると考えられる。
CatSperおよびCatSper2はいずれも精巣に特異的に発現しており、精子においては鞭毛の主部にタンパク質の局在が見られる。さらに、CatSperのノックアウトマウスは、精子の運動性低下と雄性不妊の表現型を示すことから、CatSperファミリーは精子において重要な機能を有すると考えられる。しかし、CatSperおよびCatSper2はいずれも、現時点では、チャネルとしての活性は電気生理学的には証明されておらず、未知のサブユニットとの会合が必要であることも考えられる。
【非特許文献１】
Nature、第413巻、603頁、2001年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
Ca2+チャネルには多数の分子種が存在し、それらの発現部位も多様である。また、ひとつの細胞が複数のCa2+チャネルを発現していることが多い。Ca2+チャネルによる細胞内Ca2+濃度の変化は生理的に重要な現象であり、その異常と疾患との関連が知られている例もあるが、詳細なメカニズムが明らかでない例も多い。精子においては複数のCa2+チャネルが発現しており、中でもCatSperファミリーは重要な機能を担っていると考えられるが、その真の活性や精子機能への関与の詳細なメカニズムは明らかにはなっていない。
個々のチャネルが有する特定の機能と各分子種との関係を明らかにすることが、そのチャネルが関与する種々の疾患の治療薬や薬剤の開発につながる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規電位依存性Ca2+チャネルタンパク質を見出した。該タンパク質を調節する方法としては、例えばCa2+イオンの透過阻害または促進、該タンパク質遺伝子の転写抑制による発現レベル低下、該タンパク質遺伝子のプロモーターの活性化、mRNAの安定化による発現レベルの亢進などが考えられる。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（４） 配列番号：４２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（５） 上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（６） 上記（１）記載のタンパク質または上記（５）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（７） ＤＮＡである上記（６）記載のポリヌクレオチド、
（８） 配列番号：２、配列番号：４または配列番号：４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（９） 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列を有する上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（１０） 上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１１） 上記（１０）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１２） 上記（１１）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（５）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１３） 上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１４） 上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１５） 上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１６） 上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１７） 上記（１６）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１８） 上記（１６）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１９） 上記（６）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（２０） 上記（１９）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（２１） 上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２） 上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２３） 上記（２１）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（５）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩、
（２４） 上記（２３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２５） 上記（６）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２６） 上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２７） 上記（２５）記載のスクリーニング方法または上記（２６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２８） 上記（２７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２９） 上記（１６）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の定量方法、
（３０） 上記（２９）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法、
（３１） 上記（１６）記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３２） 上記（１６）記載の抗体を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３３） 上記（３１）記載のスクリーニング方法または上記（３２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（３４） 上記（３３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３５） 上記（１）記載のタンパク質の多量体、
（３６） ホモ４量体またはヘテロ４量体である上記（３５）記載の多量体、
（３７） 不妊症の予防・治療剤または避妊薬である上記（１３）、（１４）、（１８）、（２０）、（２４）、（２８）または（３４）記載の医薬、
（３８） 不妊症の診断薬である上記（１５）または（１７）記載の診断薬、
（３９） 哺乳動物に対して、上記（２３）、（２７）または（３３）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする不妊症の予防・治療方法または避妊方法、
（４０） 不妊症の予防・治療剤または避妊薬を製造するための上記（２３）、（２７）または（３３）記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と例えば約３０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と例えば約３０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と例えば約３０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性の測定は、公知の方法に準じて行うことが出来、例えば、J. Biol. Chem.、第275巻、12237頁、2000年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【０００８】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、（i）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、とくに限定されない。
【０００９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）のいずれであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
【００１０】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において例えば、第１〜９１番目、第３０７〜４７２番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど、配列番号：３で表されるアミノ酸配列において例えば、第３０７〜４２８番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列において例えば、第１〜６７番目、第２８３〜４４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
【００１１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。例えば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において例えば、第１９〜４６番目、第４９〜７７番目、第２６８〜２８３番目、第３１３〜３４１番目、第４１０〜４４０番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど、配列番号：３で表されるアミノ酸配列において例えば、第４１０〜４４０番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列において例えば、第１９〜５２番目、第２４４〜２５９番目、第２８８〜３１６番目、第３２２〜３５２番目、第３９５〜４１８番目、第４２２〜４４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
本発明のタンパク質は、多量体（例、ホモ４量体、ヘテロ４量体など）を形成していてもよい。ヘテロ多量体としては、例えば、ＣａｔＳｐｅｒ、ＣａｔＳｐｅｒ２などとのヘテロ多量体などが挙げられる。
【００１２】
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなリガンド作動性カチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（a）〜（e）に記載された方法が挙げられる。
（a）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（b）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（c）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（d）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、 タンパク質の化学ＩＶ、 205、(1977年)
（e）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、（i）配列番号：２または配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：２２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ii）配列番号：４または配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４または配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（iii）配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００２０】
配列番号：２または配列番号：２２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：２２で表される塩基配列と例えば約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４または配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４または配列番号：２３で表される塩基配列と約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列と約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：３５で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：４１で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２１】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２２】
本発明のタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal ofMolecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻，2110(1972)やGene，17巻，107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller）， Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G.A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２９】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３１】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495 (1975) 〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３２】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３４】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４３、配列番号：３５または配列番号：４１で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５'端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３７】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を抑制することで、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。好ましくは避妊薬などとして使用する。
一方、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を促進することで、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。好ましくは不妊症の予防・治療剤などとして使用する。
【００３８】
〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を有し、その透過に寄与することで、精子の運動性や受精能などの細胞の機能に重要な役割を果たしている。
したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などの種々の疾患が発症する。
したがって、本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。好ましくは不妊症の予防・治療剤などとして使用する。
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００３９】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００４０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、不妊症の治療目的で本発明のタンパク質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、不妊症の治療目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、カチオン透過活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。より具体的には、例えば、
（２）（i）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞のカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性と（ii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性の比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（i）と（ii）の場合において、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過に伴う膜電位の変化を蛍光色素で測定し、のカチオン透過の指標として比較することを特徴とするものである。
【００４２】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
【００４３】
本発明のタンパク質のカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性は、公知の方法、例えば、J. Biol. Chem.、第275巻、12237頁、2000年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ii）の場合におけるカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
また、例えば、上記（ii）の場合におけるカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または抑制）する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
また、本発明のタンパク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を探索することによって本発明のタンパク質の発現を促進または抑制（すなわち、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（３）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（４）（iii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（iv）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（iii）と（iv）の場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（iv）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（iv）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（５）本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（６）（v）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（vi）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて（v）と（vi）の場合における、本発明のタンパク質の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量）を測定（例、本発明のタンパク質の発現を検出、本発明のタンパク質の発現量を定量等）して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のカチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（vi）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（v）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（vi）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（v）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、カチオン透過活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として有用である。好ましくは不妊症の予防・治療剤などとして使用する
、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として有用である。好ましくは避妊薬などとして使用する。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤などとして使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、不妊症の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、不妊症の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００４８】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４９】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などが発症している可能性が高いと診断することができる。また、反対に、本発明のタンパク質の濃度の上昇が検出された場合、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などが発症している可能性が高いと診断することが出来る。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５２】
〔４〕遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が検出された場合、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などである可能性が高いと診断することが出来る。反対に、発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などである可能性が高いと診断することができる。
【００５３】
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能〔例、カチオン（例、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｎａ+など）透過活性〕を抑制することができるので、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。好ましくは避妊薬などとして使用する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の医薬として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、不妊症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを精巣に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５４】
さらに、本発明は、
（i）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ii）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
（iii）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
（iv）前記リボザイムを含有してなる医薬、
（v）前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。好ましくは避妊薬などとして使用する。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記（v）の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
【００５５】
〔６〕本発明のＤＮＡを有する動物の作出
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５６】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（i）ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５８】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５９】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６０】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質またはその機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
（i）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（v）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６１】
〔７〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６２】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６３】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６４】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF（1〜10000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5％炭酸ガス、95％空気または5％酸素、5％炭酸ガス、90％空気）で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液（通常0.001〜0.5％トリプシン/0.1〜5mM EDTA、好ましくは約0.1％トリプシン/1mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature 第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６６】
〔７ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６７】
例えば、不妊症に対して治療効果を有する化合物のスクリーニングをする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の雄に試験化合物を投与し、対照となる正常の雌の動物と一定期間飼育後、妊娠した雌の割合を測定する。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００６８】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６９】
〔７ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００７０】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【００７１】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として有用である。好ましくは不妊症の予防・治療剤などとして使用する。
【００７２】
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として有用である。好ましくは避妊薬などとして使用する。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７３】
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作出すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
〔８〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは避妊薬などとして使用する。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、静脈注射等）に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の不妊症の予防・治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００７４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００７５】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
【００７６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ２０７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０７タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ２０７Ｄ４３６Ｎタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０７Ｄ４３６Ｎタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で用いられたプライマーＲ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で用いられたプライマーＦ２Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１で用いられたプライマーＦ３Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例１で用いられたプライマーＲ４Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例１で用いられたプライマーＲ５Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例１で用いられたプライマーＦ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例１で用いられたプライマーＡＰ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例１で用いられたプライマーＡＰ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例１でＲＡＣＥ反応により同定したヒトＴＣＨ２０７遺伝子ｃＤＮＡの５'末端配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例１でＲＡＣＥ反応により同定したヒトＴＣＨ２０７遺伝子ｃＤＮＡの３'末端配列を示す
〔配列番号：１５〕
実施例２で用いられたプライマーＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例２で用いられたプライマーＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例２で用いられたプライマーＳＰ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例２で用いられたプライマーＴ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例２で用いられたプライマーＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例２で用いられたプライマーＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例２で用いられたプライマーＲ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ２０７全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ２０７Ｄ４３６Ｎ全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例３で用いられたプライマーＡ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例３で用いられたプライマーＢ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例３で用いられたＴａｑＭａｎプローブＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例４で用いられたプライマーｍＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例４で用いられたプライマーｍＢ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例４で用いられたプライマーｍＢ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例４で用いられたプライマーｍＢ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例４で用いられたプライマーｍＢ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例４で用いられたプライマーｍＡ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例４で用いられたプライマーｍＡ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例４で用いられたプライマーｍＡ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例４でＲＡＣＥ反応により同定したマウスＴＣＨ２０７遺伝子ｃＤＮＡの全長配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例５で用いられたプライマーｍＡ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例５で用いられたプライマーｍＢ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例５で用いられたプライマーｍＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例５で用いられたプライマーｍＢ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例５で用いられたプライマーｍＢ８の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例５で取得したマウスＴＣＨ２０７の全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例５で取得したマウスＴＣＨ２０７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＴＣＨ２０７タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
実施例６で用いられたプライマーｍＡ８の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
実施例６で用いられたプライマーｍＢ９の塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
実施例６で用いられたＴａｑＭａｎプローブｍＴ１の塩基配列を示す。
【００７７】
後述の実施例２で得られたEscherichia coli TOP10/pCRII-TCH207は、平成14（2002）年5月27日から、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号 305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM BP-8055として、2002年5月14日から、大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号（郵便番号 532-8686）、財団法人 発酵研究所に、受託番号IFO 16796としてそれぞれ寄託されている。
後述の実施例５で得られたEscherichia coli TOP10/pCRII-mTCH207は、平成14（2002）年6月13日から、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号 305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM BP-8077として、2002年6月4日から、大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号（郵便番号 532-8686）、財団法人 発酵研究所に、受託番号IFO 16801としてそれぞれ寄託されている。
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００７８】
実施例１
ヒトＴＣＨ２０７遺伝子ｃＤＮＡの５'末端および３'末端配列の同定
ヒト精巣Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）に対して、表１の一次用プライマーとプライマーＡＰ１（配列番号：１１）を用いて、Advantage 2 DNA Polymerase（クロンテック社製）により、以下の条件(1)〜(5)で一次RACE反応を行った。
【表１】
(1）94℃3分間
(2）94℃5秒間−72℃2分間を5サイクル
(3）94℃5秒間−70℃2分間を5サイクル
(4）94℃5秒間−68℃2分間を25サイクル
(5）70℃10分間
さらに、set5、set6については、一次RACE反応産物を鋳型として、表１の二次用プライマーとプライマーＡＰ２（配列番号：１２）を用いて、一次RACE反応と同様の反応条件で二次RACE反応を行った。set1、set2、set3、set4により得られた一次RACE反応産物、およびset5、set6により得られた二次RACE反応産物をゲル電気泳動後、主要バンドを精製し、表１に示したシークエンス用プライマーおよびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、cDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、set1、set2、set3により得られた配列から、ヒトTCH207遺伝子cDNAの5'末端配列（配列番号：１３）を、set4、set5、set6により得られた配列から、ヒトTCH207遺伝子cDNAの3'末端配列（配列番号：１４）を同定した。
【００７９】
実施例２
ヒトＴＣＨ２０７遺伝子のｃＤＮＡのクローニング
実施例１で同定した5'末端と3'末端の配列を元に設計した、２種のプライマーDNA、プライマーＡ１（配列番号：１５）およびプライマーＢ１（配列番号：１６）を用いて、ヒト精巣Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）に対して、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）により、以下の条件（1)〜(5）でPCRを行った。
(1）94℃3分間
(2）94℃10秒間−70℃3分間を5サイクル
(3）94℃10秒間−68℃3分間を5サイクル
(4）94℃10秒間−66℃30秒間−72℃3分間を25サイクル
(5）72℃10分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、1.5kbpのバンドを切り出し、ExTaq DNA polymerase（宝酒造社製）で72℃20分間処理した後、TOPO TA Cloning kit dualpromoter（インビトロジェン社製）を用いてクローニングした。独立に4回のPCRを行い、各回から1クローンづつ合わせて4クローンを得た。このプラスミドをプライマーDNA〔プライマーＳＰ６（配列番号：１７）、プライマーＴ７（配列番号：１８）、プライマーＦ１（配列番号：１９）、プライマーＦ２Ｒ（配列番号：５）、プライマーＲ１（配列番号：２０）、プライマーＲ５（配列番号：２１）、プライマーＲ５Ｒ（配列番号：９）〕およびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。
その結果、取得したプラスミドのうち、2クローンは1514bpの同一の塩基配列を有していた。この配列を配列番号：２２に示す。該cDNA断片には472個のアミノ酸配列（配列番号：１）がコードされており（配列番号：２）、該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトTCH207タンパク質と命名した。該cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）TOP10/pCRII-TCH207と命名した。
得られたクローンのうち残りの2クローンは、配列番号：２２で表される塩基配列の1323番目のGがAに置換した（この塩基置換はSNPにより生じたものであると考えられる）塩基配列を有していた。この塩基配列を配列番号：２３に示す。この塩基置換は配列番号：１で表されるアミノ酸配列の436番目のAspからAsnへの置換を伴う。このAspからAsnへのアミノ酸置換を有するタンパク質をヒトTCH207D436Nタンパク質と命名した。ヒトTCH207D436Nタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に、これをコードする塩基配列を配列番号：４に示す。
Blast P〔Nucleic Acids Res. 第25巻、3389頁、1997年〕を用いてNR〔NCBI（米国生物工学情報センター）タンパク質データベース〕に対してホモロジー検索を行ったところ、ヒトTCH207は、電位依存性Ca2+チャネルと考えられるCatSperのファミリーに属する新規遺伝子であることが判明した（図１）。ヒトTCH207タンパク質はヒトで報告されているCatSper（Nature、第413巻、603頁、2001年）に対して、アミノ酸レベルで全長では16％、膜貫通領域（S1〜S6）では25％の相同性を示し、6回膜貫通型の構造を有すると推測された。また、第4膜貫通ドメイン（S4）に塩基性アミノ酸が存在することや、ポア領域においてCa2+選択性に重要なアミノ酸残基が保存されているという構造的特徴から、電位依存性Ca2+チャネルのサブユニットとして機能する可能性が高いと考えられた。
【００８０】
実施例３
ヒトＴＣＨ２０７遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトTCH207の配列から設計した、2種のプライマーDNA〔プライマーA2（配列番号：24）およびプライマーB3（配列番号：25）〕およびTaqManプローブT1（配列番号：26）を用いて、ヒトの各組織のcDNAにおけるヒトTCH207の発現量（コピー数）をTaqMan PCRにより測定した。測定に用いたヒトの各組織のcDNAを表２に示す。
【表２】
同じcDNAについてTaqMan GAPDH control reagents（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてglyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)の発現量（コピー数）も測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図２および図３に示す。
ヒトTCH207遺伝子産物（mRNA）は精巣において選択的な非常に強い発現を示し、胃、胎盤、胎児腎臓、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌でも若干の発現を示した。Human blood fractions MTC panel、およびHuman immune system MTC panelにおいては発現を検出できなかった。
【００８１】
実施例４
ＲＡＣＥ反応によるマウスＴＣＨ２０７遺伝子ｃＤＮＡの全長配列の同定
マウス精巣Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）に対して、5'-RACE用プライマーDNA〔プライマーmB1（配列番号：27）、プライマーmB3（配列番号：28）、プライマーmB4（配列番号：29）、プライマーmB5（配列番号：30）およびプライマーmB6（配列番号：31）〕のいずれか、または3'-RACE用プライマーDNA〔プライマーmA3（配列番号：32）、プライマーmA4（配列番号：33）およびプライマーmA5（配列番号：34）〕のいずれかとプライマーAP1（配列番号：11）とを用いて、Advantage 2 DNA Polymerase（クロンテック社製）により、以下の条件(1)〜(5)でRACE反応を行った。
（1）94℃3分間
（2）94℃5秒間−72℃30秒間を5サイクル
（3）94℃5秒間−70℃30秒間を5サイクル
（4）94℃5秒間−68℃30秒間を25サイクル
（5）70℃10分間
得られたRACE反応産物をゲル電気泳動後、主要バンドを精製し、RACE反応に用いたそれぞれの5'-または3'-RACE用プライマーDNAおよびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、マウスTCH207遺伝子cDNAの全長配列（配列番号：35）を同定した。
【００８２】
実施例５
マウスＴＣＨ２０７遺伝子のｃＤＮＡのクローニング
実施例４で同定したcDNAの全長配列を元に設計した、２種のプライマーDNA〔プライマーmA6（配列番号：36）およびプライマーmB7（配列番号：37）〕を用いて、マウス精巣Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）に対して、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）により、以下の条件(1)〜(5)でＰＣＲを行った。（1）94℃3分間
（2）94℃10秒間−72℃3分間を5サイクル
（3）94℃10秒間−70℃3分間を5サイクル
（4）94℃10秒間−68℃3分間を20サイクル
（5）72℃10分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、約1.5kbpのバンドを切り出し、ExTaq DNA polymerase（宝酒造社製）で72℃20分間処理した後、TOPO TA Cloning kit dual promoter（インビトロジェン社製）を用いてクローニングした。これをプライマーDNA〔プライマーSP6（配列番号：17）、プライマーT7（配列番号：18）、プライマーmA1（配列番号：38）、プライマーmA5（配列番号：34）、プライマーmB2（配列番号：39）、プライマーmB4（配列番号：29）およびプライマーmB8（配列番号：40）〕およびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。
その結果、取得したクローンは1536個の塩基配列を有していた（配列番号：41）。この配列は、配列番号：35で表される全長cDNAの一部（14番目〜1549番目）に完全に一致した。このcDNA断片には442個のアミノ酸配列（配列番号：42）がコードされており（配列番号：43）、このアミノ酸配列を含有するタンパク質を、マウスTCH207タンパク質と命名した。
上記cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）TOP10/pCRII-mTCH207と命名した。
Blast P〔Nucleic Acids Res. 第25巻、3389頁、1997年〕を用いてNR〔NCBI（米国生物工学情報センター）タンパク質データベース〕に対してホモロジー検索を行ったところ、このcDNAは、電位依存性Ca2+チャネルと考えられるCatSperのファミリーに属する新規遺伝子であるヒトTCH207のマウスオルソログであることが判明した（図４）。マウスTCH207は、ヒトTCH207とは塩基レベルで70％、アミノ酸レベルで67％の相同性を、マウスで報告されているマウスCatSper（Nature、第413巻、603頁、2001年）とはアミノ酸レベルで17％の相同性をそれぞれ示した。マウスTCH207はヒトTCH207と同様の構造的特徴を有することから、電位依存性Ca2+チャネルのサブユニットとして機能する可能性が高いと考えられる。
【００８３】
実施例６
マウスＴＣＨ２０７遺伝子産物の組織分布の解析
マウスTCH207の配列から設計した、2種のプライマーDNA〔プライマーmA8（配列番号：44）およびプライマーmB9（配列番号：45）〕およびTaqManプローブmT1（配列番号：46）を用いて、マウスの各組織（骨髄、目、リンパ節、平滑筋、前立腺、胸腺、胃、子宮、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、胚（7日）、胚（11日）、胚（15日）、胚（17日））のcDNA（Mouse MTC panel IおよびMouse MTC panel II：クロンテック社製）におけるマウスTCH207の発現量（コピー数）を、TaqMan PCRにより測定した。同じcDNAについてTaqMan rodent GAPDH control reagents（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてrodent glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)の発現量（コピー数）も測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図５に示す。マウスTCH207遺伝子産物（mRNA）は精巣において選択的な非常に強い発現を示した。
【００８４】
【発明の効果】
本発明のタンパク質は、例えば不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩は、例えば、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無精子症、精子減少症、精子死滅症、精子無力症、精子形成障害、精巣機能不全など）、癌（例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、避妊薬などの医薬として使用することができる。該タンパク質の活性を促進する化合物またはその塩は、好ましくは不妊症の予防・治療剤などとして使用する。該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、好ましくは避妊薬などとして使用する。
【００８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトTCH207、ヒトCatSperおよびヒトCatSper2の膜貫通領域におけるアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、TCH207はヒトTCH207のアミノ酸配列（配列番号：１）のうち92番目から306番目までの配列を、CatSperはヒトCatSperのアミノ酸配列のうち439番目から671番目までの配列を、CatSper2はヒトCatSper2a（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第98巻、12527頁、2001年）のアミノ酸配列のうち104番目から340番目までの配列を示す。S1〜S6は膜貫通ドメインを、Pはポア領域を示す。□は、3配列のうち、2配列以上で一致するアミノ酸を示す。S4における塩基性残基を○で示し、ポア領域において電位依存性Ca2+チャネルファミリーで保存されている残基に※を、Ca2+選択性に重要なAspに＊を付した。
【図２】ヒトTCH207遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。ヒトの各組織cDNA〔Human MTC panel I、Human MTC panel II（上図）および Human digestive system MTC panel（下図）：クロンテック社製〕におけるヒトTCH207の発現量をTaqMan PCRにより測定した結果を示す。図中、縦軸は発現量を表し、ヒトTCH207のcDNA溶液１μｌ当たりのコピー数を、等量の各組織cDNAにおけるglyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)のコピー数で割り、10万倍した値で表した。
【図３】ヒトTCH207遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。ヒトの各組織cDNA〔Human fetal MTC panel（上図）および Human tumor MTC panel（下図）：クロンテック社製〕におけるヒトTCH207の発現量をTaqMan PCRにより測定した結果を示す。図中、縦軸は発現量を表し、ヒトTCH207のcDNA溶液1μl当たりのコピー数を、等量の各組織cDNAにおけるglyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)のコピー数で割り、10万倍した値で表した。
【図４】ヒトTCH207とマウスTCH207のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、humanはヒトTCH207のアミノ酸配列（配列番号：1）を、mouseはマウスTCH207のアミノ酸配列（配列番号：42）を示す。S1〜S6は膜貫通ドメインを、Pはポア領域を示す。□は2配列で一致するアミノ酸を示す。S4における塩基性残基を○で示し、ポア領域において電位依存性Ca2+チャネルファミリーで保存されている残基に※を、Ca2+選択性に重要なAspに＊を付した。
【図５】マウスTCH207遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。マウスの各組織cDNA（Mouse MTC panel Iおよび mouse MTC panel II：クロンテック社製）におけるマウスTCH207の発現量をTaqMan PCRにより測定した結果を示す。図中、縦軸は発現量を表し、マウスTCH207のcDNA溶液1μl当たりのコピー数を、等量の各組織cDNAにおけるrodent glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)のコピー数で割り、10万倍した値で表した。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a novel voltage-dependent Ca 2+ Provided are a channel protein, a DNA encoding the protein, a method for screening a compound that regulates the activity of the protein, and a compound obtained by the screening method.
[0002]
[Prior art]
Intracellular Ca 2+ Increased concentration is due to intracellular Ca 2+ Ca from the store 2+ Release and extracellular Ca 2+ Achieved by inflow. These intracellular Ca 2+ Changes in concentration are physiologically important phenomena, such as control of intracellular signals and depolarization of membrane potential. Extracellular Ca 2+ A lot of Ca in the inflow 2+ It is known that channels are involved, and a typical one is voltage-dependent Ca 2+ Channel (Cav: voltage-dependent Ca 2+ channel), receptor activated Ca 2+ Channel (receptor-activated Ca 2+ channel).
During the process of fertilization of sperm, maturation called capacitation activates sperm motility and enables an acrosome reaction. Cyclic nucleotides, Ca for fertility 2+ Ions and intracellular pH are thought to be involved in its control, and in fact, sperm contain voltage-dependent Ca 2+ Channel (J. Biol. Chem., 275, 21210, 2000), cyclic nucleotide-dependent Ca 2+ Channels and channels such as TRP (transient receptor potential) (Nature Cell Biol., Vol. 3, p. 499, 2001) are expressed. However, there is much unclear as to how these channels are specifically involved in sperm function.
Recently, novel proteins such as CatSper (Non-patent Document 1, Nature, 413, 603, 2001) and CatSper2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 12527, 2001) have been identified. Was. These are six transmembrane types and have a voltage-dependent K that a pore region exists between the fifth and sixth transmembrane domains. + It has a structure similar to the channel (Kv). However, several basic amino acids (Arg, Lys) are present in the fourth transmembrane domain, and in the pore region, voltage-dependent Ca 2+ Since the amino acids conserved in the channel (Cav) family are conserved, voltage-dependent Ca 2+ It is assumed that it functions as a channel. Conventional Cav has a 24-transmembrane structure having 4 units of 1 unit of 6 transmembrane regions, but CatSper and CatSper2 have the same 6-transmembrane subunit as Kv, or hetero-tetramer. It is thought that by forming a body, it functions as a channel.
Both CatSper and CatSper2 are specifically expressed in testis, and in sperm, protein localization is found in the main part of flagella. Furthermore, since CatSper knockout mice show a phenotype of sperm hypomotility and male infertility, the CatSper family is considered to have important functions in sperm. However, at present, neither CatSper nor CatSper2 has been electrophysiologically proven to be a channel, and may require association with an unknown subunit.
[Non-patent document 1]
Nature, 413, 603, 2001
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Ca 2+ Many molecular species exist in the channel, and their expression sites are also diverse. In addition, one cell has multiple Ca 2+ Often expresses channels. Ca 2+ Intracellular Ca by channel 2+ The change in concentration is a physiologically important phenomenon, and in some cases, the relationship between the abnormality and disease is known, but in many cases, the detailed mechanism is not clear. Multiple Ca in sperm 2+ Although the channel is expressed, the CatSper family is thought to play an important role, but its true activity and the detailed mechanism of its involvement in sperm function have not been elucidated.
Clarifying the relationship between the specific function of each channel and each molecular species leads to the development of therapeutics and drugs for various diseases involving the channel.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a novel potential-dependent Ca 2+ A channel protein was found. As a method for regulating the protein, for example, Ca 2+ Possible examples include inhibition or promotion of ion permeation, reduction in the expression level due to suppression of transcription of the protein gene, activation of the promoter of the protein gene, and enhancement of the expression level due to stabilization of mRNA.
The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention
(1) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42, or a salt thereof;
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof;
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof;
(4) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 or a salt thereof;
(5) a partial peptide of the protein according to (1) or a salt thereof;
(6) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein of (1) or the partial peptide of (5),
(7) the polynucleotide according to (6), which is DNA;
(8) a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 43,
(9) The polynucleotide according to the above (7), having the base sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41,
(10) a recombinant vector containing the polynucleotide according to (6),
(11) a transformant transformed with the recombinant vector according to (10),
(12) The method according to (1), wherein the transformant according to (11) is cultured to produce and accumulate the protein according to (1) or the partial peptide according to (5), and collect the protein. A) a partial peptide according to (5) or a salt thereof,
(13) a medicine comprising the protein of (1) or the partial peptide of (5) or a salt thereof,
(14) a medicine comprising the polynucleotide according to (6),
(15) a diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (6),
(16) an antibody against the protein according to (1) or the partial peptide according to (5) or a salt thereof;
(17) a diagnostic agent comprising the antibody according to the above (16),
(18) a medicine comprising the antibody according to the above (16),
(19) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide according to (6) or a part thereof,
(20) a medicine comprising the polynucleotide according to (19),
(21) The protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof, wherein the protein according to (1) or the partial peptide according to (5) or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that modulates an activity,
(22) The activity of the protein according to (1) or the partial peptide according to (5) or a salt thereof, comprising the protein according to (1) or the partial peptide according to (5) or a salt thereof. A kit for screening a compound to be modulated or a salt thereof,
(23) Modulating the activity of the protein of (1), the partial peptide of (5) or a salt thereof obtained by using the screening method of (21) or the screening kit of (22). Or a salt thereof,
(24) a medicament comprising the compound according to (23) or a salt thereof,
(25) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), which comprises using the polynucleotide according to (6);
(26) A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), comprising the polynucleotide according to (6),
(27) a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), obtained by using the screening method according to (25) or the screening kit according to (26);
(28) a medicament comprising the compound of (27) or a salt thereof,
(29) The method for quantifying a protein according to (1), comprising using the antibody according to (16);
(30) a method for diagnosing a disease associated with the function of the protein according to (1), which comprises using the quantification method according to (29);
(31) a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits expression of the protein according to (1), which comprises using the antibody according to (16);
(32) a kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1), comprising the antibody according to (16);
(33) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1), obtained by using the screening method according to (31) or the screening kit according to (32),
(34) a medicament comprising the compound according to (33) or a salt thereof,
(35) a multimer of the protein according to (1),
(36) the multimer according to (35), which is a homotetramer or a heterotetramer;
(37) The medicament according to the above (13), (14), (18), (20), (24), (28) or (34), which is an agent for preventing or treating infertility or a contraceptive.
(38) The diagnostic agent according to the above (15) or (17), which is a diagnostic agent for infertility.
(39) a method of preventing or treating infertility or a method of contraception, comprising administering to a mammal an effective amount of the compound according to (23), (27) or (33) or a salt thereof;
(40) Use of the compound according to (23), (27) or (33) or a salt thereof for producing an agent for preventing or treating infertility or a contraceptive is provided.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42 (hereinafter referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) May be) human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, Pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells) Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, bone Cells, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells, stem cells, or cancer cells of these cells) or any tissue in which those cells are present, for example, the brain, various parts of the brain (eg, Olfactory bulb, amygdala, basal ganglia, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonads, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle Proteins from the lungs, gastrointestinal tract (eg, large and small intestines), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc. Or a synthetic protein.
[0007]
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 30% or more, preferably about 50% or more, and preferably about 60% Above, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. And proteins having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is, for example, about 30% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% Above, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 includes, for example, about 30% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% Above, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42.
As substantially the same activity, for example, a cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) permeation activity. Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, cations (eg, Ca 2+ , K + , Na + It is preferable that the permeation activities are the same (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the molecular weight of the protein may be different.
Cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) The permeation activity can be measured according to a known method. For example, it can be measured according to the method described in J. Biol. Chem., Vol. 275, p. it can.
[0008]
Examples of the protein of the present invention include, for example, (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42 (eg, about 1 to 200, preferably Is about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably the number (1 to 5). (Ii) 1 or 2 or more amino acids (for example, about 1 to 200, preferably 1 to 200) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42 About 150, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about (1 to 5) amino acids Attached (Iii) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42 (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, Is an amino acid sequence in which about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) amino acids have been inserted. (Iv) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 42 (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, About 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5) amino acids were substituted with another amino acid. Amino acid sequence, Or (v) so-called muteins such as proteins containing an amino acid sequence combining them.
When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
[0009]
In the protein in this specification, the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling. The protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO - ), Amide (-CONH Two ) Or an ester (—COOR).
Here, as R in the ester, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, etc. 1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; 6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. 1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as an alkyl group 7-14 An aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group and the like are used. When the protein used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein used in the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the protein used in the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) has a protecting group (for example, a formyl group, an acetyl group or the like). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 Acyl group), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, -OH, -SH , An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 C such as alkanoyl group 1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
Specific examples of the protein of the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 42. Examples include proteins containing an amino acid sequence.
[0010]
The partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein of the present invention described above, and preferably any peptide having the same properties as the protein of the present invention described above.
For example, peptides having at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Is used.
In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the sequence, or One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, even more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid.
The partial peptide of the present invention includes, for example, a peptide having the amino acid sequence of the 1st to 91st amino acids and the 307th to 472nd amino acid sequences in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; For example, a peptide having the amino acid sequence at positions 307 to 428, a peptide having the amino acid sequence at positions 1 to 67 and 283 to 442 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, and the like.
[0011]
The partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (-COOH) and a carboxylate (-COO) at the C-terminus. - ), Amide (-CONH Two )) Or an ester (—COOR).
Further, the partial peptides used in the present invention include those having a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus and N-terminal amino acid residues (eg, methionine), similarly to the aforementioned protein of the present invention. Residue), the amino group of which is protected by a protecting group, the glutamine residue formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is appropriate. Also included are those protected with a protecting group, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded.
The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for preparing an antibody. For example, for the purpose of preparing the antibody of the present invention described below, for example, amino acids 19 to 46, 49 to 77, 268 to 283, and 313 to 341 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, such as a peptide having the amino acid sequence at positions 410-440, a peptide having the amino acid sequence at positions 410-440, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 For example, a peptide having an amino acid sequence at positions 19 to 52, 244 to 259, 288 to 316, 322 to 352, 395 to 418, and 422 to 442 can be mentioned.
The protein of the present invention may form a multimer (eg, homotetramer, heterotetramer, etc.). Examples of the heteromultimer include a heteromultimer with CatSper, CatSper2, and the like.
[0012]
As the salt of the protein or partial peptide of the present invention, salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used. Preferred acid addition salts are: Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
The protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced from the above-mentioned method for purifying a protein from human or warm-blooded animal cells or tissues, or a transformant containing a DNA encoding the protein. Can also be produced by culturing. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0013]
For the synthesis of the protein or partial peptide of the present invention, or a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. I do.
For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin.
[0014]
The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.
[0015]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonylhydrazide, tritylhydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C 1-6 A) Groups derived from carbonic acid such as an aroyl group such as an alkanoyl group and a benzoyl group, and a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl Two -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0016]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4 -Addition of a ligand operable cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0017]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein or a partial peptide, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminal has been removed, and these are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or peptide.
In order to obtain an ester of a protein or peptide, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or An ester of the peptide can be obtained.
[0018]
The partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the target peptide. it can. Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (a) to (e).
(A) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(B) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(C) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(D) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(E) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs, Volume 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide obtained by a salt is a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method.
[0019]
The polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Preferably, it is DNA. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include (i) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 22, or represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 22. A DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes with a base sequence under high stringent conditions and having substantially the same properties as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (ii) A) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 23, or a nucleotide sequence hybridizing under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 23 Encoding a protein having substantially the same properties as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Iii) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 Any DNA that encodes a protein having a base sequence that hybridizes under high stringent conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 May be.
[0020]
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 22 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 22. Contains a nucleotide sequence having a homology of 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. DNA or the like is used.
Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 23 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or about 40 % Or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. DNA or the like is used.
Examples of DNA that can hybridize with SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 under high stringency conditions include, for example, bases represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 Bases having about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the sequence. DNA containing a sequence or the like is used.
Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and represented by SEQ ID NO: 22 Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, such as the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 42, include the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, : 35 or a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 41.
[0021]
The DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 DNA having a part of the DNA having the base sequence represented by: or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 DNA containing a part of DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by the above, and encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention is used. Can be
DNAs capable of hybridizing to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 are the same as those described above. Show meaning.
The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
[0022]
Means for cloning DNA that completely encodes the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of the DNA encoding these may be simply referred to as the protein of the present invention) include: Amplifying by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or incorporating a DNA incorporated in an appropriate vector into a DNA encoding a part or the whole region of the protein of the present invention. Selection can be performed by hybridization with fragments or those labeled with synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
Conversion of the base sequence of DNA can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan. TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM The method can be carried out using -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like according to a known method such as the ODA-LA PCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
[0023]
Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a λPL promoter, an lpp promoter, a T7 promoter, and the like. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0024]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r Neomycin resistance gene (hereinafter Neo). r G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
[0025]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli K12.DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), etc. Is used.
As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22 and AH22R. - , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 and the like.
[0026]
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhfr). - ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982) can be used to transform Escherichia.
[0027]
Transformation of Bacillus sp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, the method described in Methods in Enzymology, vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) can be used. it can.
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
[0028]
As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) is preferable. . If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, as a medium, Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, a medium such as 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)) is appropriately used. The added one is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Is used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
[0029]
The protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. TM And the like. When the protein is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Using differences in charge, methods using charge differences such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, and using differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
[0030]
When the thus obtained protein is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, by a known method or a method analogous thereto, It can be converted to a free form or other salts.
The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
[0031]
The antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention.
An antibody against a protein or a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) used in the present invention is a known antibody using the protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum.
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier and a diluent at a site capable of producing an antibody upon administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained therein. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
[0032]
Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive substances or A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A; A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which globulin antibodies or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
[0033]
(B) Purification of monoclonal antibody
Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, absorption by ion exchanger (eg, DEAE)]. Desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method of collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody] it can.
[0034]
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody. Regarding the complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to hapten 1. A method of coupling at a rate of ~ 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0035]
Complementary or substantially complementary to the base sequence of DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention in the description of the antisense polynucleotide). The antisense polynucleotide having a complementary base sequence or a part thereof has a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof, and Any antisense polynucleotide may be used as long as it has an action of suppressing expression, but antisense DNA is preferable.
The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention (for example, the base sequence near the start codon, etc.) is at least about 70% or more of the complementary strand. Antisense polynucleotides having preferably at least about 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% homology are suitable.
Specifically, bases of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41 An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the sequence, or a portion thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23; Examples include a base sequence complementary to the base sequence of the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 41, or an antisense polynucleotide having a part thereof.
The antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40, preferably about 15 to 30 bases.
In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA is replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate or phosphorodithionate. It may be substituted. These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the cloned or determined nucleotide sequence information of the DNA encoding the protein. And can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through the interaction with the protein-related RNA of the present invention. Thus, the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro to produce the protein gene of the present invention. It is useful for regulating and controlling the expression of, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3 ' The terminal palindrome region and the 3'-end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as a target.
The relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense" if the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide capable of hybridizing with the target is. Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or Other polymers having non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymer is a base such as found in DNA or RNA And nucleotides having a configuration permitting the attachment of a base). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Those having side-chain groups such as syn, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc. and sugars (eg, monosaccharide), those having intercalating compounds (eg, acridine, psoralen) Containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids) Etc.). Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0036]
The antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Many such modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
[0037]
Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention) ), An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter, the antisense polynucleotide of the present invention). (May be abbreviated as nucleotide).
Pharmaceuticals containing a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof include, for example, cations (eg, Ca 2+ , K + , Na + Inhibiting permeability, for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, azoospermia, sperm, Death, asthenozoospermia, impaired spermatogenesis, testicular dysfunction), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) and a medicament for contraceptives. It is preferably used as a contraceptive or the like.
On the other hand, a drug containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention is, for example, a cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + By promoting permeability, for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, azoospermia, sperm, Death, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder Cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) and pharmaceuticals such as contraceptives. Preferably, it is used as an agent for preventing or treating infertility.
[0038]
[1] A preventive / therapeutic agent for various diseases related to the protein of the present invention
The protein of the present invention is a cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) have permeation activity and contribute to its permeation, thereby playing an important role in cell functions such as sperm motility and fertility.
Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, Breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, rectal, pancreatic, thymoma, etc., infertility (eg, Irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm death, asthenia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) Of various diseases develop.
Accordingly, the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, for infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, sperm reduction, Disease, aspermia, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc., cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer) , Gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) and pharmaceuticals such as contraceptives. It is preferably used as an agent for preventing or treating infertility.
For example, since the protein of the present invention is reduced or deleted in a living body, a cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) When there is a patient whose permeation activity is not sufficiently or normally not exhibited, (b) administering the DNA of the present invention to the patient and expressing the protein of the present invention in vivo, (b) cells After the DNA of the present invention is inserted into the patient and the protein of the present invention is expressed, the cells are transplanted into the patient, or (c) the protein of the present invention is administered to the patient. The role of the protein of the present invention can be sufficiently or normally exerted.
When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. It can be administered to warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is preferable to use a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. preferable.
[0039]
The protein of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, orally, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions. For example, the protein of the present invention may be mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of formulations. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
Examples of aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50, etc.). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Also, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated as described above, and is usually used parenterally.
[0040]
The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus, for example, is useful for warm-blooded animals (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey). , Chimpanzees, etc.).
The dosage of the protein of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. )), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the protein is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the protein varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, for the purpose of treating infertility, the protein of the present invention can be administered in the form of an injection to an adult (body weight 60 kg). ), It is convenient to administer by injecting about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the protein per day into the affected area. It is. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0041]
[2] Screening of drug candidate compounds for disease
The protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention.
The present invention provides (1) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention (for example, cation permeation activity or the like) characterized by using the protein of the present invention (hereinafter referred to as a promoter or an inhibitor, respectively) May be abbreviated as "). More specifically, for example,
(2) (i) Cell cations (eg, Ca) capable of producing the protein of the present invention 2+ , K + , Na + Cations (e.g., Ca) of a mixture of cells and test compounds having permeability activity and (ii) the ability to produce a protein of the invention. 2+ , K + , Na + Etc.) A method for screening for an accelerator or an inhibitor, which comprises comparing permeation activities.
Specifically, in the above screening method, for example, in the cases (i) and (ii), a cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + And the like) in which a change in membrane potential due to permeation is measured with a fluorescent dye and compared as an index of cation permeation.
[0042]
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
In order to carry out the above-mentioned screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer includes a cation (eg, Ca) of the protein of the present invention such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). 2+ , K + , Na + Etc.) Any buffer may be used as long as it does not inhibit the permeation activity.
As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
[0043]
The cation of the protein of the present invention (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) The permeation activity can be measured according to a known method, for example, the method described in J. Biol. Chem., 275, 12237, 2000 or a method analogous thereto.
For example, in the case of the above (ii), the cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) A test compound which enhances the permeation activity by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i), a compound which promotes the activity of the protein of the present invention or It can be selected as its salt.
In addition, for example, the cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + Etc.) A test compound that inhibits (or suppresses) the permeation activity by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i), by inhibiting the activity of the protein of the present invention. It can be selected as an inhibitory compound or a salt thereof.
In addition, a gene such as secretory alkaline phosphatase or luciferase is inserted downstream of the promoter of the protein gene of the present invention, expressed in the above-described various cells, and activated to activate the enzyme activity when the test compound is brought into contact with the cells. By searching for an inhibitory compound or a salt thereof, a compound or a salt thereof that promotes or suppresses the expression of the protein of the present invention (that is, promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention) can be screened.
[0044]
The polynucleotide encoding the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
The present invention relates to (3) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention, which is characterized by using a polynucleotide encoding the protein of the present invention (hereinafter referred to as a promoter and an inhibitor, respectively). May be provided), more specifically, for example,
(4) A comparison is made between (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (iv) culturing a mixture of cells capable of producing the protein of the present invention and a test compound. A method for screening for an accelerator or an inhibitor is provided.
In the above-mentioned screening method, for example, in the cases (iii) and (iv), the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) is measured. And compare.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
In order to carry out the above-mentioned screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the expression of the protein gene of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured according to the method.
The expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, a method such as Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), a real-time PCR analysis system (manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reaction) or the like. It can be measured according to a corresponding method.
For example, a test that promotes the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). The compound can be selected as a compound that promotes the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
For example, a test that inhibits the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). The compound can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
Furthermore, the antibody of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention.
The present invention relates to (5) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention, which is characterized by using the antibody of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a promoter or an inhibitor, respectively). Provide a screening method, more specifically, for example,
(6) A comparison is made between (v) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (vi) culturing a mixture of cells capable of producing the protein of the present invention and a test compound. A method for screening for an accelerator or an inhibitor is provided.
In the above screening method, for example, the expression level of the protein of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention) in the cases (v) and (vi) is measured using the antibody of the present invention (for example, The expression of the protein of the present invention is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, and the like, and compared.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
In order to carry out the above-mentioned screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer includes a cation (eg, Ca) of the protein of the present invention such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). 2+ , K + , Na + Etc.) Any buffer may be used as long as it does not inhibit the permeation activity.
As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured according to the method.
For example, a test compound which promotes the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (v) Can be selected as a compound or its salt that promotes the expression of the protein of the present invention.
For example, a test compound that inhibits the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (v) Can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein of the present invention or a salt thereof.
[0045]
The screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention are test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts. A compound selected from animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof, and a compound or salt thereof that promotes or inhibits the activity (eg, cation permeation activity, etc.) of the protein of the present invention.
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
The compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention, the compound or its salt that promotes the expression of the protein gene of the present invention, and the compound or its salt that promotes the expression of the protein of the present invention include, for example, infertility (eg, , Irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm annihilation, asthenia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) , Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer , Thymoma, etc.) and pharmaceuticals such as contraceptives. Preferably used as a prophylactic or therapeutic agent for infertility
A compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention, and a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein of the present invention include, for example, infertility ( For example, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm annihilation, asthenia, spermatogenesis, testicular dysfunction, etc. ), Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreas) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for cancer, thymoma and the like, and a medicament such as a contraceptive. It is preferably used as a contraceptive or the like.
[0046]
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used.
The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered orally or parenterally.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc., for example, a compound or a salt thereof which promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating infertility. Is generally administered to an adult (with a body weight of 60 kg) of the compound or a salt thereof in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg per day. Administer ~ 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, a compound that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating infertility Or, when the salt thereof is usually administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. Advantageously, 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0047]
[3] Quantification of the protein of the present invention, its partial peptide or its salt
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody; A method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, and
(Ii) After reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. A method for quantifying the protein of the present invention in a test solution is provided.
In the quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
[0048]
The protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, and the F (ab ') Two , Fab ′ or Fab fraction may be used.
The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ Three H], [ 14 C] is used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
[0049]
For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different binding site to the protein of the present invention is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes, for example, the N-terminal other than the C-terminal is used.
[0050]
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to react competitively with an antibody, an unreacted labeled antigen (F) and a labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble sediment produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
[0051]
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). )) (The above is from Academic Press) ) And the like can be referred to.
As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
Furthermore, when a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, Esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc., infertility (eg, irregular menstruation) , Dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, spermatozoa, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) It can be diagnosed that there is a high possibility that the user is doing it. Conversely, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate) Cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc., infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary Sexual amenorrhea, azoospermia, azoospermia, sperm death, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) can be diagnosed as having a high possibility.
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
[0052]
[4] Gene diagnostics
The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.). Can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein or its partial peptide of the present invention in, for example, damage, mutation, or decrease in expression of the DNA or mRNA, and decrease in the DNA or mRNA. It is useful as a diagnostic agent for genes such as increase or overexpression.
The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processings of the -Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)).
For example, when increased expression is detected by Northern hybridization, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder Cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.), infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, Azoospermia, hypospermia, sperm death, asthenozoospermia, impaired spermatogenesis, testicular dysfunction, etc.) can be diagnosed. Conversely, when a decrease in expression is detected or when a mutation in DNA is detected by the PCR-SSCP method, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer) Cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc., infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, Weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm death, asthenia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.) it can.
[0053]
[5] A drug containing an antisense polynucleotide
The antisense polynucleotide of the present invention, which complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA, has low toxicity, and functions of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo [Examples] Cation (eg, Ca 2+ , K + , Na + For example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, sperm reduction) Disease, aspermia, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc., cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer) , Stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) and pharmaceuticals such as contraceptives. It is preferably used as a contraceptive or the like.
When the above antisense polynucleotide is used as the above medicine, it can be formulated and administered according to a known method.
For example, when the antisense polynucleotide is used, the antisense polynucleotide is used alone or inserted into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. For example, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally. The antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
The dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is locally administered to testis for the purpose of treating infertility, it is generally used. For an adult (body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
Further, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
[0054]
Further, the present invention provides
(I) a double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention and RNA complementary thereto,
(Ii) a medicine comprising the double-stranded RNA,
(Iii) a ribozyme containing a part of RNA encoding the protein of the present invention,
(Iv) a medicament comprising the ribozyme,
(V) An expression vector or the like containing a gene (DNA) encoding the ribozyme is also provided.
Like the above-mentioned antisense polynucleotide, double-stranded RNA, ribozyme and the like can also destroy RNA transcribed from the DNA of the present invention or suppress the function thereof, and can be used in vivo for a protein or ribozyme used in the present invention. Since the function of the DNA used in the present invention can be suppressed, for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, Hypospermia, annihilation, asthenozoospermia, impaired spermatogenesis, testicular dysfunction, etc., cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, Prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma and the like), and can be used as a medicament such as a contraceptive. It is preferably used as a contraceptive or the like.
The double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
A ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by substituting a part of a known ribozyme sequence with a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a sequence in the vicinity of a consensus sequence NUX (where N represents all bases and X represents a base other than G) which can be cleaved by a known ribozyme, and the like are included. No.
When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide. The expression vector (v) is used in the same manner as known gene therapy methods and the like, and is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent.
[0055]
[6] Production of animals having the DNA of the present invention
The present invention relates to a non-protein having a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A human mammal is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) The animal according to (1) above, wherein the non-human mammal is a rodent.
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) A recombinant vector or the like containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals is provided.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, etc. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by introducing a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. Further, by the DNA introduction method, the exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transfected animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a known cell fusion method.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0056]
The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. When introducing the DNA of the present invention into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is introduced, DNAs derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto are expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-introduced mammals can be created.
[0057]
Examples of expression vectors for the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, for example, (i) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase β I subunit, dystrophy Int, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I And IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide elongation factor 1α (EF-1α), β-actin, α and β myosin heavy chains, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, blunt Muscle α Kuching, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression over the whole body, a promoter of human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), human and chicken β-actin promoters, and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA-transfected mammal (generally called a terminator). For example, the sequence of each DNA derived from a virus and from various mammals is used. Preferably, a simian virus SV40 terminator or the like is used.
[0058]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. From the various genomic DNA libraries described above, or as a starting material, a complementary DNA prepared by a known method from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal polypeptide obtained from the above-mentioned cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in an introduced animal by a usual DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA means that all progeny of the produced animal will retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating.
Introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0059]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level and promotes the function of the endogenous normal DNA to eventually cause hyperactivity of the protein of the present invention. Occasionally, it can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transfected animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
Further, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. .
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in an ordinary breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. Introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
[0060]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of the endogenous normal DNA, and finally the functionally inactive form of the protein of the present invention. It can be refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, by using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Also, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can inhibit the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. A model to elucidate.
In addition, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease thereof. It is.
In addition, other possible uses of the two kinds of the DNA-introduced animals of the present invention include, for example,
(I) use as a cell source for tissue culture,
(Ii) a protein specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transfected animal of the present invention, or analyzing a polypeptide tissue expressed by the DNA; Analysis of the relationship with
(Iii) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
(Iv) screening for an agent that enhances the function of the cell by using the cell according to (iii), and
(V) Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered.
Furthermore, using the DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to examine the clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including the inactive refractory disease of the protein of the present invention, etc. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-introduced animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain the released DNA-introduced cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to identify the protein-producing cell of the present invention, examine its relevance to apoptosis, differentiation or proliferation, or investigate the signal transduction mechanism thereof, and investigate their abnormalities. It is an effective research material for
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory type of the protein of the present invention, using the DNA-transfected animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using a method or the like. In addition, using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the protein of the present invention.
[0061]
[7] Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli).
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin-resistant,
(4) the embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
(7) The above (6), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. The non-human mammal of the description,
(8) the non-human mammal according to the above (6), wherein the non-human mammal is a rodent;
(9) The non-human mammal according to (8), wherein the rodent is a mouse, and
(10) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity on DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting the expression of a reporter gene. provide.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
[0062]
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); By making it impossible to synthesize complete mRNA, A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells are used in the present invention. Analysis by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or in the vicinity of the DNA as a probe, or PCR using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers However, it can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
[0063]
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufman method. May be newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used. For example, to obtain ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 was improved by hybridization with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) 1 ) Can also be used favorably. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as their background. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, it has been necessary to carry out about 10 6 Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so that the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
[0064]
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / 1mM EDTA) treatment, and seeding on freshly prepared feeder cells. Such passage is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal Of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], and the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is an Useful in protein cell biology studies.
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
[0065]
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human mammalian stem cell. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has the mutated DNA locus of the present invention, all the tissues are artificially mutated from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.
When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0066]
[7a] A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and tested using the change in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. Compounds can be tested for their therapeutic and prophylactic effects.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0067]
For example, when screening for a compound that has a therapeutic effect on infertility, a test compound is administered to a male non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and reared with a control normal female animal for a certain period of time. Measure the percentage of pregnant females.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a preventive / therapeutic effect on a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic drug such as a prophylactic / therapeutic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
[0068]
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, human or other mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) ) Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, it is generally used in an adult (assuming a body weight of 60 kg) infertile patient. Administers about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) infertile patients. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0069]
[7b] A method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. A method for screening a salt is provided.
In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
[0070]
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, a tissue that expresses the protein of the present invention should be used instead of the protein of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). Can be observed in the animal body. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
[0071]
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may include a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) and a base (eg, an organic acid). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein, for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea) Dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm death, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc.), cancer (eg, testis Tumor, ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, stomach, bladder, cervix, colon, rectum, pancreas, thymoma, etc.) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent and a medicament such as a contraceptive. Preferably, it is used as an agent for preventing or treating infertility.
[0072]
Further, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity on the DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, and thus, for example, infertility (eg, irregular menstruation, Dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, hypospermia, sperm death, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc., cancer (eg , Testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc. ) Are useful as prophylactic / therapeutic agents and pharmaceuticals such as contraceptives. It is preferably used as a contraceptive or the like.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, human or other mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) ) Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the disease to be treated, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is orally administered, generally the adult (body weight) is used. In a patient with infertility (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to an infertile patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound is administered intravenously per day. It is convenient to do so. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0073]
On the other hand, for example, when a compound of the present invention that inhibits promoter activity against DNA is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) infertile patient, about 0.1 to 100 mg of the compound per day is used. , Preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to an infertile patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound is administered intravenously per day. It is convenient to do so. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by the disease or to develop preventive and therapeutic drugs.
In addition, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). Once created, it will also be possible to specifically synthesize the polypeptide and study its effects in living organisms. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion, and a cell line that expresses the reporter gene is established, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein itself of the present invention in the body. Can be used as a search system.
[8] A drug containing the antibody of the present invention
The antibody of the present invention, which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention, includes, for example, cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate) Cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc., infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary Sexual amenorrhea, azoospermia, azoospermia, spermatozoa, asthenozoospermia, spermatogenesis disorder, testicular dysfunction, etc. It is preferably used as a contraceptive or the like.
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form in humans or mammals (eg, rat, rabbit, sheep, pig, It can be administered orally or parenterally (eg, intravenous injection, etc.) to cattle, cats, dogs, monkeys, and the like. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route and the like.For example, when used for the prevention or treatment of infertility in adults, the antibody of the present invention is usually administered as a single dose. About 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably 1 to 5 times a day It is convenient to administer by intravenous injection about three times. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intravenous injection). It is preferably provided as an inhalant.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the antibody.
[0074]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: Cytosine
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
[0075]
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
[0076]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
3 shows the amino acid sequence of human TCH207 protein obtained in Example 2.
[SEQ ID NO: 2]
This shows the base sequence of DNA encoding human TCH207 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3]
3 shows the amino acid sequence of the human TCH207D436N protein obtained in Example 2.
[SEQ ID NO: 4]
This shows the base sequence of DNA encoding human TCH207D436N protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[SEQ ID NO: 5]
3 shows the base sequence of primer R2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 6]
2 shows the base sequence of primer F2R used in Example 1.
[SEQ ID NO: 7]
2 shows the nucleotide sequence of primer F3R used in Example 1.
[SEQ ID NO: 8]
2 shows the base sequence of primer R4R used in Example 1.
[SEQ ID NO: 9]
2 shows the base sequence of primer R5R used in Example 1.
[SEQ ID NO: 10]
2 shows the base sequence of primer F5 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 11]
2 shows the nucleotide sequence of primer AP1 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 12]
2 shows the base sequence of primer AP2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 13]
5 shows the 5 ′ terminal sequence of human TCH207 gene cDNA identified by the RACE reaction in Example 1.
[SEQ ID NO: 14]
3 shows the 3 ′ end sequence of the human TCH207 gene cDNA identified by the RACE reaction in Example 1.
[SEQ ID NO: 15]
3 shows the base sequence of primer A1 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 16]
3 shows the base sequence of primer B1 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 17]
3 shows the base sequence of primer SP6 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 18]
4 shows the base sequence of primer T7 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 19]
4 shows the base sequence of primer F1 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 20]
3 shows the base sequence of primer R1 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 21]
3 shows the base sequence of primer R5 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 22]
3 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length human TCH207 gene obtained in Example 2.
[SEQ ID NO: 23]
3 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length human TCH207D436N gene obtained in Example 2.
[SEQ ID NO: 24]
3 shows the base sequence of primer A2 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 25]
3 shows the base sequence of primer B3 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 26]
4 shows the nucleotide sequence of TaqMan probe T1 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 27]
14 shows the base sequence of primer mB1 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 28]
14 shows the base sequence of primer mB3 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 29]
14 shows the base sequence of primer mB4 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 30]
14 shows the base sequence of primer mB5 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 31]
14 shows the base sequence of primer mB6 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 32]
7 shows the base sequence of primer mA3 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 33]
7 shows the base sequence of primer mA4 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 34]
14 shows the base sequence of primer mA5 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 35]
5 shows the full-length sequence of mouse TCH207 gene cDNA identified by the RACE reaction in Example 4.
[SEQ ID NO: 36]
14 shows the base sequence of primer mA6 used in Example 5.
[SEQ ID NO: 37]
14 shows the base sequence of primer mB7 used in Example 5.
[SEQ ID NO: 38]
14 shows the base sequence of primer mA1 used in Example 5.
[SEQ ID NO: 39]
14 shows the base sequence of primer mB2 used in Example 5.
[SEQ ID NO: 40]
14 shows the base sequence of primer mB8 used in Example 5.
[SEQ ID NO: 41]
7 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length mouse TCH207 gene obtained in Example 5.
[SEQ ID NO: 42]
7 shows the amino acid sequence of mouse TCH207 protein obtained in Example 5.
[SEQ ID NO: 43]
This shows the base sequence of DNA encoding the mouse TCH207 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42.
[SEQ ID NO: 44]
14 shows the base sequence of primer mA8 used in Example 6.
[SEQ ID NO: 45]
14 shows the base sequence of primer mB9 used in Example 6.
[SEQ ID NO: 46]
14 shows the base sequence of TaqMan probe mT1 used in Example 6.
[0077]
Escherichia coli TOP10 / pCRII-TCH207 obtained in Example 2 described below has been used since May 27, 2002, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566) ), At the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, under the accession number FERM BP-8055, from May 14, 2002, 2-17-85 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi (postal code 532- 8686), and deposited at the Fermentation Research Institute under the accession number IFO 16796.
Escherichia coli TOP10 / pCRII-mTCH207 obtained in Example 5 described below has been used since June 13, 2002, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Chuo No. 6 (zip code 305-8566) ), The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), the Patent Organism Depositary, with accession number FERM BP-8077, from June 4, 2002, 2-17-85 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi (postal code 532- 8686), and deposited at the Fermentation Research Institute under the accession number IFO 16801.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the genetic manipulation method using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning.
[0078]
Example 1
Identification of 5′-end and 3′-end sequences of human TCH207 gene cDNA
For human testis Marathon-Ready cDNA (Clontech), the following conditions (1) were obtained using Advantage 2 DNA Polymerase (Clontech) using the primary primer of Table 1 and primer AP1 (SEQ ID NO: 11). The primary RACE reaction was performed in steps (1) to (5).
[Table 1]
(1) 94 ° C for 3 minutes
(2) 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds -72 ° C for 2 minutes
(3) 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds and -70 ° C for 2 minutes
(4) 25 cycles of 94 ° C for 5 seconds and -68 ° C for 2 minutes
(5) 70 ° C for 10 minutes
Furthermore, for set5 and set6, the secondary RACE reaction was performed under the same reaction conditions as the primary RACE reaction using the primary RACE reaction product as a template and the secondary primer and primer AP2 (SEQ ID NO: 12) shown in Table 1. went. The primary RACE reaction product obtained by set1, set2, set3, and set4, and the secondary RACE reaction product obtained by set5 and set6 were subjected to gel electrophoresis, and then the main band was purified. The reaction was performed using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biosystems), and the nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the 5 ′ end sequence of the human TCH207 gene cDNA (SEQ ID NO: 13) was calculated from the sequences obtained by set1, set2, and set3, and the human TCH207 gene cDNA was synthesized from the sequences obtained by set4, set5, and set6. 'The terminal sequence (SEQ ID NO: 14) was identified.
[0079]
Example 2
Cloning of cDNA for human TCH207 gene
Using two types of primer DNAs, a primer A1 (SEQ ID NO: 15) and a primer B1 (SEQ ID NO: 16), designed based on the sequences at the 5 ′ end and the 3 ′ end identified in Example 1, human testis PCR was performed on Marathon-Ready cDNA (manufactured by Clontech) using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) under the following conditions (1) to (5).
(1) 94 ° C for 3 minutes
(2) 5 cycles of 94 ° C for 10 seconds and -70 ° C for 3 minutes
(3) 5 cycles of 94 ° C for 10 seconds and -68 ° C for 3 minutes
(4) 25 cycles of 94 ° C for 10 seconds -66 ° C for 30 seconds -72 ° C for 3 minutes
(5) 72 ° C for 10 minutes
After the obtained amplification product was subjected to gel electrophoresis, a 1.5 kbp band was cut out, treated with ExTaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) at 72 ° C. for 20 minutes, and cloned using a TOPO TA Cloning kit dualpromoter (manufactured by Invitrogen). . Independently, PCR was performed four times, and four clones were obtained by combining one clone from each time. This plasmid was used as a primer DNA [primer SP6 (SEQ ID NO: 17), primer T7 (SEQ ID NO: 18), primer F1 (SEQ ID NO: 19), primer F2R (SEQ ID NO: 5), primer R1 (SEQ ID NO: 20). , Primer R5 (SEQ ID NO: 21), primer R5R (SEQ ID NO: 9)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biosystems), and the base sequence of the inserted cDNA fragment was converted to DNA. It was determined using a sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems).
As a result, among the obtained plasmids, two clones had the same nucleotide sequence of 1514 bp. This sequence is shown in SEQ ID NO: 22. The cDNA fragment encodes a 472 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2), and the protein containing the amino acid sequence was named human TCH207 protein. A transformant having a plasmid containing the cDNA fragment was named Escherichia coli TOP10 / pCRII-TCH207.
In the remaining two clones among the obtained clones, the nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 where G at position 1323 was substituted with A (this nucleotide substitution is considered to be caused by SNP) Had. This nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 23. This base substitution involves substitution of Asp at position 436 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with Asn. The protein having the amino acid substitution from Asp to Asn was named human TCH207D436N protein. The amino acid sequence of human TCH207D436N protein is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 4.
Using Blast P [Nucleic Acids Res. Vol. 25, p. 3389, 1997], a homology search was performed on NR [NCBI (United States Center for Biotechnology Information) Protein Database]. Ca 2+ It was found to be a novel gene belonging to the CatSper family, which is considered to be a channel (FIG. 1). The human TCH207 protein has 16% homology at the amino acid level and 25% homology to the transmembrane domain (S1-S6) with CatSper (Nature, 413, 603, 2001) reported in humans. And it was inferred to have a six-transmembrane structure. In addition, the presence of a basic amino acid in the fourth transmembrane domain (S4), 2+ Due to the conserved amino acid residues important for selectivity, potential-dependent Ca 2+ It was considered likely to function as a subunit of the channel.
[0080]
Example 3
Analysis of tissue distribution of human TCH207 gene product
Using two types of primer DNAs [primer A2 (SEQ ID NO: 24) and primer B3 (SEQ ID NO: 25)] and TaqMan probe T1 (SEQ ID NO: 26) designed from the sequence of human TCH207, The expression level (copy number) of human TCH207 in the cDNA of was measured by TaqMan PCR. Table 2 shows the cDNA of each human tissue used for the measurement.
[Table 2]
For the same cDNA, the expression level (copy number) of glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was also measured using TaqMan GAPDH control reagents (manufactured by Applied Biosystems). The reaction was carried out using TaqMan Universal PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) at 50 ° C. for 2 minutes at ABI PRISM 7900 sequence detection system (manufactured by Applied Biosystems), and further at 95 ° C. for 10 minutes. Forty cycles were repeated at 15 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for one minute as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously.
The results are shown in FIGS.
The human TCH207 gene product (mRNA) showed selective and very strong expression in testis, and some expression in stomach, placenta, fetal kidney, breast cancer, lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer. No expression was detected in the Human blood fractions MTC panel and the Human immune system MTC panel.
[0081]
Example 4
Identification of full-length sequence of mouse TCH207 gene cDNA by RACE reaction
For mouse testis Marathon-Ready cDNA (Clontech), 5′-RACE primer DNA [primer mB1 (SEQ ID NO: 27), primer mB3 (SEQ ID NO: 28), primer mB4 (SEQ ID NO: 29), Any of primer mB5 (SEQ ID NO: 30) and primer mB6 (SEQ ID NO: 31)], or 3′-RACE primer DNA [primer mA3 (SEQ ID NO: 32), primer mA4 (SEQ ID NO: 33) and primer] mA5 (SEQ ID NO: 34)] and the primer AP1 (SEQ ID NO: 11), and an RACE reaction was performed under the following conditions (1) to (5) using Advantage 2 DNA Polymerase (Clontech). Was.
(1) 94 ° C for 3 minutes
(2) 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds -72 ° C for 30 seconds
(3) 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds and -70 ° C for 30 seconds
(4) 25 cycles of 94 ° C for 5 seconds and -68 ° C for 30 seconds
(5) 70 ° C for 10 minutes
After gel electrophoresis of the obtained RACE reaction product, the main band was purified, and each of the 5′- or 3′-RACE primer DNA used for the RACE reaction and the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) were used. And the base sequence of the inserted cDNA fragment was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the full-length sequence of the mouse TCH207 gene cDNA (SEQ ID NO: 35) was identified.
[0082]
Example 5
Cloning of cDNA for mouse TCH207 gene
Using two kinds of primer DNAs [primer mA6 (SEQ ID NO: 36) and primer mB7 (SEQ ID NO: 37)] designed based on the full-length sequence of the cDNA identified in Example 4, mouse testis Marathon-Ready cDNA PCR (Clontech) was performed using Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) under the following conditions (1) to (5). (1) 94 ° C for 3 minutes
(2) 5 cycles of 94 ° C for 10 seconds -72 ° C for 3 minutes
(3) 5 cycles of 94 ° C for 10 seconds and -70 ° C for 3 minutes
(4) 20 cycles of 94 ° C for 10 seconds and -68 ° C for 3 minutes
(5) 72 ° C for 10 minutes
After the obtained amplification product was subjected to gel electrophoresis, a band of about 1.5 kbp was cut out, treated with ExTaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for 20 minutes at 72 ° C., and then using TOPO TA Cloning kit dual promoter (manufactured by Invitrogen). Cloned. This was combined with primer DNA [primer SP6 (SEQ ID NO: 17), primer T7 (SEQ ID NO: 18), primer mA1 (SEQ ID NO: 38), primer mA5 (SEQ ID NO: 34), primer mB2 (SEQ ID NO: 39), The primers mB4 (SEQ ID NO: 29) and mB8 (SEQ ID NO: 40)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biosystems) were used for the reaction, and the base sequence of the inserted cDNA fragment was determined using a DNA sequencer. It was determined using an ABI PRISM 3100 DNA analyzer (manufactured by Applied Biosystems).
As a result, the obtained clone had 1536 base sequences (SEQ ID NO: 41). This sequence completely matched a part of the full-length cDNA represented by SEQ ID NO: 35 (14th to 1549th). This cDNA fragment encodes 442 amino acid sequences (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 43), and the protein containing this amino acid sequence was designated as mouse TCH207 protein.
A transformant having the plasmid containing the above-mentioned cDNA fragment was designated as Escherichia coli TOP10 / pCRII-mTCH207.
Using Blast P [Nucleic Acids Res. Vol. 25, p. 3389, 1997], a homology search was performed on NR [NCBI (United States Center for Biotechnology Information) Protein Database]. Ca 2+ It was found to be a mouse ortholog of human TCH207, a novel gene belonging to the CatSper family considered as a channel (FIG. 4). Mouse TCH207 has a homology of 70% at the base level and 67% at the amino acid level with human TCH207, and at the amino acid level with mouse CatSper (Nature, 413, 603, 2001) reported in mice. Each showed 17% homology. Mouse TCH207 has the same structural characteristics as human TCH207, so that voltage-dependent Ca 2+ It is likely that it will function as a subunit of the channel.
[0083]
Example 6
Analysis of tissue distribution of mouse TCH207 gene product
Using two kinds of primer DNAs [primer mA8 (SEQ ID NO: 44) and primer mB9 (SEQ ID NO: 45)] and TaqMan probe mT1 (SEQ ID NO: 46) designed from the sequence of mouse TCH207, (Bone marrow, eyes, lymph nodes, smooth muscle, prostate, thymus, stomach, uterus, heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, testis, embryo (7 days), embryo (11 days), embryo ( The expression level (copy number) of mouse TCH207 in cDNA (Mouse MTC panel I and Mouse MTC panel II: Clonetech) of embryos (15 days) and embryos (17 days) was measured by TaqMan PCR. For the same cDNA, the expression level (copy number) of rodent glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was also measured using TaqMan rodent GAPDH control reagents (manufactured by Applied Biosystems). The reaction was carried out using TaqMan Universal PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) at 50 ° C. for 2 minutes at ABI PRISM 7900 sequence detection system (manufactured by Applied Biosystems), and further at 95 ° C. for 10 minutes. The reaction was repeated 40 times with 1 reaction cycle at 15 ° C. and 1 minute at 60 ° C., and detection was performed simultaneously.
FIG. 5 shows the results. The mouse TCH207 gene product (mRNA) showed selective and very strong expression in testis.
[0084]
【The invention's effect】
The protein of the present invention can be used, for example, for infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, spermia, asperity, asthenia Disease, spermatogenesis, testicular dysfunction, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervix) Compounds that are useful as diagnostic markers for head and neck cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc., and that regulate (promote or inhibit) the activity of the protein obtained by a screening method using the protein, or compounds thereof. Salts include, for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight-loss amenorrhea, secondary amenorrhea, azoospermia, spermia, asperaemia, asthenia, Impaired spermatogenesis, testicular dysfunction, etc., cancer (eg Testicular, ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, rectal, pancreatic, thymoma, etc.) It can be used as a prophylactic / therapeutic agent, a contraceptive drug or the like. The compound or its salt that promotes the activity of the protein is preferably used as an agent for preventing or treating infertility. The compound that inhibits the activity of the protein or a salt thereof is preferably used as a contraceptive or the like.
[0085]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences in transmembrane regions of human TCH207, human CatSper and human CatSper2. In the figure, TCH207 is the sequence from the 92nd position to the 306th position in the amino acid sequence of human TCH207 (SEQ ID NO: 1), CatSper is the sequence from the 439th position to the 671st position in the amino acid sequence of human CatSper, and CatSper2 is the human. The sequence from the 104th position to the 340th position in the amino acid sequence of CatSper2a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 12527, 2001) is shown. S1 to S6 indicate transmembrane domains, and P indicates a pore region. □ indicates an amino acid that is identical in two or more of the three sequences. The basic residue in S4 is indicated by ○, and the voltage-dependent Ca 2+ * The residue conserved in the channel family 2+ Asp important for selectivity is marked with *.
FIG. 2 is a diagram showing the expression level of human TCH207 gene product in each tissue. The results obtained by measuring the expression level of human TCH207 in human human tissue cDNAs (Human MTC panel I, Human MTC panel II (upper figure) and Human digestive system MTC panel (lower figure): Clontech) by TaqMan PCR. In the figure, the vertical axis represents the expression level, and the value obtained by dividing the copy number per 1 μl of the human TCH207 cDNA solution by the copy number of glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in an equal amount of each tissue cDNA is 100,000 times. It was expressed by.
FIG. 3 is a diagram showing the expression level of human TCH207 gene product in each tissue. The results obtained by measuring the expression level of human TCH207 in human tissue cDNAs (Human fetal MTC panel (upper figure) and Human tumor MTC panel (lower figure): Clontech) by TaqMan PCR. In the figure, the vertical axis represents the expression level, and the copy number per 1 μl of the cDNA solution of human TCH207 was divided by the copy number of glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in an equal amount of each tissue cDNA and multiplied by 100,000. It was expressed by.
FIG. 4 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences between human TCH207 and mouse TCH207. In the figure, human indicates the amino acid sequence of human TCH207 (SEQ ID NO: 1), and mouse indicates the amino acid sequence of mouse TCH207 (SEQ ID NO: 42). S1 to S6 indicate transmembrane domains, and P indicates a pore region. □ indicates amino acids that are identical in the two sequences. The basic residue in S4 is indicated by ○, and the voltage-dependent Ca 2+ * The residue conserved in the channel family 2+ Asp important for selectivity is marked with *.
FIG. 5 is a view showing the expression level of mouse TCH207 gene product in each tissue. The results of measurement of the expression level of mouse TCH207 in mouse tissue cDNAs (Mouse MTC panel I and mouse MTC panel II by Clontech) by TaqMan PCR are shown. In the figure, the ordinate represents the expression level, and the copy number per 1 μl of the cDNA solution of mouse TCH207 was divided by the copy number of rodent glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in an equal amount of each tissue cDNA and multiplied by 100,000. Expressed by value.
