JP4167991B2 - 符号化変調レーザによる蛍光検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ光を測定対象物に照射するとともに、この照射による測定対象物から光信号を受け、この信号について信号処理を行なう符号化変調レーザによる蛍光検出装置に関する。特に、医療、生物分野で用いられるフローサイトメータ等のような細胞やＤＮＡやＲＮＡ等の測定対象物の識別を蛍光色素の発する蛍光を用いて行なって測定対象物の分析等を短時間に行なう分析装置に適用される符号化変調レーザによる蛍光検出装置に関する。

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を測定対象物として含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してフローセルを形成する。このフローセル中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定するものである。
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報から特定することが要求されている。

下記非特許文献１では、例えば４８８ｎｍ、５９５ｎｍ、６３３ｎｍ等の波長帯域の異なる複数のレーザ光を照射して、各レーザ光によって蛍光色素から発する波長帯域の異なる複数の蛍光をバンドパスフィルタを用いて分離して光電子倍増管（ＰＭＴ）で検出するフローサイトメータが開示されている。
これにより、複数の蛍光試薬（蛍光色素）からの蛍光を識別して複数の測定対象物の種類を同時に特定することが可能となるとされている。

http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome_Absorption.shtml（２００４年１月１３日）

しかし、蛍光試薬から発する蛍光の波長帯域は略４００〜８００ｎｍ等と比較的帯域幅が広く、可視光波長帯域で３〜４程度の波長帯域の蛍光しか識別可能なラベルとして有効に用いることができない。複数の蛍光試薬を組み合わせて識別できる蛍光の数を増やそうとしても限界がある。このため、このようなフローサイトメータを用いても、極めて多数の測定対象物について測定対象物の種類を短時間に特定して分析を行なうことが難しい、といった問題があった。

例えば、測定対象物が蛋白等の生体物質の場合、この生体物質に予め蛍光試薬により蛍光色素が付着される。そして、この生体物質は、付着された蛍光色素と異なる蛍光色素でラベル化され、表面にウィスカ状の特異な構造体の設けられた、直径５〜２０μｍのマイクロビーズを含む液体に混ぜられる。上記ウィスカ状の構造体は、ある既知の構造の生体物質に作用して結合するように構成されている。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生体物質の蛍光とを同時に検出した場合、測定対象物の生体物質は、マイクロビーズの構造体と結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。しかし、多種多様なウィスカ状の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。しかし、蛍光試薬の種類が少ないことから一度に多種類のマイクロビーズを用いて短時間に効率よく生体物質を測定することができない。

また、測定対象物に照射して蛍光を測定する測定点を管路の長手方向に複数設け、各測定点にて照射されるレーザ光が互いに干渉しないようにする方法も考えられる。しかし、この場合、レーザ光や受光部を測定点の数に応じて多数設ける必要がある。また、フローセルを形成する管路も長くなるので管路を流れるシース液の流路抵抗は大きくなり、シース液に与えるべき圧力も大きくなる。このため、装置が大型化するといった問題があった。

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物からの光信号を受信して信号処理を行う際、この信号処理により多数の測定対象物の種類を特定することができ、特に短時間で効率よく受信した光信号を識別する蛍光検出装置、例えば、フローサイトメータに好適に用いられる蛍光検出装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物からの光信号を受信して信号処理を行う検出装置であって、測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物からの光信号を受信して受光信号を出力する受光部と、１ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号を制御信号として用いて前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオン/オフを制御する光源制御部と、
前記受光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの光信号を識別する信号処理部と、を有し、前記複数の符号化系列信号は、１つの符号化系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符号化系列信号が互いに直交するように構成され、前記光源制御部は、前記制御信号を繰り返し生成し、前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオン/オフを繰り返し生成された前記制御信号に基づいて制御することを特徴とする符号化変調レーザによる蛍光検出装置を提供する。

その際、前記信号処理部は、測定対象物からの光信号から得られた前記受光信号と前記制御信号との相関関数を求め、求めた相関関数の値の大小によって、前記測定対象物からの光信号が前記レーザ光の照射によるものか否かを判別することが好ましい。
また、前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、前記信号処理部は、前記受光部において複数のレーザ光からの光信号が重なって出力された受光信号から、レーザ光の出射に用いた符号化系列信号を用いて、各レーザ光に対する測定対象物からの光信号をそれぞれ、前記相関関数を用いて識別するのが好ましい。前記測定対象物がレーザ光の照射により蛍光する蛍光色素を備える場合、前記光源制御部は、前記符号化系列信号の前記ビット方向のシフト量と前記符号化系列信号の時間分解幅との積が前記蛍光色素の蛍光緩和時間に比べて長くなるように設定して前記符号化系列信号を生成するのが好ましい。時間分解幅とは、符号化系列信号の２値化されたデジタル信号値の隣り合う信号間隔をいう。

例えば、前記複数のレーザ光源は、出射するレーザ光の波長帯域が互いに異なるものであるとする。
また、前記測定対象物は複数種類あり、各種類の測定対象物は、レーザ光の照射により蛍光する波長帯域が互いに異なる蛍光色素を、測定対象物の種類毎に備えているものであってもよい。この場合、前記受光部は、蛍光する波長帯域が互いに異なる前記蛍光色素からの光信号を分離して別々に受光するためのフィルタを有するのが好ましい。
また、前記信号処理部は、前記光源制御部において前記符号化系列信号の時間分解幅を用いて前記受光信号のサンプリングを行うのが好ましく、前記信号処理部は、例えば、４ナノ秒以下の時間分解幅で受光信号のサンプリングを行って受光信号の処理を行う。

また、前記測定対象物は、例えば蛍光色素の付着した生体物質であり、前記蛍光色素は、前記生体物質の種類を識別するラベルとして用いられて生体物質の分析に用いられる。すなわち、前記蛍光検出装置はフローサイトメータに好適に用いることができる。

本発明は、レーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号を用いて制御してレーザ光を変調するので、レーザ光を照射した測定対象物からの光信号が多数あっても、各光信号は光信号に対応した符号化系列信号によって変調した信号情報を有する。このため、この信号情報を用いることで照射されたレーザ光を特定することができる。例えば、測定対象物が、蛍光色素が付着した生体物質の場合、たとえ蛍光色素の蛍光する波長帯域が近接しても、照射するレーザ光が異なれば、どのレーザ光の照射による蛍光かを特定することができる。特に多数の蛍光色素を用いて短時間に測定対象物を効率良く特定するフローサイトメータにとっては有効である。
また、レーザ光の断続的なオン／オフによる照射により、単パルスで１回ずつ蛍光させる場合に比べて、蛍光色素に与える光エネルギーが増大するので蛍光の強度は増大する。このため、従来バックグランドノイズに埋もれ易い受光信号のＳ／Ｎ比を向上することができる。
また、多数の符号化系列信号でレーザ光を変調するので、効率よく短時間に多数の測定対象物を計測することができる。

以下、本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とする試料１２に照射し、試料１２中に付けられた蛍光色素の発する蛍光の光信号を検出して信号処理する信号処理装置（蛍光検出装置）２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果をから試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置５０とを有する。

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、レーザ光源部２２のレーザ光の出射のオン／オフを制御する光源制御部および試料中の蛍光の光信号を識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。

レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ₁＝４０５ｎｍ、λ₂＝５３３ｎｍおよびλ₃＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。

図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光の符号化変調パルスレーザ光を出射する部分で、主に赤色のレーザ光Ｒを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として断続的に出射するＲ光源２２ｒ、緑色のレーザ光Ｇを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として断続的に出射するＧ光源２２ｇおよび青色のレーザ光Ｂを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として出射するＢ光源２２ｂと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ₁、２３ａ₂と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、を有して構成される。
これらの符号化変調パルスレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
符号化変調パルスレーザ光のパルス幅は、蛍光色素の発する蛍光をバックグラウンドノイズと区別して効率よく検出できるように設定され、例えば０．５ナノ秒〜４ナノ秒である。
ダイクロイックミラー２３ａ₁は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ₂は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点の試料１２を照射する照射光となる。

Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、それぞれレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂによって駆動される。このレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、制御・処理部２８に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射のオン／オフが制御されるように構成される。ここで、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの各々は、後述するように制御信号（符号化系列信号）によって出射のオン／オフが制御されて変調される。

Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質やマイクロビーズ等の試料１２に付着されており、測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
図３は、レーザ光の発振波長と、このレーザ光によって蛍光色素の発する蛍光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。例えば、Ｂ光源から出射する波長λ_１１のレーザ光の照射により、異なる３つの蛍光色素によって中心波長をλ_１２とする蛍光、中心波長をλ_１３とする蛍光、および中心波長をλ_１３とする蛍光の３種類の光を発する。同様に、Ｇ光源から出射する波長λ_２１のレーザ光の照射により２種類の蛍光（λ_２２，λ_２３）を発する。また、Ｂ光源から出射する波長λ_３１のレーザ光の照射により１種類の蛍光（λ_３２）を発する。

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光の光信号を受光する光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。

図４に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光の光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２と、バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した光信号を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光の光信号を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。

バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、図２に示す蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されており、例えばＢ光源から出射した波長λ_１１のレーザ光の照射によって発する波長λ_１３を中心とする一定の波長幅の帯域である。この場合、図３に示すようにＧ光源から出射した波長λ_２１のレーザ光の照射によって発する波長λ_２２を中心とする蛍光は波長λ_１３の近傍に中心波長を持つため、波長λ_１３を中心とする蛍光とともにバンドパスフィルタを透過する。しかし、波長λ_２１を中心波長とする蛍光と波長λ_１３を中心波長とする蛍光とは、後述する符号化系列信号（図６中のコード１〜３）で変調された信号情報を持った光信号として光電変換器２７ａ〜２７ｃで受信されるので、この受光信号から後述する信号処理を行うことにより、どのレーザ光により発する蛍光の光信号であるかを識別することができる。

光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は信号情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は信号情報を持った受光信号となる。この受光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。

制御・処理部２８は、図５に示すように、レーザ光源部２２のレーザ光の出射のオン／オフを制御する光源制御部２８ａ、および試料１２からの蛍光の光信号を識別する信号処理部２８ｂを有して構成された部分である。
光源制御部２８ａは、受光部２４から出力される検出信号がトリガ信号として入力されると、瞬時にレーザ光の出射のオン／オフを制御する制御信号を生成するように構成される。この制御信号は、互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された１つの符号化系列信号によって作られたものである。この符号化系列信号は、１ビットの信号値で構成され、所定の符号長さのビット数で符号化されている。

具体的には、光源制御部２８ａは、系列符号Ｃ＝｛ａ_０，ａ_１，ａ_２，………，ａ_Ｎ−１｝（Ｎは自然数で符号長さを表す）を用いて基準となる符号化系列信号を生成するとともに、さらにこの系列符号Ｃをｑ1ビット、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔ_ｑ１・ｃ（Ｔ_ｑ１は、ビット方向にｑ1ビット、ビットシフトする作用素である）を用いて符号化系列信号を生成する。ここで、系列符号Ｔ_ｑ１・Ｃは、{ａ_ｑ１，ａ_ｑ１＋１，ａ_ｑ１＋２，………，ａ_{ｑ１＋Ｎ−１}｝である。さらに、系列符号Ｃをｑ２ビット（例えば、ｑ２＝２×ｑ１）、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔ_ｑ２・Ｃを用いて符号化系列信号を生成する。
この符号化系列信号を生成するために用いられる系列符号Ｃ，Ｔ_ｑ１・Ｃ，Ｔ_ｑ２・Ｃは、互いに直交する特性を有するので、生成される符号化系列信号も互いに直交する。

系列符号Ｃの一例として、下記に示すように、例えば係数ｈ_ｊと（ｊ＝１〜８の整数）および初期値ａ_ｋ（ｋは０〜７の整数）とを用いて符号化されるＰＮ系列（Psuedorandaom Noise系列)が挙げられる。このＰＮ系列は、例えば下記式（１）により定義することができる。式（１）では次数を８次としている。ここで、Ｎは上記系列符号の符号長さであり、例えばＮ＝２５５（＝２⁸−１）ビットとされる。

系列符号ＣがＰＮ系列符号である場合、符号長さがＮの巡回符号となるので、ａ_N＝ａ₀，ａ_N+1＝ａ₁，………となる。また、系列符号Ｃと同じ符号長さＮの別の系列符号をＣ’＝｛ｂ₀，ｂ₁，ｂ₂，………,ｂ_N-1｝}とし、上記作用素Ｔ_ｑを系列符号Ｃ’作用させた系列符号Ｔ_ｑ・Ｃ’＝｛ｂ_q，ｂ_q+1，ｂ_q+2，………,ｂ_q+N-1｝}として、系列符号ＣとＣ’との間の相互相関関数Ｒ_cc'(q)を下記式（２）のように定義する。ここで、Ｎ_Aは系列符号における項a_iと項b_q+iの（ｉは０以上Ｎ−１以下の整数）一致する数であり、Ｎ_Dは系列符号における項a_iと項b_q+iの不一致の数である。また、Ｎ_AとＮ_Dの和は符号長さＮとなる（Ｎ_A＋Ｎ_D＝Ｎ）。ここで、iとｑ＋iはｍｏｄ（Ｎ）で考える。

上記ＰＮ系列において２つの系列符号を項毎にｍｏｄ（２）で加算した結果はもとのＰＮ系列を巡回シフトしたＰＮ系列になる性質があり、ＰＮ系列の値が０となる個数は値が１となる個数より１つだけ少ないので、Ｎ_A−Ｎ_D＝−１となる。これより、ＰＮ系列において下記式（３）および（４）に示す値を示す。

上記式（３）よりビットシフト量が０、すなわちｑ＝０の場合、式（３）に示すようにＲ_ｃｃ’（ｑ）の値は１となり、自己相関性を有する。一方、ビットシフト量が０でない、すなわちｑ＞０の場合、式（４）に示すようにＲ_ｃｃ’（ｑ）は−（１／Ｎ）となる。ここで符号長さＮを大きくすることにより、Ｒ_ｃｃ’（ｑ）（ｑ＞０）の値は０に近づく。
すなわち、系列符号ＣとＣ’は自己相関性を持ち、かつ直交性を有するといえる。

このような自己相関性および直交性を有する系列符号を用いて、値が０と値１の２値からなる系列符号化信号を生成する。
図６は、生成される系列符号化信号の一例を示している。コード１の系列符号化信号は、符号長さＮ＝２５５ビットの信号であり、符号長さＮと時間分解幅Δｔとの積は、図４中の時刻０〜ｔ_３の時間となる。この信号において値が１のときレーザ光を出射し、値が０のときレーザ光を出射しないようにして断続的にレーザ光源の出射のオン／オフが制御される。

ここで、コード２の系列符号化信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ_１における信号に対応しており、コード２の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ_１以降の信号に対応して生成されている。同様に、コード３の系列符号化信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ_２(例えば、ｔ_２＝２×ｔ_１）における信号に対応しており、コード３の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ_２以降の信号に対応して生成されている。
光源制御部２８ａは、これらの信号を巡回的に繰り返し生成し、コード１はレーザドライバ３４ｒに、コード２はレーザドライバ３４ｇに、コード３はレーザドライバ３４ｂに制御信号として供給されるように構成されている。

なお、本発明における符号化系列信号は上記ＰＮ系列の系列符号を用いて生成されるが、本発明における自己相関性および直交性を有する系列符号化信号の生成は、上記方法に限定されず、自己相関性および直交性を有する系列符号化信号を生成する限りにおいてどのような方法を用いてもよい。
光源制御部２８ａは、このような系列符号を用いて符号化系列信号を生成し、各レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂにレーザ光の出射のオン／オフを制御する制御信号として供給する。

制御・処理部２８は、光源制御部２８ａにおけるコードの生成のタイミングに同期して一定のクロック信号で駆動して、受光信号のＡ／Ｄ変換を行うＡ／Ｄ変換器２８ｃおよび一定のクロック信号で駆動して受光信号に所定の演算処理を施す演算処理部２８ｄを備える。
Ａ／Ｄ変換器２８ｃは、受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで生成されて増幅された受光信号をＡ／Ｄ変換によりサンプリングする。サンプリングされた受光信号は演算処理部２８ｄにて演算処理に供される。なお、サンプリングの時間分解幅（サンプリング間隔）は、後述するように符号化系列信号と受光信号との相関関数を効率良く演算するために、符号化系列信号の時間分解幅に揃えられるのが好ましい。例えば符号化系列信号の時間分解幅が４ナノ秒であれば受光信号のサンプリングの時間分解幅も４ナノ秒あるいはその整数分の１とするのが好ましい。

演算処理部２８ｄは、光源制御部２８ａにおけるコードの生成のタイミングに同期して受光信号の演算処理を行うように構成され、受光部２６から出力された受光信号に含まれる光信号を識別して、どのレーザ光の照射によるどの蛍光の光信号を含んでいるかを、特定する部分である。

試料１２中の蛍光色素から発する蛍光の光信号は、光源制御部２８ａで生成された既知の符号化系列信号に従って変調された（出射を制御した）レーザ光による蛍光の信号である。このため、この光信号も光源制御部２８ａで生成された符号化系列信号に従って光強度が変調した信号となっている。したがって、光源制御部２８ａで生成された入力信号であるコード（符号化系列信号）と応答信号である受光信号とを同期させて相関関数を調べることにより、受光信号がどのコードによって変調されたレーザ光による蛍光の光信号を含んでいるのかを知ることができる。すなわち、光源制御部２８ａで生成されたコードと受光信号との相関関数を演算し、受光信号と高い相関値を持つコードがある場合、受光信号は、このコード（符号化系列信号）によって変調されたレーザ光による蛍光を光信号として含んでいるといえる。一方、相関が極めて低いか、無相関を示すコードは、このコードによって変調されたレーザ光による蛍光を光信号として含んでいないといえる。したがって、レーザ光源毎に異なるコードで変調したレーザ光を出射させることで、受光した蛍光がどのレーザ光により発したものであるかを知ることができる。
演算処理部２８ｄは、入力信号であるコードと応答信号である受光信号との相関関数を、巡回するコードの周期にしたがって繰り返し平均化処理することにより、安定した値として求める。求めた値によって、受光した蛍光がどのレーザ光により蛍光したものであるかを特定する。また、各光電変換器２７ａ〜２７ｃが受光する光の波長帯域もわかっているので、蛍光の種類も特定することができる。
さらに、演算処理部２８ｄは、レーザ光の出射を制御するコードを入力信号とし、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される受光信号を応答信号とする伝達関数を算出し、レーザ光の照射に対する蛍光色素の蛍光緩和特性を求める。

こうして、受光信号から、試料１２中の蛍光色素がどのレーザ光の照射によりどの波長帯域で放射した蛍光の信号を含んでいるかを識別し、特定することができる。
このような符号化系列信号におけるビットシフト量と符号化系列信号の時間分解幅Δｔとの積である時刻０〜ｔ_１間の時間および時刻０〜ｔ_２間の時間のいずれも、試料１２中のいずれの蛍光色素の蛍光緩和時間に比べて長いことが好ましい。すなわち、蛍光の強度は図７に示すような蛍光緩和特性に従って時間と共に低減し、この時の蛍光強度の緩和時間をτとするとこの蛍光緩和時間τは、図４中の時刻０〜ｔ_１間の時間および時刻０〜ｔ_２間の時間より短いことが好ましい。１回の測定の間に多数のパルスレーザ光を照射することにより、光エネルギーを効率よく与えて、蛍光を効率よく放射させることができる。なお、符号化系列信号の時間分解幅Δｔは蛍光緩和時間に比べて十分に短くなる様に定められる。

制御・処理部２８は、受光信号に含まれる蛍光の光信号を識別して、受光信号がどのレーザ光の照射に基づくどの波長帯域の蛍光の信号であるかについての特定結果の情報を分析装置５０に供給する。
分析装置５０は、制御・処理部２８から供給される特定結果の情報を用いて、管路３０を通過する試料１２中に含まれる生体物質の種類等を特定し、試料１２中に含まれる生体物質の分析を行う装置である。分析装置５０では、試料１２中の生体物質に付着した蛍光色素の種類が既知であり、蛍光色素が励起されるレーザ光の種類および蛍光する波長帯域がわかっているので、制御・処理部２８の特定結果の情報を用いて生体物質の種類等を特定することができる。
こうして、分析装置５０は試料１２中の生体物質の種類のヒストグラムや各種特性を短時間に求める。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。

このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０では、まず、試料１２が管路３０を流れ、測定点でレーザ光による照射が成されると、受光部２４で試料１２の通過を検出する検出信号が制御・処理装置２８にトリガ信号として出力される。
制御・処理装置２８では、この検出信号をトリガ信号とし、このトリガ信号に同期して、自己相関性を有し、かつ他の符号化系列信号と直交性を有する符号化系列信号を生成し、これを巡回的に繰り返し生成する。この符号化系列信号は、レーザ光源部２２からのレーザ光の出射のオン／オフを制御する制御信号として用いるために、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂに供給される。
レーザ光源部２２では、この制御信号に従って各レーザ光の出射のオン／オフが制御され、符号化系列信号によって時間変調した信号情報を備えるレーザ光が生成される。このレーザ光は測定点を通過する試料１２中の蛍光色素を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が発する蛍光は、受光部２６にて受光される。その際、蛍光色素からの蛍光は、時間的に変調されたレーザ光に励起して生じるため、レーザ光の時間変調に対応して蛍光強度も時間変調している。

このようにして、受光部２４による試料１２の通過の検出から変調されたレーザ光を照射するまでの時間は極めて短く、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、巡回的に繰り返す符号化系列信号によって変調されたレーザ光が試料１２に照射される。
ここで、レーザ光を変調する符号化系列信号は、数ナノ秒の時間分解幅、例えば２ナノ秒の時間分解幅で生成される場合、符号長さＮが２５５ビットの符号化変調信号の場合、０．５１０μ秒(＝０．００２×２５５）を１周期として符号化系列信号が繰り返し巡回して生成される。この繰り返し生成される符号化系列信号に基づいてレーザ光が変調される。したがって、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、レーザ光は、０．５１０μ秒を１周期とする符号化系列信号が数回〜数１０回巡回される。

受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで受光されて出力される受光信号は、Ａ／Ｄ変換器２８ｃにおいて受光部２４から出力されたトリガ信号のタイミングで同期が取られ、生成された符号化系列信号の時間分解幅Δｔと同じ時間分解幅で、受光信号のサンプリングが行われる。サンプリングは例えば８ビットのサンプリング（０〜２５５の階調のサンプリング）である。
このサンプリングされた受光信号と、光源制御部２８ａで生成された自己相関性を有し、かつ直交性を有する符号化変調信号との相関関数が演算される。受光信号は、蛍光強度が例えば８ビットで多階調でサンプリングされるので、相関関数の値（相関値）が予め設定された閾値以上の場合、受光信号は符号化変調信号と相関ありと判定され、受光信号にはレーザ光の変調に用いた符号化系列信号と同じ信号情報を持った蛍光の光信号が含まれるとされる。一方、相関値が予め設定された閾値より低い場合、受光信号は符号化変調信号と無相関であると判定され、この受光信号にはレーザ光の変調に用いた符号化系列信号の信号情報を持った蛍光の光信号が含まれないとされる。

なお、光電変換器２７ａ〜２７ｃは、バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３により波長帯域別に受光して受光信号を出力するので、受光信号がどの波長帯域の蛍光の信号なのかを知ることもできる。したがって、試料１２中から蛍光を発する蛍光色素の種類を特定することができる。従来においては、レーザ光を変調して信号情報を含ませることは行わないので、どのレーザ光の励起による蛍光であるかを特定することができない。
このように本発明では、同一の波長で放射する蛍光であっても、励起に用いるレーザ光の符号化系列信号を変えることで、異なる光信号として受光することができるので、直交性を有する符号化系列信号を多数用いることで、蛍光色素の励起に用いられる多数のレーザ光を短時間のうちに特定することができる。したがって、蛍光の波長帯域が近接する多数の蛍光色素であっても、たとえ多数のレーザ光を合成して一度に照射しても、照射するレーザ光の信号情報が蛍光に含まれ、この信号情報が受光信号の中で識別できる限りにおいて、試料中に付着する蛍光色素を特定することができる。

なお、レーザ光による蛍光色素の蛍光強度は極めて弱く、受光信号のレベルは、この受光信号に混入するバックグランドノイズレベルに対してそれほど高いものではない。このため、受光信号がバックグランドノイズレベルに埋もれる可能性の高い初期の信号（ｔ＝０に近い時間での信号）を除去するために、例えば０．５ナノ秒〜４ナノ秒とパルス幅の短いパルスレーザ光が蛍光色素を励起する照射光として通常用いられる。蛍光の緩和時間がレーザ光のパルス幅より長いことを用いてレーザ光の回り込みなどのバックグランドノイズを除去した受光信号を得ることができる。しかし、パルスレーザ光として出射するレーザ光の平均エネルギーはそれほど高くないため、計測可能な程度の蛍光強度を得ることができない場合も多い。本発明は、レーザ光の出射のオン／オフを断続的に行いながら一定時間照射することで、すなわち時間変調したレーザ光を照射することで、尖頭値はそれほど高くないが平均エネルギーを大きくすることができる、すなわち、レーザ光を連続して照射する場合の約半分の光のエネルギーを蛍光色素に与えることができる。これによって、蛍光色素を効率よく照射することができ、蛍光色素の発する蛍光を効率よく検出することができる。

以上、本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。また、本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置はフローサイトメータに適用される場合に限定されない。レーザ光により測定対象物を計測する種々の分野、例えばレーザレーダ等の分野に適用することができる。

本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。 図２に示すレーザ光源部から出射されるレーザ光と蛍光色素の発する光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。 本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。 本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置に用いられる光源制御部および信号処理部の一例を示す概略構成図である。 本発明の符号化変調レーザによる蛍光検出装置で生成される符号化系列信号の例を示す図である。 蛍光色素が発する光の蛍光強度の特性を説明する図である。

符号の説明

１０ フローサイトメータ
１２ 試料
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２２ｒ Ｒ光源
２２ｇ Ｇ光源
２２ｂ Ｂ光源
２３ａ₁，２３ａ₂，２３ｂ₁，２３ｂ₂ ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ｃ₁，２６ｃ₂，２６ｃ_３ バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ 光電センサ
２８ 制御・処理部
２８ａ 光源制御部
２８ｂ 信号処理部
２８ｃ Ａ／Ｄ変換器
２８ｄ 演算処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ レーザドライバ

Claims (10)

1. 測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物からの光信号を受信して信号処理を行う検出装置であって、
   測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
   レーザ光の照射された測定対象物からの光信号を受信して受光信号を出力する受光部と、
   １ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号を制御信号として用いて前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオン/オフを制御する光源制御部と、
   前記受光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの光信号を識別する信号処理部と、を有し、
   前記複数の符号化系列信号は、１つの符号化系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符号化系列信号が互いに直交するように構成され、
   前記光源制御部は、前記制御信号を繰り返し生成し、前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオン/オフを繰り返し生成された前記制御信号に基づいて制御することを特徴とする符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
2. 前記信号処理部は、測定対象物からの光信号から得られた前記受光信号と前記制御信号との相関関数を求め、求めた相関関数の値の大小によって、前記測定対象物からの光信号が前記レーザ光の照射によるものか否かを判別する請求項１に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
3. 前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、
   前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、
   前記信号処理部は、前記受光部において複数のレーザ光からの光信号が重なって出力された受光信号から、レーザ光の出射に用いた符号化系列信号を用いて、各レーザ光に対する測定対象物からの光信号をそれぞれ、前記相関関数を用いて識別する請求項２に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
4. 前記測定対象物は、レーザ光の照射により蛍光する蛍光色素を備え、
   前記光源制御部は、前記符号化系列信号の前記ビット方向のシフト量と前記符号化系列信号の時間分解幅との積が前記蛍光色素の蛍光緩和時間に比べて長くなるように設定して前記符号化系列信号を生成する請求項３に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
5. 前記複数のレーザ光源のうち少なくとも２つは、出射するレーザ光の波長帯域が互いに異なるものである請求項３に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
6. 前記測定対象物は複数種類あり、各種類の測定対象物は、レーザ光の照射により蛍光する波長帯域が互いに異なる蛍光色素を、測定対象物の種類毎に備えている請求項１〜５のいずれか１項に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
7. 前記受光部は、蛍光する波長帯域が互いに異なる前記蛍光色素からの光信号を分離して別々に受光するためのフィルタを有する請求項６に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
8. 前記信号処理部は、前記光源制御部において前記符号化系列信号の生成に用いる時間分解幅を用いて前記受光信号のサンプリングを行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
9. 前記信号処理部は、４ナノ秒以下の時間分解幅で受光信号のサンプリングを行って受光信号の処理を行う請求項１〜８のいずれか１項に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。
10. 前記測定対象物は蛍光色素の付着した生体物質であり、前記蛍光色素は、前記生体物質の種類を識別するラベルとして用いられて生体物質の分析に用いられる請求項１〜９のいずれか１項に記載の符号化変調レーザによる蛍光検出装置。

Images