JP2006340604A - Model animal for diabetic retinopathy and nephropathy - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖尿病合併症の病態モデル動物に関し、さらに詳しくは、インスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子が導入されたことで早期に糖尿病を発症し、さらに糖尿病性網膜症・腎症などの糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、該動物の創製方法並び該動物用いる糖尿病合併症の治療薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a disease model animal for diabetic complications, and more specifically, an insulin promoter, a mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 DNA, and a gene arranged in the order of SV40-polyA signal are introduced. The present invention relates to a transgenic non-human mammal that develops diabetes at an early stage and further develops diabetic complications such as diabetic retinopathy and nephropathy, a method for creating the animal, and a method for screening a therapeutic agent for diabetic complications using the animal .
日本国内の糖尿病患者数は増加の一途をたどり、最新の厚生省統計では推定罹患人口は、７００万人に達する。全世界では現在５０００万人、近い将来は１億人に達すると予想されている。これに伴い糖尿病合併症でクオリティ・オブ・ライフ（quality of life：QOL）が著しく損なわれる患者数も急増している。糖尿病合併症の中でも、血管合併症である糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、糖尿病性神経障害は３大合併症と称されている。糖尿病性腎症や糖尿病網膜症の治療としては、透析療法・光凝固療法が主に行われているがそれらはあくまで対症療法であり、未だその根本的治療法は確立していないのが現状である。 The number of diabetic patients in Japan continues to increase, and according to the latest statistics from the Ministry of Health and Welfare, the estimated affected population reaches 7 million. Globally, it is expected to reach 50 million people now and 100 million in the near future. Along with this, the number of patients whose quality of life (QOL) is significantly impaired due to diabetic complications is rapidly increasing. Among diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, and diabetic neuropathy, which are vascular complications, are called three major complications. For the treatment of diabetic nephropathy and diabetic retinopathy, dialysis therapy and photocoagulation therapy are mainly performed, but these are only symptomatic treatments, and the fundamental treatment method has not yet been established. is there.
一方、遺伝子組み換えによる糖尿病モデル動物に関しては、例えばアンチセンス・グルコキナーゼ遺伝子を染色体に取り込んだ糖尿病モデルマウス（特許文献１）、ヒトインスリン遺伝子プロモーターと、かかるプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに導入した糖尿病発症トランスジェニックマウス（特許文献２）、母親性の発現を示すインプリンティング遺伝子であるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトラスジェニック非ヒト哺乳動物（特許文献３）等が提案されている。
他方，カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２（ＣａＭキナーゼ２：ＣａＭＫ２）は、１９８０年にラット脳において神経伝達物質の一つであるセロトニン生合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼを活性化する新しいタイプのカルモジュリン依存性リン酸化酵素として発見された酵素である。この酵素は、通常、Ｃａ２＋濃度依存的に活性化され、インスリン分泌反応において重要な役割を果たす。この酵素の１アミノ酸変異体（２８６番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換）は、カルシウム非依存で常時活性化されることが知られている（非特許文献１）。
On the other hand, calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 (CaM kinase 2: CaMK2) is a new type that activates tryptophan hydroxylase, a rate-limiting enzyme of serotonin biosynthesis, which is one of neurotransmitters in rat brain in 1980. It is an enzyme discovered as a calmodulin-dependent phosphorylase. This enzyme is usually activated in a Ca 2+ concentration-dependent manner and plays an important role in the insulin secretion reaction. It is known that a single amino acid mutant of this enzyme (the 286th threonine is replaced by aspartic acid) is always activated independently of calcium (Non-patent Document 1).
糖尿病は、インスリン依存性の１型糖尿病とインスリン抵抗性の２型糖尿病に分けられるが、いずれも高血糖を放置すると網膜症や腎症など合併症を発症する。
糖尿病性腎症や糖尿病網膜症の最適なモデル動物を開発し、糖尿病合併症の治療・予防への応用を図ることは、科学的重要性と社会的緊急性とを併せ持つ。
本発明の目的は、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病発症機構の解明および糖尿病合併症発症モデル動物の創製並びに糖尿病合併症発症モデル動物を用いた糖尿病性腎症・糖尿病網膜症・糖尿病神経障害等の糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングするための方法の構築である。
Diabetes is classified into insulin-dependent type 1 diabetes and insulin-resistant type 2 diabetes. In both cases, if hyperglycemia is left untreated, complications such as retinopathy and nephropathy develop.
Developing an optimal model animal for diabetic nephropathy and diabetic retinopathy and applying it to the treatment and prevention of diabetic complications has both scientific importance and social urgency.
The object of the present invention is to elucidate the mechanism of the onset of diabetes caused by constant activation of calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2, to create a model animal for the development of diabetic complications, and to diabetes using the model animal for the development of diabetic complications. Of a method for screening for therapeutic agents for diabetic complications such as diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, and diabetic neuropathy.
高血糖状態の膵臓ランゲルハンス島β細胞では，カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の活性化が持続していることが推定される。そこで本発明者らは、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２変異体のタンパク質をコードするｃＤＮＡをインスリンプロモーターの下流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することを特徴とするトランスジェニックマウスを創製した。さらに、本発明者らは研究を進め、今般創製したトランスジェニックマウスが、生後２〜３週間で劇症型の糖尿病を１００％発症すること、さらに４ヶ月程度飼育することで、糖尿病性腎症および糖尿病網膜症を発症することを見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
It is presumed that the activation of calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 continues in the hyperglycemic pancreatic islets of Langerhans β cells. Therefore, the present inventors constructed a transgene containing a cDNA encoding a calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 mutant protein downstream of the insulin promoter, and microtransfected the transgene into the male pronucleus of a mouse fertilized egg. Injecting, culturing the obtained egg cells, transplanting to the oviduct of a pseudopregnant female mouse, then raising the transplanted animal, and selecting a pup having the cDNA from the pups born. A transgenic mouse was created. Furthermore, the present inventors have conducted research, and that the transgenic mice that have been created recently develop 100% of fulminant diabetes in 2 to 3 weeks after birth, and are further reared for about 4 months. The inventors have found that diabetic retinopathy develops and have completed the present invention.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明で使用されるインスリンプロモーターは、特に限定されないが、例えば、げっ歯類、とりわけ、ラットのインスリンプロモーターが好ましい。また、インスリンプロモーターは、例えば、肝臓由来ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で調製すればよい。具体的なものとして、例えば、ラットインシュリン２遺伝子から得られるプロモーター（配列番号１）が挙げられる。 The insulin promoter used in the present invention is not particularly limited, but for example, the rodent, particularly rat insulin promoter is preferred. The insulin promoter may be prepared by PCR using, for example, liver-derived genomic DNA as a template. Specific examples include a promoter (SEQ ID NO: 1) obtained from the rat insulin 2 gene.
本発明で使用される変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２は、この酵素の１アミノ酸変異体であり、２８６番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換したものである。具体的なものとして、例えば、配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質が挙げられる。
この酵素のＤＮＡは、例えば、ＣＤ１マウス脳由来のＤＮＡを２つのＤＮＡ断片に分けて、それぞれを鋳型としてＰＣＲ法で増幅し、得られた各々のＰＣＲ産物をプラスミドに導入後、通常知られた方法で調製すればよい。具体的なものとして、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列が挙げられる。
The mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 used in the present invention is a single amino acid mutant of this enzyme, and is obtained by substituting the 286th threonine with aspartic acid. Specific examples include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
The DNA of this enzyme is usually known after, for example, dividing DNA derived from CD1 mouse brain into two DNA fragments, each using a template as a template, and amplifying each PCR product into a plasmid. It may be prepared by a method. Specific examples include the DNA sequence of SEQ ID NO: 2.
本発明で使用されるインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子は、例えば、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡおよびＳＶ−４０が導入されたプラスミドから、導入用のＤＮＡ断片を切り出し、それらを通常知られた方法で連結したＤＮＡを有するプラスミドを得、さらにこのプラスミドとインスリンプロモーターを有するプラスミドを用いて、通常知られた方法により調製すればよい。具体的なものとして、例えば、配列番号５のＤＮＡ配列の遺伝子が挙げられる。また、ＳＶ４０−ポリＡシグナルとしては、例えば、配列番号４のＤＮＡ配列が挙げられる。 The gene arranged in the order of the insulin promoter, mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 DNA, and SV40-polyA signal used in the present invention is, for example, the mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 From the plasmid into which DNA and SV-40 were introduced, a DNA fragment for introduction was excised, a plasmid having DNA obtained by ligating them by a generally known method was obtained, and further using this plasmid and a plasmid having an insulin promoter, It may be prepared by a generally known method. Specific examples thereof include a gene having a DNA sequence of SEQ ID NO: 5. Examples of the SV40-poly A signal include the DNA sequence of SEQ ID NO: 4.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えばげっ歯類等の非ヒト哺乳動物の受精卵にインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより創製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット等げっ歯類；ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。また、受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等を例示することができる。 The transgenic non-human mammal of the present invention comprises, for example, an insulin promoter, a mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 DNA, and an SV40-polyA signal in this order on a fertilized egg of a non-human mammal such as a rodent. The fertilized egg is transplanted into a pseudopregnant female non-human mammal, the insulin promoter, the mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 DNA, SV40-poly A signal from the non-human mammal. It can be created by delivering a non-human mammal introduced with a gene arranged in this order. Examples of non-human mammals include rodents such as mice and rats; mammals such as rabbits, but mice are preferred in terms of ease of creation, breeding, and use. In addition, the method for introducing a gene into a fertilized egg is not particularly limited, and examples thereof include a microinjection method and an electroporation method.
トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げてより具体的に説明すると、ラットインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のタンパク質をコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列した導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することよりトランスジェニックマウスを創製することができる。上記マウスの受精卵としては、特に限定されないが、例えば、ＢＤＦ１マウスの受精卵を用いることが好ましい。また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、例えば、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、ラットインスリン遺伝子の配列の一部およびカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２に相補的な配列をプライマーとするＰＣＲ法で増幅し、導入遺伝子を確認しながら選択するればよい。ここで選択されたマウスを初代として飼育し、例えば、ＣＤ１マウスと交配して弟２世代マウスを得ることができる。 More specifically, the case where the transgenic non-human mammal is a transgenic mouse will be described in more detail. Rat insulin promoter, cDNA encoding mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 protein, SV40-polyA After constructing a transgene arranged in the order of signals, microinjecting the transgene into the male pronucleus of a mouse fertilized egg, culturing the obtained egg cell, transplanting it to the oviduct of a pseudopregnant female mouse, and then receiving the animal A transgenic mouse can be created by selecting a pup mouse having the cDNA from the pup mice born. The fertilized egg of the mouse is not particularly limited. For example, it is preferable to use a fertilized egg of a BDF1 mouse. Further, the number of transgenes to be injected is suitably 100 to 3000 molecules per fertilized egg. In addition, selection of pups having cDNA includes, for example, PCR using DNA extracted from the tail of the mouse, etc., and using a part of the rat insulin gene sequence and a sequence complementary to calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 as primers. Amplification by the method and selection while confirming the transgene may be performed. The mouse selected here is bred as the first generation, and can be crossed with, for example, a CD1 mouse to obtain a brother 2 generation mouse.
本発明の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる糖尿病網膜症および／または糖尿病腎症等の糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングする方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば雄のトランスジェニックマウスに、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値や、眼球の付け根部分や尻尾などから採血した血液の血糖値等の測定や生存率等を検討することにより、該被検物質の糖尿病治療効果を評価することができる。 The transgenic non-human mammal of the present invention is used as a method for screening a therapeutic agent for diabetic complications such as diabetic retinopathy and / or diabetic nephropathy using the transgenic non-human mammal that develops the diabetic complication of the present invention. For example, when a test substance is administered to a male transgenic mouse, the urine sugar level of the urine obtained from the transgenic non-human mammal, the blood sugar level of blood collected from the base of the eyeball or the tail, etc. By examining the measurement and survival rate, the therapeutic effect of the test substance on diabetes can be evaluated.
[実施例]
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１
（ラットインスリンプロモーターの調製）
ラットインスリン２遺伝子のプロモーターDNA断片は、Wistar ラット肝臓由来ゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Lomedico et al., セル（Cell）18巻、545-558頁、1979年]中のDNA配列を参考にして723bpを増幅して得られた。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にBamHI認識配列およびXmaI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AAGGATCCCCCCAACCACTCCAAGTGG-3’（配列番号6),
5’-TACCCGGGTAGCTGGTCACTTAGGGCTG-3’（配列番号7)
得られたPCR産物をBamHIおよびXmaIで消化後、プラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の当該制限酵素部位に導入した。
得られたラットインスリン２遺伝子DNA断片の遺伝子配列（BamHI-XmaI断片723 bp）を配列番号1に示す。
[Example]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is not restrict | limited at all by this Example.
Example 1
(Preparation of rat insulin promoter)
The promoter DNA fragment of rat insulin 2 gene is a PCR (Polymerase chain reaction) method using Wistar rat liver genomic DNA as a template [Lomedico et al., Cell 18, 545-558, 1979] 723 bp was obtained with reference to the DNA sequence of. The oligonucleotide primers used were modified as follows to form a BamHI recognition sequence and an XmaI recognition sequence.
5'-AAGGATCCCCCCAACCACTCCAAGTGG-3 '(SEQ ID NO: 6),
5'-TACCCGGGTAGCTGGTCACTTAGGGCTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
The obtained PCR product was digested with BamHI and XmaI and then introduced into the restriction enzyme site of the plasmid (pBlueScript SK-: Stratagene, USA).
The gene sequence of the obtained rat insulin 2 gene DNA fragment (BamHI-XmaI fragment 723 bp) is shown in SEQ ID NO: 1.
実施例２
（変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡの調製）
アミノ酸変異型（286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換された）カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、ＣＤ１マウス脳由来complementary DNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Mayford et al., セル（Cell）81巻、891-904頁、1995年] を参考にして2つのDNA断片（A fragment, B fragment）に分けて増幅して得られた。
A fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にXmaI認識配列およびAatII認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-TTCCCGGGTACCCCTGCCTGCCCAGTGCCA-3’（配列番号8）,
5’-TCGACGTCCTCCTGTCTGTGCATGCAGGAA-3’（配列番号9）
得られたPCR産物（A fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
B fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にAatII認識配列およびBamHI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AGGACGTCGACTGCCTGAAGAAGTTCAATG-3’（配列番号10),
5’-TTGGATCCCGTCAATGCGGCAGGACGGAGG-3’（配列番号11)
得られたPCR産物（B fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
A fragmentを導入したプラスミドをXmaIおよびAatIIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、B fragmentを導入したプラスミドをAatIIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、XmaIおよびBamHIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
得られたカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、PCR法による制限酵素部位AatII導入により本来の遺伝子とは異なり286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換されたキナーゼをコードする。
得られた変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片の遺伝子配列（XmaI-BamHI断片1475 bp）を配列番号2に示す。
また、配列番号2のＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号3に示す。
Example 2
(Preparation of DNA of mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2)
A DNA fragment encoding a calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α (amino acid mutant (286th threonine replaced with aspartic acid)) was prepared by PCR (Polymerase chain reaction) using CD1 mouse brain complementary DNA as a template [ Mayford et al., Cell 81, 891-904, 1995] was obtained by dividing into two DNA fragments (A fragment, B fragment).
The oligonucleotide primers used for amplification of the A fragment were modified as follows to form an XmaI recognition sequence and an AatII recognition sequence.
5'-TTCCCGGGTACCCCTGCCTGCCCAGTGCCA-3 '(SEQ ID NO: 8),
5'-TCGACGTCCTCCTGTCTGTGCATGCAGGAA-3 '(SEQ ID NO: 9)
The obtained PCR product (A fragment) was introduced into a plasmid (pBlueScript SK-: Stratagene, USA) with a terminal protruding T (one base).
The oligonucleotide primers used for the amplification of the B fragment were modified as follows to form an AatII recognition sequence and a BamHI recognition sequence.
5'-AGGACGTCGACTGCCTGAAGAAGTTCAATG-3 '(SEQ ID NO: 10),
5'-TTGGATCCCGTCAATGCGGCAGGACGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 11)
The obtained PCR product (B fragment) was introduced into a plasmid (pBlueScript SK-: Stratagene, USA) with an end protruding T (1 base).
The insert DNA fragment digested with XmaI and AatII after digesting the A fragment-introduced plasmid with gel, the insert DNA fragment digested with AatII and BamHI after digesting the plasmid with B fragment, inserted with XmaI and BamHI Three of the digested plasmids (pBlueScript SK-: Stratagene, USA) were mixed at an equimolar ratio to prepare a DNA in which the three were ligated.
The obtained DNA fragment encoding calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α encodes a kinase in which the 286 threnin was replaced with aspartic acid, unlike the original gene, by introducing the restriction enzyme site AatII by PCR.
The gene sequence of the obtained mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α DNA fragment (XmaI-BamHI fragment 1475 bp) is shown in SEQ ID NO: 2.
The amino acid sequence of the protein encoded by the DNA of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 3.
実施例３
（インスリンプロモーター／変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２／ＳＶ４０−ポリＡ含有ＤＮＡの調製）
変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-BamHI断片1475 bp）、ポリＡ付加シグナルおよびイントロンを含むＳＶ４０遺伝子をBglIIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BglII-EcoRI断片1604 bp、配列番号4）、XmaIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
さらに、ラットインスリン２遺伝子DNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BamHI-XmaI断片723 bp）、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNAとＳＶ４０遺伝子を導入したプラスミドをXmaIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-EcoRI断片3073 bp）、BamHIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結した融合DNAを持つプラスミドを作製した。このプラスミド内部には5’端から、ラットインスリン２遺伝子DNA、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA、ＳＶ４０遺伝子が順に接続されており、全3790 bpのインサートを持つ。この融合遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号5に示す。
Example 3
(Preparation of DNA containing insulin promoter / mutated calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2 / SV40-polyA)
An insert DNA fragment (XmaI-BamHI fragment 1475 bp) obtained by digesting a plasmid into which a mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α DNA fragment has been digested with XmaI and BamHI and then excising with a gel, an SV40 gene containing a polyA addition signal and an intron The insert DNA fragment (BglII-EcoRI fragment 1604 bp, SEQ ID NO: 4) excised from the gel after digestion with BglII and EcoRI, and the plasmid digested with XmaI and EcoRI (pBlueScript SK-: Stratagene, USA) The DNA was mixed at an equimolar ratio to prepare a DNA in which the three were linked.
Furthermore, the insert DNA fragment (BamHI-XmaI fragment 723 bp) excised with gel after digesting the plasmid containing the rat insulin 2 gene DNA fragment with XmaI and BamHI, mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2αDNA and SV40 gene The insert DNA fragment (XmaI-EcoRI fragment 3073 bp) excised by gel after digesting the plasmid introduced with XmaI and EcoRI and the plasmid digested with BamHI and EcoRI (pBlueScript SK-: Stratagene, USA) Mixing at an equimolar ratio, a plasmid having a fusion DNA ligated in triplicate was prepared. Inside this plasmid, rat insulin 2 gene DNA, mutant calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α DNA, and SV40 gene are connected in this order from the 5 ′ end, and has a total insert of 3790 bp. The DNA sequence of this fusion gene is shown in SEQ ID NO: 5.
実施例４
（導入遺伝子の調製）
配列番号4のDNA配列を含むプラスミドDNAを抽出した後、制限酵素NotIとSalIで切断して1.0％のアガロースゲル（Agarose gel）で電気泳動（electrophoresis）して3.8 ｋbの変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α発現遺伝子DNAを含むアガロースゲル断片を切り出し、GeneClean Kit（Bio101社）を用いて精製した。そして、DNAの濃度が3ng/μlになるように10mM Tris-HCl(pH 7.4)/0.1mM EDTA(pH 8.0)溶液で希釈した後、マイクロインジェクションに使用した（導入遺伝子の構造を図１示す）。
Example 4
(Preparation of transgene)
Plasmid DNA containing the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 was extracted, cut with restriction enzymes NotI and SalI, and electrophoresed with 1.0% agarose gel (electrophoresis). 3.8 kb mutant calcium / calmodulin dependence An agarose gel fragment containing the protein kinase 2α-expressing gene DNA was excised and purified using GeneClean Kit (Bio101). Then, after diluting with a 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) /0.1 mM EDTA (pH 8.0) solution so that the DNA concentration becomes 3 ng / μl, it was used for microinjection (the structure of the transgene is shown in FIG. 1). .
実施例５
（トランスジェニックマウスの作製）
受精卵採取用のマウスstrainはBDF1(日本クレア社)を用いた。排卵促進剤投与後に交尾させた翌日の受精卵を雌マウスの卵管より採取して、極細のガラスピペットを用いて上記DNA溶液（3ng/μl）を受精卵の雄性前核に注入した。翌日までこれらの受精卵を培養したのちに自然分娩により20日後に出産させた。うまれた20匹のマウスを飼育し、4週齢で尾の一部からDNAを抽出して、PCR法により、導入遺伝子DNAの導入の有無を検査した。導入遺伝子の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ラットインスリン遺伝子の配列の一部、およびカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２に相補的な配列からなる以下の２本のプライマーを用いた。
5’-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3’（配列番号12）,
5’-TTCCTCGAAGAGCTGGTACTCTTCC-3’（配列番号13）
PCRによるスクリーニングの結果、３匹がトランスジェニックマウスであることが確認された。
これらの初代トランスジェニックマウスを飼育し、CD1マウス（日本チャールス・リバー社）と交配して、第２世代（F1）マウスを得た。トランスジェニックマウス３匹ともF1マウスへの導入遺伝子の子孫伝達（Germ-line transmission）が確認され、系統化を確認した。
Example 5
(Production of transgenic mice)
BDF1 (Claire Japan) was used as a mouse strain for collecting fertilized eggs. The fertilized egg on the next day after mating after administration of the ovulation promoter was collected from the oviduct of a female mouse, and the DNA solution (3 ng / μl) was injected into the male pronucleus of the fertilized egg using an ultrafine glass pipette. These fertilized eggs were cultured until the next day, and were born after 20 days by natural delivery. Twenty mice were bred, DNA was extracted from a part of the tail at 4 weeks of age, and the presence or absence of transgene DNA was examined by PCR. The oligonucleotide primers used for amplification of the transgene were the following two primers consisting of a part of the sequence of the rat insulin gene and a sequence complementary to calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2.
5'-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3 '(SEQ ID NO: 12),
5'-TTCCTCGAAGAGCTGGTACTCTTCC-3 '(SEQ ID NO: 13)
As a result of screening by PCR, it was confirmed that 3 mice were transgenic mice.
These primary transgenic mice were bred and mated with CD1 mice (Nippon Charles River) to obtain second generation (F1) mice. All three transgenic mice were confirmed to have a germ-line transmission of the transgene to the F1 mouse, confirming phylogeny.
実施例６
（トランスジェニックマウスの性質）
F1マウスでの糖尿病発症率について血糖測定器（Accu-checkII、ロシュ・ダイアグノステイクス社）を用いて調べた。その結果、３系統のトランスジェニックマウス系列の全てがF1世代で顕性糖尿病（随時血糖400以上）を生後４週齢以内に発症した。F1世代におけるトランスジェニックマウスの糖尿病発症率は３系統とも100％であった。膵臓切片の免疫組織化学により、トランスジェニックマウス膵β細胞は抗カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α抗体により強陽性に染色された。
Example 6
(Properties of transgenic mice)
The incidence of diabetes in F1 mice was examined using a blood glucose meter (Accu-check II, Roche Diagnostics). As a result, all of the three transgenic mouse lines developed overt diabetes (anytime blood glucose of 400 or more) in the F1 generation within 4 weeks of age. The incidence of diabetes in transgenic mice in the F1 generation was 100% for all three strains. By immunohistochemistry of pancreas sections, transgenic mouse pancreatic β cells were strongly positively stained with anti-calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2α antibody.
生後8週齢ではトランスジェニックマウス膵ランゲルハンス島は非常に小型で、インスリン産生細胞はほとんど消滅し主にグルカゴン産生細胞により構成されており、正常の野性型マウスの膵ランゲルハンス島と比較するとその違いは明らかであった。このトランスジェニックマウスの血糖値は600-1500の高値を示し、６か月生存率は50-70％程度と低率で、極めて重症の１型糖尿病を100％発症することが明らかになった。 At 8 weeks of age, transgenic mouse pancreatic islets are very small, almost all insulin-producing cells disappear and are mainly composed of glucagon-producing cells. It was clear. This transgenic mouse showed a high blood glucose level of 600-1500, a 6-month survival rate of about 50-70%, and it was revealed that 100% of extremely severe type 1 diabetes was developed.
実施例７
（トランスジェニックマウスの糖尿病性腎症）
トランスジェニックマウス（Tgマウス）腎臓の検索により、生後20週齢ではTgマウス腎臓は３系統とも腎腫大（1.5〜2.0倍）し、PAM染色にて腎糸球体にメサンギウム基質の増生などの糸球体硬化病変を起こしておりヒト糖尿病性腎症の類似病変像を示した（図２）。同週齢の野性型マウスの腎臓糸球体像（図３）と比べるとその違いは明瞭であった。さらにトランスジェニックマウス腎臓では強度高血糖の結果生じた糸球体内グリコーゲン顆粒を反映するArmanni-Ebstein病変が確認されるとともに、その糸球体基底膜にはAGE（Advanced Glycation Endproducts）様の顆粒状沈着物が認められた。
Example 7
(Diabetic nephropathy in transgenic mice)
In the transgenic mouse (Tg mouse) kidney, all Tg mouse kidneys were enlarged (1.5 to 2.0 times) at 20 weeks of age, and PAM staining revealed a thread such as mesangial matrix growth in the glomeruli. Spherical sclerosis lesions occurred and a similar lesion image of human diabetic nephropathy was shown (FIG. 2). The difference was clear when compared with the glomerular images of kidneys of wild-type mice of the same week (FIG. 3). In addition, in the transgenic mouse kidney, Armanni-Ebstein lesions reflecting glomerular glycogen granules resulting from intense hyperglycemia were confirmed, and AGE (Advanced Glycation Endproducts) -like granular deposits were observed in the glomerular basement membrane. Was recognized.
実施例８
（トランスジェニックマウスの糖尿病網膜症）
生後20週齢トランスジェニックマウスマウスの網膜の病理組織切片像を解析した。その結果、Ganglion Cell Layer（GC）とOuter Nuclear Layer（ON）各神経細胞層の脱落・減少などの糖尿病性網膜症に見られる病理所見が認められた（図４）。同週齢の野性型マウスの網膜組織（図５）は各神経細胞層が正常に保たれており、その違いは明瞭に認められた。
Example 8
(Diabetic retinopathy in transgenic mice)
Histopathological sections of the retina of 20-week-old transgenic mice were analyzed. As a result, pathological findings observed in diabetic retinopathy such as detachment / reduction of nerve cell layers of Ganglion Cell Layer (GC) and Outer Nuclear Layer (ON) were observed (FIG. 4). In the retinal tissue (FIG. 5) of wild-type mice of the same age, each nerve cell layer was kept normal, and the difference was clearly recognized.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、とりわけ、げっ歯類であるトランスジェニックマウスは、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明するために有用であり、さらに本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、とりわけ、げっ歯類であるトランスジェニックマウスを化合物のスクリーニングに用いることにより、糖尿病のみならず、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングすることができ、糖尿病、糖尿病合併症の医薬品の開発に有用である。 The transgenic non-human mammal of the present invention, in particular, a transgenic mouse, which is a rodent, is used to elucidate the pathogenesis of diabetes caused by continuous activation of calcium / calmodulin-dependent protein kinase 2. In addition to diabetes, diabetic retinopathy and diabetic nephropathy can be obtained by using the transgenic non-human mammals of the present invention, particularly rodent transgenic mice, for screening compounds. It is possible to screen for therapeutic drugs for complications and is useful for the development of diabetes and diabetic complications.
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Cited By (1)
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| CN111979195A (en) * | 2020-09-04 | 2020-11-24 | 四川大学华西医院 | Method for constructing full-retina in-vitro culture model for diabetic retinopathy |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010064091, 第２７回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集, 20041125, ｐ． １００９， ３ＰＢ−４９０ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN111979195A (en) * | 2020-09-04 | 2020-11-24 | 四川大学华西医院 | Method for constructing full-retina in-vitro culture model for diabetic retinopathy |
| CN111979195B (en) * | 2020-09-04 | 2023-06-02 | 四川大学华西医院 | Method for constructing diabetic retinopathy whole retina in-vitro culture model |
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