JP2004121245A - New protein and its dna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なナトリウム依存性胆汁酸トランスポータータンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物、該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物などのスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などを提供する。さらには、中枢神経系疾患(好ましくはパーキンソン症候群など)の予防・治療剤およびそのスクリーニングなどにも関する。 The present invention provides a method for screening a novel sodium-dependent bile acid transporter protein, a polynucleotide encoding the protein, a compound that promotes or inhibits the activity of the protein, a compound that promotes or inhibits the expression of the protein gene, A compound obtained by the screening method is provided. Furthermore, the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases (preferably Parkinson's syndrome and the like) and screening thereof.
胆汁酸は肝臓において合成され、小腸に分泌されるが、小腸において脂質や脂溶性ビタミン、コレステロールなどの吸収を促すという重要な働きを担っている。胆汁酸は主に、小腸(回腸)から効率良く再吸収され、門脈を経て肝臓に戻り、再び胆汁中に排泄される(腸肝循環)。体内コレステロールプールサイズは、食事中のコレステロールだけでなく、腸肝循環の胆汁酸によってもフィードバック制御されることから、胆汁酸吸着薬(陰イオン交換樹脂)を用いた胆汁酸の腸における再吸収の抑制により、高コレステロール血症の治療が行われている。 Bile acids are synthesized in the liver and secreted into the small intestine, and play an important role in the small intestine in promoting absorption of lipids, fat-soluble vitamins, cholesterol, and the like. Bile acids are mainly efficiently reabsorbed from the small intestine (ileum), return to the liver via the portal vein, and are excreted again in bile (enterohepatic circulation). Since the body cholesterol pool size is feedback-controlled not only by dietary cholesterol but also by bile acids in the enterohepatic circulation, resorption of bile acids in the intestine using a bile acid adsorbent (anion exchange resin) is considered. Suppression has led to the treatment of hypercholesterolemia.
パーキンソン症候群は、中脳黒質のドーパミン作動性神経細胞の変性脱落により、神経終末がある線条体でドーパミン不足をきたし、錐体外路性運動障害が出現する変性疾患で、静止時振戦、筋強剛、動作緩慢、無動および姿勢反射障害を四主徴とする。有病率は10万人当たり約100人である。病因は不明であり、何らかの中毒物質の関与が推定されている。 Parkinson's syndrome is a degenerative disease in which dopamine deficiency occurs in the striatum with nerve endings due to degeneration and loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra, and extrapyramidal movement disorder appears. Muscle rigidity, slow motion, immobility and postural reflex disorder are the four main features. The prevalence is about 100 per 100,000. The etiology is unknown and the involvement of some poisoning substance is presumed.
ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターは胆汁酸の運搬に寄与すると考えられている。ヒトでは、ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターのアイソフォームが2つ同定されており、NTCP(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide)は主に肝臓で発現し(非特許文献1 J. Clin. Invest.、93巻、1326-1331頁、1994年)、ISBT(Ileal sodium / bile salt cotransporter)は主に回腸・腎臓で発現している(J. Biol. Chem.、270巻、27228-27234頁、1995年)。ISBTに関しては、アミノ酸置換を伴う遺伝子の変異と胆汁酸吸収不良との直接的な関連が示唆されている(J. Clin. Invest.、99巻、1880-1887頁、1997年)。
ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターは、肝臓や小腸における胆汁酸の運搬において重要な役割を果たしていると考えられているが、その詳細なメカニズムや疾患との関連についてはそれほど明らかにされていない。ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターの詳細な基質特異性や胆汁酸代謝などにおける役割を解明することが、胆汁酸代謝などが関与する疾患の治療薬開発につながる。 The sodium-dependent bile acid transporter is thought to play an important role in the transport of bile acids in the liver and small intestine, but its detailed mechanism and its relation to disease are not well understood. Elucidation of the role of sodium-dependent bile acid transporters in detailed substrate specificity and bile acid metabolism will lead to the development of therapeutics for diseases involving bile acid metabolism and the like.
ヒトゲノム配列の決定を受け、パーキンソン症候群をはじめとする中枢神経系疾患の原因遺伝子が飛躍的に発見され、それまで発症機構が不明であった疾患に関しても病態機序が明らかになりつつある。中枢神経系疾患の分野においては、それぞれの疾患で特異的に発現する分子を標的とし、異常タンパク質の産生抑制ならびに分解促進、または沈着した異常タンパク質のクリアランスや沈着抑制などをターゲットとした薬剤が求められている。現在のところ様々なパーキンソンの治療剤が存在するものの、症状を根治する優れた医薬は未だ開発されていない。 (4) Following the determination of the human genome sequence, the genes responsible for central nervous system diseases such as Parkinson's syndrome have been dramatically discovered, and the pathogenesis of diseases for which the mechanism of onset was unknown until now has been elucidated. In the field of central nervous system diseases, drugs that target molecules that are specifically expressed in each disease, and that target the suppression of abnormal protein production and degradation, or the clearance or deposition of abnormal proteins that have been deposited, are required. Have been. At present, there are various Parkinson's therapeutic agents, but no excellent drug to cure the symptoms has yet to be developed.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトナトリウム依存性胆汁酸トランスポータータンパク質(ヒトTCH162)およびそのマウスオルソログ(マウスTCH162)を見出した。ヒトTCH162はアミノ酸レベルで、ヒトNTCP(非特許文献1 J. Clin. Invest.、93巻、1326-1331頁、1994年)と34%の相同性を示し、ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターとして機能し得るものである。また、Genbank Accession No. BC019066(非特許文献2)の塩基配列の一部分である。 The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found a human sodium-dependent bile acid transporter protein (human TCH162) and its mouse ortholog (mouse TCH162). Human TCH162 shows 34% homology at the amino acid level to human NTCP (J. Clin. Invest., 93, 1326-1331, 1994), and functions as a sodium-dependent bile acid transporter. Can be done. Also, it is a part of the base sequence of Genbank Accession No. BC019066 (Non-Patent Document 2).
上記タンパク質を抑制する方法としては、例えば、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を阻害したり、該タンパク質の転写を抑制して発現レベルを低下させることが考えられる。該タンパク質を賦活化する方法としては、例えば胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を促進したり、該タンパク質のプロモーターを活性化したり、mRNAを安定化することで発現レベルを亢進することが考えられる。 As a method for suppressing the above protein, for example, inhibiting the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) or suppressing the transcription of the protein It is conceivable to reduce the expression level. Methods for activating the protein include, for example, promoting the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.), activating the promoter of the protein, and the like. It can be considered that the expression level is enhanced by stabilizing mRNA.
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
すなわち、本発明は、
(1) 配列番号:1または配列番号:19で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 配列番号:1で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
(3) 配列番号:19で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
(4) 上記(1)記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(5) 上記(1)記載のタンパク質または上記(4)記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6) DNAである上記(5)記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号:20または配列番号:27で表わされる塩基配列からなるDNA、
(8) 上記(5)記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(9) 上記(8)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(10) 上記(9)記載の形質転換体を培養し、上記(1)記載のタンパク質または上記(4)記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(11) 上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
(12) 上記(5)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(13) 上記(5)記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(14) 上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(15) 上記(14)記載の抗体を含有してなる診断薬、
(16) 上記(14)記載の抗体を含有してなる医薬、
(17) 上記(5)記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、
(18) 上記(17)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(19) 上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(20) 上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(21) 上記(19)記載のスクリーニング方法または上記(20)記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記(1)記載のタンパク質もしくは上記(4)記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
(22) 上記(21)記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(23) 上記(5)記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(24) 上記(5)記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(25) 上記(23)記載のスクリーニング方法または上記(24)記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
(26) 上記(25)記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(27) 上記(14)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記載のタンパク質の定量方法、
(28) 上記(27)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法、
(29) 上記(14)記載の抗体を用いることを特徴とする、上記(1)記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(30) 上記(14)記載の抗体を含有してなる、上記(1)記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(31) 上記(29)記載のスクリーニング方法または上記(30)記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記(1)記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
(32) 上記(31)記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(33) 中枢神経系疾患の予防・治療剤である、上記(11)、(12)、(16)、(18)、(22)、(26)または(32)記載の医薬、
(34) 中枢神経系疾患の診断薬である、上記(13)または(15)記載の診断薬、
(35) 哺乳動物に対して、上記(21)、(25)または(31)記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患の予防・治療方法、
(36) 中枢神経系疾患の予防・治療剤を製造するための上記(21)、(25)または(31)記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。
That is, the present invention
(1) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19, or a salt thereof;
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof;
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or a salt thereof;
(4) a partial peptide of the protein according to (1) or a salt thereof,
(5) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein of (1) or the partial peptide of (4),
(6) the polynucleotide according to (5), which is DNA;
(7) a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27,
(8) a recombinant vector containing the polynucleotide according to (5),
(9) a transformant transformed with the recombinant vector according to (8),
(10) culturing the transformant according to (9), producing and accumulating the protein according to (1) or the partial peptide according to (4), and collecting the protein; )) Or a method for producing the partial peptide according to (4) or a salt thereof,
(11) a medicine comprising the protein of (1) or the partial peptide of (4) or a salt thereof,
(12) a medicine comprising the polynucleotide according to the above (5),
(13) A diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (5),
(14) an antibody against the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof;
(15) a diagnostic agent comprising the antibody according to (14),
(16) a medicine comprising the antibody according to the above (14),
(17) a polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide according to (5) or a part thereof;
(18) a medicine comprising the polynucleotide according to the above (17),
(19) The protein according to (1), the partial peptide according to (4) or a salt thereof, wherein the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity,
(20) The activity of the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof, comprising the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof. A kit for screening for a compound that promotes or inhibits or a salt thereof,
(21) Promotes the activity of the protein of (1), the partial peptide of (4) or a salt thereof obtained by using the screening method of (19) or the screening kit of (20). Or a compound that inhibits or a salt thereof,
(22) a medicine comprising the compound or a salt thereof according to (21),
(23) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), which comprises using the polynucleotide according to (5);
(24) A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), comprising the polynucleotide according to (5),
(25) a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), obtained by using the screening method according to (23) or the screening kit according to (24);
(26) a medicament comprising the compound according to (25) or a salt thereof,
(27) The method for quantifying a protein according to (1), comprising using the antibody according to (14),
(28) A method for diagnosing a disease associated with the function of the protein according to (1), which comprises using the quantification method according to (27);
(29) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1), which comprises using the antibody according to (14).
(30) A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1), comprising the antibody according to (14);
(31) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1), which is obtained by using the screening method according to (29) or the screening kit according to (30),
(32) a medicament comprising the compound according to (31) or a salt thereof,
(33) The medicament according to (11), (12), (16), (18), (22), (26) or (32), which is a prophylactic / therapeutic agent for a central nervous system disease.
(34) The diagnostic agent according to the above (13) or (15), which is a diagnostic agent for a central nervous system disease.
(35) a method for preventing or treating a central nervous system disease, which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (21), (25) or (31) or a salt thereof;
(36) Use of the compound or salt thereof according to (21), (25) or (31) for producing a prophylactic / therapeutic agent for a central nervous system disease is provided.
本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび抗体などは、例えば高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの診断マーカー等として有用である。好ましくは中枢神経系疾患、特に好ましくはパーキンソン症候群などの診断マーカー等として有用である。該タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体などを用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物、該タンパク質の発現を促進または阻害する化合物などは、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などとして使用することができる。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 The protein, polynucleotide and antibody of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis) ), Central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis, etc.) Insufficiency), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, , Testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc. Useful as a diagnostic marker A. It is preferably useful as a diagnostic marker for central nervous system diseases, particularly preferably for Parkinson's syndrome and the like. Compounds that promote or inhibit the activity of the protein obtained by a screening method using the protein, polynucleotide or antibody include compounds that promote or inhibit the expression of the protein gene, compounds that promote or inhibit the expression of the protein, and the like. For example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, , Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disease (eg, pancreatic insufficiency such as pancreatitis, cystic fibrosis, etc.), respiratory disease ( Eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc., hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.) Cancer (eg, testicular, ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, colon, rectal, pancreatic, Thymoma, etc.). Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
本発明で用いられる配列番号:1または配列番号:19で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある)は、ヒトや温血動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19 used in the present invention (hereinafter referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) May be) human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, hepatocytes, splenocytes, neurons, glial cells, Pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells) Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone fine cells , Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells or cancer cells of these cells) or any tissue in which these cells are present, for example, brain, each part of the brain (Eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonads, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal Skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joints, skeletal muscle, etc. Protein or a synthetic protein.
配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 As the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably about 70% or more, More preferably, the amino acid sequence has about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing the same amino acid sequence as the above-mentioned amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
配列番号:19で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:19で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably about 70% or more as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, More preferably, the amino acid sequence has about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
配列番号:19で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:19で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。 Amino acid sequence homology was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF). Can be calculated.
実質的に同質の活性としては、例えば、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同質であることを示す。したがって、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送が同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 Examples of substantially the same activity include transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) and the like. Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, transportation of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times). , More preferably 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送などの活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、Am. J. Physiol.、274巻、G157-169頁、1998年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。 Activity such as transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) can be measured according to known methods. For example, Am. Physiol., Vol. 274, G157-169, 1998 or a method analogous thereto.
また、本発明のタンパク質としては、例えば(1)(i)配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:1で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:1で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、(2)(i)配列番号:19で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:19で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:19で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:19で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜200個程度、好ましくは1〜150個程度、好ましくは1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。 The protein of the present invention includes, for example, (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, Is an amino acid sequence in which about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5) amino acids have been deleted. , (Ii) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably 1 to 50 (Preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5) amino acids, and (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 1 or Or more (e.g., about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, More preferably, an amino acid sequence having a number (1 to 5) of amino acids inserted therein, and (iv) one or more (eg, about 1 to 200, preferably 1 to 200) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 1 to 150 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably a number (1 to 5) pieces. A so-called mutein such as a protein containing an amino acid sequence in which an amino acid is substituted with another amino acid, or (v) an amino acid sequence obtained by combining them; (2) (i) an amino acid represented by SEQ ID NO: 19 1 or 2 or more in the row (for example, about 1 to 200 pieces, preferably about 1 to 150 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably An amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids have been deleted, and (ii) one or more amino acids (for example, 1 to 200) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 Pieces, preferably about 1 to 150 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably a number (1 to 1 (Iii) 1 or 2 or more amino acids (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19; -10 An amino acid sequence in which about 0, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) amino acids have been inserted, (iv 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or more (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, Amino acid sequence in which about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably number (1 to 5) amino acids have been substituted with other amino acids, or (v) an amino acid sequence combining them So-called muteins such as proteins containing
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、とくに限定されない。 場合 When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。本発明のタンパク質は、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO-)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)のいずれであってもよい。 In the protein in the present specification, the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling. Proteins of the present invention, C-terminal, carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO -), may be any of an amide (-CONH 2) or an ester (-COOR).
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。 Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl , C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or C 7- alkyl groups such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl. 14 An aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group and the like are used.
本発明のタンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。 場合 When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
さらに、本発明のタンパク質には、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。 Furthermore, in the protein of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) has a protecting group (eg, a C 1-6 acyl such as a C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group). Group), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine-oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc. protected with a suitable protecting group (eg, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group and acetyl group) Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。 具体 Specific examples of the protein of the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and the like.
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。 部分 The partial peptide of the protein of the present invention is the partial peptide of the protein of the present invention described above, and preferably any peptide having the same properties as the protein of the present invention described above.
例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも5個以上、好ましくは10個以上、好ましくは15個以上、好ましくは20個以上、好ましくは50個以上、さらに好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上、最も好ましくは200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。 For example, at least 5 or more, preferably 10 or more, preferably 15 or more, preferably 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 70 or more, of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Is a peptide having an amino acid sequence of 100 or more, most preferably 200 or more.
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜10個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは1〜5個程度)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the sequence, or One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid.
本発明の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列において第1〜97番目、第169〜191番目、第254〜277番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:19で表されるアミノ酸配列において第1〜97番目、第169〜191番目、第254〜277番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。 As the partial peptide of the present invention, for example, a peptide having the 1st to 97th amino acids, the 169th to 191st amino acids, and the 254th to 277th amino acid sequences in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Peptides containing the 1st to 97th amino acids, the 169th to 191st amino acids, and the 254th to 277th amino acid sequences in the represented amino acid sequences are exemplified.
また、本発明で用いられる部分ペプチドはC末端が通常カルボキシル基(−COOH)またはカルボキシレート(−COO-)であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、C末端がアミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。 The partial peptide used in the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO − ) at the C-terminus, but has an amide (—CONH 2 ) at the C-terminus as in the protein of the present invention described above. Or it may be an ester (-COOR).
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。 Further, the partial peptides used in the present invention include those having a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus and N-terminal amino acid residues (eg, methionine), similarly to the aforementioned protein of the present invention. Residue), the amino group of which is protected by a protecting group, the glutamine residue formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is appropriate. Also included are those protected with a protecting group or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded.
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。たとえば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列において第1〜28番目、第99〜129番目、第180〜193番目、第246〜286番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:19で表されるアミノ酸配列において第1〜97番目、第169〜191番目、第254〜277番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。 部分 The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for preparing an antibody. For example, in order to prepare the antibody of the present invention described below, for example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 1st to 28th positions, the 99th to 129th positions, the 180th to 193rd positions, and the 246th to 286th positions And a peptide having the 1st to 97th amino acids, the 169th to 191st amino acids, and the 254th to 277th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。 As the salt of the protein or partial peptide of the present invention, salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used. Preferred acid addition salts are: Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。 The protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced from the above-mentioned method for purifying a protein from human or warm-blooded animal cells or tissues, or a transformant containing a DNA encoding the protein. Can also be produced by culturing. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。 市 販 For synthesis of the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. I do.
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N'−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBt,HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。 For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. Later it can be added to the resin.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N−ジメチルホルムアミド,N,N−ジメチルアセトアミド,N−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン,クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン,ジオキサン,テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル,プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル,酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 (4) The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole, so that the subsequent reaction is not affected.
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、t−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。 Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、t−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級(C1-6)アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基などである。 The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for the esterification include lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as an acetyl group, aroyl groups such as a benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、t−ブチルなどが用いられる。 As the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine, for example, Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。 @ As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール(例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBt)とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。 Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールなどのようなリガンド作動性カチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4 -Addition of a ligand operable cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。 保護 The protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド(タンパク質)鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。 As another method for obtaining an amide form of a protein or a partial peptide, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group has been removed, and these are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein or peptide.
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。 In order to obtain an ester of a protein or peptide, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or An ester of the peptide can be obtained.
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の(a)〜(e)に記載された方法が挙げられる。
(a)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(b)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(c)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(d)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(e)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
The partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the target peptide. it can. Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (a) to (e).
(A) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(B) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(C) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(D) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of
(E) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten After the reaction, conventional purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. Can be used to purify and isolate the partial peptide used in the present invention. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained as a salt, a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method.
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。 ポ リ The polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Preferably it is DNA. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA.
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅することもできる。 ベ ク タ ー The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
本発明のタンパク質をコードするDNAとしては、例えば(1)配列番号:2で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、(2)配列番号:15で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:15で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、(3)配列番号:20で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:20で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、(4)配列番号:27で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:27で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNAなどであれば何れのものでもよい。 The DNA encoding the protein of the present invention includes, for example, (1) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 hybridized under high stringent conditions. DNA encoding a protein having a soybean base sequence and having substantially the same properties as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) a base sequence represented by SEQ ID NO: 15 Or a protein having a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 under high stringent conditions, and substantially comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA encoding a protein having the same properties as described above, (3) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: A protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 0 and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (4) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27, or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27; Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by No. 19.
配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、より好ましくは約70%以上、特に好ましくは約80%以上、最も好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。 Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 27 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 50% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27. For example, DNA containing a base sequence having 90% or more homology is used.
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。 The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; filtering = ON; match score = 1; It can be calculated by mismatch score = -3).
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 Hybridization can be carried out according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。 High stringency conditions refer to, for example, conditions of a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
より具体的には、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:2または配列番号:15で表される塩基配列を含有するDNAが、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。 More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 15 is SEQ ID NO: As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 or the like is used.
本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。 DNA The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used.
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列を有するDNAの一部分を有するDNA、または配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。 Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include a DNA having a part of a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27; Alternatively, it contains a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 under high stringent conditions, and substantially differs from the protein of the present invention. For example, a DNA containing a part of a DNA encoding a protein having the same activity can be used.
配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。 DNA DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 has the same significance as described above.
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。 は The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
本発明のタンパク質、部分ペプチド(以下、これらをコードするDNAのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 As a means for cloning a DNA that completely encodes the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated to the protein of the present invention), Amplifying by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or incorporating a DNA incorporated in an appropriate vector into a DNA encoding a part or the whole region of the protein of the present invention. Selection can be performed by hybridization with fragments or those labeled with synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
DNAの塩基配列の変換は、PCRや公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM-K(宝酒造(株))等を用いて、ODA-LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。 The DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit such as Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) or Mutan ™ -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) using the ODA-LA PCR method or the like. It can be performed according to a known method such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
クローン化されたタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5'末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。 DNA The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、(イ)本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 The expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス,ワクシニアウイルス,バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられる。 Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 プ ロ モ ー タ ー The promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
これらのうち、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、SRαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。 の う ち Among them, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter or the like. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and when the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン(以下、SV40oriと略称する場合がある)などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、Neorと略称する場合がある、G418耐性)等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてdhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. As the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin resistant gene (Hereinafter, may be abbreviated as Neo r , G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in dhfr gene, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のN端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 (4) If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。 形 質 A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。 As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが用いられる。 Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology)]. Biology)], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. Is used.
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。 Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピキア パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用いられる。 Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R - , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, such as Pichia pastoris (Pichia pastoris) KM71 is Used.
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N 細胞;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ(In Vivo),13, 213-217,(1977))などが用いられる。 Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five ™ cell derived from egg of Trichoplusia ni And cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985)〕。 As the insect, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO細胞と略記),dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO(dhfr-)細胞と略記),マウスL細胞,マウスAtT−20,マウスミエローマ細胞,ラットGH3,ヒトFL細胞などが用いられる。 Examples of animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO cells), dhfr gene deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dhfr -) cell), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。 In order to transform Escherichia, for example, Procagings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 Transformation of Bacillus sp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),194巻,182−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。 For transforming yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。 Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール.263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。 {To transform animal cells, see, eg, Cell Engineering Separate Volume 8} New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
このようにして、タンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。 Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。 When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is used therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。 場合 When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。 場合 When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77巻,4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing a transformant in which the host is yeast, as a medium, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences of Science] Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the National. Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium(Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)) is added as a medium. What added the thing suitably is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration or stirring is added.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of the American Medical Association)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], a DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)]. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。 As described above, the protein of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells.
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。 分離 The protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX−100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。 When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 培養 The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Using differences in charge, methods using charge differences such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, and using differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。 When the thus obtained protein is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, by a known method or a method analogous thereto, It can be converted to a free form or other salts.
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。 The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein modifying enzyme. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。 The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。 The antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof.
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある)に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) using the protein of the present invention as an antigen, is a known antibody or It can be produced according to the method for producing antiserum.
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。 When preparing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、P3U1、SP2/0、AP−1などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくはPEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive substances or A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A; A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which globulin antibodies or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原(タンパク質抗原)自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as a hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
(B) Purification of monoclonal antibody Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger, (Eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific method of collecting only antibody by antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain antibody Purification Method].
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody.
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
Regarding the complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin and the like are used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 Various condensing agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なわれる。 (4) The condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody itself or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。 The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。 ポ リ Polyclonal antibody titer in antiserum can be measured in the same manner as in the above-described measurement of antibody titer in antiserum. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするDNA(以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのDNAを本発明のDNAと略記する場合がある)の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のDNAの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスDNAが好ましい。 Complementary or substantially complementary to the base sequence of DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention in the description of the antisense polynucleotide). The antisense polynucleotide having a complementary base sequence or a part thereof has a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof, and Any antisense polynucleotide may be used as long as it has an action of suppressing expression, but antisense DNA is preferable.
本発明のDNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のDNAに相補的な塩基配列(すなわち、本発明のDNAの相補鎖)の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のDNAの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。 The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, a base sequence near the start codon, etc.) is at least about 70% or more complementary to Antisense polynucleotides having preferably at least about 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% homology are suitable.
具体的には、配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表わされる塩基配列を有するDNAの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号:2、配列番号:15、配列番号:20または配列番号:27で表わされる塩基配列を有するDNAの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。 Specifically, a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 27, Or a base sequence complementary to a base sequence of a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27, preferably an antisense polynucleotide having a part thereof, Or an antisense polynucleotide having a part thereof.
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、10〜40個程度、好ましくは15〜30個程度の塩基から構成される。 Antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基(ホスフェート)は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。 In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA is replaced with, for example, a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate or phosphorodithionate. It may be substituted. These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド(核酸)を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするDNAの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド(核酸)は、本発明のタンパク質遺伝子のRNAとハイブリダイズすることができ、該RNAの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連RNAとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連RNAと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド(タンパク質)との間で「対応する」とは、ヌクレオチド(核酸)の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド(タンパク質)のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の5'端ヘアピンループ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the cloned or determined nucleotide sequence information of the DNA encoding the protein. And can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through the interaction with the protein-related RNA of the present invention. Thus, the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro to produce the protein gene of the present invention. It is useful for regulating and controlling the expression of, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term “corresponding” means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3 ' The terminal palindrome region and the 3'-end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as a target.
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー(例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー)または特殊な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。 関係 The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be that the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is “antisense”. Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or Other polymers having non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymer is a base such as found in DNA or RNA And nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, eg, those having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Those having side-chain groups such as syn, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc. and sugars (eg, monosaccharide), those having intercalating compounds (eg, acridine, psoralen) Containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids) Etc.). Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド(核酸)は、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 ア ン チ The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。 Many such modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレステロールなど)といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端あるいは5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端あるいは5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。 The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。 (4) The antisense nucleic acid inhibitory activity can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある)、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするDNA(以下、本発明のDNAと略記する場合がある)、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体(以下、本発明の抗体と略記する場合がある)、および本発明のDNAのアンチセンスポリヌクレオチド(以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある)の用途を説明する。 Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention) ), An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter, the antisense polynucleotide of the present invention). (May be abbreviated as nucleotide).
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を抑制することで、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤として使用することができる。 Pharmaceuticals containing a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, for example, inhibit the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.). Thus, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases ( Eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatic insufficiency such as pancreatitis, cystic fibrosis), respiratory diseases (Eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor) , Ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, rectal, pancreatic, thymoma, etc.) It can be used as a prophylactic / therapeutic agent.
一方、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を促進することで、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤として使用することができる。
〔1〕本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性などを有し、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送に寄与するとともに、胆汁酸代謝などに重要な役割を果たしている。
On the other hand, a medicament containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention can transport bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.). By promoting, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system Diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, pancreatic diseases (eg, pancreatic insufficiency such as pancreatitis, cystic fibrosis, etc.), respiratory System diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, Tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) Can be used as a prophylactic / therapeutic agent.
[1] Agent for Prevention / Treatment of Various Diseases Related to the Protein of the Present Invention The protein of the present invention has a transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.). It contributes to the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) and plays an important role in bile acid metabolism.
したがって、本発明のタンパク質をコードするDNAに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの種々の疾患が発症する。 Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, hyperlipidemia, digestive diseases (eg, Irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, integration Ataxia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disease (eg, pancreatitis, pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.) , Hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell) Lung cancer, prostate cancer, gastric cancer Bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, various diseases such as thymoma, etc.) to develop.
したがって、本発明のタンパク質および本発明のDNAは、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Therefore, the protein of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, Proctitis), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis, etc.) Pancreatic insufficiency, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (Eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectum cancer, pancreatic cancer, breast cancer Medicines such as prophylactic / therapeutic agents such as adenomas) To be able to use. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、(イ)本発明のDNAを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、(ロ)細胞に本発明のDNAを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または(ハ)本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。 For example, since the protein of the present invention is reduced or deficient in the living body, the transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) is sufficient, Alternatively, when there is a patient who does not normally exert, (a) administering the DNA of the present invention to the patient and expressing the protein of the present invention in vivo, (b) inserting the DNA of the present invention into cells, By expressing the protein of the present invention and then transplanting the cells into a patient, or (c) administering the protein of the present invention to the patient, the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently improved. Or normal.
本発明のDNAを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該DNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のDNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 When the DNA of the present invention is used as the above-described prophylactic / therapeutic agent, the DNA is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも90%、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上に精製されたものを使用するのが好ましい。 When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is preferable to use a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. preferable.
本発明のタンパク質等は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 The protein or the like of the present invention can be, for example, sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquids orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, if necessary coated with sugar. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the protein or the like of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. Can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例えば、エタノールなど)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート80TM、HCO−50など)などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。 Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol or the like), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol or the like), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50, or the like). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Also, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
本発明のDNAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。 ベ ク タ ー The vector into which the DNA of the present invention is inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して投与することができる。 The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus, for example, is useful for warm-blooded animals (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey). , Chimpanzees, etc.).
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、パーキンソン症候群の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該タンパク質等を約0.1mg〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、パーキンソン症候群の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔2〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
The dose of the protein or the like of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating Parkinson's syndrome, it is generally adult (body weight). 60 kg), the protein or the like is administered in an amount of about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, for the purpose of treating Parkinson's syndrome, the protein or the like of the present invention may be used in the form of an injection ( (As a body weight of 60 kg), the protein or the like is administered by intravenous injection of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[2] Screening of drug candidate compounds for disease The protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention.
本発明は、(1)本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性(例えば、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送など)を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。より具体的には、例えば、
(2)(i)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性と(ii)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性の比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
The present invention provides (1) the activity of the protein of the present invention characterized by using the protein of the present invention (eg, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.)) The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as an accelerator or an inhibitor, respectively) that promotes or inhibits transport or the like. More specifically, for example,
(2) (i) transport activity of cells capable of producing the protein of the present invention such as bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, and neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) and (ii) the present invention It is characterized by comparing the transport activity of a mixture of cells having the ability to produce the protein of the invention with a test compound, such as bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, and neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.). And a method for screening for an accelerator or an inhibitor.
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(i)と(ii)の場合において、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を、放射標識した基質もしくは蛍光色素で測定し、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送を指標として比較することを特徴とするものである。 Specifically, in the above screening method, for example, in cases (i) and (ii), transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) Is measured with a radiolabeled substrate or a fluorescent dye, and compared using the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) as an index. It is.
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、pH約4〜10(望ましくは、pH約6〜8)のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 実 施 In order to carry out the above screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer includes a bile acid, a steroid hormone, a fat-soluble vitamin, a neurotransmitter (eg, a bile acid) of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). Any buffer that does not inhibit the transport activity, such as dopamine, glutamic acid, enkephalin and the like, may be used.
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 細胞 As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
本発明のタンパク質の胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性は、公知の方法、例えば、Am. J. Physiol.、274巻、G157-169頁、1998年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。 The transport activity of the protein of the present invention such as bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, and neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) can be determined by known methods, for example, Am. J. Physiol. It can be measured according to the method described on page G157-169, 1998 or a method analogous thereto.
例えば、上記(ii)の場合における胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 For example, the activity of transporting bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) in the case of the above (ii) is about 20 times that of the above (i). A test compound that promotes the activity of the protein of the present invention or a salt thereof can be selected as a test compound that promotes the activity of the protein of the present invention by at least 30%, preferably at least 30%, more preferably at least about 50%.
また、例えば、上記(ii)の場合における胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害(または抑制)する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 Also, for example, the transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) in the case of the above (ii) is compared with the case of the above (i). A test compound that inhibits (or suppresses) about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof.
また、本発明のタンパク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を探索することによって本発明のタンパク質の発現を促進または抑制(すなわち、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害)する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。 In addition, a gene such as secretory alkaline phosphatase or luciferase is inserted downstream of the promoter of the protein gene of the present invention, expressed in the above-described various cells, and activated to activate the enzyme activity when the test compound is brought into contact with the cells. By searching for an inhibitory compound or a salt thereof, a compound or a salt thereof that promotes or suppresses the expression of the protein of the present invention (that is, promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention) can be screened.
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。 (4) The polynucleotide encoding the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
本発明は、(3)本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
(4)(iii)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と(iv)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
The present invention relates to (3) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention, which is characterized by using a polynucleotide encoding the protein of the present invention (hereinafter referred to as a promoter and an inhibitor, respectively). May be provided), more specifically, for example,
(4) A comparison is made between (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (iv) culturing a mixture of cells capable of producing the protein of the present invention and a test compound. A method for screening for an accelerator or an inhibitor is provided.
上記スクリーニング方法においては、例えば、(iii)と(iv)の場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量(具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするmRNA量)を測定して、比較する。 In the above-mentioned screening method, for example, in the cases (iii) and (iv), the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) is measured. And compare.
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、pH約4〜10(望ましくは、pH約6〜8)のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 実 施 In order to carry out the above screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 細胞 As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。 The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured according to the method.
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription-polymerase chain reaction(RT−PCR)、リアルタイムPCR解析システム(ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction)などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。 The expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, a method such as Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), a real-time PCR analysis system (manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reaction) or the like. It can be measured according to a corresponding method.
例えば、上記(iv)の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 For example, a test that promotes the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). The compound can be selected as a compound that promotes the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
例えば、上記(iv)の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 For example, a test that inhibits the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). The compound can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。 Furthermore, the antibody of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention.
本発明は、(5)本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
(6)(v)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と(vi)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
The present invention relates to (5) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention, which is characterized by using the antibody of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a promoter or an inhibitor, respectively). Provide a screening method, more specifically, for example,
(6) A comparison is made between (v) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (vi) culturing a mixture of cells capable of producing the protein of the present invention and a test compound. A method for screening for an accelerator or an inhibitor is provided.
上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて(v)と(vi)の場合における、本発明のタンパク質の発現量(具体的には、本発明のタンパク質量)を測定(例、本発明の蛋白質の発現を検出、本発明の蛋白質の発現量を定量等)して、比較する。 In the above screening method, for example, the expression level of the protein of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention) in the cases (v) and (vi) is measured using the antibody of the present invention (for example, The expression of the protein of the present invention is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, and the like, and compared.
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、pH約4〜10(望ましくは、pH約6〜8)のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 実 施 In order to carry out the above screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the expression of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 細胞 As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。 The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured according to the method.
例えば、上記(vi)の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 For example, a test compound which promotes the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (v) Can be selected as a compound or its salt that promotes the expression of the protein of the present invention.
例えば、上記(vi)の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 For example, a test compound that inhibits the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (v) Can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein of the present invention or a salt thereof.
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。 ス ク リ ー ニ ン グ The screening kit of the present invention contains a protein or a partial peptide of the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide of the present invention.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性(例、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性など)を促進または阻害する化合物またはその塩である。 Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention are test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts. , A compound selected from animal tissue extract, plasma and the like, or a salt thereof, and the activity of the protein of the present invention (eg, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) Or a salt thereof which promotes or inhibits the transport activity such as
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。 塩 As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Compounds or salts thereof which promote the activity of the protein of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic Ulcers, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis) Pancreatic insufficiency, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.) , Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer , Thymoma, etc.) As useful. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
また、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Further, the compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, pancreatic cystic) Pancreatic insufficiency such as fibrosis, respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis) ), Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, Pancreatic cancer, thymoma, etc.) It is useful as a pharmaceutical. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Compounds or salts thereof that promote the expression of the protein gene of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, digestion, Ulcers, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis) Pancreatic insufficiency such as dysfunction), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, circulatory disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.) ), Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreas) Cancer, thymoma, etc.) It is useful as a pharmaceutical. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
また、本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Further, the compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis) , Peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, pancreatic diseases (eg, pancreatitis, pancreatic cyst) Pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis, respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, artery Sclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) , Pancreatic cancer, thymoma, etc.) Agents are useful as pharmaceuticals such as. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Compounds or salts thereof that promote the expression of the protein of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic Ulcers, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis) Pancreatic insufficiency, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.) , Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer , Thymoma, etc.) As useful. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
また、本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Further, the compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, digestive diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, pancreatic cystic) Pancreatic insufficiency such as fibrosis, respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis) ), Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, Pancreatic cancer, thymoma, etc.) It is useful as a pharmaceutical. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。 化合物 When the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered orally or parenterally.
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、パーキンソン症候群治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該化合物またはその塩を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、パーキンソン症候群治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔3〕本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, and the like.For example, a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Parkinson's syndrome is used. In the case of oral administration, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg per day. Administer 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, a compound or a compound that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Parkinson's syndrome or When the salt is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. Advantageously, 1 to 10 mg is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[3] Quantification of the protein of the present invention, its partial peptide or its salt Since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, the quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly It can be used for quantification by sandwich immunoassay and the like.
すなわち、本発明は、
(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody; And (ii) simultaneously or sequentially reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on a carrier and another antibody of the present invention labeled on a carrier. The present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after the reaction.
上記(ii)の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のC端部に反応する抗体であることが望ましい。 In the quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体(以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある)を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2 、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。 In addition, the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、タンパク質量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of the protein) in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。 As a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the above-mentioned enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。 (4) For the insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。 は In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes, for example, the N-terminal other than the C-terminal is used.
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 モ ノ ク ロ ー ナ ル The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. A solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。 ネ In nephelometry, the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。 適用 In applying each of these immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations and the like need to be set. The protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。 For example, "Radioimmunoassay" edited by Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1974), "Radioimmunoassay" continued (edited by Kodansha, published in 1979), and "Enzyme immunoassay" edited by Eiji Ishikawa (Medical Shoin, Showa) Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). Academic Press Company)).
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。 As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などが発症している可能性が高いと診断することができる。反対に、例えば、本発明のタンパク質の濃度の上昇が検出された場合、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などが発症している可能性が高いと診断することが出来る。 Furthermore, when a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, hypersensitivity) Inflammatory bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia) ), Diabetes, pancreatic disease (eg, pancreatitis, pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), thyroid gland Functional decline, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, Prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, uterus Part cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) can be diagnosed as likely to be developed. Conversely, for example, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, Gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, pancreas) Pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis, respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, Arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectum Cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) It can be diagnosed with a high sex.
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
〔4〕遺伝子診断剤
本発明のDNAは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異常(遺伝子異常)を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
[4] Gene diagnostic agent The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog) , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or partial peptides thereof, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, It is useful as an agent for diagnosing a gene such as an increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
本発明のDNAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874〜879頁(1989年)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America),第86巻,2766〜2770頁(1989年))などにより実施することができる。 The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processings of the -Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)).
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が検出された場合、例えば高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などである可能性が高いと診断することが出来る。反対に、発現低下が検出された場合やPCR−SSCP法によりDNAの突然変異が検出された場合は、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などである可能性が高いと診断することができる。
〔5〕アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のDNAに相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のDNAの活性や機能(例、胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質(例、ドーパミン、グルタミン酸、エンケファリンなど)などの輸送活性)を抑制することができるので、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などとして使用することができる。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。
For example, when increased expression is detected by Northern hybridization, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, Proctitis), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis, etc.) Pancreatic insufficiency, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (Eg, testicular, ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, rectal, pancreatic, breast Adenoma) It can be diagnosed as high. Conversely, when a decrease in the expression is detected or a mutation in the DNA is detected by the PCR-SSCP method, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, Pancreatic disease (eg, pancreatitis, pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, Heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, uterus) Cervical, colon, rectal, pancreatic, breast It can be diagnosed that it is highly likely that in such tumors, etc.).
[5] Pharmaceuticals Containing Antisense Polynucleotide The antisense polynucleotide of the present invention, which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA, has low toxicity and exhibits the present invention in vivo. Activity or function (eg, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, transport activities of neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.), etc.) can be suppressed, For example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease) Disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disease (eg, pancreatitis, cystic fibrosis, etc.) Pancreatic insufficiency, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (Eg, testicular, ovarian, breast, esophageal, lung, kidney, liver, non-small cell lung, prostate, gastric, bladder, cervical, colon, rectal, pancreatic, breast Adenoma, etc.). Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。 When the antisense polynucleotide is used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a known method.
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 For example, when the antisense polynucleotide is used, the antisense polynucleotide is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then inserted into a human or mammal according to a conventional method. It can be administered orally or parenterally to animals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). The antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、パーキンソン症候群の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを患部に投与する場合、一般的に成人(体重60kg)においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約0.1〜100mg投与する。 The dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered to an affected part for the purpose of treating Parkinson's syndrome, a general method is used. In adults (weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のDNAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 Furthermore, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and its expression status.
さらに、本発明は、
(i)本発明のタンパク質をコードするRNAの一部とそれに相補的なRNAを含有する二重鎖RNA、
(ii)前記二重鎖RNAを含有してなる医薬、
(iii)本発明のタンパク質をコードするRNAの一部を含有するリボザイム、
(iv)前記リボザイムを含有してなる医薬、
(v)前記リボザイムをコードする遺伝子(DNA)を含有する発現ベクターなども提供する。
Further, the present invention provides
(I) a double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention and RNA complementary thereto,
(Ii) a medicine comprising the double-stranded RNA,
(Iii) a ribozyme containing a part of RNA encoding the protein of the present invention,
(Iv) a medicament comprising the ribozyme,
(V) An expression vector or the like containing a gene (DNA) encoding the ribozyme is also provided.
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖RNA、リボザイムなども、本発明のDNAから転写されるRNAを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質または本発明で用いられるDNAの機能を抑制することができるので、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などとして使用することができる。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Like the above-mentioned antisense polynucleotide, double-stranded RNA, ribozyme and the like can also destroy RNA transcribed from the DNA of the present invention or suppress the function thereof, and can be used in vivo for the protein of the present invention or the ribozyme. Since the function of the DNA used can be suppressed, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, Proctitis), central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disorders (eg, pancreatitis, cystic fibrosis, etc.) Pancreatic insufficiency, etc., respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, Pulse sclerosis), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectum Cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.). Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
二重鎖RNAは、公知の方法(例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 A double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
リボザイムは、公知の方法(例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードするRNAの一部に置換することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするRNAの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列NUX(式中、Nはすべての塩基を、XはG以外の塩基を示す)の近傍の配列などが挙げられる。 A ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by substituting a part of a known ribozyme sequence with a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a sequence in the vicinity of a consensus sequence NUX (where N represents all bases and X represents a base other than G) which can be cleaved by a known ribozyme, and the like are included. No.
上記の二重鎖RNAまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記(v)の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
〔6〕本発明のDNAを有する動物の作出
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするDNA(以下、本発明の外来性DNAと略記する)またはその変異DNA(本発明の外来性変異DNAと略記する場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide. The expression vector (v) is used in the same manner as known gene therapy methods and the like, and is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent.
[6] Production of Animal Having DNA of the Present Invention The present invention relates to a DNA encoding the foreign protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the foreign DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the foreign DNA of the present invention). (May be abbreviated as mutant DNA).
すなわち、本発明は、
(1)本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記(1)記載の動物、
(3)ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記(2)記載の動物、および
(4)本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) The animal according to (1) above, wherein the non-human mammal is a rodent.
(3) The animal according to the above (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and (4) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. I do.
本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物(以下、本発明のDNA導入動物と略記する)は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に8細胞期以前)に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法などにより目的とするDNAを導入することによって作出することができる。また、該DNA導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性DNAを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のDNA導入動物を作出することもできる。 Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by introducing a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. Further, by the DNA introduction method, the exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transfected animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a known cell fusion method.
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス(例えば、純系として、C57BL/6系統,DBA2系統など、交雑系として、B6C3F1系統,BDF1系統,B6D2F1系統,BALB/c系統,ICR系統など)またはラット(例えば、Wistar,SDなど)などが好ましい。 As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As a system, one B6C3F system, one BDF system, one B6D2F system, a BALB / c system, an ICR system, or a rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferable.
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 「As the“ mammal ”in the recombinant vector that can be expressed in mammals, humans and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
本発明の外来性DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のDNAではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のDNAをいう。 外 The exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
本発明の変異DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異(例えば、突然変異など)が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたDNAなどが用いられ、また、異常DNAも含まれる。 As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA or the like is used, and also includes abnormal DNA.
該異常DNAとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるDNAを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるDNAなどが用いられる。 異常 The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of a normal protein of the present invention is used.
本発明の外来性DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のDNAを対象動物に導入するにあたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDNAを導入する場合、これと相同性が高い本発明のDNAを有する各種哺乳動物(例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト(例、ベクターなど)を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のDNAを高発現するDNA導入哺乳動物を作出することができる。 (4) The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same species or different species from the target animal. When introducing the DNA of the present invention into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is introduced, DNAs derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto are expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-introduced mammals can be created.
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。 Examples of the expression vector of the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
上記のDNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、(i)ウイルス(例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど)に由来するDNAのプロモーター、(ii)各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP依存タンパク質キナーゼβIサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ(一般にTie2と略される)、ナトリウムカリウムアデノシン3リン酸化酵素(Na,K−ATPase)、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、MHCクラスI抗原(H−2L)、H−ras、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、ポリペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Thy−1、免疫グロブリン、H鎖可変部(VNP)、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンC、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンA、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。 Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, for example, (i) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophy Fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β Actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle Actin, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a promoter of human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), human and chicken β-actin promoters, and the like are preferable.
上記ベクターは、DNA導入哺乳動物において目的とするmRNAの転写を終結する配列(一般にターミネターと呼ばれる)を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネターなどが用いられる。 The above vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target mRNA in a DNA-transfected mammal (generally called a terminator). For example, a sequence of each DNA derived from a virus and from various mammals is used. Preferably, a simian virus SV40 terminator or the like is used.
その他、目的とする外来性DNAをさらに高発現させる目的で各DNAのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核DNAのイントロンの一部などをプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流 に連結することも目的により可能である。 In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible depending on the purpose to connect to the 3 ′ downstream の.
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物(例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来DNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーよりゲノムDNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来RNAより公知の方法により調製された相補DNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。 The normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. From a variety of genomic DNA libraries, or as a starting material, a complementary DNA prepared by known methods from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal polypeptide obtained from the above-mentioned cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
該翻訳領域は導入動物において発現しうるDNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のDNA工学的手法により作製することができる。 翻 訳 The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in an introduced animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated to the downstream of the aforementioned promoter and, if desired, to the upstream of the transcription termination site.
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。DNA導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを有する。 導入 Introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA means that all progeny of the produced animal will retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
本発明の外来性正常DNAを導入した非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して、該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。 非 The non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating.
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。DNA導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。 導入 The introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。 (4) A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all the offspring can be bred to have the DNA in excess.
本発明の正常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常DNA導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level and promotes the function of the endogenous normal DNA to eventually cause hyperactivity of the protein of the present invention. Occasionally, it can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transfected animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
また、本発明の外来性正常DNAを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。 Further, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. .
一方、本発明の外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのDNAコンストラク卜は、通常のDNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常DNAの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを有するように繁殖継代することができる。 On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the desired foreign DNA can be used as a raw material by incorporating it into the aforementioned plasmid. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. Introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
本発明の異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常DNA導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。 The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of endogenous normal DNA, and finally, the functionally inactive form of the protein of the present invention. It can be refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, by using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害(dominant negative作用)を解明するモデルとなる。 Also, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can inhibit the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) by the abnormal protein of the present invention in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. A model to elucidate.
また、本発明の外来異常DNAを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質またはその機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。 In addition, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease thereof. It is.
また、上記2種類の本発明のDNA導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
(i)組織培養のための細胞源としての使用、
(ii)本発明のDNA導入動物の組織中のDNAもしくはRNAを直接分析する、またはDNAにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
(iii)DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv)上記(iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
(v)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
In addition, other possible uses of the two kinds of the DNA-introduced animals of the present invention include, for example,
(I) use as a cell source for tissue culture,
(Ii) a protein specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transfected animal of the present invention, or analyzing a polypeptide tissue expressed by the DNA; Analysis of the relationship with
(Iii) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
(Iv) Screening of a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (iii) above, and (v) Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
さらに、本発明のDNA導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。 Furthermore, using the DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to examine the clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including the inactive refractory disease of the protein of the present invention, etc. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
また、本発明のDNA導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したDNA導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。 In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-introduced animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain the released DNA-introduced cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to examine the specificity of the protein-producing cell of the present invention, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism, and its abnormalities. It is an effective research material for
さらに、本発明のDNA導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のDNA導入動物または本発明の外来性DNA発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のDNA治療法を検討、開発することが可能である。
〔7〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory type of the protein of the present invention, using the DNA-transfected animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using a method or the like. In addition, using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the protein of the present invention.
[7] Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
すなわち、本発明は、
(1)本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化された上記(1)記載の胚幹細胞、
(3)ネオマイシン耐性である上記(1)記載の胚幹細胞、
(4)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記(1)記載の胚幹細胞、
(5)ゲッ歯動物がマウスである上記(4)記載の胚幹細胞、
(6)本発明のDNAが不活性化された該DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記(6)記載の非ヒト哺乳動物、
(8)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記(6)記載の非ヒト哺乳動物、
(9)ゲッ歯動物がマウスである上記(8)記載の非ヒト哺乳動物、および
(10)上記(7)記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli).
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin-resistant,
(4) the embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
(7) The above (6), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. The non-human mammal of the description,
(8) the non-human mammal according to the above (6), wherein the non-human mammal is a rodent;
(9) A test compound is administered to the non-human mammal according to (8), wherein the rodent is a mouse, and (10) the animal according to (7), and the expression of the reporter gene is detected. And a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAに人為的に変異を加えることにより、DNAの発現能を抑制するか、あるいは該DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、DNAが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない(以下、本発明のノックアウトDNAと称することがある)非ヒト哺乳動物の胚幹細胞(以下、ES細胞と略記する)をいう。 A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。 As the non-human mammal, the same one as described above is used.
本発明のDNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該DNA配列の一部又は全部の削除、他DNAを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよい。 方法 The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by genetic engineering techniques. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞(以下、本発明のDNA不活性化ES細胞または本発明のノックアウトES細胞と略記する)の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはlacZ(β−ガラクトシダーゼ遺伝子)、cat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子)を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるDNA配列(例えば、polyA付加シグナルなど)を挿入し、完全なmRNAを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したDNA配列を有するDNA鎖(以下、ターゲッティングベクターと略記する)を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたES細胞について本発明のDNA上あるいはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のDNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列をプライマーとしたPCR法により解析し、本発明のノックアウトES細胞を選別することにより得ることができる。 Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); By making it impossible to synthesize complete mRNA As a result, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells are used in the present invention. Analysis by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or in the vicinity of the DNA as a probe, or PCR using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers However, it can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
また、相同組換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのES細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)を用いて樹立したものなども良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。 As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufman method. May be newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. for example the purpose of acquiring the obvious ES cells, the BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 for the egg collection number of lack of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 were improved by crossing with DBA / 2 Those established using F 1 ) can also be used favorably. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing.
また、ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。 In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
また、雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その1例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数(約50個)で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。 As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 6 cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
また、第二次セレクションとしては、例えば、G−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞(例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングすることが望ましい。 {Circle around (2)} The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(1〜10000U/ml)存在下に炭酸ガス培養器内(好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気)で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液(通常0.001〜0.5%トリプシン/0.1〜5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。 胚 The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but must be subcultured carefully since it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。 ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin} Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. The DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful in in vitro cell biology studies of the proteins of the present invention.
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のmRNA量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。 The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。 非 As the non-human mammal, the same one as described above is used.
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウトさせることができる。 The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
本発明のDNAがノックアウトされた細胞は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCR法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。 When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でDNA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のDNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。 In the case of using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
このようにして本発明のDNAがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。 (4) In the individual knocked out of the DNA of the present invention in this way, animal individuals obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can be reared in a normal rearing environment.
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体1,ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。 生殖 Furthermore, the acquisition and maintenance of the germ line may be performed in accordance with ordinary methods. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。 非 The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
〔7a〕本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防・治療効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防・治療効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
In addition, since the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[7a] A method for screening for a compound having a preventive / therapeutic effect on diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be deficient or damaged by the DNA of the present invention. Can be used for screening for compounds that have a prophylactic / therapeutic effect on diseases caused by.
すなわち、本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防・治療効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound having a prophylactic or therapeutic effect on a disease or a salt thereof.
該スクリーニング方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。 DNA The non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method includes the same ones as described above.
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
具体的には、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の予防・治療効果を試験することができる。 Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The prophylactic and therapeutic effects of the compounds can be tested.
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。 (4) As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
例えば、パーキンソン症候群に対して治療効果を有する化合物のスクリーニングをする場合、本発明のタンパク質をコードするDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の脳内におけるドーパミンおよびその代謝物量の測定、黒質内の神経細胞の数または変性の観察、該動物の運動量の測定または行動パターンなどの解析を行う。 For example, when screening for a compound having a therapeutic effect on Parkinson's syndrome, a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of DNA encoding the protein of the present invention, and the amount of dopamine and its metabolite in the brain of the animal is administered. Of the animal, observation of the number or degeneration of nerve cells in the substantia nigra, measurement of the amount of movement of the animal, or analysis of the behavior pattern.
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a prophylactic / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic drug such as a prophylactic / therapeutic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸など)や塩基(例、アルカリ金属など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など)との塩などが用いられる。 The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 医 薬 A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, human or other mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) ) Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群の患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔7b〕本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, it is generally used in an adult (assuming a body weight of 60 kg) patient with Parkinson's syndrome. Administers about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) of a patient with Parkinson's syndrome. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[7b] A method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention The present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention.
上記スクリーニング方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。 In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。 (4) Examples of the test compound include the same compounds as described above.
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。 As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
本発明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。 In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
例えば、本発明のタンパク質をコードするDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトピラノシド(X−gal)のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄後、X−galを含む染色液で、室温または37℃付近で、約30分ないし1時間反応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、lacZをコードするmRNAを検出してもよい。 For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the tissue that expresses the protein of the present invention should be used instead of the protein of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). Of the protein in an animal body can be observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM @ EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。 The compound or its salt obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸など)や塩基(例、有機酸など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など)との塩などが用いられる。 The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may include a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) and a base (eg, an organic acid). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Since the compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, Irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, integration Ataxia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic diseases (eg, pancreatitis, pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma) , Hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell) Lung cancer, prostate Cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) are useful as pharmaceuticals such as prophylactic and therapeutic agents such as. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
また、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば高脂血症、消化器疾患(例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎など)、中枢神経系疾患(例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、うつ病、感情障害、統合失調症、不安神経症など)、糖尿病、膵臓疾患(例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など)、呼吸器系疾患(例、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息など)、甲状腺機能低下、循環器疾患(例、心不全、不整脈、QT延長症候群、動脈硬化など)、癌(例、精巣腫瘍、卵巣癌、乳癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など)などの予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは中枢神経系疾患などの予防・治療剤、特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防・治療剤である。 Further, the compound or its salt that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein. E.g., irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (e.g., Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, Schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, pancreatic disease (eg, pancreatitis, pancreatic insufficiency such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.) ), Hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small) Cell lung cancer, Tatsusengan, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, thymoma, etc.) are useful as pharmaceuticals such as prophylactic and therapeutic agents such as. Preferably, it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like.
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。 医 薬 A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, human or other mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) ) Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the disease to be treated, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is orally administered, generally the adult (body weight) is used. In a patient with Parkinson's syndrome (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to a Parkinson's syndrome patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is injected intravenously. It is convenient to administer by In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
一方、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)のパーキンソン症候群患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。 On the other hand, for example, when a compound of the present invention that inhibits promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) Parkinson's syndrome patient, about 0.1 to 100 mg of the compound per day is used. Preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to a Parkinson's syndrome patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is injected intravenously. It is convenient to administer by In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
このように、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のDNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。 As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by it or to develop preventive and therapeutic drugs.
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するDNAを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物(遺伝子導入動物)を作出すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。 Further, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). Once produced, the polypeptide can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion, and a cell line that expresses the reporter gene is established, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein itself of the present invention in the body. Can be used as a search system.
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。 塩 基 In the present specification and the drawings, the abbreviations for bases, amino acids and the like are based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in this field, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu:ピログルタミン酸
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threin Crythine : Methionine Glu: Glutamate Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg : Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid The substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols. write.
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
Tos :p−トルエンスルフォニル
CHO :ホルミル
Bzl :ベンジル
Cl2-Bzl :2,6−ジクロロベンジル
Bom :ベンジルオキシメチル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc :t−ブトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェニル
Trt :トリチル
Bum :t−ブトキシメチル
Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−
1,2,3−ベンゾトリアジン
HONB :1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC :N,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕
実施例1で取得したヒトTCH162タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するヒトTCH162タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕
実施例1で用いられたプライマーA3の塩基配列を示す。
〔配列番号:4〕
実施例1で用いられたプライマーB3の塩基配列を示す。
〔配列番号:5〕
実施例1で用いられたプライマーSP6の塩基配列を示す。
〔配列番号:6〕
実施例1で用いられたプライマーT7の塩基配列を示す。
〔配列番号:7〕
実施例1で用いられたプライマーF1の塩基配列を示す。
〔配列番号:8〕
実施例1で用いられたプライマーF2の塩基配列を示す。
〔配列番号:9〕
実施例1で用いられたプライマーF3の塩基配列を示す。
〔配列番号:10〕
実施例1で用いられたプライマーR1の塩基配列を示す。
〔配列番号:11〕
実施例1で用いられたプライマーR2の塩基配列を示す。
〔配列番号:12〕
実施例1で用いられたプライマーR3の塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
実施例1で用いられたプライマーA2の塩基配列を示す。
〔配列番号:14〕
実施例1で用いられたプライマーB2の塩基配列を示す。
〔配列番号:15〕
実施例1で取得したヒトTCH162全長遺伝子を含むcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:16〕
実施例2で用いられたプライマーTF2の塩基配列を示す。
〔配列番号:17〕
実施例2で用いられたプライマーTR2の塩基配列を示す。
〔配列番号:18〕
実施例2で用いられたTaqManプローブT2の塩基配列を示す。
〔配列番号:19〕
実施例3で取得したマウスTCH162タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:20〕
配列番号:19で表されるアミノ酸配列を有するマウスTCH162タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:21〕
実施例3で用いられたプライマーmA3の塩基配列を示す。
〔配列番号:22〕
実施例3で用いられたプライマーmB3の塩基配列を示す。
〔配列番号:23〕
実施例3で用いられたプライマーmA1の塩基配列を示す。
〔配列番号:24〕
実施例3で用いられたプライマーmB1の塩基配列を示す。
〔配列番号:25〕
実施例3で用いられたプライマーmTFの塩基配列を示す。
〔配列番号:26〕
実施例3で用いられたプライマーmTRの塩基配列を示す。
〔配列番号:27〕
実施例3で取得したマウスTCH162全長遺伝子を含むcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:28〕
実施例4で用いられたTaqManプローブmT1の塩基配列を示す。
〔配列番号:29〕
実施例6で用いられたプライマーOFの塩基配列を示す。
〔配列番号:30〕
実施例6で用いられたプライマーORの塩基配列を示す。
〔配列番号:31〕
実施例6で用いられたプライマーBGH RVの塩基配列を示す。
〔配列番号:32〕
実施例8で用いられたプライマーTFの塩基配列を示す。
〔配列番号:33〕
実施例8で用いられたプライマーTRの塩基配列を示す。
〔配列番号:34〕
実施例8で用いられたTaqManプローブT1の塩基配列を示す。
Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine -4 (R) - carboxamide group Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitrophenyl Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc : N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBT: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences. .
[SEQ ID NO: 1]
1 shows the amino acid sequence of human TCH162 protein obtained in Example 1.
[SEQ ID NO: 2]
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human TCH162 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3]
2 shows the base sequence of primer A3 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 4]
2 shows the base sequence of primer B3 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 5]
2 shows the nucleotide sequence of primer SP6 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 6]
2 shows the nucleotide sequence of primer T7 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 7]
2 shows the nucleotide sequence of primer F1 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 8]
2 shows the base sequence of primer F2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 9]
2 shows the base sequence of primer F3 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 10]
2 shows the base sequence of primer R1 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 11]
3 shows the base sequence of primer R2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 12]
2 shows the base sequence of primer R3 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 13]
2 shows the base sequence of primer A2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 14]
2 shows the base sequence of primer B2 used in Example 1.
[SEQ ID NO: 15]
1 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length human TCH162 gene obtained in Example 1.
[SEQ ID NO: 16]
3 shows the base sequence of primer TF2 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 17]
3 shows the base sequence of primer TR2 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 18]
4 shows the base sequence of TaqMan probe T2 used in Example 2.
[SEQ ID NO: 19]
4 shows the amino acid sequence of mouse TCH162 protein obtained in Example 3.
[SEQ ID NO: 20]
This shows the nucleotide sequence of DNA encoding the mouse TCH162 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
[SEQ ID NO: 21]
3 shows the nucleotide sequence of primer mA3 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 22]
3 shows the nucleotide sequence of primer mB3 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 23]
3 shows the nucleotide sequence of primer mA1 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 24]
3 shows the base sequence of primer mB1 used in Example 3.
[SEQ ID NO: 25]
3 shows the nucleotide sequence of primer mTF used in Example 3.
[SEQ ID NO: 26]
3 shows the nucleotide sequence of primer mTR used in Example 3.
[SEQ ID NO: 27]
3 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length mouse TCH162 gene obtained in Example 3.
[SEQ ID NO: 28]
7 shows the base sequence of TaqMan probe mT1 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 29]
14 shows the base sequence of primer OF used in Example 6.
[SEQ ID NO: 30]
14 shows the base sequence of primer OR used in Example 6.
[SEQ ID NO: 31]
14 shows the base sequence of primer BGH RV used in Example 6.
[SEQ ID NO: 32]
14 shows the nucleotide sequence of primer TF used in Example 8.
[SEQ ID NO: 33]
14 shows the base sequence of primer TR used in Example 8.
[SEQ ID NO: 34]
14 shows the base sequence of TaqMan probe T1 used in Example 8.
後述の実施例1で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/pCR-BluntII-TCH162は、2003年7月24日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8434として寄託されている。 The transformant Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-TCH162 obtained in Example 1 described below was obtained from July 24, 2003 at 1-1-1, Higashi 1-chome, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566), Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8434.
後述の実施例3で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/pCR-BluntII-mTCH162は、2003年7月24日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8435として寄託されている。 The transformant Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-mTCH162 obtained in Example 3 described below was obtained from July 24, 2003 at 1-1-1, Higashi 1-chome, Chuo No. 6 (zip code 305-8566), Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8435.
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モリキュラークローニング(molecular cloning, 2nd,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press,1989年)に記載されている方法に従った。
実施例1
ヒトTCH162遺伝子cDNAのクローニング
2種のプライマーDNA、プライマーA3(配列番号:3)およびプライマーB3(配列番号:4)を用いて、ヒト脳cDNA library(宝酒造社製)、およびヒト小腸cDNA library(宝酒造社製)に対してPyrobest DNA Polymerase(宝酒造社製)により以下の条件(1)〜(3)でPCRを行った。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. The gene manipulation using Escherichia coli, Mori Cloning (molecular cloning, 2 nd, J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 years) according to the method described in.
Example 1
Cloning of human TCH162 gene cDNA Using two types of primer DNAs, primer A3 (SEQ ID NO: 3) and primer B3 (SEQ ID NO: 4), a human brain cDNA library (Takara Shuzo) and a human small intestinal cDNA library (Takara Shuzo) Was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) under the following conditions (1) to (3).
(1)94℃2分間
(2)98℃10秒間-68℃30秒間-72℃3分間を30サイクル
(3)72℃10分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、1.5kbpのバンドを切り出し、Zero Blunt TOPO PCR cloning kit(インビトロジェン社製)を用いてクローニングした。脳および小腸の各cDNA libraryに由来するクローンを1クローンずつ合わせて2クローンを得た。これをプライマーDNA〔プライマーSP6(配列番号:5)、プライマーT7(配列番号:6)、プライマーF1(配列番号:7)、プライマーF2(配列番号:8)、プライマーF3(配列番号:9)、プライマーR1(配列番号:10)、プライマーR2(配列番号:11)、プライマーR3(配列番号:12)、プライマーA2(配列番号:13)、プライマーB2(配列番号:14)〕およびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて反応を行い、挿入されているcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて決定した。その結果、取得した2クローンは同一のDNA断片を含んでおり、1538個の塩基配列を有していた(配列番号:15)。このcDNA断片には437個のアミノ酸配列(配列番号:1)がコードされており(配列番号:2)、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をヒトTCH162タンパク質と命名した。
(1) 94 ° C for 2 minutes (2) 98 ° C for 10 seconds -68 ° C for 30 seconds -72 ° C for 3 minutes for 30 cycles (3) 72 ° C for 10 minutes After gel electrophoresis of the obtained amplification product, a 1.5 kbp band was The DNA was excised and cloned using Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (manufactured by Invitrogen). Clones derived from cDNA libraries of the brain and small intestine were combined one by one to obtain two clones. This was used as a primer DNA [primer SP6 (SEQ ID NO: 5), primer T7 (SEQ ID NO: 6), primer F1 (SEQ ID NO: 7), primer F2 (SEQ ID NO: 8), primer F3 (SEQ ID NO: 9), Primer R1 (SEQ ID NO: 10), Primer R2 (SEQ ID NO: 11), Primer R3 (SEQ ID NO: 12), Primer A2 (SEQ ID NO: 13), Primer B2 (SEQ ID NO: 14)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing The reaction was carried out using Kit (Applied Biosystems), and the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems). As a result, the obtained two clones contained the same DNA fragment and had a base sequence of 1538 (SEQ ID NO: 15). This cDNA fragment encodes a 437 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2), and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was named human TCH162 protein.
上記cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)TOP10/pCR-BluntII-TCH162と命名した。 形 質 A transformant having the plasmid containing the above-mentioned cDNA fragment was named Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-TCH162.
Blast P〔ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucleic Acids Res.)第25巻、3389頁、1997年〕を用いてowlに対してホモロジー検索を行ったところ、ヒトTCH162は、ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターファミリーに属する遺伝子であることが判明した(図1)。ヒトTCH162は、ヒトで報告されているナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターであるSodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP)(J. Clin. Invest.、第93巻、1326頁、1994年)とは塩基レベルで39%、アミノ酸レベルで34%の相同性を示した。ヒトTCH162は、Genbank Accession No. BC019066のアミノ酸配列と同一の配列を有していた。
実施例2
ヒトTCH162遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトTCH162をコードする塩基配列から設計した、2種のプライマーDNA〔プライマーTF2(配列番号:16)およびプライマーTR2(配列番号:17)〕およびTaqManプローブT2(配列番号:18)を用いて、ヒトの各組織のcDNA(Human MTC panel IおよびII、Human digestive system MTC panel;クロンテック社製、Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel IおよびV;バイオチェーン社製)におけるヒトTCH162の発現量をTaqMan PCRにより測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system(アプライドバイオシステムズ社製)にて、最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。測定に用いたヒトの各組織のcDNAを〔表1〕に示す。
〔表1〕
cDNA 組 織
Human MTC panel I 心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓
Human MTC panel II 脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、
末梢血白血球
Human digestive 肝臓、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、回盲部、
system MTC panel 盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、直腸
Human Adult Digestive I;食道、胃、小腸、結腸
System Normal Tissue V;十二指腸、空腸、回腸、盲腸
cDNA Panel IおよびV
結果を図2、図3および図4に示す。TCH162遺伝子産物(mRNA)は、Human MTC panel IおよびMTC panel IIにおいては、心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、卵巣、末梢白血球でわずかな発現が見られ、前立腺、精巣、結腸で若干の発現が見られ、膵臓、肺、脳で強い発現が見られ、小腸でもっとも強い発現が見られた。
When homology search was performed on owl using Blast P (Nucleic Acids Res., Vol. 25, p. 3389, 1997), human TCH162 belongs to the sodium-dependent bile acid transporter family. It was found to be a gene (FIG. 1). Human TCH162 is at the base level with sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP), a sodium-dependent bile acid transporter reported in humans (J. Clin. Invest., 93, 1326, 1994). Showed homology of 39% and 34% at the amino acid level. Human TCH162 had the same amino acid sequence as Genbank Accession No. BC019066.
Example 2
Analysis of tissue distribution of human TCH162 gene product Two kinds of primer DNAs [primer TF2 (SEQ ID NO: 16) and primer TR2 (SEQ ID NO: 17)] and TaqMan probe T2 (sequence) were designed from the nucleotide sequence encoding human TCH162. No. 18) in the cDNA of each human tissue (Human MTC panel I and II, Human digestive system MTC panel; Clontech, Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel I and V; BioChain) The expression level of human TCH162 was measured by TaqMan PCR. The reaction was first performed at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) using TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Forty cycles were repeated at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for one minute as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously. The cDNA of each human tissue used for the measurement is shown in [Table 1].
[Table 1]
cDNA organization
Human MTC panel I Heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas
Human MTC panel II spleen, thymus, prostate, testis, ovaries, small intestine, colon,
Peripheral blood leukocytes
Human digestive liver, esophagus, stomach, duodenum, jejunum, ileum, ileocecum,
system MTC panel Cecum, ascending colon, transverse colon, descending colon, rectum
Human Adult Digestive I; esophagus, stomach, small intestine, colon
System Normal Tissue V; Duodenum, jejunum, ileum, cecum
cDNA Panel I and V
The results are shown in FIGS. 2, 3 and 4. The TCH162 gene product (mRNA) is slightly expressed in Human MTC panel I and MTC panel II in heart, placenta, liver, skeletal muscle, kidney, spleen, thymus, ovary, peripheral leukocytes, prostate, testis, Some expression was observed in the colon, strong expression was observed in the pancreas, lung and brain, and strongest expression was observed in the small intestine.
Human digestive system MTC panelにおいては、胃から直腸まですべての部位で強い発現が見られ、回腸、空腸で特に強い発現が見られた。 (4) In the Human digestive system MTC panel, strong expression was observed in all regions from the stomach to the rectum, and particularly strong expression was observed in the ileum and jejunum.
Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel IおよびVにおいては、小腸(空腸、回腸)、盲腸、結腸において強い発現が見られ、特に回腸において最も強い発現が見られた。
実施例3
マウスTCH162タンパク質をコードするcDNAのクローニング
2種のプライマーDNA〔プライマーmA3(配列番号:21)およびプライマーmB3(配列番号:22)〕を用いて、マウス脳Marathon-Ready cDNA(クロンテック社製)に対して、Pyrobest DNA Polymerase(宝酒造社製)により、以下の条件(1)〜(3)でPCRを行った。
In the Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panels I and V, strong expression was observed in the small intestine (jejunum, ileum), cecum and colon, and the strongest expression was observed particularly in the ileum.
Example 3
Cloning of cDNA encoding mouse TCH162 protein Using two kinds of primer DNAs [primer mA3 (SEQ ID NO: 21) and primer mB3 (SEQ ID NO: 22)], mouse brain Marathon-Ready cDNA (Clontech) was used. PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) under the following conditions (1) to (3).
(1)94℃2分間
(2)98℃10秒間−65℃30秒間−72℃3.5分間を30サイクル
(3)72℃10分間
得られた増幅産物をZero Blunt TOPO PCR Cloning kit(インビトロジェン社製)を用いてクローニングし、プラスミドpCR−BluntII−mTCH162を得た。
(1) 94 ° C for 2 minutes (2) 98 ° C for 10 seconds -65 ° C for 30 seconds -72 ° C for 3.5 minutes for 30 cycles (3) 72 ° C for 10 minutes The amplified product obtained was subjected to Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (Invitrogen). To obtain the plasmid pCR-BluntII-mTCH162.
これをプライマーDNA〔プライマーSP6(配列番号:5)、プライマーT7(配列番号:6)、プライマーmA1(配列番号:23)、プライマーmB1(配列番号:24)、プライマーmTF(配列番号:25)、プライマーmTR(配列番号:26)〕およびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて反応を行い、挿入されているcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて決定した。その結果、クローンは1398個の塩基配列を有していた(配列番号:27)。このcDNA断片には437個のアミノ酸配列(配列番号:19)がコードされており(配列番号:20)、配列番号:19で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、マウスTCH162タンパク質と命名した。 This was used as a primer DNA [primer SP6 (SEQ ID NO: 5), primer T7 (SEQ ID NO: 6), primer mA1 (SEQ ID NO: 23), primer mB1 (SEQ ID NO: 24), primer mTF (SEQ ID NO: 25), Primer mTR (SEQ ID NO: 26)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biosystems), and the base sequence of the inserted cDNA fragment was analyzed using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems). (Manufactured by the company). As a result, the clone had 1398 base sequences (SEQ ID NO: 27). This cDNA fragment encodes a 437 amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20), and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 was named mouse TCH162 protein.
上記cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)TOP10/pCR-BluntII-mTCH162と命名した。 形 質 A transformant having a plasmid containing the above-mentioned cDNA fragment was named Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-mTCH162.
Blast P[ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucleic Acids Res.)第25巻、3389頁、1997年]を用いてowlに対してホモロジー検索を行ったところ、マウスTCH162は、NTCP(J. Clin. Invest.、第93巻、1326頁、1994年)とは塩基レベルで41%、アミノ酸レベルで35%の相同性を示した。また、マウスで報告されている肝臓ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターであるマウスNTCP(Genbank:NP#035517)とは塩基レベル40%、アミノ酸レベルで33%の相同性を示した。 When a homology search was performed on owl using Blast P [Nucleic Acids Res., Vol. 25, p. 3389, 1997], mouse TCH162 was found to be NTCP (J. Clin. Invest. 93, p. 1326, 1994), showing 41% homology at the base level and 35% homology at the amino acid level. Further, it showed a homology of 40% at the base level and 33% at the amino acid level with mouse NTCP (Genbank: NP # 035517), which is a liver sodium-dependent bile acid transporter reported in mice.
マウスTCH162は、ヒトTCH162とは塩基レベルで81%、アミノ酸レベルで86%の相同性を示し、マウスTCH162がヒトTCH162のマウスオルソログであることが判明した(図5)。
実施例4
マウスTCH162遺伝子産物の組織分布の解析
マウスTCH162をコードする塩基配列から設計した、2種のプライマーDNA〔プライマーmTF(配列番号:25)およびプライマーmTR(配列番号:26)〕およびTaqManプローブmT1(配列番号:28)を用いて、マウスの各組織(骨髄、目、リンパ節、平滑筋、前立腺、胸腺、胃、子宮、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、胚(7日)、胚(11日)、胚(15日)、胚(17日))のcDNA(Mouse MTC panel IおよびMouse MTC panel II:クロンテック
社製)におけるマウスTCH162の発現量(コピー数)をTaqMan PCRにより測定した。Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel IおよびVについては、TaqMan GAPDH control reagents(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてGAPDHの発現量(コピー数)も測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system(アプライドバイオシステムズ社製)にて、最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
Mouse TCH162 showed homology of 81% at the base level and 86% at the amino acid level with human TCH162, indicating that mouse TCH162 is a mouse ortholog of human TCH162 (FIG. 5).
Example 4
Analysis of tissue distribution of mouse TCH162 gene product Two types of primer DNAs [primer mTF (SEQ ID NO: 25) and primer mTR (SEQ ID NO: 26)] and TaqMan probe mT1 (sequence) were designed from the nucleotide sequence encoding mouse TCH162. No. 28), mouse tissues (bone marrow, eyes, lymph nodes, smooth muscle, prostate, thymus, stomach, uterus, heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, testis, embryo ( 7 days), embryo (11 days), embryo (15 days), embryo (17 days)) cDNA (Mouse MTC panel I and Mouse MTC panel II: Clontech) expression level (copy number) of mouse TCH162 It was measured by TaqMan PCR. For the Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panels I and V, the expression level (copy number) of GAPDH was also measured using TaqMan GAPDH control reagents (manufactured by Applied Biosystems). The reaction was first performed at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) using TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Forty cycles were repeated at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for one minute as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously.
結果を図6に示す。 The results are shown in FIG.
マウスTCH162遺伝子産物(mRNA)はMouse MTC panel IおよびMTC panel IIおいては、
広範な組織で発現が見られたが、目、平滑筋、前立腺で比較的強い発現が見られ、胚(15日)、胚(17日)でさらに強い発現が見られ、脳、胚(11日)で最も強い発現が見られた。
実施例5
マウスTCH162遺伝子産物の7週齢BALB/cマウスにおける組織分布の解析
7週齢BALB/cマウスの各組織(大脳、延髄、海馬、小脳、脊髄、眼球、前胃、後胃、十二指腸、空回腸、結腸、直腸、盲腸、肺、気管、骨格筋、心臓、腎臓、膵臓、肝臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮、前立腺、皮膚;1-10匹分,卵巣および子宮以外は雄)より、RNeasy Mini Kit(キアゲン社製)を用いてtotal RNAを調製した。調製したtotal RNA に対してTaqMan Revease Transcription Reagents(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて逆転写反応を行いcDNAを調製した。これについて、実施例4で用いたプライマーmTF(配列番号:25)およびプライマーmTR(配列番号:26)およびTaqManプローブmT1(配列番号:28)を用いて、マウスTCH162の発現量(コピー数)をTaqMan PCRにより測定した。同じcDNAについてTaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてrodent GAPDHの発現量(コピー数)も測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system(アプライドバイオシステムズ社製)にて、最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
Mouse TCH162 gene product (mRNA) is available in Mouse MTC panel I and MTC panel II.
Expression was found in a wide range of tissues, but relatively strong expression was found in eyes, smooth muscle, and prostate, and even stronger in embryos (15 days) and embryos (17 days). Day) showed the strongest expression.
Example 5
Analysis of tissue distribution of mouse TCH162 gene product in 7-week-old BALB / c mice Tissues of 7-week-old BALB / c mice (cerebrum, medulla, hippocampus, cerebellum, spinal cord, eyeball, forestomach, posterior stomach, duodenum, jejunum , Colon, rectum, cecum, lung, trachea, skeletal muscle, heart, kidney, pancreas, liver, spleen, thymus, testis, ovary, uterus, prostate, skin; 1-10, male except ovary and uterus) Total RNA was prepared using the RNeasy Mini Kit (Qiagen). Reverse transcription was performed on the prepared total RNA using TaqMan Revease Transcription Reagents (manufactured by Applied Biosystems) to prepare cDNA. For this, the expression level (copy number) of mouse TCH162 was determined using the primer mTF (SEQ ID NO: 25), the primer mTR (SEQ ID NO: 26), and the TaqMan probe mT1 (SEQ ID NO: 28) used in Example 4. It was measured by TaqMan PCR. For the same cDNA, the expression level (copy number) of rodent GAPDH was also measured using TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe (manufactured by Applied Biosystems). The reaction was first performed at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) using TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Forty cycles were repeated at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for one minute as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously.
結果を図7に示す。 The results are shown in FIG.
マウスTCH162遺伝子産物(mRNA)は7週齢BALB/cマウスの各組織の消化管系組織(前胃、後胃、十二指腸、空回腸、結腸、直腸、盲腸)や大脳で高い発現が見られ、延髄、脊髄で最も高い発現が見られた。
実施例6
ヒトTCH162発現ベクターの構築
実施例1により得られたプラスミド10ngを鋳型として、プライマーOF(配列番号:29)およびプライマーOR(配列番号:30)を用いて、Pyrobest DNA Polymerase(宝酒造社製)により以下の条件(1)〜(3)でPCRを行った。5’末端側プライマーOFおよび3’末端側プライマーORは、ベクターへのクローニングのために5’末端側にそれぞれHind IIIサイトおよびEco RIサイトを付加するように設計した。
The mouse TCH162 gene product (mRNA) is highly expressed in the digestive tract tissues (fore stomach, hind stomach, duodenum, jejunum, colon, rectum, cecum) and cerebrum of each tissue of 7-week-old BALB / c mice, The highest expression was found in the medulla and spinal cord.
Example 6
Construction of Human TCH162 Expression Vector Using 10 ng of the plasmid obtained in Example 1 as a template, Pyrobest DNA Polymerase (manufactured by Takara Shuzo) using primer OF (SEQ ID NO: 29) and primer OR (SEQ ID NO: 30), PCR was performed under the conditions (1) to (3). The 5′-end primer OF and the 3′-end primer OR were designed to add a Hind III site and an Eco RI site, respectively, to the 5 ′ end for cloning into a vector.
(1)94℃2分間
(2)98℃10秒間−65℃30秒間−72℃3分間を30サイクル
(3)72℃10分間
上記PCR反応液をゲル電気泳動後、主要バンドを精製した。これにより得られたPCR断片を、制限酵素Hind IIIおよびEcoRIを用いて、37℃で1時間保温することにより消化し、この反応液をゲル電気泳動後、精製した。これを、動物細胞発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社製)のHind IIIサイトおよびEco RIサイトに、Takara ligation kit ver.2 (宝酒造社製)を用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をエタノール沈殿処理後、コンピーテント細胞である大腸菌(Escherichia coli)TOP10 (インビトロジェン社製)に形質転換した。これにより得られた複数のコロニーからプラスミドを調製し、この塩基配列をプライマーDNA〔プライマーBGH RV(配列番号:31)、プライマーT7(配列番号:6)、プライマーF2(配列番号:8)、プライマーR2(配列番号:11)プライマーA2(配列番号:13)、プライマーB2(配列番号:14)〕およびBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて反応を行い、塩基配列をDNAシークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて確認した。このプラスミドを有する形質転換体を、Escherichia coli TOP10/pCDNA3.1(+)-TCH162と命名した。
実施例7
ヒトTCH162発現CHO細胞株の作製
Escherichia coli TOP10/pCDNA3.1(+)-TCH162を培養し、この大腸菌体からEndoFree Plasmid Maxi Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをFuGENE 6 Transfection Reagent(ロシュ社製)を用いて添付のプロトコールに従ってCHO dhfr-細胞に導入した。2μgのプラスミドDNAとトランスフェクション試薬との混合液を24時間前に3 x 106個のCHO dhfr-細胞を播種した直径6cmシャーレに添加した。10%ウシ胎児血清を含むMEMα培地で1日間培養した後、トリプシン処理により細胞をはがし、回収した細胞を適宜希釈して10cmシャーレに播種した。さらに24時間後、培地に0.5mg/mlのG418を添加し、その後10日間0.5-1.0mg/mlのG418を含んだ培地中でヒトTCH162発現細胞を選択した。G418含有選択培地中に増殖してくるモノクローナルなヒトTCH162発現細胞のコロニーを、96個選択した。
実施例8
TaqMan PCR法を用いたヒトTCH162発現CHO細胞株における導入遺伝子発現量の測定
実施例7で作製したヒトTCH162発現CHO細胞株を48well plateまたは24well plateに培養し、増殖した細胞からRNeasy 96 Kit (キアゲン社製)を用いてtotal RNAを調製した。調製したtotal RNA に対してTaqMan Revease Transcription Reagents(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて逆転写反応を行いcDNAを調製した。これについて、プライマーTF(配列番号:32)およびプライマーTR(配列番号:33)と、TaqManプローブT1(配列番号:34)とを用いて、ヒトTCH162の発現量をTaqMan PCRにより測定した。反応はTaqMan Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system(アプライドバイオシステムズ社製)にて、最初50℃2分間、さらに95℃10分間おいた後で、95℃で15秒、60℃で1分を1反応サイクルとして40サイクル繰り返し、同時に検出を行った。ヒトTCH162遺伝子高発現細胞株として、クローンNo.35を選択した。
実施例9
ヒトTCH162遺伝子のデータベースにおける発現解析
ジーンロジックデータベースを用いて主要な正常脳各部位(大脳皮質、側頭葉、小脳半球、海馬、視床下部、延髄、脊髄および黒質)におけるヒトTCH162の発現を調べた。
(1) 94 ° C for 2 minutes (2) 30 cycles of 98 ° C for 10 seconds -65 ° C for 30 seconds -72 ° C for 3 minutes (3) 72 ° C for 10 minutes After gel electrophoresis of the PCR reaction solution, the main band was purified. The PCR fragment thus obtained was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI by incubating at 37 ° C. for 1 hour, and the reaction solution was purified by gel electrophoresis. This was ligated to Hind III site and Eco RI site of pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), which is an animal cell expression vector, using Takara ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). This ligation reaction solution was subjected to ethanol precipitation treatment, and then transformed into competent cells, Escherichia coli TOP10 (manufactured by Invitrogen). A plasmid was prepared from a plurality of colonies thus obtained, and this base sequence was used as a primer DNA [primer BGH RV (SEQ ID NO: 31), primer T7 (SEQ ID NO: 6), primer F2 (SEQ ID NO: 8), R2 (SEQ ID NO: 11), primer A2 (SEQ ID NO: 13), primer B2 (SEQ ID NO: 14)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biosystems). It was confirmed using an ABI PRISM 3100 DNA analyzer (manufactured by Applied Biosystems). A transformant having this plasmid was named Escherichia coli TOP10 / pCDNA3.1 (+)-TCH162.
Example 7
Preparation of Human TCH162-Expressing CHO Cell Line Escherichia coli TOP10 / pCDNA3.1 (+)-TCH162 was cultured, and plasmid DNA was prepared from the Escherichia coli body using the EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen). This plasmid DNA was introduced into CHO dhfr − cells using FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche) according to the attached protocol. A mixture of 2 μg of the plasmid DNA and the transfection reagent was added to a 6 cm diameter petri dish seeded with 3 × 10 6 CHO dhfr − cells 24 hours before. After culturing for 1 day in MEMα medium containing 10% fetal bovine serum, the cells were detached by trypsin treatment, and the collected cells were appropriately diluted and seeded on a 10 cm Petri dish. After an additional 24 hours, 0.5 mg / ml G418 was added to the medium, and then human TCH162-expressing cells were selected in the medium containing 0.5-1.0 mg / ml G418 for 10 days. 96 colonies of monoclonal human TCH162-expressing cells growing in the G418-containing selection medium were selected.
Example 8
Measurement of transgene expression level in human TCH162-expressing CHO cell line using TaqMan PCR method The human TCH162-expressing CHO cell line prepared in Example 7 was cultured in a 48-well plate or 24-well plate, and the cells proliferated were subjected to RNeasy 96 Kit (Qiagen). Was used to prepare total RNA. Reverse transcription was performed on the prepared total RNA using TaqMan Revease Transcription Reagents (manufactured by Applied Biosystems) to prepare cDNA. For this, the expression level of human TCH162 was measured by TaqMan PCR using primer TF (SEQ ID NO: 32) and primer TR (SEQ ID NO: 33) and TaqMan probe T1 (SEQ ID NO: 34). The reaction was first performed at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) using TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Forty cycles were repeated at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for one minute as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously. Clone No. 35 was selected as a human TCH162 gene high expression cell line.
Example 9
Expression analysis of human TCH162 gene database The expression of human TCH162 in each major normal brain region (cerebral cortex, temporal lobe, cerebellar hemisphere, hippocampus, hypothalamus, medulla oblongata, spinal cord and substantia nigra) using GeneLogic database Was.
結果を図8に示す。 The results are shown in FIG.
これより、ヒトTCH162遺伝子は、黒質で特異的に発現していることが分かった。 This indicates that the human TCH162 gene is specifically expressed in the substantia nigra.
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