JP4776153B2 - Stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene-deficient model non-human animal - Google Patents

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Description

本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等に関する。   In the present invention, stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene function is deficient on the chromosome, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function due to abnormal insulin biosynthesis, and / or pituitary gland. A model non-human animal that develops pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis, and type 2 diabetes and / or pituitary gland caused by the insulin secretion abnormality and / or endoplasmic reticulum function abnormality Type 2 diabetes and / or pituitary gland resulting from abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function using a model non-human animal that develops pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis For the prevention and treatment of pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis, and insulin secretion abnormality and / or endoplasmic reticulum function abnormality Due to type 2 diabetes mellitus, and / or, a diagnostic method of pituitary dwarfism caused biosynthesized abnormality of growth hormone in the pituitary gland.

真核細胞においては、その細胞内膜系の一つとして小胞体（endoplasmic reticulum:ＥＲ）と呼ばれる小器官がある。小胞体（ＥＲ）では、一重膜に囲まれた細管状或いは平板状の膜系がつながり、細胞質全体に広がる一つの網状構造が形成されている。小胞体（ＥＲ）には、リボソームを結合しタンパク質合成を行う粗面小胞体とリボソームを結合していない滑面小胞体とが存在する。小胞体の機能としては、粗面小胞体では、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、ゴルジ体タンパク質、リソソームタンパク質、小胞体タンパク質等の合成が行われている。   In eukaryotic cells, there is an organ called endoplasmic reticulum (ER) as one of the intracellular membrane systems. In the endoplasmic reticulum (ER), a tubular or flat membrane system surrounded by a single membrane is connected to form a single network structure extending throughout the cytoplasm. The endoplasmic reticulum (ER) includes a rough endoplasmic reticulum that binds ribosomes for protein synthesis and a smooth endoplasmic reticulum that does not bind ribosomes. As for the function of the endoplasmic reticulum, in the rough endoplasmic reticulum, synthesis of secreted protein, cell membrane protein, Golgi apparatus protein, lysosomal protein, endoplasmic reticulum protein and the like is performed.

また、滑面小胞体では、主として、リン脂質やコレステロールなどの複合脂質の合成や、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを水素供与体とし、シトクロムＰ４５０、シトクロムｂ5とそれぞれの還元酵素からなる二つの電子伝達系やグルコース−６−ホスファターゼ、エステラーゼ等の酵素の存在下に、種々の内因性、外因性物質の代謝への関与が行われている。更に、滑面小胞体では、Ｃａ2+結合タンパク質やＣａ2+−ＡＴＰアーゼ、イノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体の存在により、動因可能な細胞内Ｃａ2+貯留を構成し、細胞内シグナル伝達に重要な役割が演じられている。 In the smooth endoplasmic reticulum, mainly the synthesis of complex lipids such as phospholipids and cholesterol, and two electron transfer systems consisting of cytochrome P450, cytochrome b 5 and their respective reductases, with NADPH and NADH as hydrogen donors, In the presence of enzymes such as glucose-6-phosphatase and esterase, various endogenous and exogenous substances are involved in metabolism. Furthermore, in the smooth endoplasmic reticulum, the presence of Ca 2+ binding protein, Ca 2+ -ATPase, and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor constitutes an intracellular Ca 2+ reservoir capable of mobilization. However, it plays an important role in intracellular signal transduction.

これらの小胞体は、膵臓においては、粗面小胞体が著明に発達し、肝細胞では、粗面小胞体と滑面小胞体とが約１：１の比率で、また、Ｃａ2+貯留の機能の発達した筋細胞や神経細胞では、固有の滑面小胞体が存在する。 These endoplasmic reticulums are markedly developed into rough endoplasmic reticulum in the pancreas, and in hepatocytes, the ratio of rough endoplasmic reticulum to smooth endoplasmic reticulum is about 1: 1, and Ca 2+ retention is also observed. In myocytes and nerve cells that have developed functions, there are unique smooth endoplasmic reticulum.

小胞体（ＥＲ）では、膜タンパク質及び分泌タンパク質がそれぞれ正しく折りたたまれ（folding）、オリゴマーの形成がなされている。細胞がいったんグルコース欠乏、タンパク質の糖鎖形成の抑制、Ｃａ2+恒常性の阻害（小胞体ストレス）又は低酸素などのストレスにさらされると、折り畳まれていないタンパク質が小胞体に蓄積し、真核細胞は転写の誘導、翻訳の抑制、及び分解にかかわる機構で応答する（Cell. 101, 451-454, 2000）。このように真核細胞が、ストレスにさらされると細胞の応答反応として、ストレスタンパク質の誘導がなされるが、ストレスタンパク質は、タンパク質の折りたたみ（高次構造形成）や解離会合を制御（シャペロン機能）し、膜透過、局在化、分解などに重要な役割を果たす。小胞体ストレス関連タンパク質の最も重要な役割として、虚血、糖尿病、癌及び神経変性疾病等といった、様々な病理学的症状が知られており、これまでにも多くの報告がなされている（Nature Med. 7, 317-323, 2001、Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001、J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002、Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001、Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999）。 In the endoplasmic reticulum (ER), membrane proteins and secreted proteins are correctly folded, and oligomers are formed. Once cells are exposed to glucose deficiency, inhibition of protein glycosylation, inhibition of Ca 2+ homeostasis (endoplasmic reticulum stress) or hypoxia, unfolded proteins accumulate in the endoplasmic reticulum and Nuclear cells respond by mechanisms involving transcriptional induction, translational repression, and degradation (Cell. 101, 451-454, 2000). In this way, when eukaryotic cells are exposed to stress, stress proteins are induced as cellular response responses, but stress proteins control protein folding (formation of higher-order structures) and dissociation association (chaperone function). And plays an important role in membrane permeation, localization, and degradation. As the most important role of endoplasmic reticulum stress-related protein, various pathological symptoms such as ischemia, diabetes, cancer and neurodegenerative diseases are known, and many reports have been made so far (Nature Med. 7, 317-323, 2001, Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001, J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002, Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001, Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999).

膵臓β細胞は、小胞体からはじまる高度に発達した分泌腺組織を持っており、グルコースの刺激に応答して莫大な量のインスリンを産生・分泌する。β細胞のグルコースに対する応答は主に２段階で制御されている。１）秒／分単位で行われる貯蔵顆粒からのインスリン分泌（Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999）。２）分／時間単位で行われる翻訳レベルのプレプロインスリンの生合成（Nature 283, 100-102, 1980、Biochem. J. 235, 459-467, 1986）。グルコース恒常性と膵臓β細胞生存における小胞体機能の重要な役割について、これまでに数多くの報告がなされている。高グルコース条件下では、ＭＩＮ６細胞において、トランスロコン構成分子７種類を含む早期分泌経路構成成分の発現が上昇する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000）。小胞体局在リン酸化酵素、ＰＥＲＫ、又は真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２ａ）αサブユニットのホモ接合性変異により、グルコース恒常性は重度の障害をうけ、膵臓β細胞の細胞死を伴うことが報告されている（Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001、EMBO J. 18, 4804-4815, 1999）。対照的に、ＣＨＯＰ遺伝子を分裂させることにより小胞体ストレス関連糖尿病を遅らせることが報告されている（J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002）。   The pancreatic β cell has a highly developed secretory gland tissue starting from the endoplasmic reticulum, and produces and secretes a huge amount of insulin in response to glucose stimulation. The response of β cells to glucose is mainly controlled in two stages. 1) Insulin secretion from stored granules performed in seconds / minute (Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999). 2) Translational preproinsulin biosynthesis performed in minutes / hours (Nature 283, 100-102, 1980, Biochem. J. 235, 459-467, 1986). There have been many reports to date regarding the important role of endoplasmic reticulum function in glucose homeostasis and pancreatic beta cell survival. Under high glucose conditions, the expression of early secretory pathway components including 7 types of translocon constituent molecules is increased in MIN6 cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000). Homozygous mutations in endoplasmic reticulum localized phosphorylase, PERK, or eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2a) α subunit, severely impaired glucose homeostasis and associated pancreatic β cell death Have been reported (Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001, EMBO J. 18, 4804-4815, 1999). In contrast, it has been reported to disrupt endoplasmic reticulum stress-related diabetes by disrupting the CHOP gene (J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002).

ＳＥＲＰ１（ストレス関連小胞体タンパク質１：Stress-associated ER protein 1）は、低酸素・虚血又は小胞体ストレスによって誘導される分子であると考えられており（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）、最初、Ｓｅｃ６１複合体と一緒に精製されたＲＡＭＰ４（リボゾーム関連膜タンパク質４：Ribosome-associate membrane protein 4）と同一であることが判明している（Cell 75, 615-630, 1993）。   SERP1 (Stress-associated ER protein 1) is considered to be a molecule induced by hypoxia / ischemia or endoplasmic reticulum stress (J. Cell Biol. 147, 1195-1204). , 1999), initially found to be identical to RAMP4 (Ribosome-associate membrane protein 4) purified with the Sec61 complex (Cell 75, 615-630, 1993). .

また、ＲＡＭＰ４は移動休止機構（translocational pausing mechanism）によって、ＭＨＣクラスII関連インバリアント（不変）鎖に対し糖鎖形成を調節し（EMBO J. 18, 4804-4815, 1999）、ＳＥＲＰ１の過剰発現はＳｅｃ６１複合体と関連して小胞体ストレス条件下において、新規合成膜タンパク質を安定化することも報告されている（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）。   In addition, RAMP4 regulates sugar chain formation for MHC class II-related invariant (invariant) chains by a translocational pausing mechanism (EMBO J. 18, 4804-4815, 1999), and overexpression of SERP1 It has also been reported to stabilize newly synthesized membrane proteins under endoplasmic reticulum stress conditions in conjunction with the Sec61 complex (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999).

ストレス関連小胞体タンパク質１（ＳＥＲＰ１）の遺伝子は、本発明者らによって取得され、そのストレス関連小胞体タンパク質１は、６６アミノ酸からなる小タンパク質であることが開示されている（特開２０００−２４５４７４号公報）。
特開２０００−２４５４７４号公報。 Cell. 101, 451-454, 2000。 Nature Med. 7, 317-323, 2001。 Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001。 J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002。 Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001。 Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999。 Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999。 Nature 283, 100-102, 1980。 Biochem. J. 235, 459-467, 1986。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000。 EMBO J. 18, 4804-4815, 1999。 J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999。 Cell 75, 615-630, 1993。 The gene of stress-related endoplasmic reticulum protein 1 (SERP1) was acquired by the present inventors, and it is disclosed that the stress-related endoplasmic reticulum protein 1 is a small protein consisting of 66 amino acids (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-245474). Issue gazette).
JP 2000-245474 A. Cell. 101, 451-454, 2000. Nature Med. 7, 317-323, 2001. Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001. J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002. Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001. Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999. Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999. Nature 283, 100-102, 1980. Biochem. J. 235, 459-467, 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000. EMBO J. 18, 4804-4815, 1999. J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999. Cell 75, 615-630, 1993.

本発明の課題は、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、その作製方法、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等を提供することにある。   A subject of the present invention is a model that develops type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal function of endoplasmic reticulum and / or pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland. Pituitary dwarfism caused by non-human animal, production method thereof, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or dysfunction of endoplasmic reticulum, and / or abnormal growth hormone biosynthesis in pituitary gland Pituitary Dwarf Caused by Type 2 Diabetes Mellitus Caused by Abnormal Insulin Secretion and / or Endoplasmic Reticulum Function and / or Abnormal Biosynthesis of Growth Hormone in the Pituitary Gland For screening for prophylactic / therapeutic agents for infectious diseases, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function, and / or pituitary caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland It is to provide a diagnostic method or the like of sexual dwarfism.

中枢神経系を構成する細胞のうち、神経細胞はストレスに対して極めて脆弱であるのに対して、グリア細胞、特にアストロサイトはストレス抵抗性を示す。本発明者は、アストロサイトのストレス抵抗性には様々なストレス関連遺伝子の誘導が必要であることを発見し、低酸素・再酸素に暴露した培養アストロサイトを用いて、いくつかの新規ストレス関連遺伝子をクローニングし、その一つとして、ＳＥＲＰ１の遺伝子をクローニングした（配列表の配列番号１）。   Among cells constituting the central nervous system, nerve cells are extremely vulnerable to stress, whereas glial cells, particularly astrocytes, exhibit stress resistance. The present inventor has discovered that stress resistance of astrocytes requires induction of various stress-related genes, and using cultured astrocytes exposed to hypoxia / reoxygen, several novel stress-related The gene was cloned, and as one of them, the SERP1 gene was cloned (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).

ＳＥＲＰ１（ストレス関連小胞体タンパク質１）は、６６アミノ酸からなる小タンパク質（配列表の配列番号２）で、細胞内で小胞体に存在し、Ｃ末端に膜貫通領域を持つ、いわゆるＣ末端アンカータンパク質（C-terminal anchored protein）と呼ばれる膜タンパク質であり、小胞体膜上で、Ｓｅｃ６１複合体（Sec61 complex）と結合している。Ｓｅｃ６１複合体は、分泌系タンパク質が小胞体へ入る際のチャネルのような働きをしているもので、通常は細胞質から小胞体へ分泌系タンパク質を移動させ、小胞体にストレスがかかった状態では、小胞体から細胞質へフォールデイングのうまくできなかったタンパク質を移動させる働きを持っていると考えられている。   SERP1 (stress-related endoplasmic reticulum protein 1) is a small protein consisting of 66 amino acids (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), is present in the endoplasmic reticulum within the cell, and has a transmembrane region at the C-terminus. It is a membrane protein called (C-terminal anchored protein) and is bound to the Sec61 complex (Sec61 complex) on the endoplasmic reticulum membrane. The Sec61 complex works like a channel when secretory proteins enter the endoplasmic reticulum. Normally, the secretory protein moves from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum, and when the endoplasmic reticulum is stressed, It is thought that it has a function to move a protein that could not be folded well from the endoplasmic reticulum to the cytoplasm.

本発明者は、このＳＥＲＰ１の機能解析を行う中で、ＳＥＲＰ１の過剰発現はＳｅｃ６１複合体と関連して小胞体ストレス下において、新規合成膜タンパク質を安定化すること、すなわち、小胞体ストレス下において、小胞体に貯まる膜タンパク質の安定化を行うことを確認していたので、これらのことより、ＳＥＲＰ１は分泌系タンパク質或いは膜タンパク質に直接作用していることを想定した。そして、本発明者は、ＳＥＲＰ１が膵臓ランゲルハンス島とＭＩＮ６細胞において、Ｓｅｃ６１複合体と同程度に極めて強く発現していることを見い出し、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ１はグルコース刺激後のインスリン生合成に不可欠ではないものの、インスリン生合成を促進し、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に役立つことを明らかにした。   In the functional analysis of SERP1, the present inventor stabilizes a novel synthetic membrane protein under endoplasmic reticulum stress in association with the Sec61 complex, that is, under endoplasmic reticulum stress. Since it was confirmed that the membrane protein stored in the endoplasmic reticulum was stabilized, it was assumed that SERP1 directly acts on the secretory protein or the membrane protein. The present inventor found that SERP1 was very strongly expressed in pancreatic islets and MIN6 cells to the same extent as the Sec61 complex, and as a result of confirmation using SERP1 gene-deficient mice, SERP1 was stimulated by glucose stimulation. Although it is not essential for later insulin biosynthesis, it has been shown to promote insulin biosynthesis and to contribute to survival of pancreatic islets of Langerhans cells under endoplasmic reticulum stress.

したがって、ＳＥＲＰ１はＳｅｃ６１複合体と共に、膵臓においてインスリン生産制御及びストレス応答に関し極めて重要な役割を果たしている。そして、本発明者は、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスが、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病を発症することを見い出した。   Thus, SERP1, together with the Sec61 complex, plays an extremely important role in the control of insulin production and stress response in the pancreas. Then, the present inventor has found that a mouse deficient in SERP1 gene function on the chromosome develops type 2 diabetes caused by an insulin secretion abnormality and / or an endoplasmic reticulum function abnormality due to an abnormality in insulin biosynthesis.

更に、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ（−／−）マウスは、生後４週間以内に起こる成長障害があることを認め、その後の検討により、下垂体での成長ホルモンの生合成が顕著に低下していることが判明した。そして、このＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスが、下垂体性小人症を発症することを見い出した。   Furthermore, as a result of confirmation using mice deficient in SERP1 gene function, SERP (− / −) mice were found to have growth disorders that occurred within 4 weeks of life. Subsequent studies revealed that growth hormone growth in the pituitary gland. It was found that the synthesis was significantly reduced. And it discovered that this SERP1 gene function deficient mouse developed pituitary dwarfism.

本発明は、ＳＥＲＰ１の機能解析における上記知見に基づいて完成するに至ったものであり、本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常（以下、「インスリン分泌異常」という。）及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、その作製方法、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等からなる。   The present invention has been completed based on the above findings in the functional analysis of SERP1, and the present invention relates to insulin secretion due to abnormal insulin biosynthesis, in which the function of the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 is deficient on the chromosome. Pituitary dwarfism caused by abnormalities (hereinafter referred to as "insulin secretion abnormalities") and / or type 2 diabetes caused by ER function abnormalities and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland Model non-human animal that develops, method for producing the same, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum dysfunction, and / or pituitary nature caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland Type 2 diabetes and / or pituitary gland due to abnormal insulin secretion and / or dysfunction of the endoplasmic reticulum using a model non-human animal that develops dwarfism For the prevention and treatment of pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis and type 2 diabetes and / or pituitary gland due to abnormal insulin secretion and / or ER function abnormality It consists of diagnostic methods for pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis.

すなわち詳細には、本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病及び／又は成長ホルモン生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項１）や、インスリン分泌異常が、膵臓β細胞におけるインスリン生合成異常に起因することを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病、及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項２）や、小胞体機能異常が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害であることを特徴とする請求項１又は２記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項３）や、下垂体性小人症の発症が、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項４）や、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるＳＥＲＰ１遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項５）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項６）からなる。 Specifically, the present invention relates to type 2 diabetes and / or growth hormone resulting from abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function, wherein the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene function is deficient on the chromosome. A model non-human animal that develops pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis (Claim 1) or an abnormal insulin secretion is caused by an abnormal insulin biosynthesis in pancreatic β cells. The model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism (Claim 2), or abnormal function of the endoplasmic reticulum is an obstacle to the survival of pancreatic Langerhans islet cells under endoplasmic reticulum stress A model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to claim 1 or 2, or a pituitary dwarf 4. The model non-human that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the onset is caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland The animal (Claim 4) or the deficiency in stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene function is a deficiency in the function of the SERP1 gene shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. The model non-human animal (Claim 5) that develops the type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism described in claim 5, or the non-human animal is a mouse. It consists of a model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism (Claim 6) .

また本発明は、請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン生合成／分泌、及び／又は小胞体機能の異常、或いは、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項７）や、小胞体機能の異常の測定・評価が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害の測定・評価であることを特徴とする請求項７記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項８）や、請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与した場合と、野生型非ヒト動物の場合及び／又はインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合とを、比較・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体
性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１０）からなる。 The present invention also relates to type 2 diabetes caused by an abnormal insulin secretion and / or an abnormal function of the endoplasmic reticulum according to any one of claims 1 to 6 and / or an abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland. A test substance is administered to a model non-human animal that develops pituitary dwarfism, and insulin biosynthesis / secretion and / or small in the model non-human animal or cells, tissues or organs of the model non-human animal Type 2 diabetes and / or pituitary gland resulting from abnormal insulin secretion and / or ER functional abnormality characterized by measuring or evaluating abnormal ER function or growth hormone biosynthesis in the pituitary gland A screening method for a prophylactic / therapeutic drug for pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the rat ( 7 ), and measurement / evaluation of abnormal ER function in pancreas under ER stress It is a measurement / evaluation of the disorder | damage | failure with respect to the survival of a Langerhans islet cell, Type 2 diabetes resulting from abnormal insulin secretion and / or ER functional abnormality according to claim 7 , and / or growth hormone in pituitary gland A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of the symptom ( Claim 8 ), or insulin secretion abnormality and / or endoplasmic reticulum function abnormality according to any one of Claims 1-6 When a test substance is administered to a model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland, and wild type non-human In the case of animals and / or type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function and / or pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland In comparison with the case of Dell non-human animals, it is possible to compare type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum dysfunction and / or abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland. the screening method of preventive and therapeutic agent for pituitary dwarfism due to (claim 9) and, insulin secretion abnormalities according to any one of claims 7 to 9 non-human animal characterized in that it is a mouse and / Or a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for pituitary dwarfism caused by type 2 diabetes caused by abnormal function of endoplasmic reticulum and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland ( claim 10 ). .

本発明において、小胞体に存在し、分泌系タンパク質或いは膜タンパク質に直接作用しているＳＥＲＰ１が、インスリンの合成自身に必須ではないが、グルコース負荷後の急速なインスリン合成に必要であることを明らかにした。２型糖尿病は、末梢でのインスリン抵抗性、及び、ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌障害を特徴とする多因子疾患である。本発明において、ＳＥＲＰ１遺伝子欠損（ノックアウト）モデル非ヒト動物（マウス）を作製することにより、２型糖尿病におけるインスリン合成異常及び小胞体機能の異常を確認し、解明した。   In the present invention, it is clear that SERP1, which is present in the endoplasmic reticulum and directly acts on secretory system proteins or membrane proteins, is not essential for insulin synthesis itself, but is necessary for rapid insulin synthesis after glucose loading. I made it. Type 2 diabetes is a multifactorial disease characterized by peripheral insulin resistance and impaired insulin secretion from the islets of Langerhans. In the present invention, an insulin synthesis abnormality and an endoplasmic reticulum function abnormality in type 2 diabetes were confirmed and elucidated by preparing a SERP1 gene deficient (knockout) model non-human animal (mouse).

更に、本発明においては、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ（−／−）マウスは、生後４週間以内に起こる成長障害があることを認め、その後の検討により、下垂体での成長ホルモンの生合成が顕著に低下していることが判明した。そして、このＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスが、下垂体性小人症を発症することを見い出した。   Furthermore, in the present invention, as a result of confirmation using SERP1 gene function-deficient mice, SERP (− / −) mice were found to have growth disorders that occurred within 4 weeks of life. It was found that the biosynthesis of growth hormone was significantly reduced. And it discovered that this SERP1 gene function deficient mouse developed pituitary dwarfism.

本発明のＳＥＲＰ１遺伝子欠損（ノックアウト）モデル非ヒト動物（マウス）は、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングを可能にする。また、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を可能とする。   The SERP1 gene-deficient (knockout) model non-human animal (mouse) of the present invention is capable of treating type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal function of the endoplasmic reticulum and / or abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland. Enables screening of preventive and therapeutic drugs for pituitary dwarfism. In addition, it is possible to diagnose type 2 diabetes caused by the abnormal insulin secretion and / or abnormal function of the endoplasmic reticulum and / or pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland.

本発明の、２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物とは、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損することにより、膵臓β細胞等におけるインスリン分泌異常や、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害のような小胞体機能異常に起因する２型糖尿病を発症する非ヒト動物、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症する非ヒト動物をいう。本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができ、本発明の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングに用いるモデル非ヒト動物としては、マウスが特に有利に利用することができるが、これらに限定されるものではない。   The model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism of the present invention is an insulin secretion in pancreatic β cells and the like due to the absence of stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene function on the chromosome. Abnormal biosynthesis of growth hormone in non-human animals and / or pituitary glands that develop type 2 diabetes due to abnormalities in the endoplasmic reticulum dysfunction, such as abnormalities or impairment of pancreatic islet cell survival under endoplasmic reticulum stress A non-human animal that develops pituitary dwarfism caused by Specific examples of the non-human animal in the present invention include rodents such as mice, rats, guinea pigs, etc., and the prophylactic / therapeutic agent for type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism of the present invention. As a model non-human animal used for screening, a mouse can be particularly advantageously used, but is not limited thereto.

本発明のＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製は、公知の遺伝子欠損モデル非ヒト動物の作製方法を用いて作製することができる。以下に、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製方法を、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明する。   The model non-human animal in which the SERP1 gene function of the present invention is deficient on the chromosome can be prepared by using a known gene-deficient model non-human animal production method. Hereinafter, a method for producing a model non-human animal in which the SERP1 gene function is deficient on the chromosome will be described using a mouse in which the SERP1 gene function is deficient on the chromosome as an example.

本発明のモデル非ヒト動物の作製に際しての、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）及びその遺伝子の塩基配列（配列番号１）の情報は、本発明において新規にクローニングしたマウスＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子配列（配列表の配列番号１）及びそのＳＥＲＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号２）、更に、本発明者が既にクローニングしたラット及びヒトのＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子配列及びそのＳＥＲＰ１タンパク質のアミノ酸配列（特開２０００−２４５４７４号公報）から得ることができる。   The information on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 and the base sequence (SEQ ID NO: 1) of the gene in producing the model non-human animal of the present invention is the mouse SERP1 newly cloned in the present invention. The gene sequence of the gene (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and the amino acid sequence of the SERP1 protein (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), the gene sequence of the rat and human SERP1 genes already cloned by the present inventors and the SERP1 protein thereof From the amino acid sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-245474).

本発明は、本発明において新規にクローニングした上記配列表の配列番号１に示されるマウスＳＥＲＰ１遺伝子の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ、更には、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡを含むものである。   The present invention relates to a DNA comprising the nucleotide sequence of the mouse SERP1 gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing newly cloned in the present invention or a complementary sequence thereof, or a sequence containing a part or all of these sequences, And DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions and that encodes the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1.

なお、ここで該ＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。   Here, the hybridization conditions for obtaining the DNA include, for example, hybridization at 42 ° C. and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS. More preferable examples include hybridization at 65 ° C. and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS.

ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（−／−）は、例えば、マウス膵臓から構築したマウス遺伝子ライブラリー或いはＭＩＮ６細胞からＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＳＥＲＰ１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＳＥＲＰ１遺伝子の一部又は全部を、例えばｌａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲッティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。   A mouse deficient in SERP1 gene function on the chromosome, that is, a homozygous mutant mouse (− / −) is obtained by, for example, a mouse gene library constructed from mouse pancreas or a gene fragment obtained by a method such as PCR from MIN6 cells. The SERP1 gene is screened, and part or all of the screened SERP1 gene is replaced with a marker gene such as a lac-Z gene or a neomycin resistance gene, and if necessary, diphtheria toxin on the 5 ′ end side. Genes such as the A fragment (DT-A) gene and the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene are introduced to prepare a targeting vector. The prepared targeting vector is linearized, and electroporation (electricity) Perforation) Was introduced into S cells, phase performed homologous recombination, from the homologous recombinants are selected ES cells that are resistant to antibiotics such as dyeing or G418 or ganciclovir (GANC) by X-gal. It is preferable to confirm whether or not the selected ES cell is the target recombinant by Southern blotting or the like.

上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体変異マウス（＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせることによって、ホモ接合体変異マウス（−／−）を得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウスにＳＥＲＰ１遺伝子が欠損しているかどうかを確認する方法としては、例えば、このマウスのＳＥＲＰ１遺伝子の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。   The recombinant ES cell is microinjected into a blastocyst of a mouse, and the blastocyst is returned to a temporary parent mouse to produce a chimeric mouse. When this chimeric mouse is intercrossed with a wild-type mouse, a heterozygous mutant mouse (+/−) can be obtained, and a homozygous mutant mouse can be obtained by intercrossing this heterozygous mutant mouse. (− / −) Can be obtained. As a method for confirming whether or not the SERP1 gene is defective in such a homozygous mutant mouse, for example, there is a method for examining the expression of the SERP1 gene in the mouse by Western blotting or the like.

本発明における、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングは、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン分泌の状態及び／又は小胞体機能の異常、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することにより行う。   In the present invention, type 2 diabetes resulting from abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function due to abnormal insulin biosynthesis, and / or pituitary dwarfism resulting from abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland Screening for prophylactic / therapeutic drugs in patients with type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function and / or pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland A test substance is administered to a developing model non-human animal, and the state of insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function in the model non-human animal or cells, tissues or organs of the model non-human animal, and / or This is done by measuring and evaluating abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland.

上記インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングをする際、野生型非ヒト動物及び／又はＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いて、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合と比較・評価することことが好ましく、野生型非ヒト動物としては、上記ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができ、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6132-6137, 2000）記載の方法等によって作製することができる。ＳＥＲＰ１欠損型と、それらの同腹の野生型は、個体レベルで正確な比較実験・評価（解析）等を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。   Screening for a prophylactic / therapeutic agent for type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function and / or pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland When using wild-type non-human animals and / or non-human animals in which SERP1 gene function is deficient on the chromosome, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function and / or pituitary gland It is preferable to compare and evaluate with a model non-human animal that develops pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone, and as a wild-type non-human animal, the SERP1 gene function is The animal of the same species as the model non-human animal deficient in (2) is preferably exemplified by the same litter, and the non-human animal deficient in SERP1 gene function on the chromosome. The literature (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6132-6137, 2000) can be prepared by the method described. It is preferable to use the SERP1-deficient type and the wild type of the same litter simultaneously at the point that an accurate comparison experiment / evaluation (analysis) or the like can be performed at the individual level.

インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングにおける被検物質を投与したモデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン分泌の状態及び小胞体機能の異常の測定・評価には、グルコース負荷試験による血糖値・インスリン分泌量の測定や、ランゲルハンス島β細胞におけるインスリンの分泌や生合成の測定、或いはランゲルハンス島における細胞死、更には、下垂体での成長ホルモンの生合成の検出・測定等、適宜の測定・評価方法を用いることができる。   Examination in screening for prophylactic / therapeutic drugs for type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function and / or pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland For measurement / evaluation of the state of insulin secretion and abnormal function of the endoplasmic reticulum in the model non-human animal to which the substance has been administered, or the cells, tissues or organs of the model non-human animal, Measurement, evaluation of insulin secretion and biosynthesis in β islets of Langerhans, or cell death in Langerhans islets, and detection and measurement of growth hormone biosynthesis in the pituitary gland are used. be able to.

更に、本発明においては、検体からストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることにより、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を行うことができる。   Furthermore, in the present invention, by extracting the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene from the specimen and examining the presence or absence of the gene abnormality, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function, and / or Diagnosis of pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland can be performed.

また、本発明のストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部をインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用プローブとすることができ、また、このＳＥＲＰ１遺伝子の欠損に起因する疾病の診断用プローブをセットして、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用キットとして製品化することもできる。   In addition, all or part of the antisense strand of DNA or RNA encoding the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 of the present invention is type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function, and / or pituitary gland A probe for diagnosing pituitary dwarfism caused by an abnormal biosynthesis of growth hormone in the rat, and setting a probe for diagnosing a disease caused by the deletion of the SERP1 gene, It can also be commercialized as a kit for diagnosing type 2 diabetes caused by abnormal function of the endoplasmic reticulum and / or pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland.

さらに、本発明においては、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体を用いて、検体におけるストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子による該タンパク質の発現の異常を検出・測定することにより、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を行うことができる。ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体としては、モノクロナール抗体及びポリクロナール抗体のいずれも利用することができる。   Furthermore, in the present invention, by using an antibody that specifically binds to the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1, an abnormality in the expression of the protein by the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene in a specimen is detected and measured, whereby insulin secretion Diagnosis of type 2 diabetes caused by abnormalities and / or abnormal function of the endoplasmic reticulum and / or pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland can be performed. As an antibody that specifically binds to the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

［材料と実験方法］
（マウスＳＥＲＰ１遺伝子のクローニング）
マウスＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡの部分配列を、ラットＳＥＲＰ１との相同性によりＥＳＴクローンより得た。その配列を基に、センスプライマーとしてｍｓ１プライマー（5'-CTGTCCGGTGGTTGGATCCT-3'：配列番号３）、アンチセンスプライマーとしてｍｓ４プライマー（5'-ACTTTGCCGCGCTGAGTTAT-3'：配列番号４）を合成し、マウス１２９Ｓｖ／ＪゲノムＤＮＡライブラリーをＰＣＲにてスクリーニングした。得られたクローンをサザンブロット法により確認した。さらに、得られたクローンの配列をシークエンスすることにより決定した。同定されたマウスＳＥＲＰ１ ゲノムＤＮＡの配列を、配列番号１に示した。
（細胞培養）
マウスインスリノーマ由来の細胞系であるＭＩＮ６細胞（大阪大学の宮崎博士より供与；Endocrinology. 127, 126-132, 1990）を１５％のＦＣＳ及び２５ｍＭのグルコースを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞が７０％コンフルエント状態に達した時に、培地を高グルコース濃度培地（２５ｍＭグルコース）又は低グルコース濃度培地（５．５ｍＭグルコース）と交換した。ＳＥＲＰ１及び他の分子の発現解析は培養開始から２４時間後に行った。
（ノザンブロット法及びin situハイブリダイゼーション）
ＭＩＮ６細胞及びマウス膵臓から全ＲＮＡを単離し、全ＲＮＡ１０μｇを１％アガロースを含むホルムアルデヒドゲルで分子量別に分けた後、Immobilon Nメンブレン（Millipore社製；MA, USA）に固定した。ＳＥＲＰ１のプローブとして、マウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの５´側配列（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの４２８番目から７８８番目の塩基配列：配列番号５）及び、３´側配列（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの７９３５番目から８４０３番目の塩基配列：配列番号６）を用いた。ＳＥＲＰ１、Ｓｅｃ６１（α及びβサブユニット）、及びＧＲＰ７８のＤＮＡ断片によるハイブリダイゼーションは山口らの方法（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）に従って行った。 [Materials and experimental methods]
(Cloning of mouse SERP1 gene)
A partial sequence of mouse SERP1 cDNA was obtained from an EST clone by homology with rat SERP1. Based on the sequence, ms1 primer (5′-CTGTCCGGTGGTTGGATCCT-3 ′: SEQ ID NO: 3) is synthesized as a sense primer, and ms4 primer (5′-ACTTTGCCGCGCTGAGTTAT-3 ′: SEQ ID NO: 4) is synthesized as an antisense primer. / J Genomic DNA library was screened by PCR. The resulting clone was confirmed by Southern blotting. Furthermore, the sequence of the obtained clone was determined by sequencing. The sequence of the identified mouse SERP1 genomic DNA is shown in SEQ ID NO: 1.
(Cell culture)
MIN6 cells (provided by Dr. Miyazaki of Osaka University; Endocrinology. 127, 126-132, 1990), a cell line derived from mouse insulinoma, were cultured in DMEM medium containing 15% FCS and 25 mM glucose. When cells reached 70% confluence, the medium was replaced with high glucose concentration medium (25 mM glucose) or low glucose concentration medium (5.5 mM glucose). The expression analysis of SERP1 and other molecules was performed 24 hours after the start of culture.
(Northern blotting and in situ hybridization)
Total RNA was isolated from MIN6 cells and mouse pancreas, and 10 μg of total RNA was separated by molecular weight with a formaldehyde gel containing 1% agarose, and then immobilized on an Immobilon N membrane (Millipore, MA, USA). As a probe for SERP1, the 5'-side sequence of mouse SERP1 genomic DNA (the 428th to 788th base sequences of mouse SERP1 genomic DNA described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing: SEQ ID NO: 5) and the 3'-side sequence (arrangement) The nucleotide sequence from the 7935th to the 8403rd of the mouse SERP1 genomic DNA described in SEQ ID NO: 1 in the sequence table: SEQ ID NO: 6) was used. Hybridization with DNA fragments of SERP1, Sec61 (α and β subunits), and GRP78 was performed according to the method of Yamaguchi et al. (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999).

ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１またはＳｅｃ６１複合体の発現は、Human Endocrine System MTN? Blot（CLONTECH社製；Palo Alto, CA）を用いて解析した。ジゴキジゲニン標識ＳＥＲＰ１ｃＲＮＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは前述と同様の方法で行った（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999、J Cell Biol. 157, 1151-60, 2002）。膵臓標本を、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、厚さ８μｍの切片に切り分けた。アルカリホスファターゼ標識ジゴキジゲニン抗体を用いてｃＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションをし、ＮＢＴ及びＸ−リン酸塩溶液で発色反応を行うことによりＳＥＲＰ１遺伝子の細胞内局在を調べた。
（免疫沈降、ウエスタンブロット法及び免疫染色）
タンパク質レベルにおけるＳＥＲＰ１の発現と小胞体内分子シャペロンＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４の発現を比較するため、ＭＩＮ６細胞及び単離した膵臓ランゲルハンス島を１％ TritonX-100、１０ｍＭ Tris（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌペプスタチンを含む溶液で溶解した。免疫沈降又はウエスタンブロット法は抗ＳＥＲＰ１抗体（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）、抗ＫＤＥＬ抗体（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４を認識する。StressGen Biotechnologies社製；Victoria, BC, Canada）、及び抗インスリン抗体（Biogenesis社製; Poole England, UK）を用いて行った。一次抗体認識部位はアルカリホスファターゼ標識二次抗体によって検出した。なお、免疫染色は、抗インスリン抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体（マウスより単離したランゲルハンス島にＡｄｅｘ１ ＣＡ ＳＥＲＰ１を用いてＳＥＲＰ１を強制発現させる際に、ＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡをＦＬＡＧでタグしておいて異所性に発現しているＳＥＲＰ１のみＦＬＡＧで確認できるようにした。）を用い、厚さ５μｍの膵臓切片及び／又は単離した膵臓ランゲルハンス島を用いて行った。また、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。なお、山口らの方法（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）に従い、Quality Oneソフトウェア（pdi社製；Huntington Station, NY）を用いて、ウエスタン及びノーザンブロット法の結果を標準化するためにレーザー濃度測定を行った。
（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの作製）
マウス１２９Ｓｖ／Ｊライブラリー（Incyte genomics社製；St. Louis, Mo, USA）由来のマウスＳＥＲＰ１遺伝子のエキソン１をネオマイシン耐性遺伝子（pGK-neo）で置換し、さらに５．２ｋｂｐ上流にｈｓｖ−ｔＫ遺伝子を挿入した配列を、pPNT（Dr. Tybulewiczより供与；MRC National Institute for Medical Research, London, UK）に挿入することにより、ターゲッティングベクターを構築した（図３Ａ）。さらに、ヘテロ接合体胚幹細胞クローンを未分化胚芽細胞に注入することにより、ＳＥＲＰ１突然変異遺伝子の生殖系列伝達系を構築した。 Expression of SERP1 or Sec61 complex in human endocrine tissue was analyzed using Human Endocrine System MTN ? Blot (CLONTECH; Palo Alto, CA). In situ hybridization using a digoxigenin-labeled SERP1 cRNA probe was performed in the same manner as described above (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999, J Cell Biol. 157, 1151-60, 2002). Pancreatic specimens were fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin and cut into 8 μm thick sections. The intracellular localization of the SERP1 gene was examined by hybridization with a cRNA probe using an alkaline phosphatase-labeled digoxigenin antibody and performing a color reaction with NBT and X-phosphate solution.
(Immunoprecipitation, Western blotting and immunostaining)
To compare the expression of SERP1 at the protein level with the expression of endoplasmic reticulum molecular chaperones GRP78 and GRP94, MIN6 cells and isolated pancreatic islets of Langerhans were treated with 1% TritonX-100, 10 mM Tris (pH 7.6), 150 mM sodium chloride, Dissolved in a solution containing 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml leupeptin, and 1 μg / ml pepstatin. Immunoprecipitation or Western blotting includes anti-SERP1 antibody (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999), anti-KDEL antibody (recognizes GRP78 and GRP94, StressGen Biotechnologies; Victoria, BC, Canada), and anti Insulin antibody (Biogenesis, Poole England, UK) was used. The primary antibody recognition site was detected by an alkaline phosphatase labeled secondary antibody. In addition, immunostaining is carried out by using anti-insulin antibody or anti-FLAG antibody (when SERP1 is forcibly expressed using dex1 CA SERP1 on islets of Langerhans isolated from mice, SERP1 cDNA is tagged with FLAG to make it ectopic. Only the expressed SERP1 was confirmed by FLAG.), And a pancreas section having a thickness of 5 μm and / or an isolated pancreatic islet of Langerhans was used. In addition, a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody was used as the secondary antibody. To standardize Western and Northern blot results using Quality One software (pdi; Huntington Station, NY) according to the method of Yamaguchi et al. (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999). The laser concentration was measured.
(Preparation of SERP1 knockout mouse)
Exon 1 of the mouse SERP1 gene derived from the mouse 129Sv / J library (Incyte genomics; St. Louis, Mo, USA) was replaced with a neomycin resistance gene (pGK-neo), and hsv-tK further 5.2 kbp upstream. A targeting vector was constructed by inserting the gene-inserted sequence into pPNT (provided by Dr. Tybulewicz; MRC National Institute for Medical Research, London, UK) (FIG. 3A). Furthermore, a germline transmission system of SERP1 mutant gene was constructed by injecting heterozygous embryonic stem cell clones into undifferentiated germ cells.

マウスをＣ５７ＢＬ／６系統に８世代遡って交配し、ＰＣＲ及びサザンブロット法により遺伝子型を特定した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーはＣＶｎｅｏ１（5'-CTACCCGGTAGAATTGACCT-3'（配列番号７）；pGK-neoカセットでアニールする）、センスプライマーとしてｍｓ６プライマー（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの６３２８番目から６３４７番目の塩基配列、5'-AGACCTCGGTAAGGGAAAGT-3（配列番号８）；ＳＥＲＰ１遺伝子の欠損領域でアニールする）、及びアンチセンスプライマーとしてｍｓ５プライマー（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの６６１５番目から６６３４番目の塩基配列、5'-GGCCAATAACCAGGGTCCTA-3'（配列番号９）；ＳＥＲＰ１遺伝子短腕３’側でアニールする）であり、ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型マウス）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）の比較には、ＳＥＲＰ１+/-マウスの交配によって産まれた同性の同腹仔を用いた。
（血中グルコース濃度及びインスリン濃度の測定）
血中グルコース濃度は、携帯用グルコース測定装置Dexter-Z（Bayer Medical社製）を用いて測定した。腹腔内（ＩＰ）グルコース負荷試験及びインスリン負荷試験（ＩＴＴ）は、マウス体重１ｇあたり２ｍｇのグルコース又は体重１ｇあたり１Ｕのインスリン（１Ｕ／ｋｇ）を腹腔内投与し、特定時刻に尾静脈から血液を採取する方法で行った。血漿、培養培地、及び細胞抽出液中のインスリン濃度及び成長ホルモン濃度はＥＬＩＳＡキット（インスリン濃度：Shibayagi社製、成長ホルモン用キット：Cayman Chemical社製）を用いて測定した。
（組換えアデノウイルスの作製とアデノウイルスによる遺伝子発現）
マウスＳＥＲＰ１のコーディング領域全体とＦＬＡＧエピトープ（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）を含むｃＤＮＡ断片を、pAdx1CAコスミドベクターに挿入し、さらに、アデノウイルス発現キット（TaKaRa社製）を用いた相同組換えにより、組換え型アデノウィルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を作製した。得られたウイルスの力価は、培地１ｍｌあたり約１０９プラーク形成単位（plaque-forming units：ｐｆｕ）であった。対照として、ウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰ（大阪市立大学のKiyama博士より供与）を用いた。単離した膵臓ランゲルハンス島を、１１ｍＭのグルコースを含むＲＰＭＩ １６４０培地中にＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１又はＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰを添加することにより１６時間刺激した後、ＲＰＭＩ １６４０培地中で２４時間培養した。ＳＥＲＰ１の発現は、膵臓ランゲルハンス島を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察することにより解析した。
（パルスラベリング法による、膵臓ランゲルハンス島におけるインスリン生合成及び分泌量の測定）
ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１-/-マウスから、コラゲナーゼ処理により膵臓ランゲルハンス島を単離した。膵臓ランゲルハンス島細胞をグルコースを含まないＲＰＭＩ １６４０培地（Sigma社製）で１時間培養した後、培地中に異なる濃度のグルコース（０〜２２ｍＭ）を添加することにより細胞を刺激し、膵臓ランゲルハンス島細胞中のインスリン分泌及びインスリン含有量を特定時刻に測定した。インスリンの生合成及び分泌量の測定には、２２ｍＭグルコース及び２００μＣｉの35Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（Amersham Pharmacia Biotech Inc.社製；Piscataway, NJ, USA）を含む１００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地中で３０分間培養することにより放射性標識した膵臓ランゲルハンス島細胞を用いた。これらの細胞を抗インスリン抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を１５％トリシン緩衝ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、オートラジオグラフィーにより目的のバンドを検出した。
（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay）
ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１-/-マウスより単離したランゲルハンス島をそれぞれ、1)小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（tunicamycin １μｇ／ｍｌ: Sigma社製）入りのＲＰＭＩ１６４０培地、2)ツニカマイシン及びタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（cycloheximide １μｇ／ｍｌ： Sigma社製）入りのＲＰＭＩ１６４０培地、3)ＲＰＭＩ１６４０培地のみの条件、の計６群に分けて４８時間培養した。その後の細胞の状態を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay（Molecular probe社；Eugene, OR, USA）にて評価した。
［実験結果］
（ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１遺伝子の発現分布）
ＳＥＲＰ１の機能を研究するためのモデル器官を探すため、ヒトの内分泌組織（膵臓、副腎髄質、甲状腺、副腎皮質、精巣、胸腺、小腸、胃の計８組織）における、ＳＥＲＰ１遺伝子及びＳｅｃ６１複合体遺伝子（α，βサブユニット）の組織分布をノザンブロット法により解析した（図１）。その結果、ＳＥＲＰ１遺伝子は膵臓で多く発現し、副腎髄質、甲状腺及び副腎皮質でも検出された。Ｓｅｃ６１αサブユニットは全体的に広く分布していたが、特に膵臓で高発現し、βサブユニットは膵臓の他、副腎皮質でも検出された。いずれの遺伝子も膵臓において高発現することが明らかになった。
（ＭＩＮ６細胞及び膵臓ランゲルハンス島におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体の発現分布）
Ｓｅｃ６１複合体等のトランスロコンメンバーが、高グルコース濃度条件下のＭＩＮ６細胞において発現が上昇することから（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000）、膵臓内におけるＳＥＰＲ１の発現をさらに詳しく解析するために、マウスインスリノーマ由来の細胞系であるＭＩＮ６を用いて検討した。その結果、ＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体は、ｍＲＮＡ及びタンパク質共に、インスリン産生が盛んになる高濃度のグルコース条件下で発現が上昇することが明らかになった（図２Ａ、Ｂ）。また、膵臓切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、ＳＥＲＰ１はランゲルハンス島のβ細胞において強い発現が認められ、絶食条件下で発現が低下することが明らかになった（図２Ｃ）。
（ＳＥＲＰ１遺伝子ノックアウトマウスの作製）
インスリンの生合成、及び分泌におけるＳＥＲＰ１の役割を明らかにするために、相同組換え法を用いてＳＥＲＰ１遺伝子ノックアウトマウスを作製した（図３Ａ）。ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）の比較をサザンブロット法により行った（図３Ｂ）。さらにＳＥＲＰ１ ｍＲＮＡ及びＳｅｃ６１α ｍＲＮＡの発現をノザンブロット法で解析したところ、ＳＥＲＰ１-/-マウスでは、ＳＥＲＰ１遺伝子が発現しないことが確認された（図３Ｃ）。 Mice were crossed back to the C57BL / 6 strain for 8 generations, and genotypes were identified by PCR and Southern blotting. The primers used for PCR were CVneo1 (5′-CTACCCGGTAGAATTGACCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7); annealed with the pGK-neo cassette), the ms6 primer as the sense primer (mouse SERP1 genome described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) The nucleotide sequence from the 6328th to the 6347th DNA, 5′-AGACCTCGGTAAGGGAAAGT-3 (SEQ ID NO: 8); anneal at the deletion region of the SERP1 gene, and ms5 primer as an antisense primer (described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) The 6615th to 6634th nucleotide sequence of mouse SERP1 genomic DNA, 5′-GGCCAATAACCAGGGTCCTA-3 ′ (SEQ ID NO: 9); SERP1 gene short arm 3 ′ side annealed), SERP1 + / + mouse (wild type mouse) ), Ratio of SERP1 +/− mice and SERP1 − / − mice (SERP1 knockout mice) For comparison, same-sex littermates born by mating of SERP1 +/− mice were used.
(Measurement of blood glucose concentration and insulin concentration)
The blood glucose concentration was measured using a portable glucose measuring device Dexter-Z (manufactured by Bayer Medical). Intraperitoneal (IP) glucose tolerance test and insulin tolerance test (ITT), 2 mg glucose / g body weight of mouse or 1 U insulin (1 U / kg) body weight / g is administered intraperitoneally, and blood is collected from the tail vein at a specific time. The method was to collect. The concentrations of insulin and growth hormone in plasma, culture medium, and cell extract were measured using an ELISA kit (insulin concentration: manufactured by Shibayagi, kit for growth hormone: manufactured by Cayman Chemical).
(Production of recombinant adenovirus and gene expression by adenovirus)
A cDNA fragment containing the entire coding region of mouse SERP1 and the FLAG epitope (J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999) was inserted into the pAdx1CA cosmid vector, and an adenovirus expression kit (TaKaRa) was used. Recombinant adenovirus Adex1CA SERP1 was produced by homologous recombination. The titer of the virus obtained was about 109 plaque-forming units (pfu) per ml of medium. As a control, virus Index1CA GFP (provided by Dr. Kiyama of Osaka City University) was used. Isolated pancreatic islets of Langerhans were stimulated for 16 hours by adding dex1CA SERP1 or dex1CA GFP in RPMI 1640 medium containing 11 mM glucose, and then cultured in RPMI 1640 medium for 24 hours. The expression of SERP1 was analyzed by immunostaining pancreatic islets of Langerhans with an anti-FLAG antibody and then observing with a fluorescence microscope.
(Measurement of insulin biosynthesis and secretion in pancreatic islets of Langerhans by pulse labeling method)
Pancreatic islets were isolated from SERP1 + / + , SERP1 +/− and SERP1 − / − mice by collagenase treatment. After culturing pancreatic islets of Langerhans cells in RPMI 1640 medium without glucose (Sigma) for 1 hour, the cells were stimulated by adding different concentrations of glucose (0 to 22 mM) to the medium. Insulin secretion and insulin content were measured at specific times. Insulin biosynthesis and secretion levels were measured for 30 minutes in 100 μl RPMI 1640 medium containing 22 mM glucose and 200 μCi 35 S-Met / Cys (Amersham Pharmacia Biotech Inc .; Piscataway, NJ, USA). In this way, radiolabeled pancreatic islets of Langerhans were used. These cells were immunoprecipitated using an anti-insulin antibody, the precipitated proteins were separated on a 15% tricine buffered polyacrylamide gel, and the target band was detected by autoradiography.
(Live / DEAD assay)
Langerhans islets isolated from SERP1 + / + , SERP1 +/− and SERP1 − / − mice, respectively, 1) RPMI 1640 medium containing tunicamycin (tunicamycin 1 μg / ml: Sigma), an endoplasmic reticulum stress inducer, 2 The cells were cultured in 48 groups for 6 hours, divided into 6 groups: RPMI1640 medium containing tunicamycin and protein synthesis inhibitor cycloheximide (cycloheximide 1 μg / ml: Sigma), 3) RPMI1640 medium alone. The state of subsequent cells was evaluated by a LIVE / DEAD assay (Molecular probe; Eugene, OR, USA).
[Experimental result]
(Expression distribution of SERP1 and Sec61 gene in human endocrine tissue)
SERP1 gene and Sec61 complex gene in human endocrine tissues (pancreatic, adrenal medulla, thyroid, adrenal cortex, testis, thymus, small intestine, stomach total 8 tissues) in order to search for model organs for studying the function of SERP1 The tissue distribution of (α, β subunit) was analyzed by Northern blotting (FIG. 1). As a result, the SERP1 gene was highly expressed in the pancreas and was also detected in the adrenal medulla, thyroid gland and adrenal cortex. Although the Sec61α subunit was widely distributed as a whole, it was highly expressed particularly in the pancreas, and the β subunit was also detected in the adrenal cortex in addition to the pancreas. Both genes were found to be highly expressed in the pancreas.
(Expression distribution of SERP1 and Sec61 complex in MIN6 cells and pancreatic islets of Langerhans)
Since translocon members such as the Sec61 complex are increased in MIN6 cells under high glucose concentration conditions (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000), SEPR1 in the pancreas In order to analyze the expression in more detail, it was examined using MIN6, a cell line derived from mouse insulinoma. As a result, it was revealed that the expression of SERP1 and Sec61 complex increased under high-concentration glucose conditions where both insulin and mRNA are active (FIGS. 2A and 2B). Moreover, when in situ hybridization was performed using a pancreas section, SERP1 was found to be strongly expressed in β cells on the islets of Langerhans and was found to decrease in expression under fasting conditions (FIG. 2C).
(Preparation of SERP1 gene knockout mouse)
To elucidate the role of SERP1 in insulin biosynthesis and secretion, SERP1 gene knockout mice were generated using homologous recombination (FIG. 3A). Comparison of SERP1 + / + mice (wild type), SERP1 +/− mice, and SERP1 − / − mice (SERP1 knockout mice) was performed by Southern blotting (FIG. 3B). Furthermore, when the expression of SERP1 mRNA and Sec61α mRNA was analyzed by Northern blotting, it was confirmed that SERP1 gene was not expressed in SERP1 − / − mice (FIG. 3C).

また、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスは、生後約３週間以内に原因不明の理由で約半数が死亡し、生存したＳＥＲＰ１-/-マウスの体重も、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１+/-マウスの５割程度であることが確認された（図４Ｂ、Ｃ）。８週齢以降は、体重の増加と３群間における体重差の縮小が認められ、雌雄ともに生殖可能であることが明らかになった（図４Ｂ）。 In addition, about half of the SERP1 knockout mice died for about 3 weeks after birth for unknown reasons, and the weight of surviving SERP1 − / − mice was about 50% of that of SERP1 +/− and SERP1 +/− mice. It was confirmed that there was (FIG. 4B, C). After 8 weeks of age, an increase in body weight and a decrease in body weight difference among the three groups were observed, revealing that both males and females can reproduce (FIG. 4B).

ＳＥＲＰ１-/-マウスはメンデルの法則にしたがって生まれ、ＳＥＲＰ１+/+マウス及びＳＥＲＰ１+/-マウスと比較して、体重がわずかに減少したことを除いては、表現型による差は認められなかった（ＳＥＲＰ１-/-マウスに対して０．９±０．１ｇ、他の遺伝子型に対し１．０±０．１ｇ）。しかしながら、１週齢においては、ＳＥＲＰ１-/-マウスの死亡率の上昇（図４Ａ）、及び成長遅延（図４Ｂ及びＣ）が認められ、４週齢になるまで、このような減少が認められた。しかし、予想に反して、後述の２種の表現型では、背景となる系統に依存した。１２９Ｓｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統と交配させたＳＥＲＰ１-/-マウスの約７０％は、成体に成長したが（ｎ＝１４）、Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝１２）と交配させたＳＥＲＰ１-/-マウスでは、その２５％しか４週齢にまで生存しなかった（図４Ａ）。 SERP1 − / − mice were born according to Mendel's law, and no phenotypic differences were observed except for a slight decrease in body weight compared to SERP1 + / + mice and SERP1 +/− mice (0.9 ± 0.1 g for SERP1 − / − mice, 1.0 ± 0.1 g for other genotypes). However, at 1 week of age, an increase in mortality (FIG. 4A) and growth delay (FIGS. 4B and C) of SERP1 − / − mice was observed, and such a decrease was observed until 4 weeks of age. It was. However, contrary to expectations, the two phenotypes described below depended on the background strain. About 70% of SERP1 − / − mice mated with the 129Sv / JxC57BL / 6 strain grew adult (n = 14), but in SERP1 − / − mice mated with C57BL / 6 (n = 12) Only 25% of them survived to 4 weeks of age (FIG. 4A).

ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、生後４週間で、１２９Ｓｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統においては、５０〜７０％にまで減少し、Ｃ５７ＢＬ／６系統においても、４０〜６０％にまで減少した。ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、同週齢（４週齢まで）のＳＥＲＰ１+/+マウスの約５０％であったため、死亡する傾向にあった。死亡したＳＥＲＰ１-/-マウスの解剖により、胃及び腸内に十分量のミルクを認めた。短命であったＳＥＲＰ１-/-マウスの血中グルコース濃度及び肝臓グリコーゲン濃度の解析により、１〜４週齢においては、他の遺伝子型と比較して、特に大きな違いは認められなかった。これらの結果により、ＳＥＲＰ１-/-マウスの高い死亡率は、哺乳量の減少又は腸での吸収障害によるものではないことが示唆された。ＳＥＲＰ１-/-マウスは、いったん４週齢まで生きると、成長及び体重とも一定して増加した。１２週齢まで、ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、両系統において、ＳＥＲＰ１+/+マウスの８０％弱にまで回復した。
（グルコース及びインスリン負荷試験）
ＳＥＲＰ１の発現がインスリンの生合成及び分泌へ与える影響を、in vivoにおけるグルコース負荷試験により検討した。１０週齢及び２５週齢のマウスに、体重１ｇあたり２ｍｇのグルコースを腹腔内投与した後、血糖値を測定した結果、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスにおいて耐糖能異常が認められた。特に、雄においては、雌と比較してより強い耐糖能異常が見られたが、加齢による影響は認められなかった（図５）。 The body weight of SERP1 − / − mice decreased to 50-70% in the 129Sv / JxC57BL / 6 strain at 4 weeks of age, and also decreased to 40-60% in the C57BL / 6 strain. The body weight of SERP1 − / − mice was about 50% of SERP1 + / + mice of the same age (up to 4 weeks of age) and therefore tended to die. A sufficient amount of milk was found in the stomach and intestine by dissection of the dead SERP1 − / − mice. According to the analysis of blood glucose concentration and liver glycogen concentration in SERP1 − / − mice, which were short-lived, no significant difference was observed at 1 to 4 weeks of age compared to other genotypes. These results suggested that the high mortality rate of SERP1 − / − mice was not due to a decrease in milk yield or impaired absorption in the intestine. SERP1 − / − mice steadily increased in both growth and body weight once they lived to 4 weeks of age. By 12 weeks of age, the body weight of SERP1 − / − mice recovered to less than 80% of SERP1 + / + mice in both strains.
(Glucose and insulin tolerance test)
The effect of SERP1 expression on insulin biosynthesis and secretion was examined by an in vivo glucose tolerance test. After intraperitoneal administration of 2 mg of glucose per gram of body weight to 10-week-old and 25-week-old mice, blood glucose level was measured. As a result, abnormal glucose tolerance was observed in SERP1 knockout mice. In particular, males showed stronger glucose tolerance abnormalities than females, but no effect of aging was observed (FIG. 5).

次に、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常が、末梢でのインスリン抵抗性に起因するものなのかどうかを、インスリン負荷試験により検討した。マウス１ｋｇあたり１ユニットのインスリンを腹腔内投与し、血糖値を測定した結果、ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-、及びＳＥＲＰ１-/-マウスの３群間に有意な差は認められなかった（図６）。従って、膵臓におけるインスリン生合成、或いは分泌異常により、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常が引き起こされることが示唆された。
（グルコース負荷によるインスリン分泌への影響）
ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型マウス）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）よりランゲルハンス島を単離し、グルコース負荷によるインスリン分泌への影響を解析した。（結果を図７に示す。）その結果、グルコース負荷より１５分後のインスリンの分泌量においては、３群間で有意な差は認められなかったが、負荷後３０分及び６０分後では、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスにおけるインスリン分泌量が有意に減少し、さらに１２０分後には、再び３群間で有意な差が認められなくなった（図７Ａ）。従って、ＳＥＲＰ１は、グルコース負荷後のインスリンの生合成速度に影響を与えることが示唆された。また、インスリン分泌量は、負荷グルコース濃度依存的に増加することが明らかになった（図７Ｂ）。
（ＳＥＲＰ１の強制発現によるインスリン分泌への影響）
野性型マウス及びＳＥＲＰ１ノックアウトマウス由来のランゲルハンス島にアデノウイルスを用いてＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡを導入することにより、インスリン分泌量への影響を検討した。はじめに、ランゲルハンス島への遺伝子導入効率を確認するため、作製した組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を、対照として組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰをランゲルハンス島に導入した。ＧＦＰ及びＳＥＲＰ１の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察した（図８Ａ）。その結果、組換え型アデノウィルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１は７０％以上の効率で遺伝子が導入されることが確認された。 Next, it was examined by an insulin tolerance test whether the glucose tolerance abnormality of SERP1 knockout mice was caused by insulin resistance in the periphery. As a result of intraperitoneal administration of 1 unit of insulin per kg of mouse and measurement of blood glucose level, no significant difference was observed among the three groups of SERP1 + / + , SERP1 +/− , and SERP1 − / − mice ( FIG. 6). Therefore, it was suggested that abnormal glucose tolerance in SERP1 knockout mice is caused by insulin biosynthesis or secretion abnormality in the pancreas.
(Influence on insulin secretion by glucose load)
Islets of Langerhans were isolated from SERP1 + / + mice (wild type mice), SERP1 +/− mice, and SERP1 − / − mice (SERP1 knockout mice), and the influence of glucose load on insulin secretion was analyzed. (The results are shown in FIG. 7.) As a result, in the amount of insulin secreted 15 minutes after the glucose load, no significant difference was observed between the three groups, but after 30 and 60 minutes after the load, The amount of insulin secretion in SERP1 knockout mice was significantly reduced, and after 120 minutes, no significant difference was again observed among the three groups (FIG. 7A). Therefore, it was suggested that SERP1 affects the rate of insulin biosynthesis after glucose loading. Moreover, it became clear that the amount of insulin secretion increases depending on the loaded glucose concentration (FIG. 7B).
(Effect of forced expression of SERP1 on insulin secretion)
The effect on insulin secretion was examined by introducing SERP1 cDNA into the islets of Langerhans derived from wild type mice and SERP1 knockout mice using adenovirus. First, in order to confirm the efficiency of gene introduction into the islets of Langerhans, the prepared recombinant adenovirus Adex1CA SERP1 was introduced as a control and the recombinant adenovirus Adex1CA GFP was introduced into the islets of Langerhans. The expression of GFP and SERP1 was observed with a fluorescence microscope after immunostaining with an anti-FLAG antibody (FIG. 8A). As a result, it was confirmed that the gene was introduced into the recombinant adenovirus Adex1CA SERP1 with an efficiency of 70% or more.

また、組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を導入した野性型マウスは、ランゲルハンス島からのインスリン分泌に変化が認められなかったが、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、対照群であるアデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰ導入群と比較して有意にインスリンの分泌が上昇することが認められた（図８Ｂ）。従って、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、ＳＥＲＰ１の存在により、ランゲルハンス島からのインスリン分泌が顕著に改善することが示唆された。
（グルコース刺激後のプロインスリン及びインスリン生合成量の変化）
パルスラベリング法により、ランゲルハンス島でのインスリン生合成及び培養液中への分泌量の経時変化を解析した。その結果、野性型マウスではいずれも、グルコース負荷後３０〜６０分でプロインスリンの合成量が最大となり、その後減少していくのに対し、ノックアウトマウスでは、９０〜１２０分後に合成量が最大となることが認められた（図９Ａ、Ｂ）。従って、ＳＥＲＰ１は、インスリンの合成そのものに直接関与するのではなく、グルコース負荷後の急速なインスリン生合成に必須であることが示唆された。
（ＳＥＲＰ１の発現と膵臓ランゲルハンス島のストレス応答との関係）
ＳＥＲＰ１が、小胞体ストレスによりその発現が上昇することから、ＳＥＲＰ１の発現とランゲルハンス島のストレス抵抗性との関係を、（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay）を用いて検討した。ランゲルハンス島を、小胞体ストレスを誘導するツニカマイシン（tunicamycin）で処理したところ、４８時間後、野性型マウスでは、あまり多くの細胞死は認められなかったが、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、細胞死に至る細胞の数が有意に増加した。この細胞死は、小胞体ストレスによる細胞死を防ぐ薬剤であるシクロヘキシミド（cycloheximide）を培地中に添加することにより抑制された。その結果、小胞体ストレスによって引き起こされた細胞死であることが示唆された（図１０）。
（下垂体及びホルモン生合成におけるＳＥＲＰ１遺伝子の影響）
出生後のＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて一時的に成長発育不全が認められることから、ＳＥＲＰ１は、新生児の成長と相関しているホルモンの生合成において重要な役割を果たしていることが示唆された。マウス脳（大脳皮質及び視床下部）及び脳下垂体からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットより、ＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体（Ｓｅｃ６１β）両者とも下垂体において高発現していることが明らかになった（図１１Ａ）。免疫組織学的解析によりＳＥＲＰ１の発現は、成長ホルモンの分布と同様、前葉において観察された（図１１Ｂ）。Ｃ５６ＢＬ／６系統及び１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の各遺伝子型の成熟マウス（１２〜１６週齢、図１１Ｃ Ｉ、II）及び新生児マウス（６日）を用いて解析したところ、コントロールである野生型と比較して、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて下垂体前葉の大きさが減少していることが明らかになった。下垂体中葉及び後葉においては、このような変化は認められなかった。 In addition, wild type mice introduced with recombinant adenovirus Adex1CA SERP1 showed no change in insulin secretion from the islets of Langerhans, but SERP1 knockout mice were compared with the control group adenovirus Adex1CA GFP introduction group. It was confirmed that insulin secretion was significantly increased (FIG. 8B). Therefore, it was suggested that in the SERP1 knockout mice, the insulin secretion from the islets of Langerhans is markedly improved by the presence of SERP1.
(Changes in proinsulin and insulin biosynthesis after glucose stimulation)
The time course of insulin biosynthesis in Langerhans and secretion into the culture medium was analyzed by the pulse labeling method. As a result, in all wild type mice, the amount of proinsulin is maximized 30 to 60 minutes after glucose loading and then decreases, whereas in knockout mice, the amount of synthesis is 90 to 120 minutes later. (FIGS. 9A and 9B). Therefore, it was suggested that SERP1 is not directly involved in insulin synthesis itself but is essential for rapid insulin biosynthesis after glucose load.
(Relationship between SERP1 expression and stress response of pancreatic islets of Langerhans)
Since the expression of SERP1 is increased by endoplasmic reticulum stress, the relationship between the expression of SERP1 and the stress resistance of the islets of Langerhans was examined using (Live / DEAD assay). Treatment of islets of Langerhans with tunicamycin, which induces endoplasmic reticulum stress. After 48 hours, not much cell death was observed in wild type mice, but in SERP1 knockout mice, cell death leading to cell death was observed. The number increased significantly. This cell death was suppressed by adding cycloheximide, which is a drug that prevents cell death due to endoplasmic reticulum stress, to the medium. As a result, it was suggested that the cell death was caused by endoplasmic reticulum stress (FIG. 10).
(Effect of SERP1 gene on pituitary and hormone biosynthesis)
The temporary growth failure was observed in postnatal SERP1 − / − mice, suggesting that SERP1 plays an important role in hormone biosynthesis that correlates with neonatal growth. Western blots of protein extracts from mouse brain (cerebral cortex and hypothalamus) and pituitary revealed that both SERP1 and Sec61 complex (Sec61β) are highly expressed in the pituitary gland (FIG. 11A). ). By immunohistochemical analysis, the expression of SERP1 was observed in the anterior lobe, similar to the growth hormone distribution (FIG. 11B). When analysis was performed using mature mice (12 to 16 weeks of age, FIGS. 11C I and II) and newborn mice (6 days) of each genotype of C56BL / 6 strain and 129v / JxC57BL / 6 strain, wild type as a control In comparison with SERP1 − / − mice, it was revealed that the size of the anterior pituitary gland decreased. Such changes were not observed in the pituitary middle lobe and posterior lobe.

下垂体前葉の体積の減少は、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて下垂体前葉の細胞数が減少していることに起因した。免疫染色によって解析した結果、個々の細胞の大きさは、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいてもほぼ同程度であり、下垂体ホルモン陽性細胞の割合も、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて顕著に減少することはなかった（図１１Ｄ）。 The decrease in anterior pituitary volume was attributed to a decrease in the number of anterior pituitary cells in SERP1 − / − mice. As a result of analysis by immunostaining, the size of individual cells was almost the same in SERP1 − / − mice, and the proportion of pituitary hormone positive cells was not significantly decreased in SERP1 − / − mice. (FIG. 11D).

成長ホルモン（ＧＨ）生合成／分泌におけるＳＥＲＰ１遺伝子の欠損による影響を解析するために、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行い、Ｃ５６ＢＬ／６系統及び１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の各遺伝子型の成熟マウス（１２〜１６週齢）における血中ＧＨレベルを測定した。ＳＥＲＰ１+/+マウスにおいて、低血糖に対する応答に対して血中ＧＨが増加し、インスリン投与後６０分後に最高値に達した（１８±２．１ｎｇ／ｍＬ）。一方、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて６０分後の時点で上昇しなかった（６±０．５ｎｇ／ｍＬ）。９０分後、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいてはＧＨレベルが上昇したが、野生型においてＧＨレベルが徐々に減少し始めた。１２０分後、各群ともＧＨレベルは同程度となった（１３〜１５ｎｇ／ｍＬ）。 In order to analyze the effect of SERP1 gene deficiency on growth hormone (GH) biosynthesis / secretion, an insulin tolerance test (ITT) was conducted, and mature mice of each genotype of C56BL / 6 strain and 129v / JxC57BL / 6 strain ( Blood GH levels at 12-16 weeks of age) were measured. In SERP1 + / + mice, blood GH increased in response to hypoglycemia and reached a maximum 60 minutes after insulin administration (18 ± 2.1 ng / mL). On the other hand, in SERP1 − / − mice, there was no increase at the time point after 60 minutes (6 ± 0.5 ng / mL). After 90 minutes, GH levels increased in SERP1 − / − mice, but GH levels began to gradually decrease in wild type. After 120 minutes, GH levels were similar in each group (13-15 ng / mL).

下垂体前葉の研究において、ＧＨを有する細胞内においても、高レベルのＳＥＲＰ１の発現が観察された（図１１Ａ及びＢ）。実際、コントロールの野生型と比較して、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいては下垂体前葉が顕著に減少し、細胞の大きさは同程度にもかかわらず、細胞数の減少に至った。これらのデータによりＳＥＲＰ１は、インスリンに対する膵臓ランゲルハンス島における実験と同様の機構で、下垂体ホルモンの生合成を促進すると推測される。この推測と一致して、免疫染色により判断したＧＨ又は他の下垂体ホルモンの基礎的生合成量は、各遺伝子型の間で変化なかったにもかかわらず（図１１Ｄ）、成熟ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいては、インスリンで刺激された後のＧＨの産生が著しく遅延した（図１１Ｅ）。それゆえに、ＳＥＲＰ１はＧＨの生合成速度を増加させ、また、下垂体前葉におけるホルモン産生細胞の成長及び増殖に影響を与えることが判明した。 In studies of the anterior pituitary gland, high levels of SERP1 expression were also observed in cells with GH (FIGS. 11A and B). In fact, in the SERP1 − / − mice, the anterior pituitary gland decreased significantly, and the number of cells decreased despite the same size. These data suggest that SERP1 promotes pituitary hormone biosynthesis by a mechanism similar to that in experiments in pancreatic islets of Langerhans for insulin. Consistent with this assumption, the amount of basal biosynthesis of GH or other pituitary hormones determined by immunostaining did not change between genotypes (FIG. 11D), but mature SERP1 − / −. In mice, GH production after insulin stimulation was significantly delayed (FIG. 11E). Therefore, it was found that SERP1 increases the rate of GH biosynthesis and also affects the growth and proliferation of hormone-producing cells in the anterior pituitary gland.

本発明の実施例における試験において、ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体ｍＲＮＡの発現分布を示す図である。In the test in the Example of this invention, it is a figure which shows the expression distribution of SERP1 and Sec61 complex mRNA in a human endocrine tissue. 本発明の実施例における試験において、Ａは、ＭＩＮ６細胞におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体ｍＲＮＡの発現量に対するグルコースの影響を示す図である。また、Ｂは、ＭＩＮ６細胞におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体タンパク質の発現量に対するグルコースの影響を示す図である。更に、Ｃは、膵臓におけるＳＥＲＰ１ｍＲＮＡの発現（ランゲルハンス島に強く発現）と、ＳＥＲＰ１発現に対する絶食の影響を、in situハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す図である。In the test in the Example of this invention, A is a figure which shows the influence of glucose with respect to the expression level of SERP1 and Sec61 complex mRNA in a MIN6 cell. Moreover, B is a figure which shows the influence of glucose with respect to the expression level of SERP1 and Sec61 complex protein in a MIN6 cell. Furthermore, C is a figure which shows the result of having analyzed the expression of SERP1 mRNA in pancreas (it strongly expresses in Langerhans islet), and the influence of the fasting with respect to SERP1 expression by in situ hybridization. 本発明の実施例において、Ａは、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの作製に用いたターゲッティングベクターの構造を示す図である。また、Ｂは、作製したＳＥＲＰ１ノックアウトマウスをサザンブロット法で確認した結果を示す図である。さらに、Ｃは、作製したＳＥＲＰ１ノックアウトマウスのＳＥＲＰ１ ｍＲＮＡの発現をノザンブロット法で確認した結果を示す図である。In the Example of this invention, A is a figure which shows the structure of the targeting vector used for preparation of a SERP1 knockout mouse. Moreover, B is a figure which shows the result of having confirmed the produced SERP1 knockout mouse | mouth by Southern blotting. Furthermore, C is a figure which shows the result of having confirmed the expression of SERP1 mRNA of the produced SERP1 knockout mouse | mouth by the Northern blot method. 本発明の実施例における試験において、出生後のＳＥＲＰ１-/-マウスが成長遅延を呈すことを示す図である。Ａ：ＳＥＲＰ１+/+マウス、ＳＥＲＰ１+/-マウス、ＳＥＲＰ１-/-新生児マウスの生存率の変化を示す図である。各群の出生時におけるマウスの頭数を１００とした。Ｃ５６ＢＬ／６系統のＳＥＲＰ１-/-マウスは、１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統のＳＥＲＰ１-/-マウスと比較して生存率が低かった。Ｂ：特定の遺伝子型のＳＥＲＰ１マウスにおいて、出生後の体重が遺伝的要因によって決定されるを示す図である。Ｃ：１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の同腹仔における、ＳＥＲＰ１+/+マウスとＳＥＲＰ１-/-マウスの大きさを比較した図である。In the test in the Example of this invention, it is a figure which shows that SERP1 <-/-> mouse | mouth after birth exhibits a growth delay. A: Changes in survival rate of SERP1 + / + mice, SERP1 +/− mice, SERP1 − / − newborn mice. The number of mice at birth in each group was taken as 100. C56BL / 6 strain SERP1 − / − mice had a lower survival rate than 129v / JxC57BL / 6 strain SERP1 − / − mice. B: A graph showing that postnatal weight is determined by genetic factors in SERP1 mice of a specific genotype. C: Sizes of SERP1 + / + mice and SERP1 − / − mice in litters of the 129v / JxC57BL / 6 strain. 本発明の実施例における試験において、インスリンの生合成及び分泌に対するＳＥＲＰ１の発現の影響を、グルコース負荷試験により調べた結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having investigated the influence of the expression of SERP1 with respect to the biosynthesis and secretion of insulin by the glucose tolerance test in the test in the Example of this invention. 本発明の実施例における試験において、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常をインスリン負荷テストを用いて解析した結果を示す図である。In the test in the Example of this invention, it is a figure which shows the result of having analyzed the glucose tolerance abnormality of the SERP1 knockout mouse | mouth using the insulin tolerance test. 本発明の実施例における試験において、Ａは、ランゲルハンス島β細胞におけるグルコース負荷後のインスリン分泌量の経時変化を示す図である。また、Ｂは、ランゲルハンス島β細胞において、インスリンの分泌量がグルコース濃度依存的に上昇することを示す図である。In the test in the Example of this invention, A is a figure which shows the time-dependent change of the insulin secretion amount after glucose load in a Langerhans islet β cell. Moreover, B is a figure which shows that the secretion amount of insulin rises in a glucose concentration-dependent manner in the islets of Langerhans β cells. 本発明の実施例において、Ａは、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスのランゲルハンス島細胞に、組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１が導入されたことを示す図である。また、Ｂは、ＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡを導入したランゲルハンス島におけるインスリンの分泌量の経時変化を示す図である。In the Example of this invention, A is a figure which shows that recombinant adenovirus Adex1CA SERP1 was introduce | transduced into the Langerhans islet cell of a SERP1 knockout mouse | mouth. B is a graph showing changes over time in the amount of insulin secreted in the islets of Langerhans introduced with SERP1 cDNA. 本発明の実施例における試験において、Ａは、グルコース刺激後のランゲルハンス島における、細胞中のプロインスリン生合成量及び培養液中へのインスリン分泌量の経時変化を、パルスラベリング法により解析した結果を示す図である。また、Ｂは、Ａの結果をグラフ化した図である。In the tests in the examples of the present invention, A shows the results of analyzing the time-dependent changes in the amount of proinsulin biosynthesis in the cells and the amount of insulin secreted into the culture medium in the islets of Langerhans after glucose stimulation by the pulse labeling method. FIG. B is a graph of the results of A. 本発明の実施例における試験において、ＳＥＲＰ１の発現と、ランゲルハンス島のストレス抵抗性との関係を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assayにより解析した結果を示す図である。なお、図中のＴｍはツニカマイシン（tunicamycin）を、Ｃｘはシクロへキシミド（cycloheximide）をそれぞれ示す。In the test in the Example of this invention, it is a figure which shows the result of having analyzed the relationship between the expression of SERP1 and the stress resistance of islets of Langerhans by LIVE / DEAD assay. In the figure, Tm represents tunicamycin, and Cx represents cycloheximide. Ａ及びＢ：下垂体における、ＳＥＲＰ１、Ｓｅｃ６１β、成長ホルモン（ＧＨ）、β−アクチン抗原の発現について、それぞれの抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った結果、及び、抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す図である。Ｃ：ＳＥＲＰ１-/-マウス下垂体前葉の形成不全について、Ｉ：各遺伝子型のマウス（１２〜１６週齢、前額断）から摘出した下垂体をＨ＆Ｅ染色したものである。II：Iで得られた写真において、前葉（ａ）、及び後葉（ｐ）＋中葉（ｉ）部位の面積を測定した結果を示す図である。Ｄ：各遺伝子型における下垂体前葉ホルモン陽性細胞の数を、総細胞数に対する割合（％）で示した図である。Ｅ：各遺伝子型のＳＥＲＰ１マウス（８〜１２週齢）における、インスリンによる刺激後の所定時間におけるＧＨ生合成／分泌の関係について示す図である。A and B: About the expression of SERP1, Sec61β, growth hormone (GH), and β-actin antigen in the pituitary gland, the results of Western blotting using the respective antibodies, and immunostaining using the antibodies It is a figure which shows the result. C: Regarding dysplasia of the anterior pituitary gland of SERP1 − / − mice, I: H & E staining of pituitary gland extracted from mice of each genotype (12 to 16 weeks of age, pre-cut). II: It is a figure which shows the result of having measured the area of the front lobe (a) and the back lobe (p) + middle lobe (i) site | part in the photograph obtained by I. D: It is the figure which showed the number of the anterior pituitary hormone positive cell in each genotype by the ratio (%) with respect to the total cell number. E: It is a figure which shows the relationship of GH biosynthesis / secretion in the predetermined time after the stimulation by insulin in the SERP1 mouse | mouth (8-12 weeks old) of each genotype.

Claims (10)

ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病及び／又は成長ホルモン生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 Pituitary properties due to type 2 diabetes and / or growth hormone biosynthesis abnormalities resulting from abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function, wherein the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene function is deficient on the chromosome A model non-human animal that develops dwarfism. インスリン分泌異常が、膵臓β細胞におけるインスリン生合成異常に起因することを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病、及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 The model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to claim 1, wherein the insulin secretion abnormality is caused by an insulin biosynthesis abnormality in pancreatic β cells. 小胞体機能異常が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害であることを特徴とする請求項１又は２記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 The model non-developed type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to claim 1 or 2, wherein the ER dysfunction is an obstacle to the survival of pancreatic islets of Langerhans cells under ER stress. Human animals. 下垂体性小人症の発症が、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 The type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to any one of claims 1 to 3, wherein the onset of pituitary dwarfism results from abnormal biosynthesis of growth hormone in the pituitary gland. A model non-human animal that develops. ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるＳＥＲＰ１遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 The type 2 diabetes mellitus according to any one of claims 1 to 4, wherein the deficiency in the function of the stress-related endoplasmic reticulum protein SERP1 gene is a deficiency in the function of the SERP1 gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A model non-human animal that develops pituitary dwarfism. 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。 The model non-human animal that develops type 2 diabetes and / or pituitary dwarfism according to any one of claims 1 to 5, wherein the non-human animal is a mouse. 請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン生合成／分泌、及び／又は小胞体機能の異常、或いは、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。 Pituitary dwarfism caused by type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or dysfunction of endoplasmic reticulum and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland A test substance is administered to a model non-human animal that develops insulin biosynthesis / secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function in the model non-human animal, or in cells, tissues or organs of the model non-human animal, Alternatively, measurement and evaluation of abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland, type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or abnormal endoplasmic reticulum function, and / or growth hormone in the pituitary gland A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis. 小胞体機能の異常の測定・評価が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害の測定・評価であることを特徴とする請求項７記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。 8. An abnormal insulin secretion and / or an abnormal endoplasmic reticulum function according to claim 7, wherein the measurement / evaluation of an abnormal function of the endoplasmic reticulum is a measurement / evaluation of an obstacle to the survival of pancreatic islets of Langerhans cells under an endoplasmic reticulum stress Screening method for a prophylactic / therapeutic agent for pituitary dwarfism caused by type 2 diabetes caused by thrombosis and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland. 請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与した場合と、野生型非ヒト動物の場合及び／又はインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合とを、比較・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。 Pituitary dwarfism caused by type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or dysfunction of endoplasmic reticulum and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland When a test substance is administered to a model non-human animal that develops, and in the case of a wild-type non-human animal and / or type 2 diabetes caused by abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum function, and / or Insulin secretion abnormality and / or endoplasmic reticulum dysfunction characterized by comparing and evaluating the model nonhuman animal that develops pituitary dwarfism caused by abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland A method for screening a prophylactic / therapeutic drug for pituitary dwarfism caused by type 2 diabetes caused by the disease and / or abnormal growth hormone biosynthesis in the pituitary gland. 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。 The non-human animal is a mouse, type 2 diabetes resulting from abnormal insulin secretion and / or endoplasmic reticulum dysfunction according to any one of claims 7 to 9, and / or growth hormone in the pituitary gland A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for pituitary dwarfism caused by abnormal biosynthesis.
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