JP4171512B2

JP4171512B2 - 魚油を用いた治療に対する感受性に及ぼす遺伝子型の影響

Info

Publication number: JP4171512B2
Application number: JP2006506160A
Authority: JP
Inventors: フランシスグリンブル，ロバート; チャールズカルダー，フィリップ; マーティンホウェル，ウィリアム
Original assignee: University of Southampton
Current assignee: University of Southampton
Priority date: 2003-04-22
Filing date: 2004-04-21
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2024-04-21
Also published as: EP1616030A1; CA2523377A1; US20100183734A1; US20160298190A1; AU2004233299B2; AU2004233299A1; JP2006525009A; US20060246454A1; WO2004094665A1; CN1806054A

Description

発明の分野
本発明は、栄養補助食品を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性を評価する方法に関する。

発明の背景
ヒトの身体における炎症は、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）により媒介される。TNF-αは、感染後や傷害後に急速に現れる一群の前炎症性サイトカインの１つである（Beutlerら, Crit Care Med 21:423-35 (1993)およびLinら, Surgery 127:117-26 (2000)）。TNF-αは、広範にわたる作用を有する。TNF-αは、赤身（lean）組織および脂肪組織の減失を引き起こし、体温を上昇させ、食欲を低下させ、さまざまな免疫調節サイトカインや酸化剤分子の産生を促進する（Grimble, Clin Sci 91:121-30 (1996)）。これらの作用は、侵入する病原体にとって不利な環境を作り出し、内在性供給源に由来する免疫系に対して基質をもたらし、免疫系の活性を亢進させ修正する。したがって、TNF-αは、身体が病原体の侵入に耐えるようにさせる上で極めて重要な役割を担っている。

しかし、過剰であったりタイミングが悪かったりするTNF-αは、敗血症（van der Pollら, Infect Dis Clin North Am. 13:413-26 (1999)）、髄膜炎（Westendorpら, Lancet 349:170-3 (1997)）およびマラリア（Knightら, Proc Assoc Am Physicians 111:290-8 (1999)）による死亡や発病に深く関与する。また、TNF-αは、関節リウマチ（Mainiら, Ann Rev Med 51:207-29 (2000)）や炎症性腸疾患（Murchら, Gut 32:913-7 (1991)）などの炎症性疾患の病理、アテローム斑の発生（Ross, Nature 362:801-9 1993）および移植組織の拒絶（Kutukculerら, Transpl Int. 8:45-50 (1995)）においても重要な役割を担っている。

n-3多価不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）を豊富に含んでいる魚油は、多くの炎症動物モデルにおいて抗炎症作用を示し（Calder, Ann Nutr Metab 41:203-34 (1997)およびGrimble, Proc Nutr Soc. 57:535-42 (1998)）、そして関節リウマチ（Calder & Zurier Curr Opin Clin Nutr Metab Care 4:115-21 (2001))、クローン病（Belluziら, N Engl J Med 334:1557-616 (1996)）および乾癬（Mayserら, J Am Acad Dermatol 38:539-47 (1998)）において抗炎症作用をもたらすことが示されている。カプセル封入した魚油がしばしば栄養補助食品として摂取されている。

報告されている魚油の抗炎症作用の１つは、末梢血単核細胞（PBMC）によるTNF-αの産生の低下に認められる（Endresら, N Engl J Med 320:265-71 (1989)）。しかし、魚油を抗炎症剤として調べた研究では、それが全ての個体において有効であることは認められていない。例えば、健常な被験体由来のPBMCによるTNF-α産生に対する魚油の効果を調べた11の研究（Endresら, N Engl J Med 320:265-71 (1989); Schmidtら, Scand J Clin Lab Med 56:87-92 (1996); Cooperら, Clin Nutr 12:321-8 (1993); Blokら, Eur J Clin Invest 27:1003-8 (1997); Meydaniら, J Clin Invest 92:105-13 (1993); Molvigら, Scan J Immunol 34:399-410 (1991); Meydaniら, J Nutr 121:547-55 (1991); Caugheyら, Am J Clin Nutr 63:116-22 (1996); Yaqoobら, Eur J Clin Nutr 30:399-410 (2000); Gallaiら, J Neuroimmunol 56:143-53 (1995)、およびKelleyら, Lipids 34:317-24 (1999)）のうち、抑制効果を報告したものは６つだけである（Endresら, N Engl J Med 320:265-71 (1989); Meydaniら, J Clin Invest 92:105-13 (1993); Meydaniら, J Nutr 121:547-55 (1991); Caugheyら, Am J Clin Nutr 63:116-22 (1996); Gallaiら, J Neuroimmunol 56:143-53 (1995)およびKelleyら, Lipids 34:317-24 (1999)）。

健常な男性および閉経後の女性では、PBMCからのTNF-αの産生は目立った定常性を示し、個体はそれぞれ特徴的なサイトカイン産生レベルを示す（Jacobら, PNAS 87:1233-7 (1990)）。しかし、TNF-αの産生は個体間で非常にばらつきがある。TNF-αおよびリンホトキシン-α（LT-α、またTNF-βとしても知られる）の遺伝子のプロモーター領域における多型は、炎症刺激後に産生されるTNF-αの量に影響を及ぼすと考えられる（Wilsonら, J Inflamm 45:1-12 (1995)）。このことは、臨床的に重要と思われる。例えば、TNF-α -308（TNF2）アレルについてホモ接合である個体は、それよりも一般的なTNF1アレルについてヘテロ接合またはホモ接合である個体よりも、マラリア関連の死亡率が７倍であり、重篤な神経学的症状を有する（Mc Guireら, Nature 371:508-11 (1994)）。LT-α +252（TNFB2）アレルに対してホモ接合である敗血症を発症している外科患者は、死亡率が、TNFB1アレルに対してホモ接合である個体よりも3.5倍高く、ヘテロ接合である個体よりも2.4倍高かった（Stuberら, Crit Care Med 24:381-4 (1996)）。

別のサイトカインであるインターロイキン-6（IL-6）のレベルもまた、魚油治療に対する個体の応答を決定するものとみなされている。文献（Fishmanら, J. Clin Invest 102:1369-1376 (1998)およびVilluendasら, J. Clin Endocrinol Metab 87:1134-1141 (2002)）によれば、IL-6遺伝子の-174位にGG塩基対を有する個体は高レベルのIL-6を産生するが、この位置にCC塩基対を有する個体は低レベルのIL-6を産生する。体内でのIL-6の産生は、個体が体験する炎症の総合レベルを促進する。しかし、従来技術では、-174位における特定の遺伝子型はTNF産生と関連付けられていない。-174位における遺伝子型と、炎症レベルと、TNF産生との関係を分析することにより、魚油を、それに最も応答する見込みが高い個体に、より正確に的を絞って用いることが可能になるであろう。

TNF-α産生に及ぼす魚油の効果についての全ての研究で、TNF-α産生において標準偏差が大きいことが報告されており、そのことは研究対象集団では遺伝子型が入り混じっている可能性があることを示唆していた。TNF-α遺伝子、LT-α遺伝子およびIL-6遺伝子における多型が、魚油のTNF-α産生抑制能に影響するか否かについては判っていない。これらの相互作用を理解することにより、文献におけるその不一致を説明できるかもしれず、また、炎症性疾患に対する魚油治療をより特異的に的を絞って用いることが可能になると思われる。

魚油は、炎症性疾患の安価な治療である。しかし、毎回の栄養補助食品に適用すれば成功の保証がない患者にとって大きな経済的支出となりうる場合には、そのような栄養補助食品を摂取して「それが役立つかどうかを調べる」べきと各患者に提案するよりも、魚油を、それが有益である可能性が高い患者に絞って用いることができれば、その方が好ましいであろう。

発明の要旨
本発明者らは、TNF-α産生に対する魚油の炎症抑制作用に対する個体の感受性が、TNF-α -308、LT-α +252およびIL-6 -174の一塩基多型（SNP）によりコードされるかまたはそれらと関連する遺伝的多様性（genetic variation）と関連することを見出した。また、TNF-α産生に対する魚油の炎症抑制作用が、細胞による固有のTNF-α産生レベルとも関連することが示された。

したがって、本発明は、その第１の態様において、魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性の評価方法であって、その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し、そこから、その個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定することを含む上記方法を提供する。

第２の態様において、本発明は、魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性の評価方法であって、
a)その個体の固有のTNF-α状態を決定し；
b)その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し；そして
そこから、その個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定する、
ことを含む上記方法を提供する。

別の態様において、本発明は、患者の炎症性疾患の治療方法であって、魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性を評価し、そしてその個体を適当量の魚油を用いて治療することを含み、ただし、その評価が、
a)その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し；
b)そこから、その個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定する、
ことを含む、上記方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、患者の炎症性疾患の治療方法であって、魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性を評価し、そしてその個体を適当量の魚油を用いて治療することを含み、ただし、その評価が、
a)その個体の固有のTNF-α状態を決定し；
b)その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し；そして
c)そこから、その個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定する、
ことを含む、上記方法を提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、その第１の態様において、個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定することを必要とする。

TNF-α（TNF1、TNF2）遺伝子およびLT-α（TNFB1、TNFB2）遺伝子における多型により、いずれの場合にも、ホモ接合性TNF1/1もしくはTNFB1/1、ホモ接合性TNF2/2およびTNFB2/2、またはヘテロ接合性TNF1/2およびTNFB1/2、という３種の遺伝子型が生じる。同様に、IL-6遺伝子については、個体は、ホモ接合性CCもしくはGGまたはヘテロ接合性CGのいずれかである。したがって本発明では、個体は、次の遺伝子型のうちの１つを有しうる。
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB1/1：ヘテロ接合性IL-6 CG
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF1/1：ホモ接合性TNFB2/2：ヘテロ接合性IL-6 CG
ホモ接合性TNF1/1：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF1/1：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF1/1：ヘテロ接合性TNFB1/2：ヘテロ接合性IL-6 CG
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB1/1：ヘテロ接合性IL-6 CG
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF2/2：ホモ接合性TNFB2/2：ヘテロ接合性IL-6 CG
ホモ接合性TNF2/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 CC
ホモ接合性TNF2/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 GG
ホモ接合性TNF2/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ヘテロ接合性IL-6 CG
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 CC
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB1/1：ホモ接合性IL-6 GG
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB1/1：ヘテロ接合性IL-6 CG
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 CC
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB2/2：ホモ接合性IL-6 GG
ヘテロ接合性TNF1/2：ホモ接合性TNFB2/2：ヘテロ接合性IL-6 CG
ヘテロ接合性TNF1/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 CC
ヘテロ接合性TNF1/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ホモ接合性IL-6 GG、または
ヘテロ接合性TNF1/2：ヘテロ接合性TNFB1/2：ヘテロ接合性IL-6 CG。

理論上、上記は可能性のある全ての遺伝子組合せであるが、実際には、それらの組合せの全てが生じるわけではない。例えば、連鎖不平衡を生じる幾つかの遺伝子の連鎖により、特定の組合せは形成されないことがある。このことに加えて、TNF2/2という遺伝子は非常に稀であり、人口の10％未満にしか存在しない。

本発明の１つの好ましい実施形態では、LT-α遺伝子の遺伝子型がヘテロ接合性TNFB1/2であることが好ましい。

本発明の別の好ましい実施形態では、IL-6遺伝子における遺伝子型がホモ接合性GGであることが好ましい。

本発明のさらに好ましい実施形態では、LT-α遺伝子およびIL-6遺伝子における遺伝子型が、それぞれヘテロ接合性TNFB1/2およびIL-6 GGであることが好ましい。

本発明のこの態様の好ましい実施形態では、TNF-α、LT-αおよびIL-6アレルのうちの１つにおける遺伝子型を決定する。しかし、さらに好ましくは、TNF-α、LT-αおよびIL-6アレルのうち２つ以上について遺伝子型を決定し、最も好ましくは、LT-αおよびIL-6アレルの両者の遺伝子型を決定する。

本発明は、その第２の態様において、個体の固有のTNF-α状態を決定することを必要とする。

個体の固有のTNF-α状態とは、その個体の白血球がもつTNF産生能の測定値である。無病状態であるか、または実質的に無病状態である個体の固有のTNF-α状態は、目立った定常性を示す。TNF-αの産生は、一般に、その個体の年齢や性別には左右されない。無病状態であるか、または実質的に無病状態である、とは、個体が、いかなるタイプの炎症性疾患にも罹患していないこと、または有意なレベルの炎症性疾患に罹患してないことを意味する。したがって、個体の固有のTNF-α状態は、好ましくは、その個体がいかなるタイプの炎症性疾患にも罹患していないか、または有意なレベルの炎症性疾患に罹患していないときに、決定する。

個体の固有のTNF-α状態の決定は、当業者に公知の手順を用いて行うことができる。典型的には、全血のサンプルを採取し、そこから末梢血単核細胞（PBMC）を単離する。PBMCの単離技術は公知であり、例えば、全血をヘパリンリチウムで処理し、次に遠心分離してPBMCを単離した後、例えばEASIA（登録商標）ELISAキット（Biosource International, Nivelles, Belgium）などの標準的方法を用いてTNF-α濃度を測定することができる。

TNF-α産生個体は、それらのPBMCにより産生されるTNF-αの濃度に応じて、多くの群に分類され、それによってそれらの固有のTNF-α状態を規定することができる。一般に、本発明の目的のためには、産生個体を３つの群（例えば高度産生個体、中度産生個体または低度産生個体）に分類することが好ましい。PBMCにより産生されるTNF-αの正確な量は、上記の３つの群を規定する上で必須ではないが、一般に、高度産生個体は、細胞１×10⁹個のインキュベート物が約850〜2500ng/LのTNF-α濃度を有し、中度産生個体は、細胞１×10⁹個のインキュベート物が約2500〜5000ng/LのTNF-α濃度を有し、高度産生個体は、細胞１×10⁹個のインキュベート物が約5000〜14000ng/LのTNF-α濃度を有することが好ましい。

以下の表１に、TNF-α産生に対する魚油の効果を示す。

TNF-α産生についての魚油の投与前と投与後の値の差は、対応のあるスチューデントｔ検定を用いて求めた。上記の結果から、魚油投与に対する感受性は、投与前のすなわち固有のTNF-α産生の影響を受けることが明らかである。最高三分位では、平均TNF-α産生は43％低減した。中位三分位では、TNF-α産生は低減したが有意な量ではなく、最低三分位では、TNF-α産生は160％増大した。

本発明者らは、上記の結果から鑑みて、固有のTNF-α産生から「低度産生個体」のカテゴリーに入れられる個体、すなわち細胞１×10⁹個のインキュベート物が約850〜2500ng/LのTNF-αを示す個体は、魚油を用いた治療に対して十分に応答する見込みがないものとした。逆に、固有のTNF-α産生から「高度産生個体」のカテゴリーに入れられる個体、すなわち細胞１×10⁹個のインキュベート物が約5000〜14000ng/LのTNF-αを示す個体は、魚油を用いた治療に対して十分に応答する見込みがある。

そうした方法における使用に適したゲノムサンプルは、任意の適当な依頼者または患者の細胞サンプルから単離することができる。好都合には、DNAを頬（口腔）細胞から単離することが好ましい。それにより、細胞を簡単かつ無痛で採取できる。

細胞は、プラスチック製もしくは紙製のマトリックス「ブラシ」を備えた使い捨て掻き取り具、例えばC.E.P. Swab（商標）（Life Technologies Ltd., UK）を用いて、口の内側から単離することができる。頬内側をそっと擦って細胞をマトリックスに付着させることにより、約2000個の細胞を採取する（Aron, Y.ら (1994) Allergy 49 (9): 788-90）。次に、その紙製ブラシを完全に乾燥させ、分析まで保存しておくために、取り付けられているハンドルから微量遠心管中へと排出すればよい。

細胞サンプルからのゲノムDNAは、慣用の手順を用いて単離することができる。例えば、DNAをフィルター、カラムマトリックスまたは磁性ビーズに固定すればよい。Qiagen QIAampキット（Qiagen, Crawley, UK）などの多くの市販のキットが使用できる。簡単に説明すると、細胞サンプルを、微量遠心管に入れ、プロテイナーゼKを配合し、混合し、インキュベートして、細胞を溶解させることができる。次に、エタノールを添加し、溶解物をQIAampスピンカラムに移し、数回洗浄した後で、カラムからDNAを溶出させる。

使用した特定の方法により単離されたDNAの量を定量して、十分なDNAが確実にアッセイに利用されうるようにし、PCR増幅のための所望のDNA濃度を達成するのに必要な希釈率を決定することができる。例えば、望ましい標的DNA濃度は、50ng〜150ngの範囲とすることができる。この範囲以外のDNA濃度は個々のアレルのPCR増幅に影響を及ぼし、ひいては、多型決定ステップの感度および選択性に影響を及ぼす可能性がある。

サンプルから得られたDNAの量は、適当な技法を用いて測定できる。そうした技法は当業者には周知であり、UV（Maniatis T., Fritsch E. F.およびSambrook J., (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY）または蛍光に基づく方法が挙げられる。UV法ではヌクレオチド、RNA、EDTAおよびフェノールなどの混入分子により引き起こされる吸光度の干渉が問題となることがあり、またこの方法のダイナミックレンジおよび感度は蛍光法の場合ほど高くないので、蛍光法が好ましい。PicoGreen dsDNA Quantification（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）などの蛍光ベースのキットが市販されている。

サンプルを試験する前に、米国特許第4,683,202号および同第4,683,195号に記載されているように、サンプル中の核酸を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を用いて選択的に増幅してもよい。

本発明で使用するのに好ましいプライマーは、長さが18〜23ヌクレオチドで、内部相同性もプライマー間の相同性もないものである。

さらに、対象とする領域の増幅および特異性を確実にするために、ARMS-PCRまたはアレル特異的PCR法を使用する。こうして、それぞれのPCR反応において、１つのプライマーの3’末端がSNP部位に正確に配置され、それにより、１つの特定のアレルに対応するヌクレオチド塩基が存在する場合にだけ、増幅が起こり得るようになる。１SNP当たり２回のPCR反応を行い、一回がそれぞれのアレルに特異的である。１つのプライマーは両方のPCR反応に共通しているが、それぞれの反応について別々のアレル特異的プライマーを加える。例えば、共通プライマーを「フォワード」プライマーとし、アレル１（反応１）またはアレル２（反応２）を「リバース」プライマーとして加えてもよいし、また、その逆も可能である。

この方法は、PCR反応における特異性が、PCRプライマーの3’末端とその標的DNA配列との正確なマッチングに依存する、という当初の知見に基づくものである。この手法を用いれば、単一の共通プライマーを、別個のPCR反応において２つのアンチセンスプライマーの一方と組み合わせて用いて、野生型配列から点突然変異を区別することができる。アンチセンスプライマーの一方は、その3’末端で野生型配列と正確にマッチングし、第２のプライマーは、その3’末端で変異配列と正確にマッチングする。したがって、一方のPCR反応では野生型配列だけを増幅し、他方のPCR反応では変異配列だけを増幅する。この方法は、もともと「増幅不応性変異システム（amplification refractory mutation system）-PCR（ARMS-PCR）と呼ばれ（Newtonら1989）、Taq DNAポリメラーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠損していることによりプライマー−鋳型二重鎖の3’末端でのワトソン-クリック・ミスマッチを修復できずにミスプライミングが生じる、という事実に依存する。ARMS-PCR法を成功裏に適用するには、PCR反応におけるプライマーアニーリングのためにストリンジェントな条件も必要である。この方法の極めて重要な要素は、第２の遺伝子に由来する配列を増幅し、実験チューブ内でのPCR増幅が成功したか失敗したかについての実験チューブ内ポジティブ対照として機能する、第２のプライマー対を含めることである。

TNF-α、LT-αおよびIL-6遺伝子の分析に使用可能なプライマー対の好ましい例を、ヒト白血球抗原DRB1の第３のイントロンに由来する配列を増幅して、PCR成功の内部対照として機能する対照プライマーと共に表２に示す。

DNAサンプルが得られたら、好ましくは対象の増幅領域を用いて、個々の多型を同定することができる。多型のマーカーの同定には、それぞれ-308位、+252位および／または-174位におけるヌクレオチド置換により異なっているTNF-α、LT-αおよびIL-6遺伝子のアレル形態を判別検出することを伴う。

既知のヌクレオチド差異の存在を決定する方法は、当業者には周知である。これらとしては、限定するものではないが、次のものが挙げられる。
−アレル特異的オリゴヌクレオチド（ASO）とのハイブリダイゼーション（Wallace, R. B.ら(1981) Nucleic Acids Research. 9:879-894；Ikuta, S.ら (1987) Nucleic Acids Research. 15:797-811；Nickerson, D.ら (1990) PNAS USA 87:8923-8927, Verlaan-de Vries, Mら(1986) Gene. 50:313-320, Saiki, R. K.ら(1989) PNAS. USA 86:6230-6234、およびZhang, Y.ら(1991) Nucleic Acids Research. 19: 3929-3933）；
−アレル特異的PCR（Newton, C. R.ら(1989). Nucleic Acids Research. 17:2503-2516, Gibbs, R. A.ら (1989) Nucleic Acids Research. 17:2437-2448）。

以下の参考文献に、使用するTNF-α／LT-α遺伝子型決定システムの全詳細が示されている。
−Howell WM, Bateman AC, Turner SJ, Theaker JM (2002). Influence of TNFαand LTα single nucleotide polymorphisms on susceptibility to and prognosis in cutaneous malignant melanoma in the British population European Journal of Immunogenetics, 29, 17-23。

ARMS-PCRによるサイトカインの遺伝子型決定の詳細を記載した他のいくつかの例としては、次のものが挙げられる。
−McCarron SL, Edwards S, Evans PR, Gibbs R, Dearnaley DP, Dowe A, Southgate C, The CRC/BPG UK Familial Prostate Cancer Study Collaborators, Easton DF, Eeles RA, Howell WM (2002) Influence of cytokine gene polymorphisms on the development of prostate cancer. Cancer Research, 62, 3369-3372。
−Howell WM, Turner SJ, Bateman AC, Theaker JM (2001). IL-10 promoter polymorphisms influence tumour development in cutaneous malignant melanoma. Genes and Immunity, 2, 25-31。
−Poole KL, Gibbs PJ, Evans PR, Sadek SA, Howell WM (2001) Influence of patient and donor cytokine genotypes on renal allograft rejection: evidence from a single study. Transplant Immunology, 8, 259-265。

関心が持たれるさらなる参考文献としては、次のものが挙げられる。
−固相ミニシーケンシング（Syvanen, A. C.ら(1993) Am. J. Human Genet. 52:46-59）。
−オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Wu, D. Y.,ら (1989) Genomics. 4:560-569, Barany, F. (1991) PNAS USA 88:189-193, Abravaya, K.ら 1995. Nucleic Acids Research. 23:675-682）。
−5’蛍光原性ヌクレアーゼアッセイ（Lee, E.ら J. Toxicol. Soc. 23: 140-142, (1998), 米国特許第4,683,202号、米国特許第4,683,195号、米国特許第5,723,591号および米国特許第US5,801,155号）。
−制限酵素断片長多型（RFLP）（Donis-Keller H.ら. (1987) Cell, 51, 319-337）。

好ましい実施形態では、上記３つの遺伝子の遺伝子座は、一般にはTaqman（登録商標）アッセイと呼ばれておりAB7700または7900HTの機器（Applied Biosystems, Warrington, UK）を用いて行われる、多型を検出するのに使用される特化したタイプのPCRにより評価することができる。この方法では、多型を含む対象の領域にハイブリダイズするプローブを合成する。このプローブは、次の３つの修飾を含む：蛍光リポーター分子、蛍光消光分子、およびゲノムDNA鎖への結合を促進するためのマイナー・グルーブ結合性化学物質。このプローブは、DNAのいずれか一方の鎖に結合できる。例えば、コード鎖に結合する場合、Taqポリメラーゼ酵素が5’上流プライマーからDNA合成を開始すると、このポリメラーゼはそのプローブと遭遇し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を利用してそのプローブから塩基を一度に１個ずつ除去し始める。蛍光リポーター分子に結合している塩基が除去されると、その蛍光分子は消光分子によって消光されなくなり、その分子が蛍光を発し始める。このタイプの反応は、プローブが、マッチしたゲノム配列に完全にハイブリダイズしている場合にのみ、起こり得る。増幅のサイクルを連続して行うと（すなわち、より多くのプローブおよびプライマーが、反応混合物中に存在するDNAに結合する）、蛍光の量は増大し、陽性の結果が検出される。ゲノムDNAがプローブと完全にマッチングする配列を持たない場合は、蛍光シグナルは検出されない。

遺伝的多型分析の結果は、固有のTNF-α産生に関する産生個体レベルの測定結果と組み合わせて用いて、個体の魚油治療に対する感受性の判定を行うことが可能である。下記の表３に、固有のTNF-α産生個体状態に関して調べた集団における、TNF-α、LT-αおよびIL-6遺伝子型の分布を示す。

上記の表から判るように、TNF1/1、TNF1/2およびTNF2/2の遺伝子型に分類される被験体の割合は、それぞれおよそ68％、30％および２％であった。TNFB1/1、TNFB1/2およびTNFB2/2の遺伝子型に分類される被験体の割合は、それぞれ19％、53％および28％であり、IL-6GG、IL-6GCおよびIL-6CCの遺伝子型に分類される被験体の割合は、それぞれ53％、56％および29％であった。TNF-α遺伝子型はTNF-α産生と無関係であると思われた。何故ならば、TNF1およびTNF2アレルの分布は、投与前のTNF-α産生の三分位全てに含まれる被験体についてほぼ同じであったからである。TNFB2/B2およびIL-6 GG遺伝子型の頻度は、TNF-α産生と正の関連を示した。TNFB2/2については、最低三分位における19％から最高三分位での48％まで増大し、IL-6については、最低三分位における33％から最高三分位での39％へとより少ない増大を示した。TNFB1/B2遺伝子型およびIL-6 CC遺伝子型の頻度は、固有のTNF-α産生が増大するにつれて低下した。

LPS刺激した末梢血単核細胞からのTNF-α産生を低下させる魚油の能力に及ぼす遺伝子型の影響については、表４にも示す。この表から、IL-6 GGまたはTNFB 1/2の多型のいずれかが単独で存在することにより、これらの多型のいずれかを有する個体が、魚油投与後のTNF-α産生について有利な低下をより生じやすくなることは明らかである。さらに、TNFB1/2遺伝子型とIL-6GG遺伝子型が組み合わさると、魚油のTNF産生低下効果が増強される可能性が最も高くなり、これは、その遺伝子型を有する被験体の56％が魚油投与後にTNF-α産生の低下を示すことからも示される（表４）。

本発明の目的では、魚油とは、少なくとも28％のn-3 PUFA（そのうち約60％がエイコサペンタエン酸であり、約40％がドコサヘキサエン酸である）を含有する魚の新鮮な臓器から抽出した油である。魚油は、いかなる脂肪分の多い魚の供給源からも抽出することができる。この点に関して特に適切であるのは、サバ、スプラット、ニシン、マグロおよび天然サケであり、これらの魚はn-3 PUFAの豊富な供給源である。魚油の残部成分は、典型的には、魚油の活性には影響を及ぼさないと思われる飽和および一価不飽和脂肪酸の混合物である。

好適な炎症性疾患としては、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹、乾癬などの炎症性皮膚障害、ならびに肛門周囲性クローン病および関節炎（例えば関節リウマチおよび乾癬性関節炎）などの他の炎症性疾患を含む、炎症を軽減することが望ましい任意の疾患を挙げることができる。魚油治療は、関節リウマチの治療において特に有益であることが判明している。

幾つかの実施形態では、方法は、魚油を個体に投与するさらなるステップを含んでもよい。魚油は、単独で投与してもよいし、あるいは、ビタミンB12／B6および抗酸化剤（例えばビタミンC、ビタミンE、リコペン、β-カロテン）ならびにミネラル（例えばマグネシウム、マンガン、セレンおよび亜鉛）のうち１種以上と組み合わせて投与してもよい。

投与は、例えば活性成分と適切な賦形剤とを含む錠剤もしくは丸剤などの医薬品の形態、または魚油を豊富に含む食品の形態とすることができる。適切な食品としては、サバ、スプラット、ニシン、マグロおよび天然サケなどの脂肪分の多い魚が挙げられるであろう。

方法は、葉酸、ビタミンB6／B12およびビタミンCのうち１種以上のレベルが高い食品を含めた食事摂取計画を、上記個体に提供するさらなるステップを含むことができる。

本発明のもう１つの態様は、TNF-α -308、LT-α +252およびIL-6 -174多型のうち１つ以上について多型である個体における炎症性疾患の治療において使用するための医薬品の製造における、魚油を含む組成物の使用を提供する。

本明細書においてある状態を治療するという文脈において用いられる「治療」という用語は、一般に、例えば炎症状態の進行の阻止などの何らかの望ましい治療効果が達成されるような、ヒトに対するものであるか動物に対するもの（例えば獣医学的用途の場合）であるかにはかかわらない治療及び療法に関するものであり、これは、炎症状態の進行速度の低下、進行速度の中断、炎症状態の改善、ならびに炎症状態の治癒を包含する。また、予防的手段としての治療（すなわち予防法）も含まれる。

本明細書中で用いられる「治療上有効量」という用語は、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、何らかの望ましい治療効果を生じさせるのに有効な、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物もしくは剤形の量に関するものである。

魚油または魚油を含む医薬組成物は、任意の慣用の投与経路によって被験体に投与でき、限定するものではないが、経口投与（例えば経口摂取による）または非経口投与（例えば皮下、筋肉内もしくは静脈内注射による）が挙げられる。

被験体は、真核生物、動物、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類、ネズミ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジまたはヒトでありうる。

魚油は単独で投与することが可能であるが、少なくとも魚油を、１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝化剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、または当業者に周知である他の物質、ならびに場合によっては他の治療剤もしくは予防剤と共に含む、医薬組成物（例えば製剤）として提供することが好ましい。

したがって、本発明はさらに、上記で定義したような医薬組成物、ならびに、魚油を、１種以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝化剤、アジュバント、安定化剤、または本明細書中で記載されているような他の物質と共に混合することを含む医薬組成物の製造方法を提供する。

本明細書中で用いられる「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題や合併症を起こさず、合理的なベネフィット／リスク比に見合っており、被験体（例えばヒト）の組織と接触させて使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形に関するものである。また、それぞれの担体、賦形剤などは、製剤の他の成分との適合性を有するという意味で、「許容される」ものでなければならない。

好適な担体、賦形剤などは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990などの標準的な製剤テキストに見ることができる。

製剤は、単位剤形として提供することが好都合な場合があり、製薬の分野で周知の任意の方法によって調製できる。そのような方法は、活性化合物を、１種以上の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体または微粉砕固体担体またはそれらの両者と均一かつ十分に結合させ、次に、必要に応じてその生成物を成形することにより、調製する。

製剤は、液体、溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル剤、シロップ、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒、粉末、カプセル、カシェ剤、丸剤、アンプル、油剤、坐剤、ボーラス剤、または持続放出製剤の形態であってよい。

経口投与（例えば経口摂取による）に適する製剤は、それぞれが所定量の活性化合物を含む個別単位（例えばカプセル剤、カシェ剤または錠剤）として；粉剤または顆粒剤として；水性または非水性液体中に調製した溶液剤または懸濁剤として；水中油型液状乳剤または油中水型液状乳剤として；ボーラス剤として；舐剤として；あるいはペースト剤として提供することができる。

錠剤は、例えば、場合によっては１種以上の補助成分と共に、圧縮または鋳型成形することなどの慣用の手段により製造できる。圧縮錠は、粉末または顆粒などの自由流動性形態の活性化合物を、場合によっては１種以上の結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤もしくは希釈剤（例えば乳糖、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えばグリコール酸デンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；界面活性剤もしくは分散化剤もしくは湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）；ならびに保存剤（例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸）と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製できる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を適切な機械で鋳型成形することにより製造できる。錠剤は、場合により、コーティングしたり刻み目を入れたりしてもよいし、例えば、目的とする放出プロファイルをもたらすようにヒドロキシプロピルメチルセルロースをさまざまな割合で用いることにより、その中に含まれる活性化合物の遅延放出もしくは制御放出をもたらすように製剤化してもよい。また、錠剤は、場合により、腸溶性コーティングを施して、胃以外の消化管の部分で放出されるようにしてもよい。

非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内のいずれかの注射によることを特徴とする。注射剤は、溶液もしくは懸濁液として、または注射の前に溶液または液状懸濁物とするのに適した固形形態として、または乳濁液として、慣用の形態に調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、それが望まれる場合には、投与しようとする医薬組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝化剤（例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸ナトリウムトリエタノールアミン）などの少量の非毒性の補助物質を含んでもよい。

より最近に考案された非経口投与向けの方法は、徐放性もしくは持続放出性システムの埋め込み物（インプラント）を用いて、一定レベルの投薬量が維持されるようにするというものである。例えば、米国特許第3,710,795号を参照されたい。

そのような非経口用組成物中に含まれる活性化合物の割合は、その特定の性質、ならびにその化合物の活性および被験体における必要性に大きく依存する。しかし、溶液中で0.1％〜10％という活性成分割合を用いることができ、その組成物が、その後に上記の割合まで希釈される固体である場合は、それよりも多くする。好ましくは、この組成物は、溶液中に0.2〜2％の活性成分を含む。

活性化合物および活性化合物を含む組成物の適切な投薬量は、患者間で異なり得るものであると理解される。最適投薬量の決定は、一般に、本発明の治療の治療利益のレベルとあらゆるリスクまたは有害な副作用とのバランスをとることを伴う。選択した投薬量レベルは、限定するものではないが、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／もしくは材料、ならびに患者の年齢、性別、体重、状態、全身的な健康状態および以前の病歴などのさまざまな要因に応じて決定される。化合物の量および投与経路は、最終的には医師の裁量に委ねられるが、一般に、投薬は、作用部位で、多大な有毒または有害な副作用を引き起こすことなく目的の効果を達成する局所濃度を達成するようにすべきである。

in vivo投与は、治療経過を通して、１回の投薬で、連続的に、または断続的に（例えば適当な間隔をあけて分割投与で）行うことができる。最も有効な手段および投薬量の決定方法は、当業者には周知であり、治療に用いる製剤、治療の目的、治療する標的細胞、および治療対象の被験体によって異なる。単回投与または複数回投与は、処置する医師によって選択された投薬のレベルおよびパターンを用いて、行うことができる。

一般に、魚油の好適な投与量は、１日当たり約４g〜約８gの範囲、さらに好ましくは１日当たり約６gである。これは、単回ボーラス投与の形態で行うことができ、さらに好ましくは複数回適用または持続放出調製物とすることができる。年齢、体重、性別および他の非炎症性疾患の有無などの要因は、一般に、魚油の好適な日用量とは無関係である。

本発明の方法を実施するための正確なフォーマットは、当業者であれば、ルーチンな技能や知識を用いてさまざまなものとすることができる。

無論、当業者であれば、本発明の方法で得られた結果を比較するための適切な対照実験が設計するであろう。

ここで、本発明の態様を、以下の実験および結果を参照しながら説明するが、それらは説明のためのものであり、限定しようとするものではない。さらに別の態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。

本明細書中で述べた全ての文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

実験
１．被験体および研究設計
年齢28±８才（20〜57才の範囲）、体重77±11kg（50〜103kgの範囲）およびボディマス指数24±４kg/m²（18〜34kg/m²の範囲）である健常な男性の被験体（ｎ＝111人）をサウサンプトン地域から募集した。喫煙者および炎症性疾患を有する個体もしくは抗炎症薬の投与を受けている個体は、本研究からは除外した。被験体は、通常の生活と食事を続けたが、さらに、６g/日のカプセル封入魚油（1.8ngのn-3 PUFA/日を与える）（Maxepa, Seven Seas Ltd, Hull, UK）を12週間にわたり摂取した。血液を採取する前に、被験体は一夜、少なくとも12時間絶食した。開始時および魚油投与期間完了時に、３つの別個の血液サンプルを連続的に採取した。まず最初に、ヘパリンリチウム入りバキュテイナー管に20mlの血液を採取した。この血液はPBMCの調製に使用した。次に、５mlの血液を凝血剤不含のバキュテイナー管に採取した。この血液は、C-反応性タンパク質（CRP）濃度を測定するための血清の調製に用いた。最後に、５mlの血液をEDTA入りバキュテイナーに採取した。この血液は、遺伝子型決定用のDNAの調製に用いた。

採血時の被験体における感染または炎症の有無を検出するため、血清CRP濃度を測定した。いずれの血液サンプルについてもCRP濃度が100mg/Lを超える個体は本研究から除外した。

２．TNF-αの誘導および測定
ヘパリン添加血液をHistpaque-1077（Sigma Chemical Co., Poole, UK）で遠心分離すること（Yaqoobら,. Eur J Clin Nutr 30:399-410 (2000)）によりPBMCを単離し、２mmol/Lのグルタミンおよび50ml/lの自己血漿を含有するRPMI培養培地に再懸濁した。PBMC（２×10⁶個）を、最終培養量２ml中、最終濃度15 mg/lの大腸菌0111:B4の内毒素（Sigma Chemical Co., Poole, UK)の存在下で、24ウェル組織培養プレートで培養した。５％CO₂／95％空気の雰囲気下で37℃で24時間後に、培養プレートを遠心分離し、上清を分析するまで-80℃で凍結させた。TNF-α濃度を、EASIA（登録商標）ELISAキット（Biosource International, Nivelles, Belgium）を用いて測定した。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は10％未満であり、検出限界は３ng/lであった。

３．TNF-αおよびLT-αアレルの遺伝子型決定
EDTA中に採取した血液のアリコートを、TNF-α -308（TNF1、TNF2）およびLT-α +252（TNFB1、TNFB2）の一塩基多型（SNP）について遺伝子型を決定した。これらのSNPは、文献に報告があるが変動的であるそれらのTNF-α産生との関連（Kroegerら, Cytokine 12:110-119 (2000)およびWarzochaら, Blood 91:3564-81 (1998)）に基づいて選定した。ゲノムDNAを塩析法（Millerら, Nucleic Acid Res 16:1215 (1988)）により抽出した。それぞれのSNPを、二反応増幅不応性変異システムポリメラーゼ連鎖反応（ARMS-PCR）法を用い、先に公表されている方法（Howell WMら, European Journal of Immunogenetics, 29:17-23 (2002); Perreyら, Transpl Immunol 7:127-8 (1999)）に基づいて検出した。この方法では、１つのSNP当たり２つの別個のPCR反応を行う。それぞれのPCR反応はまた、追加のPCRプライマー対を含むものとした。このプライマー対は、ヒト白血球抗原DRB1遺伝子の第３イントロン由来の配列を増幅させて、PCRが成功したことの内部対照として機能するものである。全てのPCR反応は反応容量10μl中で行い、最終試薬濃度は次のとおりとした：１×AS反応緩衝液（Abgene, Epsom, UK）、200μmol/lの各dNTP、120g/lのショ糖、200μmol/lのクレゾールレッド、１μmol/lのそれぞれの特異的または共通プライマー、0.2μmol/lの各内部対照プライマー、0.25単位のThermoprime^PLUS DNAポリメラーゼ（Abgene, Epsom, UK）、1.75mmol/lのMgCl₂および25〜100ngのDNA。PCRプライマー配列、および各SNPアンプリコンの産物サイズを表２に示す。PCR反応条件は、Primus 96 Plusサーマルサイクラー（MWG Biotech, Germany）を用い、次のサイクル条件に従って行った：96℃で60秒、続いて96℃で15秒、65℃で50秒、72℃で40秒を10サイクル；次に96℃で190秒、60℃で50秒、72℃で40秒を20サイクル。PCR産物を、0.5g/lのエチジウムブロミドを含有する２％アガロースゲルにそのままローディングし、電気泳動を行い、UV照射の下で写真撮影により可視化した。

４．血漿リン脂質の脂肪酸組成
魚油食事療法に対するコンプライアンスは、血漿リン脂質の脂肪酸組成の測定により評価した。総脂質をクロロホルム／メタノール（２：１ v/v）で血漿から抽出し、リン脂質を薄層クロマトグラフィーにより、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（90:30:1 v/v/v）の混合物を溶出相として用いて単離した。10g/lの三フッ化ホウ素を含むメタノールと共に80℃で60分間インキュベートすることにより脂肪酸メチルエステルを調製した。脂肪酸メチルエステルを溶媒抽出により単離し、乾燥し、そして30m×0.32mm BPX70キャピラリーカラムに適合させた膜厚0.25μmのHewlett-Packard 6890ガスクロマトグラフ（Hewlett Packard, Avondale, PA）でのガスクロマトグラフィーにより分離した。キャリアガスとしてヘリウムを1.0ml/分で用い、スプリット／スプリットレス注入装置をスプリット／スプリットレス比20：1で用いた。注入装置および検出装置の温度は275℃とした。サンプル注入後、カラムオーブン温度を170℃で12分間維持し、次に５℃／分で170℃から210℃まで昇温し、その後210℃で15分間維持するようにプログラムした。分離は、HP GC Chem Stationソフトウェア（Hewlett Packard, Avondale, PA）で記録した。脂肪酸メチルエステルは、予め分離しておいた標準物質との比較により同定した。

５．統計学的分析
特に明示しない限り、表示の値は平均±SDとして表わす。魚油を投与する前のTNF-α産生の三分位間でのTNF-αおよびLT-α遺伝子型の分布の差違は、χ²検定を用いて調べた。TNF-α産生についておよび血漿リン脂質中の各種脂肪酸の割合についての魚油投与前の値と魚油投与後の値との間の差異は、対応のあるスチューデントt検定を用いて求めた。魚油投与前または投与後の各種遺伝子型間でのTNF-α産生の差異は、一元配置分散分析法（one-factor ANOVA）により求めた。遺伝子型、投与前のTNF-α産生の三分位、ならびにそれらの相互作用の、TNF-α産生に対する魚油の作用に及ぼす影響は、二元配置分散分析法（two-factor ANOVA）により求めた。全ての場合において、有意差レベルは0.05に設定し、多重比較用のBonferonniの補正法を用いた。全ての統計学的比較は、SPSSバージョン10（SPSS Inc, Chicago, IL）を用いて行った。

結果
１．血漿リン脂質の脂肪酸組成
全ての被験体が、その血漿リン脂質におけるエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の割合の増大を示し、投与期間の終了時点でそれぞれ平均増加量は370および94であった（表５）。魚油由来のn-3 PUFAの見かけ上の増加は、血漿リン脂質中のアラキドン酸の割合が大幅に減少したことに伴うものであった。

調べた集団内での遺伝子型の分布、TNF-α産生との関係、およびTNF-α産生に及ぼす魚油の影響は、上記で述べてある。

２．魚油に対する応答に及ぼすTNF-α、LT-αおよびIL-6遺伝子型の影響
TNF-α高度産生個体における魚油の抑制作用は、TNF-α、LT-αまたはIL-6遺伝子型とは無関係に生じた（表６）。しかし、魚油投与後のTNF-α産生の低下の程度の測定において、TNF-α遺伝子型と固有のTNF-α産生との間には有意な相互作用が存在した（相互作用についてのP＝0.035；二元配置ANOVA）。

さらに分析を行ったところ、投与前のTNF-α産生の最高三分位における個体間でのTNF-α産生の低下は、それらがTNF1/1遺伝子型を有している場合よりもTNF1/2遺伝子型を有している場合の方が有意に大きかった（P＝0.02）ことが示された（表６）。魚油投与後のTNF-α産生の低下の程度の測定におけるLT-α遺伝子型と固有のTNF-α産生との相互作用は、統計学的有意差には至らなかった（相互作用についてのP＝0.062；二元配置ANOVA）。魚油は、固有のTNF-α産生の低位三分位および中位三分位における何人かの個体由来の細胞によるTNF-αの産生を抑制することができた。TNFB1/B2アレルは、これらの個体間での魚油に対する感受性を決定する上で重要であると思われた。すなわち、固有のTNF-α産生の最低三分位に含まれる、魚油治療に対して応答してTNF-α産生が低下した８人の被験体は全員、TNFB1/B2遺伝子型を有していた。固有のTNF-α産生の中位三分位においては、このように応答した16人の被験体のうちの12人がTNFB1/B2遺伝子型を有していた。固有のTNF-α産生の最高三分位では、TNFB1/B2遺伝子型を特徴としていたのは、魚油に応答してTNF-α産生が低下した被験体の半分（32人中16人）にすぎなかった。

考察
本発明者らのデータから、n-3 PUFAのTNF-α産生抑制作用に対する個体の感受性が、投与前の個体由来の細胞によるサイトカイン産生の固有レベル、ならびにTNF-α -308、LT-α +252およびIL-6 -174のSNPによりコードされるかまたはそれらと関連する遺伝的多様性と関連することが示唆される。矛盾するようであるが、魚油は、一部の被験体、特に投与前の産生の最低三分位に含まれる被験体においては、TNF-α産生を増大させると思われる。魚油がTNF-α産生を低下させずに増大させることができることは、意外なことではない。炎症が起こっている間、ホスホリパーゼA₂は、膜リン脂質を加水分解して、前炎症性エイコサノイドであるプロスタグランジンE₂（PGE₂）およびロイコトリエンB₄（LTB₄）の産生に利用可能なアラキドン酸を生成する。in vitroでの研究から、PGE₂およびLTB₄が、前炎症性サイトカイン産生に対して逆の作用を有し、前者（PGE₂）は抑制的な影響を及ぼし、後者（LTB₄）は促進的な影響を及ぼすことが示されている（Endresら, N Eng J Med 320:265-71 (1989)およびChoiら, Cell Immunol 170:178-84 (1996)）。魚油は、細胞膜中のプロアラキドン酸を改変させる可能性がある。そのような作用により、PGE₂およびLTB₄の産生は低下し、PGE₃およびLTB₅の形成は増大する。これらのエイコサノイドは、PGE₂およびLTB₄よりも生物活性が低い。したがって、全体としてみたTNF-α産生に対する作用（抑制か、促進か）は、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸から生じるさまざまな促進性エイコサノイドと抑制性エイコサノイドとの間のバランスに依存する。

先に概記したように、遺伝的影響が、TNF-α産生への影響において重要である。本研究におけるTNF1、TNF2、TNFB1、TNFB2、IL-6GGおよびIL-6CCアレルの頻度は、健常な英国人被験体および他のヨーロッパ人被験体の研究から得られた公表されている値とほぼ一致しており（Perreyら, Transpl Immunol 6:193-7 (1998), Fanningら, Tissue Antigens 50:23-31 (1997) and Brinkmanら, Br J Rheumatol 36:516-21 (1997)）、本発明者らの実験室で独自に行った研究から得られた値（Howellら, Eur J Immunogenet 29:17-23 (2002)）とほぼ一致する。したがって、ここで調べた被験体群は、少なくとも調べたTNF-α、LT-αおよびIL-6遺伝子型の頻度に関しては、それが抽出された集団を代表するものである。TNFB2ホモ接合性と固有のTNF-α産生との間に正の関連が見られたことにより、Stuberら, Crit Care Med 24:381-4 (1996)およびPociotら, Eur J Immunol 23:224-31 (1993)の知見が確認される。しかし、本発明者らは、TNF-α -308遺伝子型とTNF-α産生との関連は確認していない。固有のTNF-α産生の３つの三分位の個体の遺伝的特徴を、魚油のTNF-α産生低下能と関連づけて調べたところ、複雑な相互作用が明らかになった。本発明者らが調べた結果から、まず第１に、高い固有のTNF-α産生レベルを有する個体の大部分（この場合86％）が魚油の抗炎症作用に感受性であること、第２に、中位および高位の固有のTNF-α産生が、TFNB2アレルのホモ接合性と関連すること、第３に、中位または低位レベルの固有のTNF-α産生を示す個体は、TNFBアレルについてヘテロ接合である場合には、魚油の抗炎症作用をより受けやすいこと、そして第４に、IL-6 -174 CC遺伝子型を有することが、魚油の（TNF-α産生に関する）抗炎症作用への応答レベルがより低いことと関連することが示唆される。また、その場合、TNFB2/B2である個体は、その固有のTNF-α産生レベルに関係なく、魚油の抗炎症作用を受けにくいと見込まれる。

本研究は、科学文献（Calderら, Nutr Res 21:309-41 (2001)）で現在報告されているヒトPBMCからのex vivo TNF-α産生に及ぼす魚油の食事投与の効果を最も広く調べたものである。本研究からのデータは、各被験体の固有のex vivo TNF-α産生、またはTNF-α、LT-αもしくはIL-6遺伝子型を考慮に入れずに総計すると、魚油がそのような産生に対して調節作用を示さないことを示唆する他の研究（Schmidtら, Scand J Clin Lab Med 56:87-92 (1996); Cooper at al., Clin Nutr 12:321-8 (1993); Blokら, Eur J Clin Invest 27:1003-8 (1997); Molvigら, Scand J Immunol 34:399-410 (1991)およびYaqoobら, Eur J Clin Nutr 30:399-410 (2000)）と一致する。同様の研究では、魚油の広範囲な投与量が用いられた（0.55〜6gのn-3 PUFA/日）。TNF-α産生に対する魚油の抑制作用は、概して、本研究において用いたものよりも多量のn-3 PUFAの投与量を用いた研究において実証されたものである（Endresら, N Engl J Med 320:265-71 (1989); Gallaiら, J Neuroimmunol 56:143-53 (1995)およびKelleyら, Lipids 34:317-24 (1999)）。しかし、これは一般的に当てはまるものではない。何故ならば、それより多量の投与量を用いた幾つかの研究ではTNF-α産生に対する作用は全く示されていないからである（Blokら, Eur J Clin Invest 27:1003-8 (1997); Molvigら, Scand J Immunol 34:399-410 (1991)およびYaqoobら, Eur J Clin Nutr 30:399-410 (2000)）。５つの研究（Schmidtら, Scand J Clin Lab Med 56:87-92 (1996); Cooperら, Clin Nutr 12:321-8 (1993); Blokら, Eur J Clin Invest 27:1003-8 (1997); Meydaniら, J Clin Invest 92:105-13 (1993)およびMolvigら, Scand J Immunol 34:399-410 (1991)）のうち、Meydaniらによるものだけが、TNF-α産生に対する魚油の抑制作用を実証した。しかし、この研究では、魚油は、低脂肪食を摂取している被験体に与えていた。この食事状況では、細胞構造への取り込みに関しての補給食品由来のn-6 PUFAと補給食品由来のn-3 PUFAとの競合は、本研究の場合よりも少なかったであろう。

本研究の結果を、TNF-α産生に及ぼす魚油補給食品の効果について行った他の研究と合わせて考慮すると、n-3 PUFAの摂取とサイトカインの生物学との相互作用が複雑であることが示される。与えた魚油の投与量は、TNF-α産生に対する魚油の抑制作用が集団全体のレベルで実証されうるかどうかの決定要因であるかもしれないが、本発明者らのデータは、TNF-α -308、LT-α +252およびIL-6 -174 SNPによりコードされるかまたはそれらに関連する遺伝的多様性のために、魚油の作用に対して個体の感受性が異なることにより、抗炎症剤としての魚油の適度な投与量の有効性を制限する可能性があることを示唆している。本出願により提供される魚油に対する感受性の決定要因の正確な性質をよりよく理解すれば、現在の状況よりもさらに正確に、炎症に影響を及ぼすように魚油補給を利用できるようになるであろう。

Claims

魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性の評価方法であって、その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し、決定された遺伝子型に基づいてその個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定することを含む上記方法。
個体の固有のTNF-α状態を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
LT-α +252およびIL-6 -174アレルにおける遺伝子型を決定する、請求項１に記載の方法。
LT-α遺伝子における遺伝子型がヘテロ接合性TNFB1/2である、請求項１または２に記載の方法。
IL-6遺伝子における遺伝子型がホモ接合性GGである、請求項１または２に記載の方法。
LT-αおよびIL-6遺伝子における遺伝子型が、それぞれヘテロ接合性TNFB1/2およびIL-6 GGである、請求項１または２に記載の方法。
魚油を用いた炎症性疾患の治療に対する個体の感受性の評価方法であって、
a)その個体の固有のTNF-α状態を決定し；
b)その個体の遺伝子型をTNF-α -308、LT-α +252および／またはIL-6 -174アレルでの多型に関して決定し；そして
決定された遺伝子型に基づいてその個体が魚油を用いた治療に対して十分応答するかどうかを推定する、ことを含む上記方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施することにより前記治療に対する感受性があると評価された該治療に感受性のある患者の炎症性疾患を治療する医薬の製造のための、魚油の使用。