JP5150876B2 - Mutant β-synuclein transgenic non-human animal - Google Patents
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Description
本発明は、神経変性疾患のモデル動物となるトランスジェニック非ヒト動物に関する。詳しくは、中枢神経系細胞において変異型βシヌクレインを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
また、本発明は、当該非ヒト動物を用いた神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、及び神経変性疾患の治療薬の副作用の検定方法に関する。
The present invention relates to a transgenic non-human animal that serves as a model animal for a neurodegenerative disease. Specifically, the present invention relates to a transgenic non-human animal that expresses mutant β-synuclein in central nervous system cells.
The present invention also relates to a screening method for a therapeutic agent for a neurodegenerative disease using the non-human animal and a method for assaying a side effect of the therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
パーキンソン病（Parkinson's disease: PD）は、振戦、硬直、歩行障害等のパーキンソンニズムを呈し、病理組織学的には、中脳黒質におけるドーパミン産生神経細胞の脱落、及び神経細胞内封入体であるレビー小体形成を特徴とする神経変性疾患である。 Parkinson's disease (PD) presents parkinsonism such as tremor, stiffness, and gait disturbance. Histopathologically, it is a loss of dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra and inclusions in neurons. It is a neurodegenerative disease characterized by certain Lewy body formation.
PDでみられる神経細胞内封入体と同様の封入体の形成は、アルツハイマー病に次ぐ頻度でみられる進行性の痴呆を伴った、痴呆性レビー小体病（dementia with Lewy body: DLB）などでも観察され、DLBはPDの関連疾患として取り扱われている。 The formation of inclusion bodies similar to the inclusion bodies in neuronal cells seen in PD is also seen in dementia with Lewy body disease (DLB), etc., accompanied by progressive dementia following the frequency of Alzheimer's disease. Observed, DLB is treated as a PD-related disease.
これらの疾患（PD及びDLB）は、近年、老齢人口の激増とともに増加傾向にあり、根本的な治療法が存在しない現状においては深刻な社会問題となっている。PD及びDLBの発症には遺伝的因子や環境因子を含めた多くの要因が関与すると考えられるが、近年、これらの神経変性疾患の病態において、α-シヌクレイン（α-syn）の蓄積及び凝集が大きく関与していることが示された（非特許文献１）。 In recent years, these diseases (PD and DLB) have been increasing along with the rapid increase of the aging population, and in the current situation where there is no fundamental cure, it has become a serious social problem. Many factors including genetic factors and environmental factors are thought to be involved in the development of PD and DLB, but in recent years, accumulation and aggregation of α-synuclein (α-syn) have been observed in the pathogenesis of these neurodegenerative diseases. It was shown that it was greatly involved (Non-Patent Document 1).
α-synと神経変性疾患：
ヒトα-synは、140アミノ酸からなる、神経組織に豊富に発現するリン酸化タンパク質であり、主として神経細胞の前シナプスに局在する。α-synは、それぞれ、異なる経緯で同定されアミノ酸配列上相同性の高いβ-シヌクレイン（β-syn）及びγ-シヌクレイン（γ-syn）とともに、シヌクレインペプチドファミリーを構成する（図１）。これらタンパク質は、シナプスの可塑性、ドーパミン放出の制御などに関与することが示唆されているが、詳細な生理的機能は明らかではない（非特許文献１）。
α-syn and neurodegenerative diseases:
Human α-syn is a phosphorylated protein consisting of 140 amino acids and abundantly expressed in nerve tissue, and is mainly localized at the presynapse of nerve cells. α-syn constitutes the synuclein peptide family together with β-synuclein (β-syn) and γ-synuclein (γ-syn), which are identified by different processes and have high amino acid sequence homology (FIG. 1). These proteins have been suggested to be involved in synaptic plasticity, control of dopamine release, and the like, but detailed physiological functions are not clear (Non-patent Document 1).
α-synは特別な折りたたみ構造をとらず、凝集しやすいアミロイド前駆体タンパク質であり、タンパク質凝集を特徴とする神経変性疾患の病態において重要な役割を担うことが示されてきた。そして、1993年には、アルツハイマー病患者の脳におけるアミロイド斑よりα-synがAβ以外の構成成分であるNAC（non-Aβ component of AD amyloid）の前駆体として同定された（非特許文献２）。しかしながら、神経変性におけるα-synの重要性が確立されたのは、1997年にα-synのミスセンス変異（A53T）が家族性PDに連鎖することが証明され（図１；非特許文献３）、これに引き続き、多くの組織学的解析が行われた結果、α-synがレビー小体の主要構成要素であることが見出されたことによる（非特許文献４）。α-synのミスセンス変異に関しては、その後、A30P及びE46Kが、それぞれ、家族性PD及び家族性DLBに連鎖することが報告され（図1）、A53T、A30P及びE46Kのいずれのミスセンス変異においてもα-synの凝集能が増加することが示された（非特許文献５，６）。また、それまで病態機序が不明であった多系統萎縮症（Multiple system atrophy: MSA）においても、オリゴデンドロサイトに形成される細胞内封入体においてα-synの蓄積が確認された（非特許文献７）。これらの神経変性疾患は、α-synによる細胞内封入体の形成という共通の病理像を示すことから、α-シヌクレイノパチーとして分類されている（非特許文献８）。 α-syn does not have a special folding structure, is an amyloid precursor protein that is easily aggregated, and has been shown to play an important role in the pathology of neurodegenerative diseases characterized by protein aggregation. In 1993, α-syn was identified as a precursor of NAC (non-Aβ component of AD amyloid) other than Aβ from amyloid plaques in the brain of Alzheimer's disease patients (Non-patent Document 2). . However, the importance of α-syn in neurodegeneration was established in 1997 when it was proved that a missense mutation (A53T) of α-syn was linked to familial PD (FIG. 1; Non-Patent Document 3). As a result of many subsequent histological analyses, α-syn was found to be a major component of Lewy bodies (Non-patent Document 4). Regarding α-syn missense mutations, it was subsequently reported that A30P and E46K were linked to familial PD and familial DLB, respectively (Fig. 1), and α53 was detected in any of the A53T, A30P, and E46K missense mutations. It was shown that -syn aggregation ability is increased (Non-patent Documents 5 and 6). In addition, accumulation of α-syn was confirmed in intracellular inclusions formed in oligodendrocytes even in multiple system atrophy (MSA), where the pathologic mechanism was unknown. Reference 7). These neurodegenerative diseases are classified as α-synucleinopathies because they show a common pathological image of formation of intracellular inclusion bodies by α-syn (Non-patent Document 8).
α-synトランスジェニック（Tg）マウス：
α-synの凝集による神経毒性に関する機序は不明であるが、この機序を明らかにすることは、神経変性疾患の病態を理解し、さらにそれらの治療方法を開発する上で不可欠である。この目的のために、多くの研究室においてα-syn過剰発現型Tgマウスの開発が精力的に試みられた。最初に成功したα-syn過剰発現型Tgマウスは（非特許文献９）、脳切片が、免疫組織染色により、抗α-syn抗体、抗ユビキチン抗体で染まる封入体様構造物を呈するものであった。そして、生化学的には、α-synが不溶分画に集積し、チロシンキナーゼの活性の低下が観察されたこと、行動学的には、ロタロッドで平衡運動感覚能力が有意に低下していることなどから、パーキンソン病の最初のモデル動物と認められた（非特許文献９）。しかしながら、封入体中にあるα-synはアミロイド繊維を形成していないこと、また神経細胞死などの所見が見られないことなど、必ずしもPDやDLBの完全な病態モデルと言えるものではなかった。α-syn Tgマウスの作製は、その後も多くのグループによってなされたが、レビー小体様封入対の形成が認められるものは見出されなかった。
α-syn transgenic (Tg) mice:
The mechanism of neurotoxicity caused by α-syn aggregation is unknown, but elucidation of this mechanism is indispensable for understanding the pathophysiology of neurodegenerative diseases and developing treatments for them. To this end, many laboratories have vigorously attempted to develop α-syn overexpressing Tg mice. The first successful α-syn overexpressing Tg mouse (Non-patent Document 9) exhibits an inclusion body-like structure in which a brain section is stained with an anti-α-syn antibody or an anti-ubiquitin antibody by immunohistochemical staining. It was. Biochemically, α-syn accumulated in the insoluble fraction, and a decrease in tyrosine kinase activity was observed. Behaviorally, rotarod significantly reduced the ability to balance motor sensation. From this, it was recognized as the first model animal of Parkinson's disease (Non-patent Document 9). However, α-syn contained in inclusion bodies is not necessarily a complete pathological model of PD or DLB, such as the absence of amyloid fibril formation and the absence of findings such as neuronal cell death. Although the generation of α-syn Tg mice was continued by many groups thereafter, none of them were found to form a Lewy body-like inclusion pair.
野生型β-synの神経保護作用：
α-synの凝集は神経変性の病態に重要な役割を果たしているため、この凝集を抑制することが神経変性疾患の治療法を開発するための中心課題となる。この見地より、α-synの凝集を抑えるような薬剤開発が重点的に行われてきた。本発明者は、これに関連して、β-synが、α-synとは対照的に、神経保護的に働くことにより、α-synの神経変性促進作用に対する負の調節因子としての役割を担うものであることを提案した（非特許文献１０）。β-synは、α-synの中央部にある凝集に本質的な疎水性ドメインが欠損しているため、本来的に、構造上凝集しにくいタンパク質である（図１）。本発明者は、PDのモデル動物であるα-syn Tgマウスとβ-synを過剰発現させたTgマウスとを交配させたバイジェニックマウスにおいて、α-syn Tgマウスに比べてレビー小体様封入体の減少や平衡運動感覚能力の回復などの神経変性病理が改善した所見を得た（非特許文献１１）。
Neuroprotective effects of wild-type β-syn:
Since α-syn aggregation plays an important role in the pathogenesis of neurodegeneration, inhibiting this aggregation is a central issue for developing therapeutic methods for neurodegenerative diseases. From this viewpoint, drug development that suppresses the aggregation of α-syn has been focused on. In this regard, the present inventor has a role as a negative regulator of α-syn's neurodegenerative promoting action by β-syn acting neuroprotectively as opposed to α-syn. It has been proposed to be responsible (Non-Patent Document 10). Since β-syn lacks the hydrophobic domain essential for aggregation at the center of α-syn, it is inherently a protein that is structurally difficult to aggregate (FIG. 1). The present inventor, in a bigenic mouse in which an α-syn Tg mouse which is a model animal of PD and a Tg mouse overexpressing β-syn are crossed, has Lewy body-like encapsulation compared to an α-syn Tg mouse. We obtained findings that improved neurodegenerative pathologies such as body loss and recovery of equilibrium motor and sensory ability (Non-patent Document 11).
β-synによる神経保護作用の機序としては、インビトロでβ-synがα-synの凝集を直接抑制すること（非特許文献１１）、また、培養細胞において、β-synがヒートショックタンパク質などと同じようにシャペロンタンパク質としてAkt（Protein kinase B）に直接作用してその活性を促進することを見いだした（非特許文献１２）。後者の知見は、常染色体劣性型の家族性PDの原因遺伝子として同定されたDJ-1(Park7)やPINK1(Park6)が、PI3キナーゼシグナル伝達経路に対して促進的に働くこと（非特許文献１３）などからも支持される。また最近、β-synがα-synによるプロテアソーム活性の低下を抑制することが報告されている（非特許文献１４）。 As a mechanism of neuroprotective action by β-syn, β-syn directly inhibits aggregation of α-syn in vitro (Non-patent Document 11), and in cultured cells, β-syn is a heat shock protein or the like. In the same manner as the above, it was found that it acts directly on Akt (Protein kinase B) as a chaperone protein to promote its activity (Non-patent Document 12). The latter finding suggests that DJ-1 (Park7) and PINK1 (Park6), identified as causative genes for autosomal recessive familial PD, promote the PI3 kinase signaling pathway (Non-patent literature) 13) etc. are also supported. Recently, it has been reported that β-syn suppresses the decrease in proteasome activity caused by α-syn (Non-patent Document 14).
以上の結果を総合すると、β-synの神経保護作用は多彩な機序にわたるものであり、保護作用に関与する機序を増強することで、PDやDLBの治療に応用できる可能性があると考えられる。実際、本発明者は、β-synをコードするレンチウィルスベクターを用いて、α-syn Tgマウスの脳にβ-synを発現させることにより、レビー小体様の封入体が減少することを観察した（非特許文献１５）。 Taken together, the neuroprotective action of β-syn covers a variety of mechanisms, and it can be applied to the treatment of PD and DLB by enhancing the mechanisms involved in the protective action. Conceivable. In fact, the present inventor has observed that Lewy body-like inclusion bodies are reduced by expressing β-syn in the brain of α-syn Tg mice using a lentiviral vector encoding β-syn. (Non-patent Document 15).
変異型β-synの同定：
β-synの神経保護作用が示される一方で、β-synの変異が関与すると考えられるDLBの症例が報告された（非特許文献１６）。この報告において、野生型β-synのアミノ酸配列における第70番目のバリンがメチオニンに置換した変異（V70M）と、第123番目のプロリンがヒスチジンに置換した変異（P123H）とが同定され、それぞれ孤発性及び家族性DLBに連鎖していた（図１）。しかしながら、α-synのミスセンス変異の場合と異なり、P123Hの浸透率が高くないこと、またP123H患者の脳組織におけるレビー小体が、抗β-syn抗体により染色されなかったことなどから、これらの変異が家族性DLBの確かな原因となるかは不明である。それにも関わらず、V70M及びP123Hのいずれのアミノ酸変異も健常人には認められていない。したがって、V70M及びP123Hのアミノ酸変異はSNP多型によるものではないと考えられる。また、変異により置換されたアミノ酸は生物種を越えて保存されている部位であることなどから、V70M及びP123Hのアミノ酸変異は、β-synの機能に重要な変化を及ぼす変異の可能性がある。
While the neuroprotective action of β-syn is shown, a case of DLB that is considered to involve β-syn mutation has been reported (Non-patent Document 16). In this report, a mutation in which the 70th valine was replaced with methionine (V70M) and a mutation in which the 123rd proline was replaced with histidine (P123H) in the amino acid sequence of wild-type β-syn were identified and isolated. It was linked to onset and familial DLB (Figure 1). However, unlike the case of the α-syn missense mutation, the penetration rate of P123H was not high, and Lewy bodies in the brain tissue of P123H patients were not stained with anti-β-syn antibodies. It is unclear if the mutation is a sure cause of familial DLB. Nevertheless, neither V70M nor P123H amino acid mutations are found in healthy individuals. Therefore, it is considered that amino acid mutations in V70M and P123H are not due to SNP polymorphism. In addition, since amino acids replaced by mutations are conserved across biological species, amino acid mutations in V70M and P123H may be mutations that cause significant changes in β-syn function. .
本発明は、神経変性疾患のモデル動物となるトランスジェニック非ヒト動物を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the transgenic non-human animal used as a model animal of a neurodegenerative disease.
また本発明は、神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、及び神経変性疾患の治療薬の副作用の検定方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a screening method for therapeutic agents for neurodegenerative diseases and a method for assaying side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
すなわち、本発明は以下の通りである。 That is, the present invention is as follows.
(１) 中枢神経系細胞において機能するプロモーター及び変異型βシヌクレイン遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
本発明の非ヒト動物としては、例えば、変異型βシヌクレイン遺伝子が脳神経細胞及び／又は中枢神経系グリア細胞において発現するものが挙げられる。ここで、変異型βシヌクレインとしては、例えば、自己凝集促進活性及び／又はαシヌクレイン凝集促進活性を有するものが挙げられる。具体的には、変異型βシヌクレインとしては、野生型βシヌクレインのアミノ酸配列において第７０番目及び第１２３番目のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は当該置換されたアミノ酸配列のうち第７０番目及び第１２３番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を例示することができ、好ましくは、第７０番目のアミノ酸がメチオニンに置換されたもの、及び／又は、第１２３番目のアミノ酸がヒスチジンに置換されたものが挙げられる。
本発明の非ヒト動物としては、齧歯類動物を例示することができ、具体的にはマウスが挙げられる。
(1) A transgenic non-human animal into which a promoter that functions in central nervous system cells and a mutant β-synuclein gene are introduced.
Examples of the non-human animal of the present invention include those in which a mutant β-synuclein gene is expressed in brain neurons and / or central nervous system glial cells. Here, examples of the mutant β-synuclein include those having self-aggregation promoting activity and / or α-synuclein aggregation promoting activity. Specifically, the mutant β-synuclein is an amino acid sequence in which at least one of the 70th and 123rd amino acids is substituted with another amino acid in the amino acid sequence of wild-type β-synuclein, or the substitution In the amino acid sequence, a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the 70th and 123rd amino acids have been deleted, substituted or added can be exemplified. Examples include those in which an amino acid is substituted with methionine and / or those in which the 123rd amino acid is substituted with histidine.
Examples of the non-human animal of the present invention include rodent animals, and specifically include mice.
(２) 上記(1)に記載の非ヒト動物に候補物質を投与する工程、及び当該候補物質投与後の非ヒト動物の神経変性疾患に関する病態を評価する工程を含む、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。 (2) A therapeutic agent for a neurodegenerative disease, comprising a step of administering a candidate substance to the non-human animal according to (1) above and a step of evaluating a pathological condition related to the neurodegenerative disease of the non-human animal after administration of the candidate substance How to screen.
(３) 胎生期にある上記(1)に記載の非ヒト動物由来の中枢神経系細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
当該方法において、前記非ヒト動物としては、例えば胎生期の非ヒト動物が挙げられ、中枢神経系細胞としては、例えば初代培養細胞が挙げられる。
また当該方法としては、例えば、中枢神経系細胞が脳神経細胞であり、細胞活性が神経突起伸張能及び／又は生存能である方法、あるいは、中枢神経系細胞がグリア細胞であり、細胞活性が増殖能及び／又は生存能である方法が例示できる。
(3) A candidate substance is contacted with a central nervous system cell derived from the non-human animal described in (1) in the embryonic period, and the cellular activity of the cell is measured. A method of screening for therapeutic agents.
In the method, examples of the non-human animal include embryonic non-human animals, and examples of central nervous system cells include primary cultured cells.
As the method, for example, the central nervous system cell is a cerebral neuron and the cell activity is neurite outgrowth and / or viability, or the central nervous system cell is a glial cell and the cell activity is increased. The method which is ability and / or viability can be illustrated.
(４) 上記(1)に記載の非ヒト動物に神経変性疾患の治療薬を投与する工程、及び当該薬物投与後の非ヒト動物における副作用の有無を検出する工程を含む、神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法。 (4) Treatment of a neurodegenerative disease comprising the steps of administering a therapeutic agent for a neurodegenerative disease to the non-human animal according to (1) above and detecting the presence or absence of side effects in the non-human animal after the administration of the drug A method to test drug side effects.
(５) 胎生期にある上記(1)に記載の非ヒト動物由来の中枢神経系細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法。
当該方法において、前記非ヒト動物としては、例えば胎生期の非ヒト動物が挙げられ、中枢神経系細胞としては、例えば初代培養細胞が挙げられる。
また当該方法としては、例えば、中枢神経系細胞が脳神経細胞であり、細胞活性が神経突起伸張能及び／又は生存能である方法、あるいは、中枢神経系細胞がグリア細胞であり、細胞活性が増殖能及び／又は生存能である方法が例示できる。
(5) A therapeutic agent for a neurodegenerative disease is contacted with a central nervous system cell derived from the non-human animal described in (1) in the embryonic period and the cellular activity of the cell is measured, and the obtained measurement result is used as an index. A method for testing side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
In the method, examples of the non-human animal include embryonic non-human animals, and examples of central nervous system cells include primary cultured cells.
As the method, for example, the central nervous system cell is a cerebral neuron and the cell activity is neurite outgrowth and / or viability, or the central nervous system cell is a glial cell and the cell activity is increased. The method which is ability and / or viability can be illustrated.
本発明によれば、神経変性疾患の有用なモデル動物となる新規なトランスジェニック非ヒト動物が提供される。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトの神経変性疾患の病態と極めてよく似た表現型（具体的には、PDやDLB脳のレビー小体に酷似した封入体の形成）を有するため、PD及びDLB等の神経変性疾患の治療薬のスクリーニング、及び、当該疾患の治療薬の副作用の検定に利用することができ、極めて有用である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel transgenic non-human animal used as a useful model animal of a neurodegenerative disease is provided. Since the transgenic non-human animal of the present invention has a phenotype very similar to the pathology of human neurodegenerative diseases (specifically, the formation of inclusion bodies that closely resemble the Lewy bodies of PD and DLB brain) It can be used for screening therapeutic agents for neurodegenerative diseases such as PD and DLB, and for testing side effects of therapeutic agents for the diseases, and is extremely useful.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these explanations, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.
１．本発明の概要
βシヌクレイン（β-syn）の変異による機能変化の有無を解明することは、神経変性の機序の解明において本質的なものである。本発明者は、組換えタンパク質を用いた生化学的実験により、変異型β-syn（P123H及びV70M）がそれ自身で凝集し、またα-synと共存させた場合にはα-synの凝集を促進することを確認した。さらに、変異型β-syn（P123H及びV70M）を過剰発現させた神経芽細胞においては、α-synと共発現させることにより、オートファジー／リソソームによるタンパク質分解が顕著に亢進することを明らかにした。これらの結果から、本発明者は、野生型β-synが神経保護作用を有するものであることとは対照的に、変異型β-synは、神経変性促進的な作用を有するものではないかと考えた（図２）。
1. Summary of the Invention Elucidating the presence or absence of functional changes due to mutations in β-synuclein (β-syn) is essential in elucidating the mechanism of neurodegeneration. As a result of biochemical experiments using recombinant proteins, the present inventor has found that mutant β-syn (P123H and V70M) aggregate itself, and when coexisting with α-syn, α-syn aggregation Confirmed to promote. Furthermore, in neuroblasts overexpressing mutant β-syn (P123H and V70M), co-expression with α-syn significantly increased autophagy / lysosome proteolysis. . From these results, the present inventor has shown that, in contrast to wild-type β-syn having a neuroprotective action, mutant β-syn may have a neurodegenerative action. I thought (Figure 2).
この変異型β-synの神経変性促進作用をインビボで確認するため、本発明者は、中枢神経系細胞において変異型β-synを過剰発現し得るトランスジェニックマウス（Tgマウス）の作製及び解析を行った。 In order to confirm in vivo the neurodegeneration promoting action of this mutant β-syn, the present inventor made and analyzed a transgenic mouse (Tg mouse) that can overexpress mutant β-syn in central nervous system cells. went.
発現ベクターに用いるプロモーターは、パーキンソン病（Parkinson's disease: PD）や痴呆性レビー小体病 (dementia with Lewy body: DLB)の病変が脳に広範に及ぶことを考慮し、中枢神経系細胞、特に中枢神経細胞全般に高発現するThy-1プロモーターを選択した（図３Ａ）。具体的には、Thy-1カセットに、変異型β-syn（β-syn P123H）のcDNA（PCRを用いて作製）を挿入した発現ベクターを構築し、C57BL/6Nマウスの受精卵に注入した。誕生したマウスについて、テールブロットによりβ-syn P123Hトランスジーンを解析した結果、計７ライン（A〜Gライン）のF0マウスを得た。これらF0マウスを野生型のマウスと交配して、誕生したF1マウスに対してウエスタンブロット法により変異型β-synの発現解析をし、変異型β-synの発現量のレベルに応じて、低発現、中発現、及び高発現のマウスのラインに分類した。 Promoters used in expression vectors are central nervous system cells, especially the central nervous system, considering that Parkinson's disease (PD) and dementia with Lewy body (DLB) lesions are widespread in the brain. A Thy-1 promoter highly expressed in all neurons was selected (FIG. 3A). Specifically, an expression vector was constructed by inserting cDNA of a mutant β-syn (β-syn P123H) into a Thy-1 cassette and injected into fertilized eggs of C57BL / 6N mice. . As a result of analyzing the β-syn P123H transgene by tail blot for the born mice, a total of 7 lines (A to G lines) of F0 mice were obtained. These F0 mice were mated with wild-type mice, and the expression of mutant β-syn was analyzed by Western blotting for the new F1 mice. It was categorized into a line of mice with expression, medium expression and high expression.
本発明者は、この実験系において、以下の(i)，(ii)の知見を得た。
(i) 変異型β-synの発現量に応じて、マウスの寿命が顕著に短縮すること（図３Ｄ）。
(ii) 複数のライン（F0及びF1マウス）の脳組織標本において、大脳基底核等の特異的な領域にレビー小体様の封入体が形成されること（図３Ｅ）。
The inventor has obtained the following findings (i) and (ii) in this experimental system.
(i) The life span of the mouse is remarkably shortened according to the expression level of the mutant β-syn (FIG. 3D).
(ii) Lewy body-like inclusions are formed in specific regions such as the basal ganglia in brain tissue specimens of multiple lines (F0 and F1 mice) (FIG. 3E).
上記(i)に関しては、従来、α-syn過剰発現Tgマウスにおいてこのような個体死はほとんど報告されていない。 Regarding the above (i), conventionally, such individual death has hardly been reported in α-syn overexpressing Tg mice.
上記(ii)に関しては、レビー小体様の封入体数は、変異型β-synの発現量にほぼ相関しており、低発現及び中発現マウスに比べ高発現マウス（ラインC）においてより多く認められた。また、レビー小体様の封入体は、形態的にはヒトのPD又はDLB脳に形成されるレビー小体と同様に、対称的で繊細な円形像を呈するものであった。封入体のサイズは大小様々であり、小さな封入体が時間の経過に伴って徐々に増大するものと考えられた。免疫組織学的に、これらの封入体は、抗β-syn抗体、抗変異型β-syn抗体及び抗α-syn抗体のいずれによっても強く染色された。さらに、蛍光二重染色による変異型β-syn及びα-synの免疫原性から判断して、各封入体は、α-syn及びβ-synが種々の割合で共在するものであった。 As for (ii) above, the number of Lewy body-like inclusions is almost correlated with the expression level of mutant β-syn, and is higher in high-expressing mice (line C) than in low- and medium-expressing mice. Admitted. In addition, the Lewy body-like inclusions exhibited a symmetrical and delicate circular image in the same manner as the Lewy bodies formed in the human PD or DLB brain. The size of the inclusion body varied in size, and it was considered that the small inclusion body gradually increased over time. Immunohistologically, these inclusion bodies were strongly stained by any of anti-β-syn antibody, anti-mutated β-syn antibody and anti-α-syn antibody. Furthermore, judging from the immunogenicity of mutant β-syn and α-syn by fluorescence double staining, each inclusion body was one in which α-syn and β-syn coexist in various proportions.
これまで、変異型β-syn発現によるTgモデルマウスは知られていない。また、PD又はDLB脳のレビー小体に酷似した封入体の形成が認められるTgマウスは他に例を見ない。これらの点を考慮すると、本発明にかかる変異型β-syn過剰発現Tgマウスは、極めてユニークなものである。また、当該Tgマウスは、神経変性疾患の病態におけるβ-synの役割及び封入体形成の機序の理解を深めるとともに、神経変性疾患の治療薬及び治療法を開発し得る強力なツールとなるため、極めて有用なものである。 So far, no Tg model mice with mutant β-syn expression have been known. In addition, there are no other examples of Tg mice in which the formation of inclusion bodies resembling PD or DLB brain Lewy bodies is observed. Considering these points, the mutant β-syn overexpressing Tg mouse according to the present invention is very unique. In addition, the Tg mouse will deepen understanding of the role of β-syn in the pathogenesis of neurodegenerative diseases and the mechanism of inclusion body formation, and it will be a powerful tool for developing therapeutic agents and treatment methods for neurodegenerative diseases. Is extremely useful.
なお、本明細書においては、α-syn、β-syn及びγ-synのタンパク質分子並びに遺伝子は、野生型か変異型かに関わらず、また明記しているか否かに関わらず、いずれもヒト由来のものを示すこととする。 In the present specification, α-syn, β-syn and γ-syn protein molecules and genes are all human regardless of whether they are wild-type or mutant, and whether or not they are specified. Let's show the origin.
２．トランスジェニック非ヒト動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、中枢神経系細胞において機能するプロモーター及び変異型βシヌクレイン（β-syn）遺伝子が導入された動物である（以下、「β-synトランスジェニック非ヒト動物」と言うことがある。）。
2. Transgenic non-human animal The transgenic non-human animal of the present invention is an animal into which a promoter that functions in central nervous system cells and a mutant β-synuclein (β-syn) gene have been introduced (hereinafter referred to as “β-syn transgenic”). Sometimes referred to as "non-human animals").
通常、所望の遺伝子を目的組織において特異的に発現させる場合は、組織特異的なプロモーターを利用する。本発明は、変異型β-syn遺伝子を中枢神経系細胞において特異的に発現させることを目的とし、変異型β-syn遺伝子を、中枢神経系細胞において機能するプロモーターにより発現制御するようにする。中枢神経系細胞において機能するプロモーターとしては、限定はされないが、例えば、Thy-1プロモーター（脳特異的）、Neuron-Specific Enolaseプロモーター（脳特異的）及びTα1プロモーター（脳特異的）及びプリオンプロモーター（脳特異的）等の中枢神経細胞用プロモーター、並びに、グリア細胞など中枢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが挙げられる。中枢神経系細胞において機能するプロモーターは、中枢神経細胞用プロモーターとしての機能と、中枢神経系に存在し得る各種細胞用プロモーターとしての機能とを、いずれも有するものであってもよい。 Usually, when a desired gene is specifically expressed in a target tissue, a tissue-specific promoter is used. An object of the present invention is to specifically express a mutant β-syn gene in a central nervous system cell, and to control the expression of the mutant β-syn gene by a promoter that functions in the central nervous system cell. Examples of promoters that function in central nervous system cells include, but are not limited to, for example, Thy-1 promoter (brain-specific), Neuron-Specific Enolase promoter (brain-specific), Tα1 promoter (brain-specific), and prion promoter ( Examples include promoters for central nerve cells such as brain specific) and known promoters for various cells that can exist in the central nervous system such as glial cells. The promoter that functions in the central nervous system cells may have both a function as a promoter for central nervous cells and a function as a promoter for various cells that may exist in the central nervous system.
本発明の非ヒト動物において変異型β-syn遺伝子を発現させる「中枢神経系細胞」は、限定はされず、例えば、脳神経細胞（大脳、間脳、中脳、小脳の各神経細胞）、延髄神経細胞及び脊髄神経細胞等の中枢神経細胞、並びに、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト及びマイクログリア等）が挙げられ、中でも脳神経細胞及びグリア細胞が好ましく、より好ましくは脳神経細胞である。なお、本発明で言う「グリア細胞」とは、中枢神経系に存在するグリア細胞（中枢神経系グリア細胞）を意味する。 The “central nervous system cell” for expressing the mutant β-syn gene in the non-human animal of the present invention is not limited, and examples thereof include cerebral nerve cells (cerebral nerve, diencephalon, mesencephalon and cerebellar nerve cells), medulla oblongata. Examples thereof include central nerve cells such as nerve cells and spinal nerve cells, and glial cells (such as astrocytes, oligodendrocytes, and microglia). Among them, brain nerve cells and glial cells are preferable, and brain nerve cells are more preferable. In addition, the “glial cell” referred to in the present invention means a glial cell (central nervous system glial cell) existing in the central nervous system.
変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物は、中枢神経系細胞において機能するプロモーターの制御下にある変異型β-syn遺伝子を導入した非ヒト動物であり、当該動物の染色体DNAに、上記プロモーター制御下の変異型β-syn遺伝子がホモ遺伝子型(+/+)又はヘテロ遺伝子型(+/-)で導入されたものである。変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物は、変異型β-syn遺伝子と共に導入される上記プロモーターの制御により、変異型β-synが中枢神経系細胞特異的に発現亢進されたものである。 A mutant β-syn transgenic non-human animal is a non-human animal introduced with a mutant β-syn gene under the control of a promoter that functions in central nervous system cells, and the promoter control is performed on the chromosomal DNA of the animal. The lower mutant β-syn gene is introduced as a homo genotype (+ / +) or a hetero genotype (+/−). The mutant β-syn transgenic non-human animal is one in which the expression of the mutant β-syn is specifically enhanced in the central nervous system cells by the control of the promoter introduced together with the mutant β-syn gene.
ここで、「プロモーターの制御下にある」とは、当該プロモーターが機能して変異型β-syn遺伝子が中枢神経系細胞において特異的に発現され得るように、すなわち、当該プロモーターが変異型β-syn遺伝子に作用可能なように、連結されたものであることを意味する。 Here, “under the control of a promoter” means that the promoter functions so that the mutant β-syn gene can be expressed specifically in central nervous system cells, that is, the promoter is mutated β- It means that it is linked so that it can act on the syn gene.
また、本明細書において、変異型β-syn遺伝子の遺伝子型を表す「(+/+)」及び「(+/-)」の表記は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作出するために導入される変異型β-syn遺伝子、すなわち「中枢神経系細胞において機能するプロモーターの制御下にある変異型β-syn遺伝子」についての遺伝子型を示しており、「(+/+)」はホモ導入、「(+/-)」はヘテロ導入の遺伝子型を意味する。同様に、「(-/-)」の表記は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作出するために導入される変異型β-syn遺伝子についての遺伝子型を意味するものであり、この場合は、「中枢神経系細胞において機能するプロモーターの制御下にある変異型β-syn遺伝子」が導入されていない非トランスジェニック非ヒト動物を意味する。 Further, in the present specification, the notation of “(+ / +)” and “(+/−)” representing the genotype of the mutant β-syn gene is used for producing the transgenic non-human animal of the present invention. The genotype of the mutant β-syn gene to be introduced, that is, “mutant β-syn gene under the control of a promoter that functions in central nervous system cells” is shown, and “(+ / +)” is homozygous. Introduced, “(+/−)” refers to the heterogenous genotype. Similarly, the notation "(-/-)" means the genotype for the mutant β-syn gene introduced to produce the transgenic non-human animal of the present invention, in this case , “A non-transgenic non-human animal into which a“ mutated β-syn gene under the control of a promoter that functions in central nervous system cells ”has not been introduced”.
本発明に用い得る非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物が挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物が好ましく、より好ましくはマウスである。 Examples of non-human animals that can be used in the present invention include mammals other than humans such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, dogs, cats, monkeys, sheep, cows, and horses. And rodent (murine) animals such as guinea pigs are preferred, and mice are more preferred.
本発明の非ヒト動物は、中枢神経系細胞、特に脳神経細胞において、ヒトのPD又はDLB脳に見られるレビー小体に酷似した封入体（レビー小体様の封入体）が形成されたものが好ましい。また本発明の非ヒト動物は、ヒトのPD又はDLBなど、ヒトにおける神経変性疾患と同様の病態を有するものが好ましい。これら非ヒト動物は、ヒトにおける神経変性疾患のモデル動物として極めて有用である。 In the non-human animal of the present invention, an inclusion body (a Lewy body-like inclusion body) that is very similar to a Lewy body found in a human PD or DLB brain is formed in a central nervous system cell, particularly a cerebral nerve cell. preferable. In addition, the non-human animal of the present invention preferably has a disease state similar to a neurodegenerative disease in humans such as human PD or DLB. These non-human animals are extremely useful as model animals for neurodegenerative diseases in humans.
以下に、本発明の非ヒト動物の作出方法について説明する。ここでは、非ヒト動物としてマウスを用いた場合を例に挙げて説明するが、他の非ヒト動物を用いる場合についても同様の方法を適用することができる。 Below, the production method of the non-human animal of this invention is demonstrated. Here, a case where a mouse is used as a non-human animal will be described as an example, but the same method can be applied to a case where another non-human animal is used.
変異型β-synトランスジェニックマウスは、公知の作出方法、すなわち受精卵前核へのDNAマイクロインジェクションによる方法、胚性幹細胞（ES細胞）にDNAを導入した後キメラを作製する方法、及びレトロウイルスベクターを初期発生胚に感染させて導入する方法等のいずれの方法を用いることができる。これらの方法については、例えば、「Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1994) Hogan B et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor」、「マウス ラボマニュアル 第２版 −ポストゲノム時代の実験法−（第271〜296頁）, 発行日：2003年5月26日（初版）, 編集：東京都臨床医学総合研究所 実験動物研究部門, 発行者：平野皓正, 発行所：シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社」、「発生工学実験マニュアル (1987) 勝木元也（編）講談社サイエンティフィク, 東京」、「マウス胚の操作マニュアル 第２版 (1997) Hogan B et al.（著）, 山内一也ら（訳）近代出版, 東京」、「Gordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diego」等に記載されており、これらの記載を適宜参照してトランスジェニックマウスを作出することができる。 Mutant β-syn transgenic mice can be produced by known production methods, that is, a method by DNA microinjection into the pronucleus of the fertilized egg, a method of producing a chimera after introducing DNA into embryonic stem cells (ES cells), and a retrovirus. Any method can be used such as a method of introducing a vector by infecting an early developing embryo. As for these methods, for example, “Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1994) Hogan B et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor”, “Mouse Lab Manual Second Edition-Post Experimental methods in the genome era (pp.271-296), Publication date: May 26, 2003 (first edition), Editing: Laboratory for Animal Research, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Publisher: Masamasa Hirano, Publisher: Springer Fairlark Tokyo Co., Ltd., Developmental Engineering Experiment Manual (1987) Motoya Katsuki (ed.) Kodansha Scientific, Tokyo, Operation Manual for Mouse Embryo 2nd Edition (1997) Hogan B et al. ), Kazuya Yamauchi et al. (Translation) Modern Publishing, Tokyo, “Gordon, JW (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, PM, and DePamphilis, ML, Eds.), Academic Press, San Diego” And refer to these descriptions as needed. It is possible to produce a Kkumausu.
公知の作出方法の中でも、最も一般的である受精卵前核へのDNAマイクロインジェクション法を用いる場合について、以下の(i)〜(vii)に概略を説明する。 Among the known production methods, the case of using the most common DNA microinjection method to the pronucleus of the fertilized egg will be outlined in the following (i) to (vii).
(i) 変異型β-syn遺伝子を調製する。
具体的には、まず、ヒトのcDNA遺伝子ライブラリーからPCR等の方法により野生型β-syn遺伝子断片を得、この遺伝子断片を用いて野生型β-syn遺伝子をスクリーニングする。野生型β-syn遺伝子には、必要により、エピトープタグ等をコードするDNAを連結しておいてもよい。スクリーニングした野生型β-syn遺伝子は、組換えDNA技術を用いて、適当なプラスミドベクターに挿入しておいてもよい。あるいは、上記スクリーニングをする代わりに、予め野生型β-syn遺伝子が挿入された市販のプラスミドベクターを使用してもよい。
(i) A mutant β-syn gene is prepared.
Specifically, first, a wild-type β-syn gene fragment is obtained from a human cDNA gene library by a method such as PCR, and the wild-type β-syn gene is screened using this gene fragment. If necessary, the wild-type β-syn gene may be linked with DNA encoding an epitope tag or the like. The screened wild-type β-syn gene may be inserted into an appropriate plasmid vector using recombinant DNA technology. Alternatively, instead of performing the above screening, a commercially available plasmid vector into which a wild-type β-syn gene has been inserted may be used.
野生型ヒトβ-syn遺伝子の塩基配列情報（配列番号１）は、公知のデータベースから容易に入手することができ、例えばNCBIのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において「アクセッション番号：BC002902」として公表されている。配列番号１において、野生型ヒトβ-synのコード領域（CDS）は第252番目〜第656番目であるため、配列番号１に示す全長配列の代わりに上記コード領域を使用することも可能である。 The nucleotide sequence information (SEQ ID NO: 1) of the wild type human β-syn gene can be easily obtained from a known database, for example, the NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) As “Accession Number: BC002902”. In SEQ ID NO: 1, since the coding region (CDS) of wild type human β-syn is from the 252nd to the 656th, the above coding region can be used instead of the full-length sequence shown in SEQ ID NO: 1. .
次いで、野生型β-syn遺伝子の塩基配列に変異を加えて、変異型β-synタンパク質をコードする変異型β-syn遺伝子を得る。ここで、本発明でいう変異型β-synタンパク質とは、自己凝集促進活性及びαシヌクレイン（α-syn）凝集促進活性のいずれか又は両方を有するタンパク質を意味する。「自己凝集促進活性」とは、自己、すなわち変異型β-syn同士が互いに凝集する活性を意味し、構造的に本来凝集しにくい野生型β-syn同士の凝集の程度に比べて、変異型β-syn同士の凝集の程度が高いと認められる物性であればよい。また、「α-syn凝集促進活性」とは、α-syn同士を互いに凝集させる活性を意味し、野生型β-synの存在下におけるα-syn同士の凝集の程度が、野生型β-synの非存在下におけるα-syn同士の凝集の程度に比べて高いと認められる物性であればよい。 Next, a mutation is added to the base sequence of the wild-type β-syn gene to obtain a mutant β-syn gene encoding the mutant β-syn protein. Here, the mutant β-syn protein referred to in the present invention means a protein having either or both of self-aggregation promoting activity and α-synuclein (α-syn) aggregation promoting activity. “Self-aggregation-promoting activity” means self, that is, activity in which mutant β-syn aggregate with each other, compared to the degree of aggregation between wild-type β-syn that is structurally difficult to aggregate. Any physical property may be used as long as the degree of aggregation of β-syn is high. “Α-syn aggregation promoting activity” means the activity of aggregating α-syns with each other, and the degree of aggregation of α-syn in the presence of wild-type β-syn Any physical property that is recognized as being higher than the degree of aggregation of α-syn in the absence of.
本発明でいう変異型β-synタンパク質は、具体的には、(a) 野生型β-synのアミノ酸配列（配列番号２）において第70番目及び第123番目のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は、(b) 当該置換されたアミノ酸配列のうち第70番目及び第123番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましく挙げられ、これらのなかでも特に、上記第70番目のアミノ酸（バリン）が他のアミノ酸としてメチオニンに置換されたもの、及び／又は、上記第123番目のアミノ酸（プロリン）が他のアミノ酸としてヒスチジンに置換されたものが好ましい。配列番号１に示される塩基配列において、上記第70番目のアミノ酸をコードする塩基は第459番目〜第461番目の塩基「gtg」であり、上記第123番目のアミノ酸をコードする塩基は第618番目〜第620番目の塩基「ccc」である。よって、変異型β-synタンパク質の遺伝子を構築する場合は、これら塩基配列（「gtg」,「ccc」）が所望のアミノ酸をコードする配列となるように変異を加えればよい。例えば、上記第70番目のアミノ酸（バリン）をメチオニンに置換する場合は、「gtg」から「atg」となるように第459番目の塩基に変異置換を加えればよく、上記第123番目のアミノ酸（プロリン）をヒスチジンに置換する場合は、「ccc」から「cat」又は「cac」となるように第619番目や第620番目の塩基に変異置換を加えればよい。 Specifically, the mutant β-syn protein referred to in the present invention comprises (a) at least one amino acid among the 70th and 123rd amino acids in the amino acid sequence of wild type β-syn (SEQ ID NO: 2). An amino acid sequence substituted with another amino acid, or (b) an amino acid in which one or several amino acids except the 70th and 123rd amino acids in the substituted amino acid sequence have been deleted, substituted or added Preferred are those consisting of a sequence, and among these, in particular, those in which the 70th amino acid (valine) is replaced with methionine as another amino acid, and / or the 123rd amino acid (proline) is Those substituted with histidine as other amino acids are preferred. In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the base encoding the 70th amino acid is the 459th to 461st base “gtg”, and the base encoding the 123rd amino acid is the 618th base ~ 620th base "ccc". Therefore, when constructing a gene for a mutant β-syn protein, mutations may be added so that these base sequences (“gtg”, “ccc”) are sequences encoding desired amino acids. For example, when substituting the 70th amino acid (valine) with methionine, mutation substitution may be added to the 459th base so as to change from “gtg” to “atg”, and the 123rd amino acid ( When substituting (histoline) for histidine, mutation substitution may be added to the 619th and 620th bases from “ccc” to “cat” or “cac”.
上記の変異置換型の遺伝子（変異型β-synをコードする遺伝子）は、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。 The above mutation-replacement type gene (gene encoding mutant β-syn) is, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & It can be prepared according to the site-specific displacement induction method described in Sons (1987-1997) and the like. Specifically, it can be prepared using a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, and examples of the kit include QuickChange TM Site. -Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio) are preferred Can be mentioned.
また、後述する実施例に記載のように、所望のアミノ酸のコドンを示す塩基となるようにミスセンス変異が導入されるように設計したPCRプライマーを用い、野生型β-synをコードする塩基配列を含むDNA等をテンプレートとして、適当な条件下でPCRを行うことにより調製することもできる。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、限定はされないが、正確性の高いDNAポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Pwo DNA（ポリメラーゼロシュ・ダイアグノスティックス）、Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナPfx DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）、KOD-plus-ポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。PCRの反応条件は、用いるDNAポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等により適宜設定すればよいが、例えば、サイクル条件であれば「90〜98℃で5〜30秒（熱変性・解離）→50〜65℃で5〜30秒（アニーリング）→65〜80℃で30〜1200秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計20〜200サイクル行う条件が好ましい。 In addition, as described in the examples described later, a PCR primer designed so that a missense mutation is introduced so as to be a base indicating a codon of a desired amino acid, and a base sequence encoding wild-type β-syn is It can also be prepared by performing PCR under suitable conditions using the contained DNA or the like as a template. The DNA polymerase used for PCR is not limited, but is preferably a highly accurate DNA polymerase. For example, Pwo DNA (Polymerase Roche Diagnostics), Pfu DNA polymerase (Promega), Platinum Pfx DNA polymerase ( Invitrogen), KOD DNA polymerase (Toyobo), KOD-plus-polymerase (Toyobo) and the like are preferable. The PCR reaction conditions may be appropriately set depending on the optimum temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of the DNA to be synthesized, etc. For example, in the case of cycle conditions, “90-98 ° C. for 5-30 seconds (thermal denaturation, Dissociation) → 50 to 65 ° C. for 5 to 30 seconds (annealing) → 65 to 80 ° C. for 30 to 1200 seconds (synthesis / elongation) ”is preferably performed under a condition of 20 to 200 cycles in total.
さらに本発明においては、上記のごとく得られた変異型β-syn遺伝子の塩基配列またはそのコード領域の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、自己凝集促進活性及び／又はα-syn凝集促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用することもできる。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が100〜900mM、好ましくは100〜300mMであり、温度が50〜70℃、好ましくは55〜65℃の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997) )等を参照することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、その相補配列に対して少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％(例えば、95％以上、さらには99％)の同一性を有する塩基配列を含むDNAが挙げられる。 Furthermore, in the present invention, hybridization with a base sequence complementary to the base sequence of the mutant β-syn gene obtained as described above or the base sequence of its coding region is performed under stringent conditions, and self-aggregation is promoted. A gene encoding a protein having activity and / or α-syn aggregation promoting activity can also be used. Examples of the “stringent conditions” include conditions in which the salt concentration during washing in hybridization is 100 to 900 mM, preferably 100 to 300 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably 55 to 65 ° C. . For details on the hybridization procedure, see “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)), etc. The hybridizing DNA is at least 50% or more, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90% (for example, 95% or more Is a DNA containing a nucleotide sequence having 99% identity.
(ii) 受精卵に導入する目的のDNA構築物を調製する。
中枢神経系細胞において機能するプロモーター（例えば、Thy-1プロモーター）制御下で導入遺伝子が発現制御されるように設計されたベクターに、組換えDNA技術を用いて、変異型β-syn遺伝子を挿入する。上記挿入後のベクターを制限酵素処理等して、目的のDNA構築物、すなわちThy-1プロモーター及びその制御下にある変異型β-syn遺伝子を含むDNA断片を得る。
(ii) Prepare a target DNA construct to be introduced into a fertilized egg.
Using recombinant DNA technology, insert the mutant β-syn gene into a vector designed to control the expression of the transgene under the control of a promoter that functions in central nervous system cells (eg, Thy-1 promoter) To do. The inserted vector is treated with a restriction enzyme to obtain a target DNA construct, that is, a DNA fragment containing a Thy-1 promoter and a mutant β-syn gene under its control.
(iii) 雌のマウスにホルモンを注射して強制的に過剰排卵させ、受精を行い、交尾後１日目の卵管から受精卵を摘出する。
(iv) 核が融合する前の時期の受精卵に、顕微鏡下で目的のDNA構築物を雄性全核中にマイクロインジェクションにより注入する。
(v) マイクロインジェクション後の受精卵を約20個程度、仮親となる偽妊娠雌マウスの子宮又は卵管内に移植する。
(vi) 移植後の雌マウスを通常の飼育条件下で飼育し、仔マウスを出産させる。
(vii) 仔マウスの一部（尾の先端や耳介片など）からゲノムDNAを抽出し、PCR法又はサザンブロット法等により、Thy-1プロモーターの制御下にある変異型β-syn遺伝子の導入の成否を確認する。
(iii) A female mouse is forcibly over-ovulated by injecting hormone, fertilized, and a fertilized egg is removed from the oviduct on the first day after mating.
(iv) A target DNA construct is injected into a male whole nucleus by microinjection into a male whole nucleus under a microscope to a fertilized egg at a period before the nucleus is fused.
(v) About 20 fertilized eggs after microinjection are transplanted into the uterus or fallopian tube of pseudopregnant female mice serving as temporary parents.
(vi) The transplanted female mouse is bred under normal breeding conditions to give birth to a pup mouse.
(vii) Extracting genomic DNA from a part of the pups (such as the tip of the tail or auricle piece) and using the PCR method or Southern blot method, etc., the mutant β-syn gene under the control of the Thy-1 promoter Confirm the success of the introduction.
以上のようにして作出された変異型β-synトランスジェニックマウスは、野生型のマウスと交配させることにより、ヘテロ遺伝子型マウス(+/-)を得ることができる。さらに、このヘテロ遺伝子型のマウス同士を交配させることにより、ホモ遺伝子型マウス(+/+)を得ることができる。また、メンデルの法則に従い、変異型β-synトランスジェニックマウスと共に、同腹の対照マウス(-/-)を得ることもできる。 The mutant β-syn transgenic mouse produced as described above can be crossed with a wild-type mouse to obtain a heterogeneous mouse (+/−). Furthermore, a homogenous mouse (+ / +) can be obtained by mating these heterogenous mice. According to Mendel's law, littermate control mice (-/-) can be obtained together with mutant β-syn transgenic mice.
変異型β-synトランスジェニックマウスにおいて、中枢神経系特異的に変異型β-synが発現していることの確認は、例えば、当該マウスの脳の所定の部位（視床下部など）からRNAを抽出してRT-PCR法及びノーザンブロット法等により確認する方法、あるいは、当該マウスの脳における変異型β-synの発現をウエスタンブロット法等により確認する方法が挙げられる。 In mutant β-syn transgenic mice, confirmation of the central nervous system-specific expression of mutant β-syn is achieved by, for example, extracting RNA from a predetermined part of the mouse's brain (such as the hypothalamus) And a method for confirming the expression of mutant β-syn in the mouse brain by Western blotting or the like.
３．スクリーニング方法
(１) 非ヒト動物を用いる方法
前述の通り、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトの神経変性疾患の病態とよく一致するため、これら疾患の治療薬の開発において極めて有用なものである。そこで本発明は、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物を用いた神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られる神経変性疾患の治療薬を提供する。ここで、神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病（PD）、痴呆性レビー小体病（DLB）、多系統萎縮症及びレビー小体亜系型アルツハイマー病等の各種疾患を含む。
3. Screening method
(1) Methods using non-human animals As described above, mutant β-syn transgenic non-human animals are very useful in the development of therapeutics for these diseases because they are in good agreement with the pathology of human neurodegenerative diseases. It is. Therefore, the present invention provides a screening method for therapeutic agents for neurodegenerative diseases using mutant β-syn transgenic non-human animals, and therapeutic agents for neurodegenerative diseases obtained by the methods. Here, examples of the neurodegenerative disease include various diseases such as Parkinson's disease (PD), dementia Lewy body disease (DLB), multiple system atrophy and Lewy body subtype Alzheimer's disease.
本発明において、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法は、以下の(a)及び(b)の工程を含む。
(a) 変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物に、候補物質を投与する工程（投与工程）
(b) 上記トランスジェニック非ヒト動物について、神経変性疾患の病態を評価する工程
In the present invention, the method for screening a therapeutic agent for a neurodegenerative disease includes the following steps (a) and (b).
(a) A step of administering a candidate substance to a mutant β-syn transgenic non-human animal (administration step)
(b) A step of evaluating the pathological condition of the neurodegenerative disease with respect to the transgenic non-human animal.
（評価工程）
「神経変性疾患の病態を評価する」とは、候補物質を投与した後におけるトランスジェニック非ヒト動物の神経変性疾患に関する病態の表現型を解析することを意味し、候補物質の投与前後のトランスジェニック非ヒト動物の神経変性疾患に関する病態を比較検討すること、あるいは、候補物質を投与した被験動物と投与しない対照動物との比較検討を行うことのいずれをも意味するものである。
(Evaluation process)
“Evaluating the pathological condition of a neurodegenerative disease” means analyzing the phenotype of the pathological condition related to the neurodegenerative disease in a transgenic non-human animal after administration of the candidate substance, and transgenic before and after administration of the candidate substance. This means either a comparative examination of the pathological condition of a non-human animal regarding a neurodegenerative disease or a comparative examination between a test animal administered with a candidate substance and a control animal not administered.
被験動物の表現型と対照動物の表現型との比較を行なう方法について、以下に説明する。
「対照動物」は、被験動物との比較対照に使用されるに適している限り限定されるものではなく、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）又は（+/-）〕であっても、同腹の非トランスジェニック(-/-)の非ヒト動物であっても、トランスジェニック動物でない野生型非ヒト動物であってもよい。
A method for comparing the phenotype of the test animal with the phenotype of the control animal is described below.
The “control animal” is not limited as long as it is suitable for use as a control for comparison with a test animal, and a mutant β-syn transgenic non-human animal [(+ / +) or (+/−) Or a non-transgenic (-/-) non-human animal that is a litter, or a wild-type non-human animal that is not a transgenic animal.
比較検討は、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）,（+/-）〕を被験動物とし、当該被験動物以外の非ヒト動物（-/-）を対照動物として用いて、上記(a)及び(b)の工程を含む方法を採用することができる。また、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）,（+/-）〕を被験動物として用い、候補物質を投与しない変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）,（+/-）〕を対照動物として用いることもできる。 In comparative studies, mutant β-syn transgenic non-human animals [(+ / +), (+/-)] were used as test animals, and non-human animals (-/-) other than the test animals were used as control animals. Thus, a method including the steps (a) and (b) can be employed. In addition, a mutant β-syn transgenic non-human animal [(+ / +), (+/-)] is used as a test animal, and a mutant β-syn transgenic non-human animal [(+ / +), (+/-)] can also be used as control animals.
本発明の非ヒト動物と同腹又は同種の野生型非ヒト動物は、正確な比較実験を行うことができる点で対照動物として好ましい。
なお、本発明のスクリーニング方法は、必要に応じ、他の工程を含んでいてもよい。
以下に、上記各工程について説明する。
Wild-type non-human animals that are the same as or similar to the non-human animals of the present invention are preferred as control animals in that accurate comparison experiments can be performed.
The screening method of the present invention may include other steps as necessary.
Below, each said process is demonstrated.
(a) 投与工程
被験動物及び対照動物としては、特に限定されるものではないが、通常、同種の非ヒト動物を用いる。また被験動物及び対照動物は、同腹の動物を用いることが好ましく、同性及び同齢の動物を用いることがより好ましい。さらに被験動物及び対照動物は、飼料の摂取量以外の飼育条件は同様であることが好ましい。
(a) Administration Step The test animal and the control animal are not particularly limited, but usually the same kind of non-human animal is used. Moreover, it is preferable to use animals of the same litter as test animals and control animals, and it is more preferable to use animals of the same sex and age. Furthermore, it is preferable that the test animals and the control animals have the same breeding conditions other than the intake of feed.
被験動物としては、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物（+/+）を用いてもよいし、又は変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物（+/-）を用いてもよい。また被験動物は、神経変性疾患の症状を呈するものを用いることができる。対照動物として、変異型β-synについて非トランスジェニック(-/-)の非ヒト動物を用いることができる。 As a test animal, a mutant β-syn transgenic non-human animal (+ / +) may be used, or a mutant β-syn transgenic non-human animal (+/-) may be used. As the test animal, animals exhibiting symptoms of neurodegenerative diseases can be used. As a control animal, a non-transgenic (− / −) non-human animal for mutant β-syn can be used.
被験動物に投与する候補物質としては、限定はされないが、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド(DNA, RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など）、低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。 Candidate substances to be administered to a test animal are not limited, but various naturally or artificially synthesized peptides, proteins (including enzymes and antibodies), nucleic acids (polynucleotide (DNA, RNA), oligonucleotides (siRNA, etc.) ), Peptide nucleic acids (PNA), etc.), low molecular or high molecular organic compounds, and the like.
候補物質の投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、被験動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。 The candidate substance can be administered orally or parenterally, and is not limited. In any case, known administration methods, administration conditions, and the like can be adopted. The dose can be appropriately set in consideration of the type and condition of the test animal, the type of candidate substance, and the like.
(b) 評価工程
神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする場合は、候補物質が投与された被験動物、及び候補物質が投与されていない対照動物について、各種評価項目、例えば、レビー小体様封入体の有無、大小又は個数、寿命、平衡運動感覚能力（ロタロッド）及び記憶能力（水迷路）等を比較評価することが好ましい。これら評価項目の評価（測定方法等）は、公知の手段及び手順により行うことができる。
(b) Evaluation process When screening for therapeutic agents for neurodegenerative diseases, various evaluation items, for example, Lewy body-like inclusion bodies, for test animals to which candidate substances have been administered and control animals to which candidate substances have not been administered It is preferable to compare and evaluate the presence / absence, size, number, life, balance motor sense ability (rotarod), memory ability (water maze), and the like. Evaluation (measurement method, etc.) of these evaluation items can be performed by known means and procedures.
変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物（+/+）又は変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物（+/-）を対照として使用した場合は、被験動物における評価項目の内容が対照動物と比較して優れたものとなったとき、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。「優れたものとなったとき」とは、例えば、レビー小体様封入体が無くなること、小さくなること又は少なくなること、寿命が延びること、平衡運動感覚能力（ロタロッド）が高くなることの少なくとも１つを満たすときを意味する。 When a mutant β-syn transgenic non-human animal (+ / +) or mutant β-syn transgenic non-human animal (+/-) is used as a control, the content of the evaluation item in the test animal is the same as that of the control animal. When it becomes superior in comparison, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. “When it becomes excellent” means, for example, that the Lewy body-like inclusions are eliminated, become smaller or less, that the life span is extended, that the balance motor sense ability (rota rod) is increased. It means when one is satisfied.
同腹の非トランスジェニック(-/-)の非ヒト動物を対照として使用した場合は、被験動物における評価項目の内容が対照動物と比較して同等又は優れたものとなったとき、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。 When a non-transgenic (-/-) non-human animal of the same litter is used as a control, if the content of the evaluation item in the test animal is equivalent or superior to that of the control animal, the candidate substance is It can be selected as a therapeutic agent for degenerative diseases.
被験動物に候補物質を投与する前の段階を対照として使用する場合は、ホモ遺伝子型（+/+）又はヘテロ遺伝子型（+/-）を対照としたときと同様の基準で候補物質投与後の被験動物を比較評価することができる。 When using the stage prior to administration of the candidate substance to the test animal as a control, after administration of the candidate substance using the same criteria as when using the homogenotype (+ / +) or heterogenotype (+/-) as the control Can be comparatively evaluated.
(２) 中枢神経系細胞を用いる方法
また本発明は、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞を用いた変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られる変性疾患の治療薬を提供することができる。前記３.(１)の非ヒト動物を用いる方法が、in vivo法であるのに対し、中枢神経系細胞を用いる本方法は、in vitro法と言うことができる。
(2) Method Using Central Nervous System Cells The present invention also relates to a method for screening a therapeutic agent for a degenerative disease using a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal, and a modification obtained by the method. A therapeutic for a disease can be provided. While the method using the non-human animal of the above 3. (1) is an in vivo method, this method using a central nervous system cell can be said to be an in vitro method.
上記スクリーニング方法において、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞としては、当該中枢神経系細胞の初代培養細胞（初代培養中枢神経系細胞）を用いることが好ましい。また、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞としては、胎生期にある当該非ヒト動物由来の中枢神経系細胞が好ましい。胎生期の期間は、使用する非ヒト動物の種類により異なるため、特に限定はされず、各非ヒト動物に特有の公知の期間が適用される。 In the above screening method, it is preferable to use a primary cultured cell (primary cultured central nervous system cell) of the central nervous system cell as the central nervous system cell derived from the mutant β-syn transgenic non-human animal. Moreover, as a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal, a central nervous system cell derived from the non-human animal in the embryonic stage is preferable. The period of the embryonic period varies depending on the type of non-human animal to be used, and is not particularly limited. A known period specific to each non-human animal is applied.
上記スクリーニング方法は、詳しくは、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするというものである。また、当該方法のうち、より好ましい態様としては、例えば、胎生期にある変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物から採取された初代培養中枢神経系細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法が挙げられる。 Specifically, the screening method described above involves contacting a candidate substance with a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal to measure the cellular activity of the cell, and using the obtained measurement result as an index as a neurodegenerative disease Screening for therapeutic drugs. In addition, among the methods, as a more preferable embodiment, for example, a primary substance cultured central nervous system cell collected from a mutant β-syn transgenic non-human animal in the embryonic period is contacted with a candidate substance, and the cell of the cell Examples thereof include a method of screening a therapeutic agent for neurodegenerative diseases by measuring the activity and using the obtained measurement result as an index.
さらに、上記スクリーニング方法においては、例えば、中枢神経系細胞が脳神経細胞であり、細胞活性が神経突起伸張能及び／又は生存能であるか、あるいは、中枢神経系細胞がグリア細胞であり、細胞活性が増殖能及び／又は生存能であることが、特に好ましい。 Further, in the above screening method, for example, the central nervous system cell is a brain neuron and the cell activity is neurite outgrowth and / or viability, or the central nervous system cell is a glial cell, and the cell activity Is particularly proliferative and / or viable.
ここで、中枢神経系細胞の細胞活性としては、限定はされず、各々の中枢神経系細胞の機能及び特性等に関わる種々の活性を挙げることができる。種々の活性の測定方法は、公知の方法が採用できる。 Here, the cell activity of the central nervous system cell is not limited, and various activities related to the function and characteristics of each central nervous system cell can be exemplified. Known methods can be adopted as methods for measuring various activities.
中枢神経系細胞が脳神経細胞であるときは、脳神経細胞に候補物質を接触させた場合に、神経突起伸張能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞等と比較して、高い伸長率（伸長速度）を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。また、脳神経細胞に候補物質を接触させた場合に、生存能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞等と比較して、長い寿命又は高い生存率を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。 When the central nervous system cells are cerebral neurons, when the candidate substance is brought into contact with the cerebral nerve cell, the measurement result of the neurite outgrowth ability is higher than the cells etc. that do not contact the candidate substance. Can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. In addition, when a candidate substance is brought into contact with a cerebral nerve cell, if the viability measurement result can be evaluated as having a long lifespan or a high survival rate as compared with a cell that is not brought into contact with the candidate substance, the candidate substance is neurodegenerated. It can be selected as a therapeutic agent for diseases.
一方、中枢神経系細胞がグリア細胞であるときは、グリア細胞に候補物質を接触させた場合に、増殖能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞等と比較して、高い増殖率（増殖速度）を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。また、グリア細胞に候補物質を接触させた場合に、生存能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞等と比較して、長い寿命又は高い生存率を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。 On the other hand, when the central nervous system cell is a glial cell, when the candidate substance is brought into contact with the glial cell, the measurement result of the proliferation ability is higher than that of the cell etc. where the candidate substance is not contacted. Can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. In addition, when a candidate substance is brought into contact with glial cells, if the measurement result of viability can be evaluated as having a long lifespan or a high survival rate compared to cells etc. that do not contact the candidate substance, the candidate substance is neurodegenerated. It can be selected as a therapeutic agent for diseases.
４．副作用の検定方法
(１) 非ヒト動物を用いる方法
上述したスクリーニング方法により得られる神経変性疾患の治療薬が優れた効能を示すものであっても、投与した動物に悪影響を及ぼす副作用を持つ場合は有用なものとは言い難いため、上記薬物の副作用の検定は重要である。同様に、公知の又は別途開発された神経変性疾患の治療薬に関しても、その副作用の検定は重要である。そこで本発明は、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物を用いた神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法を提供する。ここで、神経変性疾患としては、前記３.の項に記載した疾患と同様のものが挙げられる。
4). Test method for side effects
(1) Method using a non-human animal Even if the therapeutic agent for neurodegenerative diseases obtained by the screening method described above exhibits excellent efficacy, it is useful if it has side effects that adversely affect the administered animal. Therefore, it is important to test for side effects of the above drugs. Similarly, with respect to known or separately developed therapeutic agents for neurodegenerative diseases, the side effect assay is important. Therefore, the present invention provides a method for assaying side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases using mutant β-syn transgenic non-human animals. Here, examples of the neurodegenerative disease include the same diseases as those described in the above section 3.
本発明の検定方法は、以下の(a)及び(b)の工程を含むものである。
(a) 被験動物に、神経変性疾患の治療薬を投与する工程（投与工程）
(b) 被験動物と対照動物とを比較評価する工程、又は被験動物における副作用の有無を検出する工程（評価工程）
なお、本発明の検定方法は、必要に応じ、他の工程を含んでいてもよい。
The assay method of the present invention includes the following steps (a) and (b).
(a) A step of administering a therapeutic agent for a neurodegenerative disease to a test animal (administration step)
(b) A step of comparing and evaluating the test animal and the control animal, or a step of detecting the presence or absence of side effects in the test animal (evaluation step)
The assay method of the present invention may include other steps as necessary.
本発明においては、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）,（+/-）〕を被験動物とし、非トランスジェニック非ヒト動物（-/-）、又は変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物〔（+/+）,（+/-）〕を対照動物として用いて、両動物の副作用の有無を比較検討することもできる。
以下に、上記各工程について説明する。
In the present invention, a mutant β-syn transgenic non-human animal [(+ / +), (+/-)] is used as a test animal, a non-transgenic non-human animal (− / −), or a mutant β- Syn transgenic non-human animals [(+ / +), (+/−)] can be used as control animals to compare the presence or absence of side effects in both animals.
Below, each said process is demonstrated.
(a) 投与工程
使用する被験動物及び対照動物については、前記スクリーニング方法と同様である。
各薬物の投与は、その種類に応じ、経口的又は非経口的に行うことができ、投与方法及び投与条件等についても、被験動物の種類や状態を考慮して適宜設定することができる。また各薬物は、薬学的に許容し得る塩又は水和物の状態で投与してもよいし、さらに、薬学的に許容し得る公知の担体とともに投与してもよく、限定はされない。
(a) Administration step Test animals and control animals to be used are the same as in the above screening method.
Administration of each drug can be performed orally or parenterally depending on the type, and the administration method and administration conditions can be appropriately set in consideration of the type and condition of the test animal. Each drug may be administered in the form of a pharmaceutically acceptable salt or hydrate, or may be administered together with a known pharmaceutically acceptable carrier, and is not limited.
(b) 評価工程
副作用の有無に関しては、被験動物及び対照動物について、あるいは薬物の投与前後の被験動物について、例えば、体重変化、造血機能、及び生殖機能からなる群より選ばれる少なくとも１つが挙げられる。対照非ヒト動物と、神経変性疾患の治療薬を投与した被験動物とについて、これら評価項目を比較することにより、当該治療薬による副作用の有無、及び副作用の種類や症状の程度等について容易に検定できる。
各評価の方法（測定方法等）は、公知の手段及び手順により行うことができるが、以下に例示して説明する。
(b) Evaluation process Regarding the presence or absence of side effects, for example, at least one selected from the group consisting of body weight change, hematopoietic function, and reproductive function for the test animal and the control animal, or for the test animal before and after administration of the drug. . By comparing these evaluation items between control non-human animals and test animals that have been administered therapeutic drugs for neurodegenerative diseases, it is easy to test for the presence or absence of side effects, the types of adverse reactions, and the degree of symptoms. it can.
Each evaluation method (measurement method and the like) can be performed by known means and procedures, and will be described below by way of example.
＜体重変化についての比較評価＞
本評価方法では、被験動物が、神経変性疾患の治療薬を投与した後、非投与群である対照動物と同様の飼育条件において、対照動物と比べて体重変化に違いが見られるかを検定する。
<Comparison evaluation about weight change>
In this evaluation method, after the test animal is administered a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, it is tested whether there is a difference in weight change compared to the control animal under the same breeding conditions as the non-administration group control animal. .
＜造血機能についての比較評価＞
本評価方法では、被験動物が、神経変性疾患の治療薬を投与した後も末梢血中の各種血液細胞（赤血球、リンパ球及び好中球等）の存在比率と絶対数が正常の範囲にあるかどうかを検定する。
<Comparative evaluation of hematopoietic function>
In this evaluation method, the abundance ratio and absolute number of various blood cells (red blood cells, lymphocytes, neutrophils, etc.) in the peripheral blood are within the normal range even after the test animal has administered the therapeutic agent for the neurodegenerative disease. Test whether or not.
＜生殖機能についての比較評価＞
本評価方法では、10週齢を越えた雄と雌の生殖能を検定する。対照動物は、少なくとも遺伝的背景がC57BL/6である限りは、雄も雌も次世代の子供をつくることができるため、神経変性疾患の治療薬を投与した被験動物と有効に比較できる。
<Comparison evaluation of reproductive function>
In this evaluation method, the fertility of males and females over 10 weeks of age is tested. As long as at least the genetic background is C57BL / 6, the control animal can make a next-generation child, so that it can be effectively compared with a test animal administered a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
(２) 中枢神経系細胞を用いる方法
また本発明は、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞を用いた神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法を提供することができる。前記４.(１)の非ヒト動物を用いる方法が、in vivo法であるのに対し、中枢神経系細胞を用いる本方法は、in vitro法と言うことができる。
(2) Method Using Central Nervous System Cells The present invention also provides a method for assaying side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases using central nervous system cells derived from mutant β-syn transgenic non-human animals. Can do. While the method using a non-human animal in the above 4. (1) is an in vivo method, this method using a central nervous system cell can be said to be an in vitro method.
上記検定方法において、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞としては、当該中枢神経系細胞の初代培養細胞（初代培養中枢神経系細胞）を用いることが好ましい。また、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞としては、胎生期にある当該非ヒト動物由来の中枢神経系細胞が好ましい。胎生期の期間については、前記３.(２)で述べた通りである。 In the above assay method, as a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal, it is preferable to use a primary cultured cell (primary cultured central nervous system cell) of the central nervous system cell. Moreover, as a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal, a central nervous system cell derived from the non-human animal in the embryonic stage is preferable. The embryonic period is as described in 3. (2) above.
上記検定方法は、詳しくは、変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物由来の中枢神経系細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定するというものである。また、当該方法のうち、より好ましい態様としては、例えば、胎生期にある変異型β-synトランスジェニック非ヒト動物から採取された初代培養中枢神経系細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法が挙げられる。 Specifically, the above-described assay method comprises contacting a central nervous system cell derived from a mutant β-syn transgenic non-human animal with a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, measuring the cellular activity of the cell, and using the obtained measurement result as an index. As a test for the side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases. Further, among the methods, as a more preferable embodiment, for example, a therapeutic drug for neurodegenerative diseases is contacted with primary cultured central nervous system cells collected from a mutant β-syn transgenic non-human animal in the embryonic stage. Examples include a method of measuring the cell activity of the cell and assaying the side effect of the therapeutic agent for neurodegenerative disease using the obtained measurement result as an index.
さらに、上記検定方法においては、例えば、中枢神経系細胞が脳神経細胞であり、細胞活性が神経突起伸張能及び／又は生存能であるか、あるいは、中枢神経系細胞がグリア細胞であり、細胞活性が増殖能及び／又は生存能であることが、特に好ましい。
ここで、中枢神経系細胞の細胞活性については、前記３.(２)で述べた通りである。
Further, in the above assay method, for example, the central nervous system cell is a brain neuron and the cell activity is neurite outgrowth and / or viability, or the central nervous system cell is a glial cell, and the cell activity Is particularly proliferative and / or viable.
Here, the cellular activity of the central nervous system cells is as described in 3. (2) above.
中枢神経系細胞が脳神経細胞であるときは、脳神経細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、神経突起伸張能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞等と比較して、同等又は高い伸長率（伸長速度）を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。また、脳神経細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、生存能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞等と比較して、同等若しくは長い寿命又は同等若しくは高い生存率を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。 When the central nervous system cell is a cerebral nerve cell, when the therapeutic agent for neurodegenerative disease is brought into contact with the cerebral nerve cell, the measurement result of the neurite outgrowth ability is compared with a cell that does not contact the therapeutic agent, etc. If it can be evaluated that it has an equivalent or high elongation rate (elongation rate), it can be determined that the therapeutic agent has no side effects. In addition, when a neurodegenerative disease therapeutic agent is brought into contact with cerebral neurons, the measurement result of viability has an equivalent or long life span or an equivalent or high survival rate compared to cells etc. that do not contact the therapeutic agent. Then, if it can be evaluated, it can be determined that the therapeutic agent has no side effects.
一方、中枢神経系細胞がグリア細胞であるときは、グリア細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、増殖能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞等と比較して、同等又は高い増殖率（増殖速度）を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。また、グリア細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、生存能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞等と比較して、同等若しくは長い寿命又は同等若しくは高い生存率を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。 On the other hand, when the central nervous system cell is a glial cell, when the therapeutic agent for neurodegenerative disease is brought into contact with the glial cell, the measurement result of the proliferative ability is compared with a cell that does not contact the therapeutic agent, etc. If it can be evaluated that the growth rate (growth rate) is equivalent or high, it can be determined that the therapeutic agent has no side effects. In addition, when a glial cell is contacted with a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, the measurement result of viability has an equivalent or long life span or an equivalent or high survival rate compared to a cell that does not contact the therapeutic agent. Then, if it can be evaluated, it can be determined that the therapeutic agent has no side effects.
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
＜トランスジェニックマウス（Tgマウス）の作製＞
野生型β-synの第123番目のアミノ酸であるプロリンをヒスチジンに置換し得る合成プライマーを用いて、野生型β-syn cDNA（pCEP-β-synプラスミド, Takenouchi et al., Mol. Cell Neurosci., 2001）を鋳型にしたPCRを行った。PCRに用いたプライマー、反応液組成及び反応条件は、以下の通りである。
<Production of transgenic mice (Tg mice)>
Using a synthetic primer capable of substituting proline, the 123rd amino acid of wild type β-syn, with histidine, wild type β-syn cDNA (pCEP-β-syn plasmid, Takenouchi et al., Mol. Cell Neurosci. , 2001) as a template. The primers, reaction solution composition, and reaction conditions used for PCR are as follows.
＜プライマー＞
Fプライマー：5'-ATGGACGTGTTCATGAAGGGCCTGTC-3' （配列番号３）
Rプライマー：5'-CTACGCCTCTGGCTCATACTCCTGATATTCCTCCTGGTGTGGG-3' （配列番号４）
<Primer>
F primer: 5'-ATGGACGTGTTCATGAAGGGCCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 3)
R primer: 5'-CTACGCCTCTGGCTCATACTCCTGATATTCCTCCTGG T GTGGG-3 '(SEQ ID NO: 4)
＜反応液組成＞
テンプレート（pCEP-β-syn；10ng/μl）： 1μl
10×buffer： 5μl
2.5mM dNTP： 4μl
Pfuポリメラーゼ： 0.5μl
Fプライマー (10μM)： 2.5μl
Rプライマー (10μM)： 2.5μl
滅菌水： 34.5μl
合計： 50μl
<Reaction solution composition>
Template (pCEP-β-syn; 10ng / μl): 1μl
10 × buffer: 5μl
2.5 mM dNTP: 4 μl
Pfu polymerase: 0.5 μl
F primer (10μM): 2.5μl
R primer (10μM): 2.5μl
Sterile water: 34.5μl
Total: 50μl
＜反応条件＞
94℃で5分間加熱後、「熱変性・解離：94℃（30sec）→アニーリング：55℃（30sec）→合成・伸長：72℃（30sec）」を1サイクルとして計35サイクル行い、72℃で10分間保温後に4℃で冷却した。
<Reaction conditions>
After heating at 94 ° C for 5 minutes, "thermal denaturation / dissociation: 94 ° C (30 sec) → annealing: 55 ° C (30 sec) → synthesis / extension: 72 ° C (30 sec)" is performed for 35 cycles in total, at 72 ° C After incubating for 10 minutes, the mixture was cooled at 4 ° C.
上記PCRの結果、増幅産物として、変異型β-syn P123H（野生型β-synのアミノ酸配列において第123番目のアミノ酸がヒスチジンに置換されたタンパク質；配列番号６）をコードするcDNA（配列番号５）を得た。 As a result of the PCR, as an amplification product, a cDNA encoding a mutant β-syn P123H (a protein in which the 123rd amino acid in the amino acid sequence of wild-type β-syn is replaced with histidine; SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 5) )
得られたcDNAを平滑末端処理し、処理後のcDNAを、Thy-1プロモーターを含むThy-1カセット型プラスミド pTSC21k（Novartis社、Basel、Switzerland）のXhoI部位に挿入することにより、Thy-1プロモーターに誘導されるβ-syn P123H発現ベクター、すなわちpTSC21k β-syn P123Hを構築した（図３Ａ）。常法により、構築した発現ベクター中に、変異型β-syn P123Hの全長を含むシークエンスが挿入されていることを確認した。
また、常法により、B103神経芽細胞に構築した発現ベクターを導入して形質転換体を得、一過性発現させることにより、β-syn P123HのmRNA及びタンパク質レベルにおける発現を確認した。
The resulting cDNA is treated with a blunt end, and the treated cDNA is inserted into the XhoI site of a Thy-1 cassette type plasmid pTSC21k (Novartis, Basel, Switzerland) containing the Thy-1 promoter to obtain a Thy-1 promoter. A β-syn P123H expression vector induced by the above, ie pTSC21k β-syn P123H was constructed (FIG. 3A). By a conventional method, it was confirmed that a sequence containing the full length of the mutant β-syn P123H was inserted into the constructed expression vector.
Moreover, the expression vector constructed in B103 neuroblasts was introduced by a conventional method to obtain a transformant and transiently expressed to confirm the expression of β-syn P123H at the mRNA and protein levels.
このようにして構築した発現ベクター（pTSC21k β-syn P123H）をEcoRIで切断し、その結果生じたThy-1プロモーター／β-syn P123H 発現ユニットを単離、精製した。 The thus constructed expression vector (pTSC21k β-syn P123H) was cleaved with EcoRI, and the resulting Thy-1 promoter / β-syn P123H expression unit was isolated and purified.
精製後の発現ユニットを、マウス受精卵（C57BL/6）に注入し（マイクロインジェクション）、これらを数匹の偽妊娠処理した仮親マウスの子宮に戻すことにより、数週間後に数十匹のマウスが誕生させた。得られたマウスの尾を切断し、常法により、ゲノムDNAを調製してPCRによるタイピングを行うことで、ヒトβ-syn P123Hのトランスジーンが存在することを確認した。さらに、β-syn P123H cDNAを32P標識したプローブを用いてサザンブロットを行うことにより、β-syn P123Hのトランスジーンの発現量を評価した。 The purified expression unit was injected into mouse fertilized eggs (C57BL / 6) (microinjection), and these were returned to the uterus of several pseudopregnant treated foster mothers. I was born. The tail of the obtained mouse was cut, and genomic DNA was prepared and PCR-typed by a conventional method to confirm the presence of the human β-syn P123H transgene. Furthermore, the expression level of β-syn P123H transgene was evaluated by performing Southern blotting using a probe labeled with 32P of β-syn P123H cDNA.
以上のようにして、ヒトβ-syn P123Hのトランスジーンを確認し得た７匹のマウスをF0マウスとして系統化し（A〜Gラインと命名）、さらに、F0マウスと野生型マウス（C57BL/6）とを交配して得られるF1マウスに対し、β-syn P123HのmRNA及びタンパク質レベルにおける発現をそれぞれ、PCR及びウエスタンブロット法で解析して、高発現、中発現、及び低発現の系統に分類した。F2以降のマウスに対しても同様の実験を繰り返し、前記トランスジーンが安定して存在し、タンパク質レベルにおける発現量も一定に保たれていることを確認した。 Seven mice that could confirm the human β-syn P123H transgene as described above were systematized as F0 mice (named A to G lines), and F0 mice and wild-type mice (C57BL / 6 ) And F1 mice obtained by mating with β-syn P123H at the mRNA and protein levels, analyzed by PCR and Western blot, respectively, and classified into high, medium and low expression lines did. Similar experiments were repeated for mice after F2, and it was confirmed that the transgene was stably present and the expression level at the protein level was kept constant.
＜Tgマウスの解析＞
生後6、12、18ヶ月のマウスに対し、所定のガイドラインに沿って、安楽死させ、大脳半球を摘出し、左右に分けた。そのうち一方は、病理組織学実験に用い、もう一方は、後日生化学実験に用いるために凍結保存した。
<Analysis of Tg mice>
6-, 12- and 18-month-old mice were euthanized according to prescribed guidelines, and the cerebral hemispheres were removed and divided into left and right. One was used for histopathological experiments and the other was stored frozen for later use in biochemical experiments.
病理組織学実験に用いる方の半球は、ブアン固定液にて一晩固定した。脱水後、パラフィン包埋し、大脳皮質、大脳基底核、黒質、海馬、小脳など脳全体像が観察できるように、4μmのパラフィン切片を作製した。 The hemisphere used for the histopathological experiment was fixed overnight with Buan fixative. After dehydration, it was embedded in paraffin, and 4 μm paraffin sections were prepared so that the entire brain such as cerebral cortex, basal ganglia, substantia nigra, hippocampus and cerebellum could be observed.
作製した切片を用い、まず、一次抗体として、抗β-syn P123H特異抗体、抗β-syn抗体、及び抗α-syn抗体を用いて、免疫組織化学的検討を行った。切片を脱パラフィン及び脱水後、マイクロウェーブ処理及び内在性ペルオキシダーゼの不活化を行い、その後、上記一次抗体にて一晩反応させた。切片を洗浄後、ビオチン化2次抗体を反応させ、さらに、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体と反応させた後、DABにて発色させた。ヘマトキシリンで核染色を行った後、切片を脱水、透徹、封入し、明視野の光学顕微鏡にて染色像を観察した。特に、β-syn P123H、α-synの細胞内異常集積、レビー小体様の封入体の形成などの所見に焦点を当てて観察した。その結果、大脳基底核を中心にした領域に、レビー小体様の封入体が形成されているのが複数のラインのマウスにおいて確認された。 Using the prepared sections, first, immunohistochemical examination was performed using an anti-β-syn P123H specific antibody, an anti-β-syn antibody, and an anti-α-syn antibody as primary antibodies. The sections were deparaffinized and dehydrated, then treated with microwaves and inactivated endogenous peroxidase, and then reacted overnight with the primary antibody. After washing the section, it was reacted with a biotinylated secondary antibody, further reacted with an avidin-biotin-peroxidase complex, and then developed with DAB. After nuclear staining with hematoxylin, the sections were dehydrated, cleared and sealed, and the stained images were observed with a bright-field optical microscope. In particular, we focused on findings such as abnormal intracellular accumulation of β-syn P123H and α-syn, and formation of Lewy body-like inclusions. As a result, it was confirmed in several lines of mice that Lewy body-like inclusions were formed in the region centered on the basal ganglia.
次に、蛍光免疫組織染色にてβ-syn P123H、α-syn、及び抗ユビキチン抗体（ケミコン社）などの二重染色を行った。切片を脱パラフィン、脱水後、マイクロウェーブ処理を行い、β-syn P123H特異抗体（ラビット）とα-syn抗体（マウスモノクローナル抗体）、あるいはβ-syn P123H特異抗体（ラビット）とユビキチン抗体（マウスモノクローナル抗体）を混合し、一晩反応させた。切片洗浄後、Alexa-fluor-488標識抗マウス2次抗体およびAlexa-fluor-555標識抗ラビット2次抗体を混合し、１時間反応させた。DAPIにて核を染色した後、水系封入剤で封入し、レビー小体様の封入体などに重点をおいて、レーザー照射による共焦点顕微鏡（オリンパス社、FV1000）を用いて観察、撮影した。 Next, double staining of β-syn P123H, α-syn, and an anti-ubiquitin antibody (Chemicon) was performed by fluorescent immunohistochemical staining. After deparaffinization, dehydration, and microwave treatment, β-syn P123H specific antibody (rabbit) and α-syn antibody (mouse monoclonal antibody), or β-syn P123H specific antibody (rabbit) and ubiquitin antibody (mouse monoclonal) Antibody) were mixed and allowed to react overnight. After washing the sections, Alexa-fluor-488 labeled anti-mouse secondary antibody and Alexa-fluor-555 labeled anti-rabbit secondary antibody were mixed and reacted for 1 hour. After staining the nuclei with DAPI, they were encapsulated with an aqueous encapsulant and observed and photographed using a laser confocal microscope (Olympus, FV1000) with emphasis on Lewy body-like inclusions.
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成コンストラクト
Sequence number 3: Synthetic DNA
Sequence number 4: Synthetic DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 6: synthetic construct
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該変異型βシヌクレインは、(a)野生型βシヌクレインのアミノ酸配列において第１２３番目のアミノ酸がヒスチジンに置換されたアミノ酸配列からなるものであるか、又は(b)該置換されたアミノ酸配列のうち第１２３番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであり、
該非ヒト動物の中枢神経系細胞において発現する変異型βシヌクレインが、自己凝集促進活性を有するものである、
前記非ヒト動物。 A transgenic non-human animal into which a promoter that functions in a central nervous system cell and a mutant β-synuclein gene are introduced,
It said variant β-synuclein, (a) either the 123 th amino acids in the amino acid sequence of the wild-type β-synuclein are those comprising the amino acid sequence is substituted with histidine, or (b) of the substituted amino acid sequence It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids except the 123rd amino acid are deleted, substituted or added ,
The mutant β-synuclein expressed in the central nervous system cells of the non-human animal has self-aggregation promoting activity.
Said non-human animal.
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