JP5645357B2 - Non-human disease model animal deficient in cytoglobin gene function - Google Patents
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Description
本発明は、哺乳類で４つ存在するグロビン（ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン）のうちの一つであるサイトグロビンの遺伝子発現が人為的に抑制されている非ヒト疾患モデル動物に関する。更に、本発明は、当該非ヒト疾患モデル動物を利用して、鉄代謝異常に関連する疾患に対する医薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a non-human disease model animal in which gene expression of cytoglobin, which is one of four globins (hemoglobin, myoglobin, neuroglobin, cytoglobin) existing in mammals, is artificially suppressed. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a drug for a disease associated with abnormal iron metabolism using the non-human disease model animal.
ウイルス性、自己免疫性等の病因の如何に拘わらず、肝細胞の慢性的破壊が惹起されると元々肝細胞の存在した部位（実質）には線維芽細胞が増殖し、その細胞が産生分泌するコラーゲンが沈着して肝線維化が誘導され、更にそれが進行した場合は最終的に肝硬変となる（非特許文献１）。肝硬変が生じると、黄疸、腹水、脳症、食道静脈瘤等の生命を脅かす合併症を生じるのみならず、肝硬変からは年率7〜8％の割合で肝癌が発症する。従って、肝線維化と肝硬変を抑制する手法の開発のためにも、肝線維化自体の分子・細胞学的理解は不可欠であり、1980年以降精力的に研究が行われてきた。特に、肝臓内でコラーゲンを産生する細胞がビタミンA貯蔵を主とした働きとしている星細胞であることが証明されてからは、本細胞の持つ特異機能の解析が飛躍的に発展してきた（非特許文献２）。 Regardless of the etiology such as virality or autoimmunity, when chronic destruction of hepatocytes is induced, fibroblasts proliferate in the site (parenchyma) where hepatocytes originally existed, and these cells are produced and secreted When hepatic fibrosis is induced by the deposition of collagen, and further progresses, cirrhosis eventually occurs (Non-patent Document 1). When cirrhosis occurs, not only does it cause life-threatening complications such as jaundice, ascites, encephalopathy, esophageal varices, but liver cirrhosis develops at an annual rate of 7-8%. Therefore, molecular and cytological understanding of liver fibrosis itself is indispensable for the development of techniques for suppressing liver fibrosis and cirrhosis, and research has been conducted energetically since 1980. In particular, since it has been proved that cells that produce collagen in the liver are stellate cells whose main function is vitamin A storage, analysis of specific functions of these cells has developed dramatically (non- Patent Document 2).
近年、肝臓を構成する細胞の分離および初代培養技術は著しい進歩を遂げている（非特許文献３）。肝細胞のみならず、非実質細胞であるKupffer細胞、内皮細胞、星細胞、pit細胞、胆管上皮細胞が分離可能となっており、これらの非実質細胞について数多くの研究がなされている。その結果、肝細胞代謝の恒常性維持と肝局所炎症反応における肝非実質細胞の重要性が認識されるようになり、特に、星細胞の機能が注目を集めている。 In recent years, separation of cells constituting the liver and primary culture techniques have made remarkable progress (Non-patent Document 3). Not only hepatocytes but also non-parenchymal cells such as Kupffer cells, endothelial cells, stellate cells, pit cells, and biliary epithelial cells can be separated, and many studies have been conducted on these non-parenchymal cells. As a result, the importance of non-parenchymal liver cells in the maintenance of homeostasis of hepatocyte metabolism and the local hepatic inflammatory reaction has been recognized.
肝臓非実質細胞の一つが星細胞である。星細胞は肝臓内でビタミンAを主とする脂肪を貯蔵する細胞として発見された(非特許文献４)。肝細胞と毛細血管である類洞との間の空間（Disse腔）に存在し、類洞を細胞体から分枝した細胞突起で取り囲むように配置している。その形態から、星細胞は他臓器における周皮細胞（pericyte）に相当すると考えられている。事実、星細胞の収縮性が報告されており、本細胞が収縮・弛緩運動することで類洞の微小循環動態を調節することが証明されている（非特許文献５）。 One of the liver non-parenchymal cells is the stellate cell. A stellate cell was discovered as a cell that stores fat mainly composed of vitamin A in the liver (Non-patent Document 4). It exists in the space (Disse space) between the hepatocytes and the sinusoids that are capillaries, and the sinusoids are arranged so as to be surrounded by cell processes branched from the cell body. Because of its morphology, stellate cells are thought to correspond to pericyte in other organs. In fact, contractility of stellate cells has been reported, and it has been proved that the microcirculation dynamics of sinusoids are regulated by the contraction and relaxation of the cells (Non-patent Document 5).
星細胞がラットやマウス等の小動物から分離培養ができるようになると、プラスチックシャーレ上で培養された星細胞がコラーゲンを産生することが判明した（非特許文献６）。即ち、従来は肝臓内でコラーゲンを産生する細胞は肝細胞であると考えられていたが、実際には、培養肝細胞には星細胞が混在しており、星細胞こそが細胞外マトリックス物質を産生する主要な細胞であることが証明された。つまり、I、III、IV型コラーゲンに加えて、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等の細胞外マトリックス分子は、星細胞が産生することが明らかにされた（非特許文献７）。 When stellate cells can be separated and cultured from small animals such as rats and mice, it has been found that stellate cells cultured on plastic petri dishes produce collagen (Non-patent Document 6). That is, conventionally, cells that produce collagen in the liver were thought to be hepatocytes, but in reality, cultured hepatocytes are mixed with stellate cells, and stellate cells are the only extracellular matrix material. It proved to be the primary cell producing. That is, it has been clarified that stellate cells produce extracellular matrix molecules such as fibronectin, laminin, and proteoglycan in addition to type I, III, and IV collagen (Non-patent Document 7).
星細胞は、肝炎等において惹起された炎症が持続すると、いわゆる「活性化」と呼ばれる機能変化をとげて、筋線維芽細胞（myofibroblast、MFB）へと形質をかえる。ラットやマウスから星細胞を分離し、プラスチックシャーレ上で培養しておくと、無刺激でも自然に活性化が生じることが観察され、よい実験モデルとして汎用されている。このように活性化された星細胞においては、以下のような細胞機能の変化が生じることはよく知られている（非特許文献８）。(1)細胞体が大きくなり、ビタミンAの貯蔵量が減少する。(2)平滑筋型α-アクチン（smooth muscle α-actin）の発現が上昇し、細胞の収縮力が増す。(3)I型コラーゲンを含む細胞外マトリックス物質の産生が著明に増加する。(4)TGFβ（transforming growth factorβ）、IGF-I（insuline-like growth factor I）、PDGF-BB（platelet-derived growth factor BB）等の、臓器線維化を促進する各種成長因子及びそれらの受容体の発現が著明に増加する。(5)マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloporoteinase, MMP）の阻害物質であるTIMP（tissue inhibitor of MMP, TIMP）の産生が増加する。(6)遊走能の亢進がみられる。 When the inflammation caused by hepatitis or the like persists, the stellate cell changes its function to so-called “activation” and transforms into myofibroblast (MFB). When stellate cells are isolated from rats and mice and cultured on a plastic petri dish, activation is observed to occur spontaneously even without stimulation, which is widely used as a good experimental model. It is well known that the following changes in cell functions occur in the activated stellate cells (Non-patent Document 8). (1) The cell body grows and the amount of vitamin A stored decreases. (2) The expression of smooth muscle α-actin increases and the contractile force of the cells increases. (3) Production of extracellular matrix material containing type I collagen is markedly increased. (4) Various growth factors such as TGFβ (transforming growth factor β), IGF-I (insuline-like growth factor I), and PDGF-BB (platelet-derived growth factor BB), and their receptors. Expression increases markedly. (5) Production of TIMP (tissue inhibitor of MMP, TIMP), which is an inhibitor of matrix metalloporoteinase (MMP), increases. (6) Increased migration ability is observed.
従って、星細胞の活性化又はMFB化は肝臓の線維化課程に深く関与していることが考えられる。実際にヒトの慢性肝炎や肝硬変組織の線維性隔壁部には細胞外マトリックスとともに、平滑筋型α-アクチン陽性の活性化された星細胞が多数存在する。また、活性化星細胞がPDGF-BBなどの成長因子のmRNAを発現していることもin situ hybridizationで調べられている（非特許文献９）。そこで、星細胞活性化の分子機構の解析は、肝線維化の病態の理解に役立つばかりでなく、新しい診断法や治療法の開発に有用であると考えられている。 Therefore, activation of stellate cells or MFB formation may be deeply involved in the fibrosis process of the liver. In fact, there are many activated stellate cells that are positive for smooth muscle α-actin, as well as the extracellular matrix, in the fibrous partition wall of human chronic hepatitis and cirrhosis. In addition, it has been examined by in situ hybridization that activated stellate cells express growth factor mRNA such as PDGF-BB (Non-patent Document 9). Thus, analysis of the molecular mechanism of stellate cell activation is considered to be useful not only for understanding the pathogenesis of liver fibrosis, but also for developing new diagnostic methods and treatments.
この星細胞活性化機構を詳しく調べる目的で、これまでに発明者らは様々な解析を行ってきた。その一つとして、プロテオミクスを用いた解析を行った（非特許文献１０）。その過程で、等電点電気泳動でpI7の位置に存在し、分子量21 kDの蛋白スポットのペプチド配列が未知の新規タンパク質を見出した。その新規タンパク質のペプチド配列の情報を基にcDNAをクローニングしたところ、2028ベースペアー長のクローンが得られた。これをシークエンスしたところ、当時遺伝子配列がデーターベースに存在しない新しい遺伝子であり[Accession number NM_130744、Rattus norvegicuscytoglobin (Cygb), mRNA]、190のアミノ酸からなり分子量21,496ダルトンであることが判った（非特許文献１１）。この蛋白質をstellatecell-activation associated protein (STAP)と名付けた。その後、この蛋白質は他のグロビンと似ていることから、サイトグロビン（cytoglobin, Cygb）と呼ばれるようになった（非特許文献１２）。このCygbのN末端側NH2-MEKVPGDMEIERRERNEE+Cys-COOHを抗原としてウサギに免疫して抗ペプチド抗体を作製した。この抗体を用いて免疫染色をすると、ラット分離培養した星細胞の活性化に伴い細胞内で蛋白質は発現増加した。また、ラットに肝臓毒であるチオアセトアミドを用いて肝硬変に近い線維化を誘導するとその線維隔壁に沿って、平滑筋型α-アクチン陽性の星細胞が存在する位置にCygbが強陽性であった。これらの知見から、Cygbは星細胞の活性化や肝臓の線維化と密接に関係する分子であることが判った。 In order to investigate this stellate cell activation mechanism in detail, the inventors have conducted various analyzes so far. As one of them, analysis using proteomics was performed (Non-patent Document 10). In the process, a novel protein that was present at the position of pI7 by isoelectric focusing and whose peptide sequence of the protein spot with a molecular weight of 21 kD was unknown was found. When cDNA was cloned based on the peptide sequence information of the new protein, a 2028 base pair long clone was obtained. When this was sequenced, it was found that the gene sequence was a new gene that did not exist in the database at that time [Accession number NM_130744, Rattus norvegicuscytoglobin (Cygb), mRNA], consisting of 190 amino acids and having a molecular weight of 21,496 Dalton (non-patented) Reference 11). This protein was named stellatecell-activation associated protein (STAP). Since then, this protein resembles other globins, so it came to be called cytoglobin (Cygb) (Non-patent Document 12). An anti-peptide antibody was prepared by immunizing a rabbit with NH2-MEKVPGDMEIERRERNEE + Cys-COOH on the N-terminal side of Cygb as an antigen. When immunostaining was performed using this antibody, the expression of the protein increased in the cells following activation of the stellate cells cultured in rats. In addition, when fibrosis close to cirrhosis was induced in rats using thioacetamide, a liver toxin, Cygb was strongly positive along the fiber septum at locations where smooth muscle α-actin-positive stellate cells were present. . These findings indicate that Cygb is a molecule closely related to stellate cell activation and liver fibrosis.
尚、ヒト[NM_134268、Homo sapiens cytoglobin (CYGB), mRNA ]とマウス[NM_030206、Mus musculus cytoglobin(Cygb), mRNA ]からもcygb遺伝子が報告された。ヒトでは第１７番染色体上に、マウスでは第１１番染色体上に存在する。 The cygb gene was also reported from human [NM_134268, Homo sapiens cytoglobin (CYGB), mRNA] and mouse [NM_030206, Mus musculus cytoglobin (Cygb), mRNA]. It exists on chromosome 17 in humans and on chromosome 11 in mice.
一方、発明者らは、サイトグロビンの発現をラットの各種臓器の免疫染色で検討した。その結果、サイトグロビンは肝臓の星細胞のみならず、脾臓の細網細胞、膵臓の星細胞、腎臓の線維芽細胞、消化管の線維芽細胞などにも発現していることが確認された（非特許文献１３）。これらの細胞は内臓の中でビタミンAを貯蔵することのできる細胞として知られている。即ち偶然にも、サイトグロビンは、ビタミンA貯蔵型線維芽細胞のマーカーになることが判明した。更に、本発明者らは膵臓や腎臓の慢性炎症時にこれら臓器の線維化と共にサイトグロビンが誘導されることも確認している。 On the other hand, the inventors examined the expression of cytoglobin by immunostaining of various organs of rats. As a result, it was confirmed that cytoglobin is expressed not only in liver stellate cells, but also in splenic reticulocytes, pancreatic stellate cells, kidney fibroblasts, and gastrointestinal fibroblasts ( Non-patent document 13). These cells are known as cells capable of storing vitamin A in the internal organs. Coincidentally, cytoglobin was found to be a marker for vitamin A storage fibroblasts. Furthermore, the present inventors have also confirmed that cytoglobin is induced with fibrosis of these organs during chronic inflammation of the pancreas and kidneys.
続いて、リコンビナントヒトCygbタンパク質を作製して機能解析した結果、このタンパク質はミオグロビンと相同性の高いヘム蛋白であり、酸素や一酸化炭素と結合することができることが判明した（非特許文献１４）。更に、本発明者らは、理化学研究所播磨Spring8との共同研究でCygbタンパク質を結晶化させ、その構造の解析を行った結果、Cygbは鉄とIX型プロトポルフィリンから成るヘムを含有するタンパク質であり、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビンに続く哺乳類第４番目のグロビンタンパク質であることが判った。Cygbのヘムはヒスチジンのイミダゾール基で両側から固定されており、ヘモグロビンやミオグロビンとは異なる非常にユニークなhexacoordinate型のヘモグロビンファミリー（前者はpentacoordinate型のグロビン）を形成することが判明した（非特許文献１５）。更に、Cygbは細胞を酸化ストレスから保護する作用のあることが報告されている。 Subsequently, as a result of producing and functionally analyzing a recombinant human Cygb protein, it was found that this protein is a heme protein having high homology with myoglobin and can bind to oxygen and carbon monoxide (Non-patent Document 14). . Furthermore, the present inventors crystallized Cygb protein in collaboration with RIKEN Harima Spring8 and analyzed its structure. As a result, Cygb is a protein containing heme consisting of iron and IX type protoporphyrin. It was found to be the fourth mammalian globin protein following hemoglobin, myoglobin, and neuroglobin. Cygb heme is fixed from both sides by imidazole histidine group, and it has been found that it forms a very unique hexacoordinate hemoglobin family (the former is pentacoordinate globin) which is different from hemoglobin and myoglobin. 15). Furthermore, Cygb has been reported to have an effect of protecting cells from oxidative stress.
以上のように、星細胞の活性化と肝臓の線維化と関係が深い遺伝子としてCygbが発見された。そのタンパク質構造やグロビンとしてのガス結合能は明らかとなった。また、Cygbは肝臓を含む内臓の線維芽細胞に発現し、臓器線維化とともに発現増強することがわかってきた。また、いくつかの報告により、Cygbを過剰発現させると細胞を酸化ストレスから保護されることが判って来ている。しかしながら、生体内におけるこの蛋白質の機能は未だ不明である。
現在のところ、Cygbについては、ガス結合性以外の機能、特にビタミンA貯蔵星細胞に発現する意義、星細胞の活性化及び肝臓の炎症や線維化における作用機序、肝臓以外の臓器に発現する意義等については依然として不明である。Cygbを欠損させた疾患モデル動物は、Cygbの生体内での機能を明らかにするだけでなく、従来、治療法が確立されていない疾患に対する診断法や治療法の開発への道が開かれる可能性がある。そこで、本発明は、Cygbが関与する疾患の治療、診断、創薬等に有用なスクリーニングツール、即ち、Cygb遺伝子の機能が欠損している非ヒト疾患モデル動物を提供することを目的とする。 Currently, Cygb has functions other than gas-binding properties, especially the significance of expression in vitamin A storage stellate cells, the mechanism of activation of stellate cells and liver inflammation and fibrosis, and expression in organs other than the liver The significance is still unknown. Disease model animals deficient in Cygb not only reveal the in vivo function of Cygb, but may open the way to the development of diagnostic methods and treatments for diseases for which treatment has not been established. There is sex. Therefore, an object of the present invention is to provide a screening tool useful for the treatment, diagnosis, drug discovery, etc. of diseases involving Cygb, that is, a non-human disease model animal deficient in the function of the Cygb gene.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Cygb遺伝子の機能が欠損している非ヒト疾患モデルマウスの開発に成功した。当該非ヒト疾患モデルマウスは、生後2ヶ月までは、野生型マウス（Cygb+/+マウス）と同等に成長し、各種臓器に大きな変化は見られなかった。しかしながら、生後１２週間経過すると、脾臓に変化が生じ、赤脾髄に鉄が沈着し、鉄関連遺伝子[haptoglobin, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1)]のmRNA発現が上昇してくることが判った。この時期の肝臓は組織学的には変化が見られなかったが、肝臓においては鉄関連遺伝子[hemeoxygenase 1, hemeoxygenase 2, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, transferrin]の遺伝子が発現変動することが定量的real time PCR法を用いて確認された。一方、上記非ヒト疾患モデルマウスは、生後10ヶ月経過すると脾臓の鉄沈着はより顕著になり、肝臓においては鉄関連遺伝子[haptoglobin, hemeoxygenase 2, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, ferritin]の遺伝子が発現上昇することが定量的real time PCR法を用いて確認され、上記非ヒト疾患モデルマウスは、鉄代謝異常に関連する疾患の発症率及び重症度を評価するためのモデル動物として有用であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have succeeded in developing a non-human disease model mouse lacking the function of the Cygb gene. The non-human disease model mouse grew up to the same level as the wild-type mouse (Cygb + / + mouse) until 2 months of age, and no significant changes were observed in various organs. However, after 12 weeks of age, spleen changes, iron is deposited in the red pulp, and mRNA expression of iron-related genes [haptoglobin, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1)] increases. It was. The liver did not change histologically during this period, but the genes of iron-related genes [hemeoxygenase 1,
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． サイトグロビン遺伝子の機能が欠損していることを特徴とする、非ヒト疾患モデル動物。
項２． 鉄代謝異常に関連する疾患のモデル動物である、項１に記載の非ヒト疾患モデル動物。
項３． 齧歯目動物である、項1又は２に記載の非ヒト疾患モデル動物。
項４． マウスである、項1乃至３のいずれかに記載の非ヒト疾患モデル動物。
項５． 項1乃至４のいずれかに記載の非ヒト疾患モデル動物に被験物質を投与し、鉄代謝異常に関連する疾患の発症率及び重症度を評価することを特徴とする、鉄代謝異常に関連する疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法。
項６． 被験物質が、サイトグロビンに対するアンタゴニスト又はアゴニストである、項５に記載のスクリーニング方法。
That is, this invention provides the invention of the aspect hung up below.
Item 3. Item 3. The non-human disease model animal according to
Item 4. Item 4. The non-human disease model animal according to any one of
Item 5. A test substance is administered to the non-human disease model animal according to any one of
Item 6. Item 6. The screening method according to Item 5, wherein the test substance is an antagonist or agonist for cytoglobin.
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、Cygb遺伝子が関与する疾患の治療法、診断法、創薬等を構築する上で有用なスクリーニングツールとなり得る。特に、本発明の非ヒト疾患モデル動物によれば、鉄の代謝異常の検査方法、検査薬の提供、病態の解析、治療又は予防に必要な医薬のスクリーニング等を可能ならしめ、鉄の代謝異常に伴って発症する疾患の診断又は治療を確立することができる。 The non-human disease model animal of the present invention can be a useful screening tool in constructing therapeutic methods, diagnostic methods, drug discovery, etc. for diseases involving Cygb genes. In particular, according to the non-human disease model animal of the present invention, it is possible to provide a method for examining abnormalities in iron metabolism, to provide test agents, to analyze pathological conditions, to screen for drugs necessary for treatment or prevention, etc. Thus, it is possible to establish a diagnosis or treatment of a disease that develops along with this.
１．非ヒト疾患モデル動物及びその利用方法
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、Cygb遺伝子の機能が欠損しているノックアウト非ヒト動物である。
1. Non-human disease model animal and method of use thereof The non-human disease model animal of the present invention is a knockout non-human animal deficient in the function of the Cygb gene.
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、非ヒトであって実験動物として使用できるものであれば、如何なる種の動物でもよいが、好ましくは齧歯目動物、更に好ましくはマウスである。 The non-human disease model animal of the present invention may be any kind of animal as long as it is non-human and can be used as an experimental animal, preferably a rodent, and more preferably a mouse.
本願明細書において、「Cygb遺伝子の機能が欠損している」とは、上記に記載したCygb遺伝子の塩基配列の改変等により、Cygb遺伝子の発現産物が全く発現しないか、または発現しても正常なCygb遺伝子産物が有する機能を示すことができないことをいう。 In the present specification, “the Cygb gene function is deficient” means that the Cygb gene expression product is not expressed at all or is normal even if expressed due to the modification of the base sequence of the Cygb gene described above. It means that the function of a Cygb gene product cannot be shown.
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、Cygb遺伝子の機能が欠損している限り、Cygb遺伝子の機能を欠損させる具体的態様については、特に制限されないが、例えば、Cygb遺伝子の少なくとも一部が改変されている；或いはCygb遺伝子のプロモーターが不活性化されている等の態様が含まれる。 In the non-human disease model animal of the present invention, as long as the Cygb gene function is deficient, the specific mode of deficient in the Cygb gene function is not particularly limited. For example, at least a part of the Cygb gene is modified. Or an embodiment in which the promoter of the Cygb gene is inactivated.
本明細書において、「Cygb遺伝子の少なくとも一部が改変」とはCygb遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に、欠失、置換又は付加を生じさせる改変を加えることをいう。Cygb遺伝子の機能を欠損させるためには、Cygb遺伝子に対して欠失、置換及び付加の内、１又は２以上の変異を組み合わせてもよい。 In the present specification, “at least part of the Cygb gene is altered” means that at least part of the base sequence of the Cygb gene is altered to cause deletion, substitution or addition. In order to delete the function of the Cygb gene, one or more mutations among deletion, substitution and addition may be combined with the Cygb gene.
また、本明細書においてCygb遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「欠失」させるとは、Cygb遺伝子の一部または全部を欠失させることにより、Cygb遺伝子の発現産物がCygbタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。また、本明細書においてCygb遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「置換」するとは、Cygb遺伝子の一部又は全部をCygb遺伝子とは関係のない別個の配列に置換することにより、Cygb遺伝子の発現産物がCygbタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。更に、本明細書においてCygb遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に「付加」するとは、Cygb遺伝子中にCygb遺伝子以外の配列を付加することにより、Cygb遺伝子の発現産物がCygbタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。 Also, in this specification, “deleting” at least a part of the base sequence of the Cygb gene means that the expression product of the Cygb gene expresses a function as a Cygb protein by deleting part or all of the Cygb gene. It means to modify so as not to. Further, in this specification, “replacement” of at least a part of the base sequence of the Cygb gene means expression of the Cygb gene by replacing part or all of the Cygb gene with a separate sequence unrelated to the Cygb gene. It means that the product is modified so that its function is not expressed as a Cygb protein. Further, in this specification, “adding” to at least a part of the base sequence of the Cygb gene means that by adding a sequence other than the Cygb gene into the Cygb gene, the expression product of the Cygb gene does not function as a Cygb protein. Is to be modified as follows.
本発明において、Cygb遺伝子の機能の欠損の好適な態様として、染色体上のCygb遺伝子座のエクソン１から２の領域が除去されることにより、その発現が完全に欠損しているもの；或いは染色体上のCygb遺伝子座のエクソン１の上流にネオマイシン耐性遺伝子等の外来遺伝子が挿入されることにより、その発現が低下している変異配列に置換されているものが例示される。
In the present invention, as a preferred embodiment of the defect in the function of the Cygb gene, the
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、Cygb遺伝子における対立遺伝子のいずれか一方の機能が欠損されているヘテロ接合体のノックアウト動物であってもよく、また対立遺伝子の双方の機能が欠損しているホモ接合体のノックアウト動物であってもよい。好ましくは、ホモ接合体のノックアウト動物である。 The non-human disease model animal of the present invention may be a heterozygous knockout animal in which the function of any one of the alleles in the Cygb gene is lacking, or the functions of both alleles are lacking. It may be a homozygous knockout animal. Preferably, it is a homozygous knockout animal.
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、Cygb遺伝子の機能が欠損しており、Cygb遺伝子が関与する疾患のモデル動物として有用である。具体的には、本発明の非ヒト疾患モデル動物は、鉄の代謝異常に伴って発症する疾患のモデル動物として有用である。 The non-human disease model animal of the present invention is deficient in the function of the Cygb gene, and is useful as a model animal for diseases involving the Cygb gene. Specifically, the non-human disease model animal of the present invention is useful as a model animal of a disease that develops with abnormal iron metabolism.
具体的には、本発明の非ヒト疾患モデル動物がマウスである場合には、経時的に、以下のような症状や病態を示す。本発明の非ヒト疾患モデルマウスは、生後2ヶ月位までは各種臓器に異常が認められることなく成長する。しかしながら、生後12週目位から、鉄の代謝異常によって、脾臓に変化が生じ、赤脾髄に鉄が沈着し、鉄関連遺伝子[haptoglobin, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine]のmRNA発現が変化する。この時点では、肝臓においては組織学的に変化は見られないが、上記と同様に鉄関連遺伝子[hemeoxygenase 1, hemeoxygenase2, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, transferrin]のmRNA発現が変化する。更に、生後10ヶ月位経過すると、肝臓と脾臓の腫大が認められる。即ち、本発明の非ヒト疾患モデルマウスは、肝臓と脾臓における鉄代謝異常が発症する。 Specifically, when the non-human disease model animal of the present invention is a mouse, it exhibits the following symptoms and pathological conditions over time. The non-human disease model mouse of the present invention grows without any abnormality in various organs until about 2 months after birth. However, from about the 12th week after birth, iron metabolism abnormalities caused changes in the spleen, iron deposited in the red pulp, and mRNA of iron-related genes [haptoglobin, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine] Expression changes. At this point, there is no histological change in the liver, but the mRNA expression of iron-related genes [hemeoxygenase 1, hemeoxygenase2, iron regulatory factor 1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, transferrin] changes as above. To do. Furthermore, swelling of the liver and spleen is observed about 10 months after birth. That is, the non-human disease model mouse of the present invention develops iron metabolism abnormality in the liver and spleen.
本発明の非ヒト疾患モデル動物は、鉄の代謝異常に伴って発症する疾患のモデル動物として使用する場合、当該疾患の病因の解明や、当該疾患の予防又は治療薬をスクリーニングに使用される。具体的には、本発明の非ヒト疾患モデル動物を利用して、鉄代謝異常に関連する疾患の予防又は治療薬をスクリーニングするには、当該非ヒト疾患モデル動物に被験物質を投与し、その後、非ヒト疾患モデル動物の鉄代謝異常に関連する疾患の発症率及び重症度を判定すればよい。このようなスクリーニングによって、鉄代謝異常に関連する疾患の予防又は治療に有用な、Cygbに対するアンタゴニスト又はアゴニストが検出され得る。なお、ここで、鉄の代謝異常に伴って発症する疾患としては、具体的には、ヘモジデローシス、ヘモクロマトーシス、慢性肝障害、膠原病、多血症等が例示される。 When the non-human disease model animal of the present invention is used as a model animal of a disease that develops with abnormal iron metabolism, the pathogenesis of the disease is elucidated and a prophylactic or therapeutic drug for the disease is used for screening. Specifically, in order to screen for a prophylactic or therapeutic drug for a disease associated with abnormal iron metabolism using the non-human disease model animal of the present invention, a test substance is administered to the non-human disease model animal, and then What is necessary is just to determine the onset rate and severity of a disease associated with abnormal iron metabolism in a non-human disease model animal. By such screening, antagonists or agonists for Cygb that are useful for the prevention or treatment of diseases associated with abnormal iron metabolism can be detected. Here, specific examples of the disease that develops due to abnormalities in iron metabolism include hemosiderosis, hemochromatosis, chronic liver injury, collagen disease, and polycythemia.
そして更に、本発明の非ヒト疾患モデル動物は、肝硬変、肝炎、肝線維化等の肝疾患、とりわけ鉄代謝異常が関連するこれらの肝疾患のモデル動物としても利用され得る。従来、Cygbは肝線維化で発現が増強されていることが知られており、Cygbの機能を欠損させたモデル動物が、肝硬変や肝線維化等の肝疾患のモデル動物として使用できることは、従来技術からは予想できなかった知見である。 Furthermore, the non-human disease model animal of the present invention can also be used as a model animal for liver diseases such as cirrhosis, hepatitis and liver fibrosis, especially those liver diseases associated with abnormal iron metabolism. Conventionally, Cygb is known to have enhanced expression due to liver fibrosis, and it is known that a model animal deficient in Cygb function can be used as a model animal for liver diseases such as cirrhosis or liver fibrosis. This is an unexpected finding from technology.
なお、本発明の非ヒト疾患モデル動物は、実験動物として十分な寿命を有し得る。ここで、実験動物として十分な寿命とは、例えばマウスの場合であれば２年程度である。 In addition, the non-human disease model animal of the present invention can have a sufficient life span as an experimental animal. Here, a sufficient life span as an experimental animal is, for example, about 2 years in the case of a mouse.
２．非ヒト疾患モデル動物の製造方法
本発明の非ヒト疾患モデル動物の製造方法については特に制限されず、通常のノックアウト動物の製造方法と同様に実施されるが、一例としてCygb遺伝子が不活性化された胚幹細胞を胚盤胞に導入して得られるキメラ胚を、対象動物の雌の子宮に着床させることにより、キメラ動物を得る方法が例示される。より具体的には、以下に説明する工程(1)〜(6)を経ることにより、本発明の非ヒト疾患モデル動物を得ることができる。
2. Method for Producing Non-Human Disease Model Animal The method for producing the non-human disease model animal of the present invention is not particularly limited, and is carried out in the same manner as the usual method for producing knockout animals. For example, the Cygb gene is inactivated. An example is a method of obtaining a chimeric animal by implanting a chimeric embryo obtained by introducing the embryonic stem cells into a blastocyst into a female uterus of the subject animal. More specifically, the non-human disease model animal of the present invention can be obtained through the steps (1) to (6) described below.
工程(1)：Cygb遺伝子のフラグメントのクローニング
先ず、CygbのゲノムDNAのフラグメントをクローニングする（工程(1)）。
Step (1): Cloning Cygb Gene Fragment First, a Cygb genomic DNA fragment is cloned (step (1)).
CygbのゲノムDNAフラグメントは、対象動物のゲノムライブラリーからクローニング、更に必要に応じてサブクローニングすることにより得ることができる。クローニング又はサブクローニングされるフラグメントには、Cygb遺伝子のコード領域、好ましくはエクソン１又は２が含まれていることが望ましい。
The genomic DNA fragment of Cygb can be obtained by cloning from a genomic library of the subject animal and further subcloning as necessary. It is desirable that the fragment to be cloned or subcloned contains the coding region of Cygb gene, preferably
工程(2)：改変フラグメントの作製
次いで、前記工程(1)で得られたフラグメントを改変して、Cygb遺伝子の機能を欠損させる改変フラグメントを作製する（工程(2)）。具体的には、前記工程(1)で得られたフラグメントに対して、欠失、置換又は付加を行うことにより、Cygb遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得ることができる。前記工程(1)で得られたフラグメントにおいて改変がなされる部位には、Cygb遺伝子のコード領域、好ましくはエクソン１又は２が含まれていることが望ましい。
Step (2): Production of Modified Fragment Next, the fragment obtained in the step (1) is modified to produce a modified fragment that lacks the function of the Cygb gene (step (2)). Specifically, a modified fragment that inactivates the Cygb gene can be obtained by performing deletion, substitution, or addition to the fragment obtained in the step (1). The site to be modified in the fragment obtained in the step (1) preferably contains the coding region of Cygb gene, preferably
前記工程(1)で得られたフラグメントの改変において、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして置換することが望ましく、このような薬剤耐性遺伝子による置換によって後述する胚幹細胞の選択が容易になる。 In the modification of the fragment obtained in the step (1), it is desirable to replace a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene, a hygromycin B phosphotransferase gene or the like as a selection marker. Selection of embryonic stem cells is facilitated.
工程(3)：ターゲッティングベクターの作製
次いで、前記工程(2)で得られた改変フラグメントが組み込まれたターゲッティングベクターを作製する（工程(3)）。
Step (3): Preparation of Targeting Vector Next, a targeting vector incorporating the modified fragment obtained in the step (2) is prepared (step (3)).
本工程で使用されるベクターの種類について、胚幹細胞に相同性組み換えを起こすことができることを限度として、その種類については特に制限されない。また、ターゲッティングベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って、ベクターに上記改変フラグメントを導入することにより作製される。 The type of vector used in this step is not particularly limited as long as homologous recombination can occur in embryonic stem cells. The targeting vector is prepared by introducing the modified fragment into the vector according to a method known in the art.
工程(4)：Cygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞の作製
次いで、前記工程(3)で得られたターゲッティングベクターを胚性幹細胞に相同性組み換えを行うことにより、Cygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞を作製する（工程(4)）。
Step (4): Preparation of embryonic stem cell lacking the function of Cygb gene Next, homologous recombination of the targeting vector obtained in the above step (3) with embryonic stem cell resulted in loss of the function of Cygb gene. Embryonic stem cells are prepared (step (4)).
本明細書において、「相同組み換え」とは、Cygb遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変したCygb遺伝子を、ゲノム中のサイトCygb遺伝子のＤＮＡ領域に、人工的に組換えさせることをいう。 In the present specification, “homologous recombination” means that a modified Cygb gene having the same or similar base sequence as the Cygb gene is artificially recombined with the DNA region of the site Cygb gene in the genome.
本工程は、前記工程(3)で得られたターゲッティングベクターを胚性幹細胞に導入し、Cygb遺伝子の機能を欠損させる改変フラグメントが組み込まれた組み換え胚性幹細胞を選択することによって行われる。 This step is performed by introducing the targeting vector obtained in the above step (3) into embryonic stem cells and selecting a recombinant embryonic stem cell into which a modified fragment that deletes the function of the Cygb gene is incorporated.
本工程で使用される胚性幹細胞の種類については特に制限されないが、Cygb遺伝子のフラグメントのクローニングを行った動物と同一種且つ同一系統由来のものが好ましい。例えば、マウスの場合であれば、胚性幹細胞として、R1細胞株、TT２細胞株、AB-1細胞株、J1細胞株等が知られており、目的や方法に応じて適宜選択して決定すればよい。 The type of embryonic stem cells used in this step is not particularly limited, but those derived from the same species and strain as the animal in which the Cygb gene fragment was cloned are preferred. For example, in the case of mice, R1 cell line, TT2 cell line, AB-1 cell line, J1 cell line, etc. are known as embryonic stem cells, and can be selected and determined appropriately according to the purpose and method. That's fine.
ターゲッティングベクターの胚性幹細胞への導入は、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法等の公知の方法で行うことができるが、導入遺伝子の相同組み換え効率を考えると、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。 Introduction of the targeting vector into embryonic stem cells can be carried out by known methods such as electroporation, liposome, calcium phosphate, DEAE-dextran, but considering the efficiency of homologous recombination of the transgene, It is preferable to use a kinetic method.
また、ターゲッティングベクターが導入された胚性幹細胞から、組み換え胚性幹細胞を選択する方法についても、従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、前記改変フラグメントに薬剤耐性遺伝子が組み込まれている場合には、当該薬剤を含む培地で培養することにより、目的の組み換え胚性幹細胞を選択することができる。選択された胚性幹細胞は、サザンハイブリダイゼーション法やPCR法等の公知の遺伝子解析法によって、組み換え体であることを確認することができる。 A method for selecting a recombinant embryonic stem cell from an embryonic stem cell into which a targeting vector has been introduced can also be performed according to a conventionally known method. For example, when a drug resistance gene is incorporated in the modified fragment, the target recombinant embryonic stem cell can be selected by culturing in a medium containing the drug. The selected embryonic stem cell can be confirmed to be a recombinant by a known gene analysis method such as Southern hybridization or PCR.
工程(5)：Cygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞が導入されたキメラ胚の作製
次いで、前記工程(4)で得られたCygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞が導入されたキメラ胚を作製する（工程(5)）。
Step (5): Preparation of chimeric embryo into which embryonic stem cells lacking the function of Cygb gene are introduced Next, the chimeric embryo into which embryonic stem cells lacking the function of Cygb gene obtained in step (4) are introduced (Step (5)).
本工程で使用される胚盤胞は、Cygb遺伝子のフラグメントのクローニングを行った非ヒト動物と同一種且つ同一系統由来のものが好適である。 The blastocyst used in this step is preferably of the same species and strain as the non-human animal in which the Cygb gene fragment was cloned.
キメラ胚は、Cygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞を胚盤胞の胚内に導入する、或いは８細胞期胚又は嚢胚と凝集させることにより作製される。胚性幹細胞を胚盤胞等の胚に導入するには、マイクロインジェクション法や凝集法等の公知の方法に従って実施すればよい。例えば、マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、FSH様作用を有するPMSGおよびLH作用を有するｈCGを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から3.5日目に、８細胞期胚又は嚢胚を用いる場合には2.5日目又は3日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、Cygb遺伝子の機能が欠損した胚性幹細胞をin vitroで注入することにより、キメラ胚が作製される。 A chimeric embryo is produced by introducing embryonic stem cells deficient in the function of the Cygb gene into blastocyst embryos or aggregating them with 8-cell stage embryos or sac embryos. Introducing embryonic stem cells into an embryo such as a blastocyst may be carried out according to a known method such as a microinjection method or an aggregation method. For example, in the case of mice, female mice subjected to superovulation treatment with hormone agents (for example, using PMSG having FSH-like action and hCG having LH action) are mated with male mice. Thereafter, early embryos are collected from the uterus on day 3.5 after fertilization when using blastocysts, and on day 2.5 or 3 when using 8-cell embryos or sac embryos, respectively. A chimeric embryo is produced by injecting embryonic stem cells lacking the function of the Cygb gene in vitro into the embryos thus collected.
工程(6)：キメラ胚を利用したキメラ動物の作製
次いで、前記工程(5)で得られたキメラ胚を雌非ヒト動物の子宮に着床させて、キメラ動物を発生させる（工程(6)）。
Step (6): Production of chimeric animal using chimeric embryo Next, the chimeric embryo obtained in the above step (5) is implanted into the uterus of a female non-human animal to generate a chimeric animal (step (6) ).
本工程で使用される雌非ヒト動物は、仮親として使用される偽妊娠動物であり、キメラ胚を得るために用いた非ヒト動物と異なる系統由来（ICRなど）を使用することが好適である。当該偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配させることにより得ることができる。 The female non-human animal used in this step is a pseudopregnant animal used as a temporary parent, and it is preferable to use a different strain (ICR, etc.) from the non-human animal used to obtain the chimeric embryo. . The pseudopregnant animal can be obtained by mating a female animal having a normal cycle with a male animal castrated by vagina ligation or the like.
雌非ヒト動物の子宮に、前記工程(5)で得られたキメラ胚を子宮内移植して子宮に着床させ、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、前記工程(5)におけるキメラ胚の作製に使用した雌非ヒト動物と仮親となる雌非ヒト動物とを、同一の性周期にある動物群から作出することが望ましい。 A chimeric animal can be produced by implanting the chimeric embryo obtained in the above step (5) in the uterus into a uterus of a female non-human animal, implanting it into the uterus, and allowing it to conceive and give birth. In order to ensure implantation of the chimeric embryo and pregnancy more reliably, the female non-human animal used for the production of the chimeric embryo in the step (5) and the female non-human animal serving as a temporary parent are in the same sexual cycle. It is desirable to produce from a group of animals.
所望のキメラ動物が得られたことを確認するには、例えば、以下の手法を用いることができる。即ち、キメラ動物を同一種の純系動物と交配させ、そして次世代個体に胚性幹細胞由来の被毛色の発現の有無を観察することにより、胚性幹細胞がキメラ動物生殖系列へ導入されたか否かを確認することができる。例えば、マウスの場合であれば、野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色、白色等の被毛色が知られており、使用する胚性幹細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択すればよい。また、キメラ動物の体の一部（例えば尾部先端）からDNAを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイ等を行うことにより、所望のキメラ動物が得られたことを確認することも可能である。 In order to confirm that a desired chimeric animal has been obtained, for example, the following method can be used. That is, whether or not embryonic stem cells have been introduced into the germ line of chimeric animals by crossing chimeric animals with pure animals of the same species and observing the presence or absence of embryonic stem cell-derived coat color in next-generation individuals Can be confirmed. For example, in the case of mice, known as hair color such as wild mouse color (Agouti color), black color, ocher color, chocolate color, white color, etc., considering the origin line of embryonic stem cells to be used, chimera A mouse strain to be mated with a mouse may be appropriately selected. It is also possible to confirm that a desired chimeric animal has been obtained by extracting DNA from a part of the body of the chimeric animal (for example, the tip of the tail) and performing Southern blot analysis, PCR assay, or the like.
工程(7)：交配によるヘテロ接合体又はホモ接合体の非ヒト動物の作製
前記工程(6)で得られたキメラ動物同士を交配させることにより、ヘテロ接合体のCygb遺伝子欠損非ヒト動物、又はホモ接合体のCygb遺伝子欠損非ヒト動物を得ることができる。得られたCygb遺伝子欠損非ヒト動物が、ヘテロ接合体であるか、或いはホモ接合体であるかについては、サザンブロット法等の公知の解析手法によって確認できる。
Step (7): Production of heterozygous or homozygous non-human animal by mating By mating the chimeric animals obtained in the above step (6), a Cygb gene-deficient non-human animal of heterozygote, or A homozygous Cygb gene-deficient non-human animal can be obtained. Whether the obtained Cygb gene-deficient non-human animal is a heterozygote or a homozygote can be confirmed by a known analysis technique such as Southern blotting.
斯くして作出されたCygb遺伝子欠損非ヒト動物は、生殖細胞及び体細胞の全てに安定的Cygb遺伝子変異を有しており、交配等により効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。 The thus produced Cygb gene-deficient non-human animal has a stable Cygb gene mutation in all germ cells and somatic cells, and can efficiently transmit the mutation to offspring animals by mating and the like.
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ Cygb遺伝子欠損マウスの作製及び確認
(1) Cygb遺伝子欠損マウスの作製
マウス１２９ＳｖゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によりCygb遺伝子の５′上流域の５．９ｋｂＤＮＡフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、CygbゲノムＤＮＡの５’ＵＴＲおよびエクソン１の一部を有する。さらに、マウス１２９ＳｖゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によりCygb遺伝子の３′下流域の６．９ｋｂＤＮＡフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、サイトグロビンゲノムＤＮＡのエクソン３，４および３’ＵＴＲを有する。上流５．９ｋｂＤＮＡフラグメントの下流にホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子カセット（ＰＧＫ−ｎｅｏ）を結合し、さらにその下流に、６．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを結合した。ネオマイシン抵抗遺伝子カセットは、両側をバクテリオファージＰ１のloxPとよばれる部位特異的組換え配列で挟まれている。この改変フラグメントを、プラスミドベクターｐBluescript II（ストラタジーン株式会社）に組み込んで、ターゲッティングベクターｐＴＶＦｌｏｘＰＧＫｎｅｏ／Ｃｇ＃３を得た。
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples and the like, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Production and confirmation of Cygb gene-deficient mice
(1) Preparation of Cygb gene-deficient mouse A 5.9 kb DNA fragment in the 5 'upstream region of the Cygb gene was cloned from mouse 129Sv genomic DNA by PCR. This fragment has the 5′UTR and part of
得られたターゲッティングベクターをＮｏｔＩによって線状化して、１２９Ｓｖ胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、抗生物質Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む（１５０μｇ／ｍｌ）、ＥＳ細胞用の２０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地において３７℃で培養し、Ｇ４１８抵抗性ＥＳ細胞クローンを選択した。選択された４８０個の抵抗性コロニーを拡張させ、以下の条件でサザンブロットを行い、組換えクローンを同定した。まず、各細胞コロニーから溶解試薬を加えて５０℃で１６時間加温し、エタノール沈澱により細胞のＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを制限酵素ＢＣＬ１で切断した後、アガロースゲルに電気泳動後、ブロットし、Cygb遺伝子の５′上流のプローブ（２００ｂｐ）をｐ３２放射性ｄＣＴＰで標識したものを加えてハイブリダイゼーションを行った。その後、フィルターを洗浄し、組換えＥＳ細胞に特異的なバンドによって、正しく相同組換えＥＳ細胞を５個同定した。
正しく相同組換えしたＥＳ細胞を、ＢＤＦ１マウスの交配から得られた嚢胚と凝集させ、偽妊娠マウスの子宮に移植し、キメラ胚を得た。得られたキメラ胚を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配して、Cygb遺伝子がヘテロのマウスを得た。このようなCygb遺伝子をヘテロにもつ雄雌マウス同士を交配させ、Cygb遺伝子を欠失したホモマウス（Cygb遺伝子欠損マウス）を得た。
The resulting targeting vector was linearized with NotI and transfected into 129Sv embryonic stem cells (ES cells) by electroporation. The transfected cells were cultured at 37 ° C. in 20% FCS-DMEM medium for ES cells containing the antibiotic G418 (neomycin) (150 μg / ml), and G418-resistant ES cell clones were selected. The selected 480 resistant colonies were expanded and Southern blotting was performed under the following conditions to identify recombinant clones. First, a lysis reagent was added from each cell colony and heated at 50 ° C. for 16 hours, and the DNA of the cells was recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA was cleaved with the restriction enzyme BCL1, electrophoresed on an agarose gel, blotted, and hybridized by adding a probe (200 bp) upstream of the Cygb gene labeled with p32 radioactive dCTP. Thereafter, the filter was washed, and 5 homologous recombinant ES cells were correctly identified by a band specific to the recombinant ES cells.
Correctly homologous recombination ES cells were aggregated with sac embryos obtained from mating BDF1 mice and transplanted into the uterus of pseudopregnant mice to obtain chimeric embryos. The resulting chimeric embryo was mated with C57BL / 6J mice to obtain mice with heterozygous Cygb genes. Male and female mice having such a Cygb gene heterozygously were mated to obtain a homo mouse (Cygb gene-deficient mouse) lacking the Cygb gene.
(2) Cygb遺伝子欠損マウスの確認
上記で作製されたマウス尾からDNAを抽出し、PCRを行いCygb遺伝子とネオマイシン遺伝子の存在をプライマー[CTCCCAGCCGGGACCGCGGTGGCCTT (両者に共通するforward primer；配列番号１), GGAGCCGAGGCCGGTGCGTGCGAGGC (Cygbに対するreverse primer；配列番号２), GTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCT (Neoに対するreverse primer；配列番号３)]で検討したところ、野生型ではCygb＋/Neo-、ヘテロマウスではCygb＋/Neo+であり、ホモマウスでは完全にCygb 遺伝子が消失していた（図２参照）。更に、上記で作製されたマウスの肝臓をホモゲネートし、その10μgをSDS-PAGEで分離後、抗ラットCygbペプチド抗体（Kawada N, KristensenDB, et al. J Biol Chem. 2001;276:25318）を用いてウエスタンブロット法でCygb蛋白発現を確認したところ、ヘテロマウスではCygb蛋白質が半分に減少し、ホモマウスでは完全にCygb蛋白質が消失していることを確認した（図３参照）。
(2) Confirmation of Cygb gene-deficient mice DNA was extracted from the mouse tail prepared above and PCR was performed to determine the presence of Cygb gene and neomycin gene as primers [CTCCCAGCCGGGACCGCGGTGGCCTT (forward primer common to both; SEQ ID NO: 1), GGAGCCGAGGCCGGTGCGTGCGAGGC (Reverse primer for Cygb; SEQ ID NO: 2), GTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCT (reverse primer for Neo; SEQ ID NO: 3)], Cygb + / Neo- in the wild type, Cygb + / Neo + in the hetero mouse, and completely Cygb in the homo mouse The gene was lost (see FIG. 2). Furthermore, the mouse liver prepared above was homogenized, and 10 μg was separated by SDS-PAGE, and then anti-rat Cygb peptide antibody (Kawada N, KristensenDB, et al. J Biol Chem. 2001; 276: 25318) was used. When the Cygb protein expression was confirmed by Western blotting, it was confirmed that the Cygb protein was reduced to half in the hetero mouse and the Cygb protein was completely lost in the homo mouse (see FIG. 3).
更に、上記で作製されたマウス尾から抽出したDNAに対して、以下の方法でサザンブロットを実施し、ゲノム上のCygb遺伝子の確認を行った。先ず、マウスDNA 20μｇをEcoRV制限酵素で切断後、0.8％アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレン（Amersham Biosciences社製 Hybond-N）に転写した。プローブにはforward primer : AAAGAGGCAGATGCCACAGG（配列番号４）, reverse primer : CGTGGCACCCACATGAGAAG（配列番号５）によるPCR産物を使用し、プローブのラベル及びCygb遺伝子の検出はDIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは65℃ 16時間、メンブレンの洗浄は、0.1 x SSC/0.1%SDS、65℃で30分行った。次いで、NBT/BCIT（nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）を加えて染色を行った。その結果、野生型マウスではCygb遺伝子が検出されたが、ホモマウスではcygb遺伝子が欠損されていることを確認した（図４参照）。 Furthermore, Southern blotting was performed on the DNA extracted from the mouse tail prepared above by the following method, and the Cygb gene on the genome was confirmed. First, 20 μg of mouse DNA was cleaved with EcoRV restriction enzyme, electrophoresed on 0.8% agarose gel, and transferred to a nylon membrane (Hybond-N manufactured by Amersham Biosciences). For the probe, PCR products using forward primer: AAAGAGGCAGATGCCACAGG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer: CGTGGCACCCACATGAGAAG (SEQ ID NO: 5) were used. (Manufactured by Diagnostics). Hybridization was performed at 65 ° C. for 16 hours, and the membrane was washed at 0.1 × SSC / 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes. Next, NBT / BCIT (nitro blue tetrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) was added for staining. As a result, it was confirmed that the Cygb gene was detected in the wild type mouse, but the cygb gene was deleted in the homo mouse (see FIG. 4).
また、抗ラットCygbペプチド抗体を用いてマウス肝臓を詳細に間接免疫酵素抗体法で検討したところ、肝臓内の血管周囲に茶色に発現しているCygb蛋白質はヘテロマウスでは減少しており、更にホモマウスでは検出されないことが判明した（図５参照）。 In addition, when the mouse liver was examined in detail by the indirect immunoenzyme antibody method using an anti-rat Cygb peptide antibody, the Cygb protein expressed in brown around the blood vessels in the liver was decreased in the hetero mouse, and further in the homo mouse. Was found not to be detected (see FIG. 5).
以上の結果から、上記で得られたホモマウスは、Cygbの機能が欠損しており、Cygb遺伝子欠損（ノックアウト）マウスであることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the homo mice obtained above lack Cygb function and are Cygb gene-deficient (knockout) mice.
実施例２ Cygb遺伝子欠損マウスの特性評価
上記実施例１で得られたCygb遺伝子欠損マウス（ホモマウス）の特性を評価するために、生育及び生理学的特徴を経時的に観察した。
Example 2 Characteristic Evaluation of Cygb Gene Deficient Mice In order to evaluate the characteristics of Cygb gene deficient mice (homo mice) obtained in Example 1 above, growth and physiological characteristics were observed over time.
＜２週目まで＞
Cygb遺伝子欠損マウスは野生型マウスの産子数（n=8.8±0.97）に比し、一回の出産により生まれる産子数(n=4.4±1.95)が有意に少ないことが判明した。また生後２週間以内に死亡に至る数はn=1.3±1.41であり繁殖率に差が生じた。その後は野生型とほぼ同様に成長し、寿命に明らかな差は認められなかった。
<Up to the second week>
Cygb gene-deficient mice were found to have significantly fewer offspring (n = 4.4 ± 1.95) than those of wild-type mice (n = 8.8 ± 0.97). The number of deaths within 2 weeks after birth was n = 1.3 ± 1.41, and there was a difference in the reproductive rate. After that, it grew almost the same as the wild type, and there was no obvious difference in lifespan.
＜１０〜１２週目頃＞
10週齢のCygb遺伝子欠損マウスでは、脾臓に軽度腫大が見られた。体重並びに臓器重量を測定すると野生型マウスにおいては、体重：25.88±0.72g（n=5）、肝重量：1.26±0.04g（n=5）、脾臓重量：0.064±0.059g（n=5）であったのに対し、Cygb遺伝子欠損マウスでは体重：30.34±1.38g（n=5）（p<0.01）、肝重量：1.50±0.11g（n=5）（p<0.05）、脾臓重量：0.089±0.017g（n=5）（p<0.01）であり、両群の重量差には有意差が認められた。当該脾臓について更に詳細に検討するために、これを４％パラホルムアルデヒドを用いて固定してパラフィン包埋した後に、４μmに薄切して脱パラフィンした組織を用いて各種染色を行った。顕微鏡下に観察すると、ベルリン青染色で赤脾髄に沿って鉄の沈着がみられることが判明し、赤脾髄に変化が生じることが明らかになった（図６参照）。
<About 10-12 weeks>
A 10-week-old Cygb gene-deficient mouse had mild swelling in the spleen. When measuring body weight and organ weight, in wild-type mice, body weight: 25.88 ± 0.72 g (n = 5), liver weight: 1.26 ± 0.04 g (n = 5), spleen weight: 0.064 ± 0.059 g (n = 5) In contrast, in Cygb gene-deficient mice, body weight: 30.34 ± 1.38g (n = 5) (p <0.01), liver weight: 1.50 ± 0.11g (n = 5) (p <0.05), spleen weight: It was 0.089 ± 0.017g (n = 5) (p <0.01), and a significant difference was recognized in the weight difference between the two groups. In order to examine the spleen in more detail, this was fixed with 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin, and then various types of staining were performed using tissue that had been sliced into 4 μm and deparaffinized. When observed under a microscope, it was revealed by Berlin blue staining that iron deposits were observed along the red spleen, and changes were found in the red spleen (see FIG. 6).
鉄の沈着が脾臓で高度であったため、脾臓並びに肝臓における鉄代謝と関連する遺伝子の発現動態をreal time RT-PCRを用いて検討した。Cygb遺伝子欠損マウスの凍結保存脾臓組織及び肝組織から、Isogen（日本ジーン社製）を用いてtotal RNAを抽出した。100 ngのtotal RNAをテンプレートとし表１に示すTaqManプローブ、並びにPCRプライマー、One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)を用い、ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemにより解析した。反応条件は42℃ 15分、95℃ 2分、（95℃5秒、60℃ 30秒）ｘ40サイクル、95℃ 15分、60℃ 1分、95℃ 15秒で行った。各遺伝子の発現はglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)の発現で標準化した。その結果、haptoglobin, hemeoxygenase 1, hemeoxygenase 2, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, ferritin, transferrinのmRNA発現が、野生型マウスに比較してCygb遺伝子欠損マウスで全て変動していることが判明した（図７、８）。脾臓組織における比較ではhaptoglobin：1.67倍（p<0.01）, hemeoxygenase 1：1.12倍, hemeoxygenase2：1.18倍, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1)：1.63倍（p<0.01）, hepcidine：0.6倍（p<0.01）, ferritin：0.89倍, transferrin：1.12倍の変化がみとめられた。肝組織においては野生型マウスとの比較において、haptoglobin：1.2倍, hemeoxygenase1：1.71倍（p<0.01）, hemeoxygenase 2：1.41倍（p<0.01）, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1)：1.52倍（p<0.01）, hepcidine：1.4倍（p<0.01）, ferritin：1.12倍, transferrin：1.49倍（p<0.01）を示した。
Since iron deposition was high in the spleen, the expression dynamics of genes related to iron metabolism in the spleen and liver were examined using real time RT-PCR. Total RNA was extracted from the cryopreserved spleen tissue and liver tissue of Cygb gene-deficient mice using Isogen (Nippon Gene). Using 100 ng of total RNA as a template, analysis was performed by ABI PRISM 7700 Sequence Detection System using the TaqMan probe shown in Table 1, PCR primers, and One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc.). The reaction conditions were 42 ° C. for 15 minutes, 95 ° C. for 2 minutes, (95 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 30 seconds) × 40 cycles, 95 ° C. for 15 minutes, 60 ° C. for 1 minute, and 95 ° C. for 15 seconds. The expression of each gene was standardized by the expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). As a result, it was found that mRNA expression of haptoglobin,
＜１０ヶ月頃＞
１０ヶ月齢のマウスを開腹すると、野生型マウスに比較してCygb遺伝子欠損マウスでは肝臓と脾臓が腫大していた（図９参照）。野生型マウスの肝臓が1.55±0.23g（n=5）であったのに対して、Cygb-/-マウスでは1.74±0.06g（n=5）であった。さらに脾臓は野生型0.11±0.027g（n=5）に対しCygb遺伝子欠損マウス0.16±0.046g（n=5）(p<0.01)と有意な腫大が認められた。
<About 10 months>
When a 10-month-old mouse was laparotomized, the liver and spleen were enlarged in the Cygb gene-deficient mouse compared to the wild-type mouse (see FIG. 9). The liver of wild-type mice was 1.55 ± 0.23 g (n = 5), whereas that of Cygb − / − mice was 1.74 ± 0.06 g (n = 5). In addition, the spleen was significantly swollen with 0.16 ± 0.046g (n = 5) (p <0.01) of Cygb gene-deficient mice against wild-type 0.11 ± 0.027g (n = 5).
１０ヶ月脾臓における、組織学的変化を見てみるとヘマトキシリン−エオジン染色ではCygb遺伝子欠損マウスの赤脾髄は拡大していた（図１０）。またベルリン青染色では、赤脾髄における鉄の沈着が著明に進行していることが明らかになった。 Looking at the histological changes in the 10-month spleen, the red spleen of Cygb gene-deficient mice was enlarged by hematoxylin-eosin staining (FIG. 10). The blue staining of Berlin revealed that iron deposition in the red spleen was progressing markedly.
１０ヶ月肝臓と脾臓における、鉄関連遺伝子の発現について、１０週令同様にrealtime RT-PCRを用いて検討した（図１１、１２）。その結果haptoglobin, hemeoxygenase 1, hemeoxygenase 2, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1), hepcidine, ferritin, transferrinのmRNA発現が、野生型マウスに比較してCygb遺伝子欠損マウスで全て有意に増加していることが判明した。肝組織においては野生型マウスとの比較において、haptoglobin：1.56倍（p<0.01）, hemeoxygenase 1：1.33倍, hemeoxygenase2：1.52倍（p<0.01）, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1)：1.63倍（p<0.01）, hepcidine：1.28倍（p<0.01）, ferritin：1.97倍（p<0.01）, transferrin：1.17倍を示した。また脾臓組織における比較ではhaptoglobin：1.35倍, hemeoxygenase1：1.12倍, hemeoxygenase 2：1.14倍, iron regulatory factor1 (ferroportin, IREG1)：1.21倍, hepcidine：1.47倍, ferritin：1.36倍, transferrin：1.13倍の増加がみとめられた。
The expression of iron-related genes in the 10-month liver and spleen was examined using realtime RT-PCR as in 10 weeks of age (FIGS. 11 and 12). As a result, mRNA expression of haptoglobin,
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