JP4174212B2 - Parkinson's disease model transgenic mouse - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パーキンソン病モデルトランスジェニックマウスに関し、詳しくは、パーキンソン病原因遺伝子であるα−シヌクレイン（α-synuclein）遺伝子の二重変異型遺伝子を導入されている、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウス、同トランスジェニックマウスの効率的な選択方法、及び、同トランスジェニックマウスを用いたパーキンソン病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パーキンソン病(Parkinson's disease: PD)は成人・高齢者にみられる神経変性疾患として最も頻度の高いものの一つである。主として運動機能が障害され、振戦、筋固縮、無動、姿勢反射障害などの症状が出現する。その責任病変は中脳黒質のドーパミン産生神経細胞の変性・消失とされ、その他に青斑核、迷走神経核などにも神経細胞の消失がみとめられる。これらの障害による中脳−基底核系の選択的ドーパミン低下はその前駆体であるＬドーパを経口投与することにより、著明な症状の改善がみられることから、現在はパーキンソン病の治療としてＬドーパおよびＬドーパ受容体アゴニストが広く用いられている。しかし、症状の進行はそれにもかかわらず次第に進行し、これらの薬効も減弱するため、数年から十数年の間には患者は寝たきり状態となり、死亡する。したがって、パーキンソン病の根本的な原因の解明と治療法の確立が早急に望まれている。
【０００３】
黒質、青斑核、迷走神経核などにおける残存ニューロンにおいて、細胞内に出現する特異的封入体がレビー小体である。脳幹病変に加え、大脳皮質にもレビー小体が出現する疾患が、レビー小体を伴う痴呆症(Dementia with Lewy bodies: DLB)であり、痴呆性変性疾患の中ではアルツハイマー病についで第二番目に多い疾患である。
【０００４】
パーキンソン病の大多数は孤発例であるが、ごく一部に常染色体優性遺伝をとる家系が存在し、1997年にPolymeropoulosらはイタリアとギリシャの家族性パーキンソン病家系の連鎖解析から、原因遺伝子を染色体第4番長腕上のα−シヌクレイン遺伝子と同定し、ミスセンス変異(A53T)を確認した（Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H, Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A, Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI, Nussbaum RL. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science 1997 Jun 27;276(5321):2045-7）。さらに翌年にはドイツ家系からミスセンス変異（A30P）が確認され（Kruger R, Kuhn W, Muller T, Woitalla D, Graeber M, Kosel S, Przuntek H, Epplen JT, Schols L, Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 1998 Feb;18(2):106-8.）、家族性パーキンソン病の原因遺伝子としてはじめに同定された。その後、抗α−シヌクレイン抗体を用いた生化学的検討や免疫組織学的検討によって孤発例のパーキンソン病やDLBのレビー小体は、α−シヌクレインタンパク質が蓄積してできることが明らかになり、パーキンソン病の原因としてのα−シヌクレインタンパク質蓄積の重要性が明らかとなってきた。
【０００５】
一方、新しい世紀を迎え、ポストゲノムプロジェクト時代には個々の遺伝子機能を個体レベルで解析することがますます重要になっている。マウスは我々ヒトと同じ哺乳類であり、遺伝子配列データがヒトと共通する部分も多いため、生命科学には欠かせない実験動物である。また近年発達し続ける遺伝子工学により遺伝子導入(トランスジェニック)や標的遺伝子置換(ジーンターゲッテイング)を行った個体を作製することが可能となり、遺伝子機能の解析ばかりでなく、原因遺伝子を用いた疾患モデル動物を開発して、疾患に対する効果的な新薬開発の需要は今後さらに増加するものと考えられる。
【０００６】
これまでに、パーキンソン病のモデルマウスとして、α−シヌクレインタンパク質の野生型、変異型を過剰発現するトランスジェニックマウスが報告されたが、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するトランスジェニックマウスについては未だ報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、パーキンソン病原因遺伝子であるα−シヌクレイン遺伝子の二重変異型遺伝子が導入されている、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウス、同トランスジェニックマウスの効率的な選択方法、及び、同トランスジェニックマウスを用いたパーキンソン病治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、α−シヌクレイン遺伝子の二重変異型遺伝子を構築し、同変異型遺伝子をマウスに導入することによって、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するトランスジェニックマウスを得ることに成功した。また、本願発明者らは、同変異型遺伝子と遺伝子マーカーを共導入（co-injection）することによって、効率的に前記トランスジェニックマウスを選択する方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
詳しくは、本願発明者らは１）より凝集性の高い二重変異型α−シヌクレインタンパク質をコードする二重変異型α−シヌクレイン遺伝子を構築し、２）高発現系を獲得可能なプロモーターを用いて、同遺伝子を発現させ、同タンパク質をマウスの脳に発現させることに成功し、パーキンソン病モデルトランスジェニックマウスを得るに至った。本願発明者らは、さらに、前記プロモーター及び二重変異型α−シヌクレイン遺伝子に加え、３）緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein）をマウスに共導入することによって大量に生まれたF0マウスから高発現系トランスジェニックマウスを効果的に迅速に選択する方法を確立することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第一の変異、及び、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第二の変異を有するα−シヌクレインタンパク質をコードするＤＮＡがプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウス。
（２） 前記α−シヌクレインタンパク質をコードするＤＮＡがヒト由来である、（１）に記載のトランスジェニックマウス。
（３） 前記プロモーターがThy-1プロモーターである、（１）又は（２）に記載のトランスジェニックマウス。
（４） 前記第一の変異は、アミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がプロリン残基に置換する変異である、（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
（５） 前記第二の変異は、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がスレオニン残基に置換する変異である、（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
（６） さらに、遺伝子マーカーを導入されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
（７） 前記遺伝子マーカーは緑色蛍光タンパク質である、（６）に記載のトランスジェニックマウス。
（８） （１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニックマウスを用いる、パーキンソン病治療薬のスクリーニング方法。
（９） 前記パーキンソン病治療薬が、Ｌ−ドーパ補充療法に使用される、（８）に記載のスクリーニング方法。
（１０） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第一の変異、及び、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第二の変異を有するα−シヌクレインタンパク質をコードするＤＮＡが、強力なプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを構築し、前記組換えＤＮＡ及び遺伝子マーカーをマウスの受精卵に導入し、得られた受精卵を偽妊娠マウスに移植し、マウスを飼育し、前記遺伝子マーカーの発現産物を指標として、生まれた仔マウスから前記組換えＤＮＡを有する仔マウスを選択する、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウスの作製方法。
（１１） 前記α−シヌクレインタンパク質をコードするＤＮＡがヒト由来である、（１０）に記載のトランスジェニックマウス。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の二重変異型α−シヌクレインタンパク質を過剰に発現するトランスジェニックマウスはパーキンソン病におけるレビー小体形成と行動異常及びドーパミンの低下を再現するパーキンソン病の疾患動物モデルであり、SIY8713と名付けた。このモデル動物(SIY8713)は今後のパーキンソン病の原因解明、治療薬物開発に貴重な役割を果たすものである。
【００１２】
本発明の二重変異型α−シヌクレイン遺伝子は、アミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第一の変異、及び、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第二の変異を有する、α−シヌクレインタンパク質をコードするDNAである。二重変異を導入するα−シヌクレイン遺伝子としては、二重変異型α−シヌクレイン遺伝子が導入されているトランスジェニックマウスが、パーキンソン病におけるレビー小体形成と行動異常及びドーパミンの低下を再現するようなものであれば、どのような生物由来のものであってもよいが、好ましい一例として、ヒト由来のものが挙げられる。このようなDNAは、例えば、公知のヒトα−シヌクレイン遺伝子をコードするゲノムDNAを鋳型とし、α−シヌクレインタンパク質のアミノ酸番号３０、及びアミノ酸番号５３のアラニン残基をコードするα−シヌクレイン遺伝子の塩基を他のアミノ酸をコードするように置換したミスセンス変異導入プライマーを用いたPCRによって、得ることができる。以下の実施例に、このようなミスセンス導入操作に用いられる、ミスセンス変異導入プライマーの一例を示す。
また、本発明の二重変異型α−シヌクレイン遺伝子は化学合成によって得ることもできる。
【００１３】
前記第一の変異としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がプロリン残基に置換する変異が好ましい。また、前記第二の変異としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がスレオニン残基に置換する変異が好ましい。
【００１４】
α−シヌクレインタンパク質は、種間、個体間でタンパク質の活性に影響しないアミノ酸残基においてアミノ酸の置換、挿入、欠失等の相違を有することがある。このようなアミノ酸の置換、挿入、欠失等を有するα−シヌクレインタンパク質における、配列番号１のアミノ酸番号３０及び５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基は、当業者によって容易に特定され得る。
【００１５】
本発明のDNAは過剰発現されることが望ましい。過剰発現は、例えば、本発明のDNAが適当なベクター中のプロモーターの制御下に配置された組換えDNAによって行うことができる。本発明に用いられるプロモーターとしては、作製するトランスジェニックマウスの神経細胞における発現を特異的に強化するものが好ましい。好ましいプロモーターの一例として、マウス神経細胞における発現を特異的に強化するヒトThy-1プロモーターが挙げられる。
【００１６】
なお、本発明に用いられるPCR、プライマーの作製、ゲノムDNAの調製、クローニング、酵素処理等の方法は、当業者によく知られている通常の方法により行うことができる。
【００１７】
本発明のトランスジェニックマウスは、アミノ酸番号３０のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第一の変異、及び、アミノ酸番号５３のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換する第二の変異を有するα−シヌクレインタンパク質をコードするＤＮＡが、プロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウスである。
【００１８】
このようなトランスジェニックマウスは、具体的には、例えば、本発明の二重変異型α−シヌクレイン遺伝子が強力なプロモーターの制御下に配置されるように組換えＤＮＡを構築し、得られた組換えＤＮＡをマウスの受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、生き残った受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、マウスを飼育し、生まれた仔マウスから前記組換えＤＮＡを有する仔マウスを選択することによって得ることができる。
生まれた仔マウスからの組換えDNAを有する仔マウスの選択は、例えば、マウス尾より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、α−シヌクレイン遺伝子の塩基配列の一部を有するプライマーを用いたPCRにて、前記組換えDNAの導入の有無を確認する方法により、行うことができる。
【００１９】
本発明のトランスジェニックマウスは、好ましくは、本発明の組換えＤＮＡと共に、遺伝子マーカーを導入されているトランスジェニックマウスである。遺伝子マーカーの一例として、好ましくは、緑色蛍光タンパク質（GFP）が挙げられる。緑色蛍光タンパク質としては、本発明のトランスジェニックマウスが選択できるものであれば、野生型、変異型のうちのいずれを用いてもよい。
【００２０】
本発明の組換えＤＮＡと共に、遺伝子マーカーを導入されているトランスジェニックマウスは、組換えＤＮＡと共に、遺伝子マーカーをマウスの受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、生き残った受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、マウスを飼育し、生まれた仔マウスから前記組換えＤＮＡを有する仔マウスを選択することによって得ることができる。
生まれた仔マウスからの組換えDNA及び遺伝子マーカーを有する仔マウスの選択は、仔マウスに発現している遺伝子マーカーの発現産物を指標として、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーの導入の有無を確認する方法により、効率的に行うことができる。例えば、遺伝子マーカーとしてEGFPを用いた場合、生まれた仔マウスに紫外線を照射し、マウスの皮膚が発現したEGFPにより緑色の蛍光を発するものを選択することによって、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーの導入の有無を確認する方法により、効率的にトランスジェニックマウスの選択を行うことができる。
【００２１】
本発明の組換えDNAを導入する受精卵は、雄マウスと雌マウスを交配することにより得ることができる。
本発明の組換えDNAを受精卵に導入する方法としては、マイクロインジェクション法、レトロウィルス・ベクターによる方法、又は、胚性幹細胞を用いる方法等が挙げられるが、マイクロインジェクション法が好ましく挙げられる。
なお、本発明に用いられる受精卵の培養、マイクロインジェクション、受精卵の移植等の方法は、当業者によく知られている通常の方法により行うことができる。
【００２２】
本願発明のトランスジェニックマウスが再現するレビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下は次のようにして確認することができる。
レビー小体の出現は、トランスジェニックマウスから調製された脳切片を、抗α−シヌクレイン抗体で反応させたものを、顕微鏡下で観察することにより、神経細胞における封入体として確認することができる。また、行動異常は、ローターロッド等を用いた行動実験により、運動機能を測定し、非トランスジェニックマウスとの比較をすることにより、非トランスジェニックマウスに比べ、低下した運動機能として確認することができる。脳内ドーパミンの低下は、対照マウス及びトランスジェニックマウスから調製された脳各組織より、タンパク質を抽出し、含まれるドーパミンの量を比較することにより確認することができる。好ましくは、ドーパミンの低下は脳内線条体において確認される。
【００２３】
本願発明者らが作製し、継代に成功したSIY8713トランスジェニックマウスは、病理学的にはパーキンソン病にみられるレビー小体とレビー変性神経突起を再現するパーキンソン病の疾患モデル動物である。さらに、学習行動実験からSIY8713トランスジェニックマウスは運動機能の著明な低下が認められた。また、SIY8713トランスジェニックマウスはパーキンソン病の最も重要な変化であるドーパミンの低下も再現する。このことは、現在、パーキンソン病の治療法の標準となっているＬ−ドーパ補充療法の新たな治療薬開発にも有用であることを示している。これらの所見は、すなわち、本願発明者らの開発した二重変異型α−シヌクレインタンパク質(A30P と A53Tの二重変異)を高発現する本発明のトランスジェニックマウスはパーキンソン病の動物モデルとして疾患の発生機序を解明し、根本的治療法及び治療薬を開発するためのスクリーニング系として有用であることを示している。
【００２４】
具体的に、本願発明のトランスジェニックマウスをパーキンソン病治療薬のスクリーニング系として、例えば、次のように用いることができる。本願発明のトランスジェニックマウスを被験マウス群、及び、対照マウス群にわけ、被験マウス群に試験する治療薬を投与し、その後、被験マウス群、及び、対照マウス群のそれぞれから脳組織を調製し、レビー小体とレビー変性神経突起などのα−シヌクレイン蓄積による病理変化の改善やドーパミンの低下の改善を観察することにより、並びに、行動実験により、各群を比較し、治療薬の効果を検討し、パーキンソン病治療薬をスクリーニングすることができる。このような治療薬の例として、L-ドーパ補充療法の治療薬が好ましく挙げられる。
【００２５】
本願発明者らが開発した変異型トランスジェニックマウス脳において神経細胞内の変異型α-シヌクレインタンパク質の蓄積とレビー小体とレビー変性神経突起を認めた。さらに、マウスの行動実験により運動機能の著明な低下も確認された。さらに、基底核におけるドーパミンの選択的低下も再現された。これらの所見より本願発明者らの開発した二重変異型α−シヌクレイン(A30P，A53T変異)を発現するトランスジェニックマウスはパーキンソン病の疾患モデルとして疾患の発生機序の検討と治療法の開発にきわめて有用である。SIY8713マウスは最も高発現なラインを365nmの紫外線照射を用いて容易にスクリーニングすることが可能であり、治療薬開発に向けた均一な表現系を有する迅速なマウスのスクリーニングにも有用である。
【００２６】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨をこえない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
（１）二重変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子導入ベクターの作製
二重変異型ヒトα−シヌクレイン遺伝子を導入するDNAとして、マウス神経細胞に特異的に発現するヒトThy-1プロモーターを有するゲノムDNA (8.1kb)を用いた（Gordon JW, Chesa PG, Nishimura H, Retting WJ, Maccari JE, Endo T, Seravalli E, Seki T, Silver J. Regulation of Thy-1 gene expression in transgenic mice. Cell 50: 445-452, 1987.）。このゲノムDNAのヒトThy-1遺伝子翻訳領域は開始コドン直前にHindIII配列(太字)とXbaI配列(下線)を含む人工的な変異配列を有している（図５）。
【００２７】
配列番号１に示されるヒト正常型α−シヌクレインタンパク質のアミノ酸番号３０のアラニン残基をプロリン残基に置換する変異（A30P変異）を導入するため、以下に示すヒト正常型α−シヌクレインcDNAに変異を導入するためのミスセンス変異導入用プライマーを作製した。
【００２８】
ミスセンス変異プライマーA30P-フォワード: TGTGGCAGAAGCACCAGGA（配列番号４）
ミスセンス変異プライマーA30P-リバース : TCCTGGTGCTTCTGCCACA（配列番号５）
【００２９】
プラスミドブルースクリプトII KS（ストラタジーン社）にクローニングしたヒト正常型α−シヌクレイン cDNAを鋳型DNAとして、A30P-フォワードとM13Rのプライマーセット、並びにA30P-リバース とM13Fのプライマーセットを用いてそれぞれ別々にPCRを行った。PCRは、94℃、1分；54℃、1分；72℃、1分を30サイクルの反応条件で行った。得られた両PCR産物を混合し、鋳型DNAとして、M13F/M13Rプライマーを用いて、PCRを行い、A30Pミスセンス変異α−シヌクレイン cDNAクローンを得た。PCRは、94℃、1分；54℃、1分；72℃、1分を30サイクルの反応条件で行った。
【００３０】
次に、配列番号１に示されるヒト正常型α−シヌクレインタンパク質のアミノ酸番号５３のアラニン残基をスレオニン残基に置換する変異（A53T変異）を導入するため、以下に示すミスセンス変異導入用プライマーを作製した。
【００３１】
ミスセンス変異プライマーA53T-フォワード: TGGTGTGACAACAGTGGCT（配列番号６）
ミスセンス変異プライマーA53T-リバース : AGCCACTGTTGTCACACCA（配列番号７）
【００３２】
A30Pミスセンス変異α−シヌクレイン cDNAクローンを鋳型DNAとして、上記A53T-フォワード及びA53T-リバースプライマーを用いて、A30P変異の導入の際と同様のPCR操作を行い、二重変異(A30P/A53T)を有する二重変異型α−シヌクレインcDNAクローンを得た。このcDNAクローンを、二重変異を有するα−シヌクレイン cDNA(450bp)断片をHindIIIにて予め切断したヒトThy-1ゲノムDNAに組み込み、ブルースクリプトII KSにクローン化し、SalI/NotIにて切断し、二重変異型α−シヌクレイン遺伝子導入ベクター(phThy1-αSN (A30P/A53T))を作製した（図1）。
【００３３】
（２）導入遺伝子マーカーの作製
発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来のコザック配列を含むEGFP（増幅緑色蛍光タンパク質）（Enhanced green fluorescent protein）ｃDNAの約730bpを可視遺伝子マーカーとして使用した。遺伝子マーカーは、pEGFP-Basic（クローンテックカンパニー）をテンプレートに用いて、ＰＣＲによってコザック配列を含むEGFPの cDNA両端にEcoRIリンカーを作製、pCAGGSベクター（Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J: Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector, Gene, 108, 193-199, 1991 ）のEcoRI 部位に、ＰＣＲ産物を導入したプラスミドpCX-EGFPから、SalI-BamHI消化による 約3Kb 断片（CX-EGFP）を回収し、導入遺伝子マーカー（CX-EGFP）を得た。
【００３４】
（３）トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウスは（１）で得られた二重変異型α−シヌクレイン遺伝子導入ベクターphThy1-αSN (A30P/A53T)及び（２）で得られた導入遺伝子マーカーCX-EGFPを、遺伝子混合モル比1：1に調整し、マイクロインジェクション（micro-injection）法にて、ＢＤＦ1マウス間の自然交配によって得られた受精卵（ＢＤＦ2）の雄性前核に1000コピー共導入後、Jcl:ICR偽妊娠マウス（0.5dpc）の卵管内に移植し作製した。受精卵移植後19.5dpcで妊娠マウスから帝王切開で生存子を摘出または自然出産させ、129匹のF0マウスを得た。なお、トランスジェニックマウス作製の基本操作はMethods in Enzymology Vol 225“Guide to techniques in mouse development" edited by Paul M. Wassarman, Melvin L. DePamphilis, Academic Press, INC.に準じて実施した。
【００３５】
得られた129匹のF0マウスのEGFPの発現を365nmの紫外線照射で検討し、緑色蛍光が１８匹で確認された。
この１８匹を含む得られた１２９匹すべての尾のＰＣＲ解析を行った。マウス尾より抽出したゲノムDNAを用い、ヒトα-シヌクレイン遺伝子の塩基配列の一部に基づいたプライマー（フォワード：TGG ATG TAT TCA TGA AAG GA（配列番号８）；リバース：CCA GTG GCT GCT GCA ATG CTC（配列番号９））、及び、EGFP遺伝子の塩基配列の一部に基づいたプライマー（フォワード：TGG TGA GCA AGG GCG AGG AG（配列番号１０）；リバース：TCG TGC TGC TTC ATG TGG TC （配列番号１１））を用いたPCRにて、導入されたヒトα-シヌクレイン遺伝子とEGFP遺伝子の導入を確認した。PCRは、94℃、1分；52℃、1分；72℃、1分を35サイクルの反応条件で行った。
【００３６】
その結果、蛍光を発していたトランスジェニックマウスは、すべてＰＣＲ判定で導入遺伝子が確認された。また、蛍光を発していないマウスは、すべてＰＣＲ判定で導入遺伝子が確認されなかった。したがって、蛍光の存在は導入遺伝子の存在を示すことが確認され、さらに緑色蛍光の強度とα−シヌクレインタンパク質の発現の強度が比例すると考えられた。
18匹のトランスジェニックマウスが365nmの紫外線照射によって、発現したGFPが励起され、皮膚が緑色の蛍光を発したが、この中で、最も緑色蛍光が強く、ヒトα−シヌクレインタンパク質を最も高発現するトランスジェニックマウス3匹を得た。
このうち、さらに、以下の（４）に示す生化学、病理学的検討及び（５）行動実験により、生化学的組織学的に最も高発現で行動障害を発症した１系統SIY8713マウスを選択し、成育した。
【００３７】
（４）生化学、病理学的検討
α−シヌクレインタンパク質を最も高発現であった3匹のうちの1系統であるSIY8713マウスについて、抗α-シヌクレイン抗体を用いた免疫組織化学的検討（Baba M, Nakajo S, Tu PH, Tomita T, Nakaya K, Lee VM, Trojanowski JQ, Iwatsubo T. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol 1998 Apr;152(4):879-84. ; Shoji M, Harigaya Y, Sasaki A, Ueda K, Ishiguro K, Matsubara E, Watanabe M, Ikeda M, Kanai M, Tomidokoro Y, Shizuka M, Amari M, KosakaK, Nakazato Y, Okamoto K, Hirai S. Accumulation of NACP/alpha-synucleinin lewy body disease and multiple system atrophy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000 May;68(5):605-8.）を行った。すなわち、抗α-シヌクレインモノクローナル抗体（LB509;コスモバイオ社）をＡＢＣ elite染色マウスキット（フナコシ社）により標識し、マウス脳を４％パラフォルムアルデヒドで８時間固定後、パラフィン包埋し、５μmの切片を作成したマウス脳切片に反応させ、免疫染色を行った。また、チロシンヒドロキシラーゼ抗体及びサブスタンスP抗体を用いて、同様に免疫染色を行った。また、各染色法（Nissle、HE）で同様に調製した脳切片を染色した。その結果、中脳黒質を含む脳幹、小脳歯状核の諸神経細胞と小脳プルキンエ細胞、大脳皮質神経細胞にヒトα-シヌクレイン発現タンパク質が蓄積し（図2a）、パーキンソン病/DLBにみられるレビー小体が脳幹神経細胞で確認された（図2c,e,f）。さらに、脳幹と大脳皮質にレビー変性神経突起が認められた。チロシンヒドロキシラーゼ（tyrosine hydroxylase）（図2g）およびサブスタンスP（substance P）（図2i）免疫染色では神経活性物質の低下が確認され、神経活性物質やドーパミン代謝系の異常も認められた。電顕では生後6カ月齢マウスで核内封入体がみられ（図2l）、生後11カ月齢マウスで細胞内封入体が観察された（図2k）。これらの封入体構造はパーキンソン病にみられる所見と一致していた。
【００３８】
以下、図２に示す結果の説明をする。
a.SIY8713系統マウス; α−シヌクレインα−シヌクレイン免疫染色 (LB509), x12、著明なα−シヌクレインの蓄積がSIY8713系統マウスで認められる。
b.非トランスジェニックマウス;α−シヌクレイン免疫染色(LB509), x12
c. SIY8713系統マウス;α−シヌクレイン免疫染色 (LB509), x200、胞体内にレビー小体が観察される。
d.非トランスジェニックマウス;α−シヌクレイン免疫染色(LB509), x200
e. SIY8713系統マウス; Nissle染色，x100、胞体内に丸い蓄積物質が確認される。
f. SIY8713系統マウス; HE染色，x200、HEでも観察される。
g. SIY8713系統マウス; チロシンヒドロキシラーゼ免疫染色，x100、著明な低下が観察される。
h. 非トランスジェニックマウス; チロシンヒドロキシラーゼ免疫染色，x100、i. SIY8713系統マウス; サブスタンスP免疫染色，x100
j. 非トランスジェニックマウス; サブスタンスP免疫染色，x100
k. SIY8713系統マウス;電顕所見，x33000、電顕的にレビー小体が観察される。
l. SIY8713系統マウス;電顕所見，x12000、核内にも封入体が認められる。
【００３９】
（５）行動実験
（４）で得られたSIY8713系統マウスについて、ローターロッドによる行動実験を行った。実験器具は、TRED MILL FOR MICE 7600（ugo basile, biological research apparatus社. ミラノ, イタリア）を用いた。実験は、16 サイクル/分にてロッドを回転させ、1分間でのマウスの落下時間(秒)を計測して行った。
その結果、4カ月齢トランスジェニックマウスで同年齢の非トランスジェニックマウスに比べて、統計学的に有意な運動機能低下が認められた（ｐ<0.01,図3）。すなわち、SIY8713系統マウスは、行動障害を発症した。
【００４０】
（６）脳内カテコールアミンの測定
マウス脳における脳内カテコールアミンの測定を行った。トランスジェニック及び対照（非トランスジェニック）マウス脳にマイクロウエーブ照射 (9.0 kW ，0.42秒，NJE 2603, New Japan Radio社, 上福岡, 日本)した後、マウスを解剖し、脳重を測定した。それぞれの脳の部位に分け、1 ml の0.05 M 過塩素酸と10 nmol/10 μl のヨウ化エチルホモコリン（ethylhomocholine iodideas ）を加えて，超音波破砕機(US-300T, Nissei社, 東京, 日本)で破砕し、17,300 g 、4°C 、15分で超遠心した。上清を0.45 μm のミリポアフィルターを通した後、5μlのサンプルを各種カテコールアミンのelectrochemical detector (LC-ECD社)を装着したHPLCに打ち込んで各濃度を測定した。遠心した沈殿を、2 ml の1 M NaOH で再度攪拌し、タンパク濃度を決定した（Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad社, Richmond, カリフォルニア, 米国)。
その結果、10ヶ月齢SIY8713系統マウスの脳ではド−パミンが線状体で低下していた（図４）。
【００４１】
（７）GFPによるトランスジェニックマウスの選択
高発現SIY8713系統マウスに、365nmの紫外線照射し、GFPの蛍光を観察した。
その結果、高発現SIY8713系統マウスは同時に導入したGFPによって365nmの紫外線照射によって蛍光を発し、トランスジェニックマウスを容易に選択可能であった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、パーキンソン病原因遺伝子であるα−シヌクレイン遺伝子の二重変異型遺伝子が導入されている、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウス、同トランスジェニックマウスの効率的な選択方法、及び、同トランスジェニックマウスを用いたパーキンソン病治療薬のスクリーニング方法が提供される。
【００４３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、導入遺伝子コンストラクトを示す図である。
【図２】 図２は、SIY8713系統マウスの免疫染色を示す図（写真）である。
【図３】 図３は、ローターロッド試験の結果を示す図である。
【図４】 図４は、大脳カテコールアミンの変化を示す図である。
DA: ドーパミン(Dopamine)、NE: ノルエピネフリン(Norepinephrine)、5HT: セロトニン(Serotonin)、Ach: アセチルコリン(Acethlcholine)
CN: 対照大脳皮質(control cerebral cortex), CT: トランスジェニックマウス大脳皮質(transgenic mice cerebral cortex); HN: 対照海馬(control hippocampus), HT: トランスジェニックマウス海馬(transgenic mice hippocampus); MTN: 対照中脳視床(control midbrain-thalamus), MTT: トランスジェニックマウス中脳視床(transgenic mice midbrain-thalamus); SN: 対照線条体(control striatum), ST: トランスジェニックマウス線条体(transgenic mice striatum); HyN: 対照視床下部(control hypothalamus), HyT: トランスジェニックマウス視床下部(transgenic mice hypothalamus); MPN: 対照橋延髄(control medulla-pons), MPT: トランスジェニックマウス橋延髄(transgenic mice medulla-pons); CeN: 対照小脳(control cerebellum), CeT: トランスジェニックマウス小脳(transgenic mice cerebellum); WN: 対照全脳(control whole brain), WT: トランスジェニックマウス全脳(transgenic mice whole brain).
【図５】 図５は、ヒトThy-1遺伝子の変異配列を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a Parkinson's disease model transgenic mouse, and more specifically, the appearance of Lewy bodies and behavioral abnormalities into which a double mutant gene of α-synuclein gene that is a Parkinson's disease causative gene has been introduced. The present invention also relates to a Parkinson's disease model transgenic mouse that reproduces a decrease in brain dopamine, a method for efficiently selecting the transgenic mouse, and a method for screening a therapeutic agent for Parkinson's disease using the transgenic mouse.
[0002]
[Prior art]
Parkinson's disease (PD) is one of the most frequent neurodegenerative diseases in adults and the elderly. The motor function is mainly impaired, and symptoms such as tremor, muscular rigidity, immobility, and posture reflex disorder appear. The responsible lesion is the degeneration / disappearance of dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra, as well as the disappearance of neurons in the locus coeruleus and vagus nucleus. The selective dopamine lowering of the midbrain-basal ganglia system due to these disorders is markedly improved by oral administration of its precursor L-dopa. Therefore, as a treatment for Parkinson's disease, L Dopa and L-dopa receptor agonists are widely used. However, the progression of symptoms nevertheless progresses and the effectiveness of these drugs diminishes, so that the patient becomes bedridden and dies within a few years to a decade. Therefore, it is urgently desired to elucidate the root cause of Parkinson's disease and establish a therapeutic method.
[0003]
In the remaining neurons in the substantia nigra, the locus coeruleus, the vagus nucleus, etc., specific inclusion bodies that appear in the cells are Lewy bodies. Dementia with Lewy bodies (DLB) is a disease in which Lewy bodies appear in the cerebral cortex in addition to brainstem lesions, and is the second of all dementia-related degenerative diseases following Alzheimer's disease. It is a common disease.
[0004]
The majority of Parkinson's disease is a sporadic case, but there are only a few families with autosomal dominant inheritance.In 1997, Polymeropoulos et al. Found a causative gene from linkage analysis of familial Parkinson's disease families in Italy and Greece. Was identified as an α-synuclein gene on the 4th long arm of chromosome, and a missense mutation (A53T) was confirmed (Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H, Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A, Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI, Nussbaum RL. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science 1997 Jun 27; 276 (5321): 2045-7). In the following year, a missense mutation (A30P) was confirmed from a German family (Kruger R, Kuhn W, Muller T, Woitalla D, Graeber M, Kosel S, Przuntek H, Epplen JT, Schols L, Riess O. Ala30 Pro mutation in the Nat Genet. 1998 Feb; 18 (2): 106-8.), first identified as a causative gene for familial Parkinson's disease. gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Later, biochemical and immunohistochemical studies using anti-α-synuclein antibodies revealed that isolated Parkinson's disease and Lewy bodies of DLB were formed by the accumulation of α-synuclein protein. The importance of α-synuclein protein accumulation as a cause of disease has become apparent.
[0005]
On the other hand, in the era of the post-genome project as we enter a new century, it is becoming increasingly important to analyze individual gene functions at the individual level. Mice are the same mammals as humans, and gene sequence data share many parts with humans, so they are laboratory animals indispensable for life science. In addition, it has become possible to create individuals that have undergone gene transfer (transgenic) or target gene replacement (gene targeting) by genetic engineering that has been developing in recent years. In addition to analysis of gene function, a disease model using the causative gene The demand for the development of animals and the development of effective new drugs for diseases is expected to increase further in the future.
[0006]
So far, transgenic mice that overexpress wild-type and mutant forms of α-synuclein protein have been reported as model mice for Parkinson's disease, but the appearance of Lewy bodies, behavioral abnormalities, and a decrease in brain dopamine are reproduced. No report has been made yet regarding transgenic mice.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and reproduces the appearance of Lewy bodies, behavioral abnormalities, and a decrease in brain dopamine, in which a double-mutated gene of the α-synuclein gene that is a parkinson's disease causative gene has been introduced. It is an object of the present invention to provide a Parkinson's disease model transgenic mouse, an efficient selection method for the transgenic mouse, and a screening method for a therapeutic agent for Parkinson's disease using the transgenic mouse.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present application constructed a double mutant gene of the α-synuclein gene and introduced the mutant gene into a mouse. We have succeeded in obtaining transgenic mice that reproduce the appearance, behavioral abnormalities and brain dopamine reduction. In addition, the present inventors have succeeded in establishing a method for efficiently selecting the transgenic mouse by co-injection of the mutant gene and a gene marker, thereby completing the present invention. It came to do.
[0009]
Specifically, the inventors of the present application constructed 1) a double mutant α-synuclein gene encoding a double mutant α-synuclein protein having a higher aggregation property, and 2) using a promoter capable of obtaining a high expression system. Thus, the inventors have succeeded in expressing the same gene and expressing the same protein in the mouse brain, resulting in obtaining Parkinson's disease model transgenic mice. In addition to the promoter and the double mutant α-synuclein gene, the inventors of the present application further 3) high expression system from F0 mice born in large quantities by co-introducing green fluorescent protein into mice We have succeeded in establishing a method for effectively and quickly selecting transgenic mice.
[0010]
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the first mutation in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue of
(2) The transgenic mouse according to (1), wherein the DNA encoding the α-synuclein protein is derived from a human.
(3) The transgenic mouse according to (1) or (2), wherein the promoter is a Thy-1 promoter.
(4) In the first mutation, the amino acid residue corresponding to the alanine residue of
(5) In the second mutation, the amino acid residue corresponding to the alanine residue of amino acid number 53 is Threonine The transgenic mouse according to any one of (1) to (4), which is a mutation that substitutes for a residue.
(6) The transgenic mouse according to any one of (1) to (5), further introduced with a genetic marker.
(7) The transgenic mouse according to (6), wherein the gene marker is green fluorescent protein.
(8) A screening method for a therapeutic agent for Parkinson's disease using the transgenic mouse according to any one of (1) to (7).
(9) The screening method according to (8), wherein the therapeutic agent for Parkinson's disease is used for L-dopa replacement therapy.
(10) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the first mutation in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue of
(11) The transgenic mouse according to (10), wherein the DNA encoding the α-synuclein protein is derived from a human.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The transgenic mouse overexpressing the double mutant α-synuclein protein of the present invention is a disease animal model of Parkinson's disease that reproduces Lewy body formation and behavioral abnormalities and a decrease in dopamine in Parkinson's disease, and was named SIY8713 . This model animal (SIY8713) plays a valuable role in elucidating the cause of Parkinson's disease and developing therapeutic drugs in the future.
[0012]
The double mutant α-synuclein gene of the present invention corresponds to the first mutation in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue of
The double mutant α-synuclein gene of the present invention can also be obtained by chemical synthesis.
[0013]
The first mutation includes an amino acid residue corresponding to the alanine residue of
[0014]
The α-synuclein protein may have differences such as amino acid substitution, insertion, and deletion in amino acid residues that do not affect protein activity between species and individuals. Amino acid residues corresponding to the alanine residues of SEQ ID NO: 1 in the α-synuclein protein having such amino acid substitutions, insertions, deletions and the like can be easily identified by those skilled in the art.
[0015]
It is desirable that the DNA of the present invention be overexpressed. Overexpression can be performed, for example, by recombinant DNA in which the DNA of the present invention is placed under the control of a promoter in an appropriate vector. As the promoter used in the present invention, a promoter that specifically enhances expression in nerve cells of the transgenic mouse to be produced is preferable. An example of a preferred promoter is the human Thy-1 promoter that specifically enhances expression in mouse neurons.
[0016]
In addition, PCR, primer preparation, genomic DNA preparation, cloning, enzyme treatment and the like used in the present invention can be performed by ordinary methods well known to those skilled in the art.
[0017]
In the transgenic mouse of the present invention, the first mutation in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue of
[0018]
Specifically, such a transgenic mouse is constructed by, for example, constructing a recombinant DNA such that the double mutant α-synuclein gene of the present invention is placed under the control of a strong promoter, and Microinject the recombination DNA into the male pronucleus of the fertilized egg of the mouse, transplant the surviving fertilized egg into the oviduct of a pseudopregnant mouse, raise the mouse, and select the pup having the recombinant DNA from the born pup Can be obtained.
Selection of pups having recombinant DNA from born pups, for example, using genomic DNA extracted from the mouse tail as a template, PCR using a primer having a part of the base sequence of the α-synuclein gene, This can be performed by a method for confirming the presence or absence of introduction of the recombinant DNA.
[0019]
The transgenic mouse of the present invention is preferably a transgenic mouse into which a genetic marker has been introduced together with the recombinant DNA of the present invention. An example of a genetic marker is preferably green fluorescent protein (GFP). As the green fluorescent protein, any of wild type and mutant types may be used as long as the transgenic mouse of the present invention can be selected.
[0020]
A transgenic mouse introduced with a genetic marker together with the recombinant DNA of the present invention is microinjected with the recombinant DNA into the male pronucleus of the fertilized egg of the mouse together with the recombinant DNA, and the surviving fertilized egg is the egg of a pseudopregnant mouse. It can be obtained by transplanting to a tube, breeding a mouse, and selecting a pup having a recombinant DNA from a born pup.
Selection of a pup having a recombinant DNA and a genetic marker from a born mouse is confirmed using the expression product of the gene marker expressed in the pup as an index. The method can be carried out efficiently. For example, when EGFP is used as a gene marker, the recombinant DNA and gene marker are introduced by irradiating the born mouse with ultraviolet rays and selecting those that emit green fluorescence by EGFP expressed on the skin of the mouse. Thus, transgenic mice can be efficiently selected by the method for confirming the presence or absence of.
[0021]
A fertilized egg into which the recombinant DNA of the present invention is introduced can be obtained by mating male and female mice.
Examples of the method for introducing the recombinant DNA of the present invention into a fertilized egg include a microinjection method, a method using a retrovirus vector, a method using embryonic stem cells, and the like, and a microinjection method is preferably exemplified.
In addition, methods such as culture of fertilized eggs, microinjection, and transplantation of fertilized eggs used in the present invention can be performed by ordinary methods well known to those skilled in the art.
[0022]
Appearance of Lewy bodies reproduced by the transgenic mouse of the present invention, behavioral abnormalities, and a decrease in brain dopamine can be confirmed as follows.
The appearance of Lewy bodies can be confirmed as inclusion bodies in nerve cells by observing a brain section prepared from a transgenic mouse with an anti-α-synuclein antibody under a microscope. In addition, behavioral abnormalities can be confirmed as reduced motor function compared to non-transgenic mice by measuring motor function through behavioral experiments using rotor rods, etc., and comparing with non-transgenic mice. it can. Decrease in brain dopamine can be confirmed by extracting proteins from brain tissues prepared from control mice and transgenic mice and comparing the amount of dopamine contained. Preferably, a decrease in dopamine is confirmed in the cerebral striatum.
[0023]
The SIY8713 transgenic mouse produced by the present inventors and succeeded in passage is a disease model animal for Parkinson's disease that reproduces Lewy bodies and Lewy degenerative neurites that are pathologically found in Parkinson's disease. In addition, SIY8713 transgenic mice showed a marked decrease in motor function from learning behavior experiments. SIY8713 transgenic mice also reproduce the reduction of dopamine, the most important change in Parkinson's disease. This indicates that it is also useful for the development of new therapeutic agents for L-dopa replacement therapy, which is currently the standard treatment for Parkinson's disease. These findings indicate that the transgenic mouse of the present invention that highly expresses the double mutant α-synuclein protein (double mutation of A30P and A53T) developed by the present inventors is used as an animal model of Parkinson's disease. It is shown that it is useful as a screening system for elucidating the mechanism of development and developing fundamental therapeutics and therapeutic agents.
[0024]
Specifically, the transgenic mouse of the present invention can be used as a screening system for Parkinson's disease therapeutic agent, for example, as follows. The transgenic mice of the present invention are divided into a test mouse group and a control mouse group, and a therapeutic drug to be tested is administered to the test mouse group, and then brain tissue is prepared from each of the test mouse group and the control mouse group. , Observe the improvement of pathological changes and the reduction of dopamine decrease due to accumulation of α-synuclein such as Lewy bodies and Lewy degenerative neurites, and compare the groups by behavioral experiments and examine the effects of therapeutic agents Thus, a therapeutic drug for Parkinson's disease can be screened. As an example of such a therapeutic agent, a therapeutic agent for L-dopa replacement therapy is preferably mentioned.
[0025]
In the mutant transgenic mouse brain developed by the present inventors, accumulation of mutant α-synuclein protein in neurons and Lewy bodies and Lewy degeneration neurites were observed. In addition, a significant decrease in motor function was confirmed by mouse behavioral experiments. Furthermore, a selective reduction of dopamine in the basal ganglia was also reproduced. Based on these findings, the transgenic mice expressing the double mutant α-synuclein (A30P, A53T mutation) developed by the inventors of the present application are used as a disease model for Parkinson's disease to investigate the mechanism of disease development and develop therapeutic methods. Very useful. SIY8713 mice can be easily screened for the most highly expressed lines using 365-nm ultraviolet irradiation, and are useful for rapid mouse screening with a uniform expression system for therapeutic drug development.
[0026]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples unless it exceeds the gist.
(1) Preparation of double mutant human α-synuclein gene transfer vector
As a DNA for introducing the double mutant human α-synuclein gene, genomic DNA (8.1 kb) having a human Thy-1 promoter specifically expressed in mouse neurons was used (Gordon JW, Chesa PG, Nishimura H, Retting WJ, Maccari JE, Endo T, Seravalli E, Seki T, Silver J. Regulation of Thy-1 gene expression in transgenic mice. Cell 50: 445-452, 1987.). The human Thy-1 gene translation region of this genomic DNA has an artificial mutant sequence including a HindIII sequence (bold) and an XbaI sequence (underlined) immediately before the start codon (FIG. 5).
[0027]
The alanine residue of
[0028]
Missense mutation primer A30P-forward: TGTGGCAGAAGCACCAGGA (SEQ ID NO: 4)
Missense mutation primer A30P-reverse: TCCTGGTGCTTCTGCCACA (SEQ ID NO: 5)
[0029]
PCR using the A30P-forward and M13R primer sets, and the A30P-reverse and M13F primer sets, respectively, using human normal α-synuclein cDNA cloned in Plasmid Bluescript II KS (Stratagene) as template DNA Went. PCR was performed at a reaction condition of 30 cycles of 94 ° C., 1 minute; 54 ° C., 1 minute; 72 ° C., 1 minute. Both obtained PCR products were mixed, and PCR was carried out using M13F / M13R primers as template DNA to obtain A30P missense mutant α-synuclein cDNA clones. PCR was performed at a reaction condition of 30 cycles of 94 ° C., 1 minute; 54 ° C., 1 minute; 72 ° C., 1 minute.
[0030]
Next, the alanine residue of amino acid number 53 of the human normal α-synuclein protein shown in SEQ ID NO: 1 Threonine Mutation that replaces a residue (A53 T In order to introduce (mutation), the following primer for introducing a missense mutation was prepared.
[0031]
Missense mutation primer A53T-forward: TGGTGTGACAACAGTGGCT (SEQ ID NO: 6)
Missense mutation primer A53 T -Reverse: AGCCACTGTTGTCACACCA (SEQ ID NO: 7)
[0032]
Using the A30P missense mutant α-synuclein cDNA clone as a template DNA, the above A53T-forward and A53 T A double mutant α-synuclein cDNA clone having a double mutation (A30P / A53T) was obtained by carrying out the same PCR operation as in the introduction of the A30P mutation using a reverse primer. This cDNA clone was incorporated into a human Thy-1 genomic DNA that had been previously cleaved with HindIII and an α-synuclein cDNA (450 bp) fragment having a double mutation, cloned into Bluescript II KS, and cleaved with SalI / NotI. A double mutant α-synuclein gene transfer vector (phThy1-αSN (A30P / A53T)) was prepared (FIG. 1).
[0033]
(2) Preparation of transgene marker
About 730 bp of EGFP (Enhanced green fluorescent protein) cDNA containing a Kozak sequence derived from Aequorea victoria was used as a visible gene marker. The gene marker is pEGFP-Basic (Clontech Company) as a template, and EcoRI linkers are created at both ends of the cDNA of EGFP containing the Kozak sequence by PCR. -expression transfectants with a novel eukaryotic vector, Gene, 108, 193-199, 1991) About 3 Kb fragment (CX-EGFP) was recovered by digestion with SalI-BamHI from the plasmid pCX-EGFP into which the PCR product was introduced. Thus, a transgene marker (CX-EGFP) was obtained.
[0034]
(3) Production of transgenic mice
In the transgenic mice, the double mutant α-synuclein gene transfer vector phThy1-αSN (A30P / A53T) obtained in (1) and the transgene marker CX-EGFP obtained in (2) were mixed at a gene mixing molar ratio of 1 : Adjusted to 1, BDF by micro-injection method 1 Fertilized eggs (BDF) obtained by natural mating between mice 2 ) Was co-introduced into the male pronucleus of 1) and then transplanted into the oviduct of a Jcl: ICR pseudopregnant mouse (0.5 dpc). At 19.5 dpc after fertilized egg transplantation, survivors were excised or spontaneously delivered from caesarean section from pregnant mice to obtain 129 F0 mice. The basic operation for producing a transgenic mouse was performed according to Methods in Enzymology Vol 225 “Guide to techniques in mouse development” edited by Paul M. Wassarman, Melvin L. DePamphilis, Academic Press, INC.
[0035]
The expression of EGFP in the obtained 129 F0 mice was examined by ultraviolet irradiation at 365 nm, and green fluorescence was confirmed in 18 animals.
PCR analysis was performed on all 129 tails obtained, including the 18 animals. Primer based on part of the base sequence of human α-synuclein gene using genomic DNA extracted from mouse tail (forward: TGG ATG TAT TCA TGA AAG GA (SEQ ID NO: 8); reverse: CCA GTG GCT GCT GCA ATG CTC (SEQ ID NO: 9)) and a primer based on a part of the base sequence of the EGFP gene (forward: TGG TGA GCA AGG GCG AGG AG (SEQ ID NO: 10); reverse: TCG TGC TGC TTC ATG TGG TC (SEQ ID NO: 11) )) Was used to confirm the introduction of the introduced human α-synuclein gene and EGFP gene. PCR was performed under the reaction conditions of 35 cycles of 94 ° C., 1 minute; 52 ° C., 1 minute; 72 ° C., 1 minute.
[0036]
As a result, all the transgenic mice emitting fluorescence were confirmed to have a transgene by PCR determination. Moreover, the transgene was not confirmed by PCR determination in all mice that did not emit fluorescence. Therefore, it was confirmed that the presence of fluorescence indicates the presence of the transgene, and the intensity of green fluorescence and the expression intensity of α-synuclein protein were considered to be proportional.
Eighteen transgenic mice were irradiated with 365 nm ultraviolet light, and the expressed GFP was excited, and the skin emitted green fluorescence. Among them, the green fluorescence was the strongest and the human α-synuclein protein was most highly expressed. Three transgenic mice were obtained.
Of these, one line of SIY8713 mice with the highest expression of biochemical histology and behavioral disorder were selected by biochemistry, pathological examination and (5) behavioral experiment shown in (4) below. , Grew up.
[0037]
(4) Biochemistry and pathological examination
SIY8713 mice, one of the three mice that expressed the highest expression of α-synuclein protein, were immunohistochemically examined using anti-α-synuclein antibodies (Baba M, Nakajo S, Tu PH, Tomita T, Nakaya K, Lee VM, Trojanowski JQ, Iwatsubo T. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol 1998 Apr; 152 (4): 879-84 .; Shoji M, Harigaya Y, Sasaki A, Ueda K, Ishiguro K, Matsubara E, Watanabe M, Ikeda M, Kanai M, Tomidokoro Y, Shizuka M, Amari M, KosakaK, Nakazato Y, Okamoto K, Hirai S. Accumulation of NACP / alpha-synucleinin Lewy body disease and multiple system atrophy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000 May; 68 (5): 605-8. Specifically, an anti-α-synuclein monoclonal antibody (LB509; Cosmo Bio) was labeled with an ABC elite-stained mouse kit (Funakoshi), the mouse brain was fixed with 4% paraformaldehyde for 8 hours, embedded in paraffin, and 5 μ It was made to react with the mouse | mouth brain section which produced the section | slice of m, and immunostaining was performed. Further, immunostaining was similarly performed using a tyrosine hydroxylase antibody and a substance P antibody. In addition, brain sections similarly prepared by each staining method (Nissle, HE) were stained. As a result, human α-synuclein-expressed protein accumulates in neurons of the brain stem, cerebellar dentate nucleus, cerebellar Purkinje cells, and cerebral cortical neurons including the midbrain substantia nigra (Fig. 2a), and is found in Parkinson's disease / DLB Lewy bodies were confirmed in brainstem neurons (Fig. 2c, e, f). In addition, Lewy degenerative neurites were found in the brain stem and cerebral cortex. Tyrosine hydroxylase (Fig. 2g) and substance P (Fig. 2i) immunostaining confirmed a decrease in neuroactive substances and abnormalities in neuroactive substances and dopamine metabolism. In the electron microscope, intranuclear inclusions were observed in 6 month old mice (Fig. 2l), and intracellular inclusions were observed in 11 month old mice (Fig. 2k). These inclusion structures were consistent with the findings seen in Parkinson's disease.
[0038]
Hereinafter, the results shown in FIG. 2 will be described.
a. SIY8713 strain mouse; α-synuclein α-synuclein immunostaining (LB509), x12, marked accumulation of α-synuclein is observed in SIY8713 strain mice.
b. Non-transgenic mouse; α-synuclein immunostaining (LB509), x12
c. SIY8713 strain mouse; α-synuclein immunostaining (LB509), x200, Lewy bodies are observed in the endoplasmic reticulum.
d. Non-transgenic mouse; α-synuclein immunostaining (LB509), x200
e. SIY8713 strain mouse; Nissle staining, x100, round accumulation in the endoplasmic reticulum is confirmed.
f. SIY8713 strain mouse; observed with HE staining, x200, HE.
g. SIY8713 strain mouse; Tyrosine hydroxylase immunostaining, x100, marked decrease is observed.
h. Non-transgenic mouse; tyrosine hydroxylase immunostaining, x100, i. SIY8713 strain mouse; substance P immunostaining, x100
j. Non-transgenic mouse; substance P immunostaining, x100
k. SIY8713 strain mouse; electron microscopic findings, x33000, Lewy bodies are observed microscopically.
l. SIY8713 strain mouse; electron microscopic findings, x12000, inclusion bodies are also observed in the nucleus.
[0039]
(5) Behavioral experiment
The SIY8713 strain mouse obtained in (4) was subjected to a behavioral experiment using a rotor rod. The experimental apparatus used was TRED MILL FOR MICE 7600 (ugo basile, biological research apparatus. Milan, Italy). The experiment was performed by rotating the rod at 16 cycles / minute and measuring the mouse fall time (second) in 1 minute.
As a result, a statistically significant decrease in motor function was observed in the 4-month-old transgenic mice compared to the non-transgenic mice of the same age (p <0.01, Figure 3). That is, SIY8713 strain mice developed behavioral disorders.
[0040]
(6) Measurement of catecholamines in the brain
Intra-brain catecholamines were measured in the mouse brain. After transgenic and control (non-transgenic) mouse brains were irradiated with microwaves (9.0 kW, 0.42 seconds, NJE 2603, New Japan Radio, Kamifukuoka, Japan), the mice were dissected and the brain weight was measured. Divided into each brain region, 1 ml of 0.05 M perchloric acid and 10 nmol / 10 μl of ethylhomocholine iodideas were added, and an ultrasonic crusher (US-300T, Nissei, Tokyo, (Japan), and ultracentrifuged at 17,300 g, 4 ° C, 15 minutes. The supernatant was passed through a 0.45 μm Millipore filter, and 5 μl of the sample was loaded into an HPLC equipped with various catecholamine electrochemical detectors (LC-ECD) to measure each concentration. The centrifuged precipitate was stirred again with 2 ml of 1 M NaOH to determine the protein concentration (Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, Richmond, California, USA).
As a result, dopamine was decreased in the form of linear bodies in the brains of 10-month-old SIY8713 mice (FIG. 4).
[0041]
(7) Selection of transgenic mice with GFP
Highly expressed SIY8713 strain mice were irradiated with 365 nm UV light and observed for GFP fluorescence.
As a result, high-expressing SIY8713 strain mice fluoresced by GFP introduced at the same time when irradiated with ultraviolet rays at 365 nm, and transgenic mice could be easily selected.
[0042]
【The invention's effect】
Parkinson's disease model transgenic mouse that reproduces the appearance of Lewy bodies, behavioral abnormalities and a decrease in brain dopamine, in which a double mutant gene of α-synuclein gene that is a Parkinson's disease causative gene is introduced according to the present invention, A method for efficiently selecting the same transgenic mouse and a method for screening a therapeutic agent for Parkinson's disease using the same transgenic mouse are provided.
[0043]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a transgene construct.
FIG. 2 is a diagram (photograph) showing immunostaining of SIY8713 strain mice.
FIG. 3 is a diagram showing the results of a rotor rod test.
FIG. 4 shows changes in cerebral catecholamines.
DA: Dopamine, NE: Norepinephrine, 5HT: Serotonin, Ach: Acethlcholine
CN: control cerebral cortex, CT: transgenic mice cerebral cortex; HN: control hippocampus, HT: transgenic mice hippocampus; MTN: in control Control midbrain-thalamus, MTT: transgenic mice midbrain-thalamus; SN: control striatum, ST: transgenic mice striatum; HyN: Control hypothalamus, HyT: Transgenic mice hypothalamus; MPN: Control medulla-pons, MPT: Transgenic mice medulla-pons; CeN: control cerebellum, CeT: transgenic mice cerebellum; WN: control whole brain, WT: transgenic mice whole brain.
FIG. 5 is a diagram showing a mutant sequence of the human Thy-1 gene.
Claims (9)
マウスを選択する、レビー小体の出現、行動異常及び脳内ドーパミンの低下を再現するパーキンソン病モデルトランスジェニックマウスの作製方法。In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, a first mutation that substitutes a proline residue for an amino acid residue corresponding to an alanine residue of amino acid number 30 and an amino acid corresponding to an alanine residue of amino acid number 53 DNA encoding the second α- synuclein protein having a mutation of replacing residues on threonine residues, to construct a recombinant DNA that is placed under the control of the promoter, the recombinant DNA and genetic markers Introducing into a fertilized egg of a mouse, transplanting the obtained fertilized egg to a pseudopregnant mouse, raising the mouse, and using the expression product of the gene marker as an index, Parkinson's disease model transgenic mice that reproduce the appearance of Lewy bodies, behavioral abnormalities, and decreased brain dopamine selection Manufacturing method.
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