JP4150588B2

JP4150588B2 - ネオセントロメアに基づくミニ染色体又は人工染色体

Info

Publication number: JP4150588B2
Application number: JP2002552165A
Authority: JP
Inventors: チュー，コング−ホング，アンディ; ウォング，リー，フゥア; セイファリ，リチャード，エリック
Original assignee: マードックチルドレンズリサーチインスティチュート
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2021-12-20
Also published as: JP2004525615A; EP1354055A4; CA2431884A1; EP1354055A1; NZ526484A; WO2002050288A1; US20040081982A1; WO2002050288A9

Description

本発明は一般的にネオセントロメア又はその機能的誘導体又はその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型を包含する規定された若しくは単離された核酸分子、及びとりわけ哺乳動物（例えば、ヒト）及び非哺乳動物のミニ染色体及び人工染色体を含むある範囲の真核生物のミニ染色体及び人工染色体を開発する場合におけるその使用に関する。本発明はさらに、ミニ染色体を開発するためのテロメア関連染色体トランケーション（ＴＡＣＴ）アプローチを提供するが、このアプローチに限定されるわけではない。本発明は、ミニ染色体を含むネオセントロメアを調製する如何なるトランケーションアプローチにも関連し、あるいは人工染色体の構築においてネオセントロメア機能を提供するクローニングされ若しくは予め構築されたＤＮＡを用いる如何なるトランスフェクションアプローチにも関連する。このようなミニ染色体及び人工染色体は遺伝子治療の分野でも有用である。

本明細書中で数値で引用した出版物の書誌的事項の詳細は明細書の末尾に集めてある。

本明細書における如何なる先行技術への参照も、その先行技術がオーストラリアにおいて又は如何なる他の国においても通常の一般的知識の一部を構成するとの認識又は示唆を示すものではなく、そしてそう解すべきでもない。

組換えＤＮＡ技術の急速に発展する精緻化は研究や医学分野・関連厚生分野における進歩を著しく促進した。とりわけ重要な領域はヒト遺伝学を含む哺乳動物遺伝学においてであり、遺伝的異常の背後に潜む分子的機序の解明においてである。この分野での研究の進歩はヒトのセントロメアを含む核酸分子の完全な配列決定が欠如していることにより妨げられてきた。このような分子の同定及び／又はクローニングはヒト細胞を含む真核細胞や特定の哺乳動物中に遺伝子を導入するための技術の発達を促進するであろうし、そして遺伝子治療や哺乳動物細胞においてある範囲の組換え遺伝子産物を生産するための発現系の開発にとっての重要な財産となるであろう。完全に配列決定されたセントロメアの同定及び／又はクローニングは哺乳動物のミニ染色体及び人工染色体の開発を促進することが重要である。

哺乳動物のミニ染色体及び人工染色体は、エピソーム的に存在しそして宿主のゲノムＤＮＡから独立にそれらの内因性制御因子の下で遺伝子を発現させうるそれらの能力に基づいて、多様な潜在的バイオテクノロジー的応用及び治療分野での応用を有する。これらは実質的に完全に機能的な哺乳動物染色体であるから、これらの実体中に導入され得るＤＮＡのサイズには理論的上限は存在しない。これらの酵母の同種体（人工染色体）との類比から、哺乳動物のミニ染色体及び人工染色体は、正常な分離のためには、機能的な哺乳動物セントロメア、テロメア及びＤＮＡ複製起点を必要とすると仮定されてきた。現時点で、これらの三つの成分の中で最も理解されておらず且つ最も複雑なものはセントロメアである。

正しいセントロメア活性に必要なタンパク質成分の同定（その数は増加しつつある）及び多様な種におけるセントロメアＤＮＡ配列の特性決定はセントロメアの形成及び機能の根底にある機序についての知識を顕著に増加させた（非特許文献１，２，３参照）。この知識は哺乳動物のミニ染色体及び人工染色体の構築のための幾つかの戦略の開発を促進させた。一つの戦略は、ヒトα−サテライトの大きなアレーを持つテロメアＤＮＡをヒト細胞中に共トランスフェクションさせることによるヒト人工染色体の新たな形成を含む（非特許文献４，５，６，７）。この戦略を用いる研究により、ＣＥＮＰ−Ｂボックスを含むα−サテライトＤＮＡのみが新たな人工染色体形成に関与できることが明らかにされた（非特許文献５，８）。一般化された人工染色体のうちの一部はその構造が線形であるが（４）、他のものは常に環状であった（非特許文献５，７，８）。これらの人工染色体はそのサイズが約１Ｍｂ〜１３Ｍｂの範囲であり、通常注入したＤＮＡよりも１オーダー以上大きかった。このサイズの増加はトランスフェクション後の注入ＤＮＡの末端結合によるものであった（非特許文献４）。

別の１戦略は、正常なセントロメアの周りの非本質的な染色体様物質を除去してミニ染色体をインサイチュ生産するために、テロメア関連染色体トランケーションの使用を含む。ヒトＸ染色体の配列トランケーションは、Ｘ染色体αサテライトＤＮＡの約１．８Ｍｂ及び近位のＸｐＤＮＡの４００ｋｂを含む２．５Ｍｂのミニ染色体を生じた（非特許文献９，１０，１１）。この染色体は正常なヒトＸ染色体のそれに匹敵する有糸分裂安定性を示す（非特許文献１０，１１）。同様のアプローチにより、ヒトＹ染色体に由来したミニ染色体が幾つか作られた。それらのサイズは約０．７Ｍｂから４Ｍｂを超える程の範囲であり、サイズのより小さなものは比較的不安定であった（非特許文献１２，１３）。より大きなミニ染色体はＣＨＯ細胞、ニワトリＤＴ４０細胞及びマウスＬ細胞中で安定に維持されたが、マウスＥＳ細胞中に導入されると安定性が悪くなった、これは細胞型が異なると正しいセントロメア機能に対する要求も異なることを示唆する（非特許文献１４，１５）。

哺乳動物の人工染色体を調製するための第３の戦略は、近点のＤＮＡの増幅及びそれに続く染色体の制御された切断により６０と４００Ｍｂの間のサテライトＤＮＡに基づく人工染色体を調製する工程を含む（非特許文献１６，１７，１８，１９，２０）。

近年、セントロメア機能と通常関連付けられてきた反復配列を欠如するネオセントロメア類（ＮＣｓ）がヒト（非特許文献２１）及びドロソフィラ（非特許文献２２）中で記述された。基礎をなすＤＮＡの特性決定及びヒトにおけるネオセントロメアのタンパク質結合の様相はＤＮＡ一次配列組成とは無関係なセントロメア形成の後生的な機序を示唆した（非特許文献２３，２４，２５，２６）。ネオセントロメアの発見は、セントロメアＤＮＡの反復配列の使用に基づいて従来記述されたきたアプローチに替わる、ミニ染色体及び人工染色体の構築のためのアプローチを提供する。
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本発明者らは完全に機能的なヒトネオセントロメアを含む有糸分裂に対し安定な一連のヒトミニ染色体を作成することを目的とする。ヒトミニ染色体の作成は遺伝子治療、トランスジェニック植物及び動物の生産、及び組換えタンパク質の生産の発展を可能とする。

発明の概要
本明細書を通じて、論旨が別意を要求しない限り、語「含む（comprise) 」又は「含む(comprises) 」若しくは「含む(comprising)」などのその変形は述べられた要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の含有を意味するが他の任意の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の排除を意味するものではないと理解される。

ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は配列番号の数（配列番号：）により引用される。この配列番号：は配列同定子＜４００＞１、＜４００＞２などに数値的に対応している。配列表は特許請求の範囲の後に添付される。

本発明はテロメア関連染色体トランケーション（ＴＡＣＴ）アプローチを使用してミニ染色体を開発することに部分的に基づいている。選択可能マーカー、ヒトのマーデル（mardel) （１０）などの真核生物染色体のｐ' 又はｑ' 腕の上の小さな領域に相同なターゲティングＤＮＡ配列、及びテロメア配列の小さなアレーを含むトランケーション構築物が開発される。ｐ' 及びｑ' 腕はこのマーデル（１０）染色体の短い腕及び長い腕を指すが、一般的にはネオセントロメアを含む任意のマーカー染色体の短い腕及び長い腕をも指す。第１のトランケーション構築物を標的細胞中にトランスフェクトし、そのマーカーを選択する。これは、使用したトランケーション構築物に応じて先端切断されたｐ' 及びｑ' 腕を持つ標的染色体を結果として生ずる。次に他のｐ' 及びｑ' 腕のトランケーション構築物を用いて同じ細胞の中に第２のトランケーション構築物をトランスフェクトする。再び、選択した後、該標的染色体のｐ' 及びｑ' 腕のトランケーションされた形が得られる。次いで、得られたミニ染色体を単離し、遺伝子治療又は遺伝子発現のために使用しうる。テロメアＤＮＡを含む若しくは含まない修正標的化法を用いて遺伝子若しくは他のヌクレオチド配列を標的染色体中に導入してもよい。

本発明の一つの側面は真核生物のネオセントロメアを規定するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。

より具体的には、本発明は真核生物染色体に由来するヌクレオチド配列を含み且つネオセントロメアを含む単離された核酸分子であって、適合細胞中でトランケーション型若しくは改変型で存在し、又は適合細胞中に予め作成されたＤＮＡ実体としてトランスフェクションにより導入された場合複製でき、染色体外因子として作用でき且つ細胞分裂と共に分離することができる核酸分子を提供する。

本発明の別の一側面はネオセントロメア又は機能的同族体を同定する方法であって、哺乳動物ＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃに特異的な抗体又は哺乳動物ＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃと交差相互作用できる抗体を用いるクロマチン免疫沈降法によりＤＮＡを単離する工程、免疫沈降法により単離されたＤＮＡを増幅する工程、及び増幅されたＤＮＡ中に標識を組み込む工程、次いで増幅されたＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡ若しくはその等価物を含むＤＮＡアレー精査する工程、及び該免疫沈降したＤＮＡにハイブリダイズするクローンを同定し且つ単離する工程を含む方法の使用を意図する。

本発明のさらなる側面は、細胞分裂の間に安定に分離できるネオセントロメア又はその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型を含むヒトネオセントロメアに基づくミニ染色体（ＮＣ−ＭｉＣｓ）の形態で単離された核酸分子を提供する。

本発明のさらに別の一側面は、ミニ染色体を作成する方法であって、
ネオセントロメアを含む染色体を保持するヒト又は哺乳動物の細胞中に、標的染色体のｑ' 及びｐ' 腕の一方又は他方の上に、テロメア配列、選択可能マーカー、ターゲティング相同ＤＮＡを有するベクターを含むトランケーション構築物を導入する工程、
選択可能マーカーを発現する細胞を選択する工程、
該細胞の中に該ｑ' 又はｐ' のターゲティングＤＮＡの他方を含む第２のトランケーション構築物を導入する工程、
該第２のトランケーション構築物と関連する選択可能マーカーを発現する細胞を選択する工程、及び
次いで、ネオセントロメアを含むトランケーションされた染色体を単離する工程、
を含む方法を提供する。

本発明はネオセントロメア特性を示す核酸分子の同定及び単離に一部基づいている。本発明によれば、ネオセントロメアは正常なセントロメア（例えば、ヒトにおけるα−サテライトやマウスにおけるマイナーサテライト）の上に存在する反復ＤＮＡ配列を実質的な量として含まず、活性化されるとセントロメアとして機能することができるセントロメアであると考えられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）のネオセントロメアはα−サテライトＤＮＡ反復配列を実質的に含まないセントロメアである。用語「実質的な」とは、この論旨において、該核酸分子が培地のストリンジェンシー条件の下でのＦＩＳＨ分析により又は培地の相同性基準の下での直接配列比較により、α−サテライトなどの正常なセントロメア反復ＤＮＡ配列を検出可能な程に含まないことを意味する。しかしながら、このネオセントロメアは高度に分岐した（highly diverged)正常セントロメア反復ＤＮＡ配列を少数含みうる。例えば、霊長類においては、α−サテライトＤＮＡは長さが約１７０ｂｐであると考えられる。活性化されたネオセントロメア又は他の方法でセントロメアとして機能するネオセントロメアを含む核酸分子は、本発明に従ってミニ染色体又は他のＤＮＡと共に予め作成された形態の核酸分子がトランスフェクションし、複製し、染色体外に留まり、細胞分裂と共に分離することを容易にする。本明細書で「ネオセントロメア」と言うときは、ヒト染色体上のα−サテライトＤＮＡ反復配列などの、内因性且つ構造的に変化のない染色体のセントロメアの上に正常に存在する反復ＤＮＡ配列をセントロメアが実質的に欠如していることを意味すると理解される。さらに、ネオセントロメアはゲノムの正常な非セントロメア領域から誘導されると考えられる。

従って、本発明の一つの側面は、真核生物のネオセントロメアを規定するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。

より具体的には、本発明は真核生物の染色体に由来するヌクレオチド配列を含み、且つその核酸分子が適合細胞中でトランケーションされた若しくは改変された形態で存在するネオセントロメア、又は適合細胞中に予め作成されたＤＮＡ実体としてトランスフェクションにより導入された場合複製でき、染色体外因子として作用できそして細胞分裂と共に分離できるネオセントロメアを包含する単離された核酸分子を提供する。

本発明はヒトのネオセントロメアの同定により本明細書に例示される。しかしながら、これは、本発明が哺乳動物、植物、鳥類、昆虫、ぜん虫、真菌、酵母及び爬虫類などの染色体由来の全ての真核生物のネオセントロメアに及ぶという理解の下でなされる。しかしながら、最も好ましいネオセントロメアは、ヒト染色体及びその哺乳動物相同染色体由来のものである。

本発明は、マーデル（１０）染色体のｑ' 腕の標的化されたテロメア関連トランケーション及びｐ' 腕の明らかな無作為トランケーションの組み合わせを用いた幾つかのネオセントロメアに基づくヒトのミニ染色体の構築に一部基づいている。マーデル（１０）染色体はヒト患者中で同定された染色体を指し、ヒト染色体１０の再配列から生ずる。このマーデル（１０）マーカーは有糸分裂において安定であり、本発明によれば非セントロメアと見られる位置に機能性のネオセントロメアを含む。マーデル（１０）のネオセントロメアは染色体１０のｑ２４とｑ２６の間に位置し、より具体的にはｑ２５付近に位置する。さらに具体的に言えば、このネオセントロメアは染色体１０のｑ２５．２に位置する。本発明はマーデル（１０）染色体のｑ２４〜ｑ２６領域からクローニングされたＤＮＡ並びに正常なヒト染色体１０の上の対応する領域により例示される。これらのＤＮＡ分子は機能を有するネオセントロメアを含む。しかしながら、本発明は哺乳動物及び非哺乳動物並びに植物、昆虫、ぜん虫、真菌、爬虫類及び酵母などの任意の染色体の上の任意のネオセントロメアに及ぶ。

１０ｑ２５領域由来のコスミドプローブ及びＢＡＣプローブを用いて詳細に地図化すると、トランケーション部位を定めることができ、ＮＣ−ＭｉＣｓがこの領域由来の単一コピーの無傷のＤＮＡを含むことを証明することができる。パン−α−サテライトＤＮＡを用いた広範なＦＩＳＨ、全ヒト染色体の全染色体ペイント、及び異なる部分染色体−１０のペイントにより、ＮＣ−ＭｉＣｓのいずれもがα−サテライトＤＮＡ又は他のヒトゲノム配列の検出可能な量を獲得しなかったことが明らかにされた。地図化データに基づいて、ＮＣ−ＭｉＣｓ３、４及び５のサイズは、それぞれ約1.6 、1.6 及び0.8 Ｍｂであると見積もられた。

本発明はさらに、ヒトのネオセントロメア又はその機能性誘導体又はその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型、又はその哺乳動物若しくは非哺乳動物の相同染色体を規定する三次元構造を有する核酸分子又はその化学的等価物を意図する。

さらにより具体的には、本発明はヒトネオセントロメア又はその機能性誘導体又はその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型又はその哺乳動物若しくは非哺乳動物の相同染色体を規定するコンホーメーションを指示するヌクレオチド配列又はその化学的等価物を有する単離された核酸分子であって、該セントロメアがＣＥＮＰ−Ａ及びＣＥＮＰ−Ｃ、これらのタンパク質に限定されないが、などのセントロメア結合性タンパク質と結合するものである核酸分子に関する。

本明細書においてセントロメアに関して「潜在的」と言う場合は、正常には機能しないがそれにもかかわらずある条件下では活性化されうるセントロメアへの言及をも含む。潜在的セントロメアは、それがα−サテライトＤＮＡ反復配列などの正常なセントロメアの上で見出される反復ＤＮＡ配列を実質的に含まない場合には、ネオセントロメアとみなしてもよい。非ヒト染色体中の好ましい反復ＤＮＡ配列はα−サテライトＤＮＡと機能的に等価な反復ＤＮＡであると考えられる。

従って、本発明の別の一側面はネオセントロメア又は機能性相同染色体を同定するための任意の方法であって、哺乳動物ＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃに特異的な抗体又は哺乳動物ＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃと交差相互作用できる抗体を用いるクロマチン免疫沈降法によりＤＮＡを単離する工程、免疫沈降法により単離されたＤＮＡを増幅する工程、増幅されたＤＮＡ中に標識を組み込む工程、及び次いで増幅されたＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡ又はその等価物を含むＤＮＡアレーを精査する工程、及び該免疫沈降したＤＮＡにハイブリダイズするクローンを同定し単離する工程を含む方法の使用を意図する（５２）。

本発明のネオセントロメアのサイズは、約50ｂｐから約 2000 ｋｂｐまで、約70ｂｐから約 1000 ｋｂｐまで、約75ｂｐから約 800ｋｂｐまで、約80ｂｐから約 500ｋｂｐまで、約85ｂｐから約 200ｋｂｐまで、約90ｂｐから約100 ｋｂｐまで、約100 ｂｐから約 1ｋｂｐまで、約120 ｂｐから約 500ｂｐまで、約180 ｂｐから約 300ｂｐまでの範囲でありうる。一つの実施態様では、ネオセントロメアは約 60 〜100 kbp である。別の一実施態様ではネオセントロメアは約80ｋｂｐである。とりわけ好ましい実施態様では、ネオセントロメアは約 50 ｋｂｐから約 2000 ｋｂｐまでである。ネオセントロメアは、ＣＥＮＰ−Ａ結合ドメイン又は他のセントロメアタンパク質結合ドメイン、又は異なる複製タイミング、クロマチン構造、足場構造体、化学的修飾状態（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ポリＡＤＰリボシル化）を示すドメインなどの別種の構造的又は機能的に異なるドメインを包含してもよい。機能的に重要な全てのドメインを包含するためサイズが２０００ｋｂｐより大きなネオセントロメアも提供される。

本発明のミニ染色体のサイズは、約 500ｂｐから約 20000ｋｂｐまで、約 700ｂｐから約 1000 ｋｂｐまで、約 750ｂｐから約 8000 ｋｂｐまで、約 800ｂｐから約 5000 ｋｂｐまで、約 850ｂｐから約 2000 ｋｂｐまで、約 900ｂｐから約 1000 ｋｂｐまで、約 1000 ｂｐから約 10 ｋｂｐまで、約 1200 ｂｐから約 5000 ｋｂｐまで、約 1800 ｂｐから約 3000 ｋｂｐまでの範囲でありうる。一つの実施態様では、ミニ染色体は約 600〜1000ｋｂｐである。別の一実施態様では、ミニ染色体は約 800ｋｂｐである。とりわけ好ましい実施態様では、ネオセントロメアは約 500ｋｂｐから約 20000ｋｂｐまでである。ミニ染色体はネオセントロメア、複製起点及びテロメアなどの別種の構造的又は機能的に異なるドメインを包含してもよい。とりわけ好ましい実施態様では、ミニ染色体は活性なネオセントロメアを含んでいる。

本発明の核酸分子は、健常なヒト被験者由来の天然に生じるヌクレオチド配列を含んでもよく、あるいはマーデル（１０）染色体若しくは等価な状態若しくは類似の状態を与える染色体を保持する被験者などの一以上の染色体依存状態を示すヒト被験者由来のヌクレオチド配列を含んでもよく、又は天然に生ずる配列若しくは天然に生じない配列に関して一つ以上のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加を有してもよい。このような改変は本明細書では「誘導体」と呼ばれ、天然に生ずるヌクレオチド配列の突然変異、断片、部分、相同染色体及び類似体が含まれる。本発明の誘導体はなお機能性ネオセントロメアを規定していることが好ましい。

本明細書で「ネオセントロメア」と言う場合は、機能性ネオセントロメア又はその機能性誘導体への言及をも含み、ネオセントロメアが有糸細胞分裂の間における姉妹染色分体結合や染色体分離を容易にすることができ、及び／又はＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃ及び／又は他の機能的に重要なセントロメアタンパク質と結合することができ、及び／又は抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体又は抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体又は他の機能的に重要なセントロメアタンパク質に対する抗体と相互作用できることを意味する。一般に、そして好ましくは、ネオセントロメアはＣＥＮＰ−Ｂ又は抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体と相互作用することはできない。また、ネオセントロメアは後成の機序若しくは他の関連機序により活性化され得る潜在的セントロメアであってもよい。ネオセントロメアはハイブリッド又は他のヒト、哺乳動物、植物又は酵母のネオセントロメアであってもよい。正確なコンホーメーションに達成するように、例えば、重合技術により提供された合成ネオセントロメアも本発明により意図される。ネオセントロメアのこのような形態及び定義の全てはこの用語の使用により包含される。

本発明の別の一側面は、ネオセントロメア若しくはその機能性誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型を規定するコンホーメーションを指示するヌクレオチド配列若しくは化学的等価物を含む単離された核酸分子若しくは化学的等価物であって、該ネオセントロメアがα−サテライトＤＮＡなどの正常セントロメアの反復ＤＮＡを実質的に欠くものであり、ネオセントロメアがＣＥＮＰ−Ａ若しくはＣＥＮＰ−Ｃ若しくは他の機能的に重要なセントロメア結合性タンパク質又はそれらの抗体と結合できるものである核酸分子を提供する。

このネオセントロメアはＣＥＮＰ−Ｂ又はその抗体と相互作用できないことが好ましい。

一つの実施態様では、このネオセントロメアは、染色体１０上のｑ２４とｑ２６の間に位置し、特に染色体１０上のｑ２５に位置するヒトゲノム領域に対応する。

コンホーメーションを有するネオセントロメア若しくはその機能性誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型を規定する本発明の核酸分子若しくはその化学的等価物は、とりわけヒトネオセントロメアに基づくミニ染色体（ＮＣ−ＭｉＣｓ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣｓ）、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）及び植物人工染色体（ＰＬＡＣｓ）などのミニ染色体若しくは人工染色体の作成に有用である。ヒトＮＣ−ＭｉＣｓは、これらが大量のＤＮＡを収容でき、且つ、ヒトの細胞中で増殖できるので、特に有用である。このＮＣ−ＭｉＣｓはその起源が非ウイルス性であり、従って、通常のウイルスに基づくベクター系よりも、例えば治療用の遺伝子を導入することによる遺伝子治療に一層適している。さらに、ＮＣ−ＭｉＣｓは染色体外に留まっており、従って、挿入による又は置換による突然変異誘発の危険がない。ＮＣ−ＭｉＣｓの本質は細胞分裂のあいだ安定な分離を可能とするネオセントロメア若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型の存在である。ＮＣ−ＭｉＣｓも染色体外に留まっており、従って、遺伝子治療に一層適している。「染色体外」と言うときは、それが主染色体と合体せず、事実上エピソームであることを意味する。

従って、本発明は真核細胞の複製起点、及びその中で遺伝子構築物が複製すべき細胞において機能を有するテロメアヌクレオチド配列により挟まれた真核生物のネオセントロメア若しくはその機能的誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型、又はその哺乳動物若しくは非哺乳動物の相同染色体を包含する核酸分子を含む遺伝子構築物であって、細胞内に導入されると該遺伝子構築物が細胞分裂と共に分離する環状若しくは線形形状いずれかの複製する染色体外因子となる遺伝子構築物を提供する。

より具体的には、本発明は、哺乳動物、ヒト、植物若しくは酵母の細胞の複製起点及び核酸分子を含むミニ染色体若しくは人工染色体の形態の遺伝子構築物をさらに意図する。ここで、核酸分子はテロメアヌクレオチド配列により挟まれた又はミニ染色体若しくは人工染色体がその中で複製すべき細胞中で機能するテロメア配列を殆ど又は全く持たない環状の、ヒトネオセントロメア若しくはその機能性誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型又はその哺乳動物若しくは非哺乳動物の相同染色体を包含する。

別の一実施態様は、哺乳動物、ヒト、植物若しくは酵母の細胞の複製起点、及び核酸分子であって、テロメア配列により挟まれた、又はミニ染色体若しくは人工染色体がその中で複製すべき細胞中で機能するテロメア配列を殆ど又は全く持たない環状の、ヒトネオセントロメア若しくはその機能性誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型又はその哺乳動物の相同染色体を規定する三次構造を有する核酸分子、を含むミニ染色体若しくは人工染色体の形態の遺伝子構築物を提供する。

さらに別の一実施態様は、哺乳動物、ヒト、植物若しくは酵母の細胞の複製起点、及びヒトネオセントロメアを規定するコンホーメーションを指示するヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むミニ染色体若しくは人工染色体の形態の遺伝子構築物であって、上記セントロメアがＣＥＮＰ−Ａ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃ及び／又は他のセントロメアタンパク質又はそれらの抗体と結合し、α−サテライトＤＮＡ反復配列を実質的に含まないものであり、上記核酸分子がテロメアヌクレオチド配列により挟まれているか又はミニ染色体若しくは人工染色体が複製すべき細胞の中で機能するテロメア配列を殆ど又は全く保持しない環状の形態である、遺伝子構築物に関する。

本発明はミニ染色体を作成する方法であって、
細胞中に、標的染色体のｑ’又はｐ’腕の一方若しくは他方の上にテロメア配列、選択可能マーカー、相同なターゲティングＤＮＡを有するベクターを含むトランケーション構築物を導入する工程、
該選択可能マーカーを発現する細胞を選択する工程、
該細胞に、該ｑ’又はｐ’を標的とするＤＮＡの他方を含む第２のトランケーション構築物を導入する工程、
該第２のトランケーション構築物と結合した選択可能マーカーを発現する細胞を選択する工程、及び
次いで、ネオセントロメアを含むトランケーションされた染色体を単離する工程、
を含む方法をさらに提供する。

一つの実施態様では、該ｑ’を標的とする腕及びｐ’を標的とする腕はマーデル（１０）染色体を標的とする。

特に好ましい実施態様では、ミニ染色体は図１に規定されているようにＮＣ−ＭｉＣ１〜５と定義される。

本発明は、ネオセントロメアを挟んでいるｑ’及びｐ’腕を有する染色体を含む細胞をさらに提供する。ここで、ｑ’及びｐ’腕はその一方又は両方がトランケーションされている。

上述の方法又はその修正法は、発現のためなどの遺伝子若しくは他のヌクレオチド配列を導入するためにも使用されうる。

本発明は、ヒト、霊長類、昆虫、酵母の真核細胞又は本発明の遺伝子構築物を保持する他の真核細胞に及び、且つそれらから生産されるタンパク質に及ぶ。

本発明の遺伝子構築物は、ミニ染色体及び人工染色体並びにミニ染色体及び人工染色体の作成に有用なＤＮＡ構築物を含む。

該遺伝子構築物はマーカー遺伝子、ユニークな制限部位、又は外来のＤＮＡの挿入を促進するための組換え促進マーカー（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼと共に使用するためのＬｏｘＰ・ＤＮＡ）を含む。従って、本発明の遺伝子構築物は目的の生産物をコードする外来の又は異種のＤＮＡをさらに含む。目的の好ましい生産物は、サイトカイン類、受容体類、成長調節剤類などをコードする遺伝子などの薬学的に有用な遺伝子を含む。内因性遺伝子は野性型遺伝子又は改変された遺伝子で置換してもよい。

該遺伝子構築物中に固有に存在する特異的ＤＮＡ配列（例えば、推定的ＥＳＴｓ又は発現された遺伝子又は不安定ＤＮＡ因子）も、同定され、取り出され又はさらなる遺伝子操作若しくは遺伝子工学により改変されうる。他のＤＮＡ成分（例えば、治療用遺伝子若しくはマーカー遺伝子、ＬｏｘＰ・ＤＮＡ配列、Ｉ−ＳｃｅＩなどのユニーク制限部位）を上記遺伝子構築物に後で付加してその有用性又は適用を改良若しくは拡大してもよい。

外来の若しくは異種のＤＮＡは特定被験者中で十分な量が合成されない分子をコードしてもよい。従って、コピー数の増加によりより大量の分子の合成が可能となる。

従って、本発明は、複製起点、及びヒトのネオセントロメア若しくはその機能性誘導体若しくはその潜在型、合成型若しくはハイブリッド型又は哺乳動物若しくは非哺乳動物の相同染色体を定める第１の核酸分子、ぺプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする第２の核酸分子を含む遺伝子構築物であって、該第１及び第２の核酸分子がヒトテロメア配列により挟まれているか又は該遺伝子構築物がその中で複製すべき細胞中で機能するテロメア配列を殆ど又は全く保持しない環状の形態で存在するものである遺伝子構築物を意図する。

本明細書で「分離する」と言うときは、好ましくは有糸分裂的に安定な分離を意味する。安定な分離は、４〜６か月の連続継代の後に娘細胞の４０〜６０％より多くにミニ染色体若しくは人工染色体が存在する場合と決定するのが便利である。

本発明は、ＨＡＣｓ、ＭＡＣｓ及びＰＬＡＣｓなどの上述のＮＣ−ＭｉＣｓに類似の他のミニ染色体若しくは人工染色体に、又はミクロ染色体、合成染色体及びそれらの変異体などの他の記述若しくは名前による同様な実体に及ぶ。

本発明の別の一側面は、本発明のヒトネオセントロメア若しくはその哺乳動物及び非哺乳動物の相同染色体と結合し、相互作用し若しくはその他の方法で会合するぺプチド、ポリペプチド及びタンパク質に関する。これらの分子は一次（１°）タンパク質と呼ばれるタンパク質であることが好ましい。この１°タンパク質はネオセントロメアに結合し、二次（２°）タンパク質はネオセントロメアと結合する前又は後に１°タンパク質に結合する。本発明のヒトネオセントロメアの同定は、例えば遺伝的障害の染色体をスクリーニングするために重要でありうる１°タンパク質及び２°タンパク質を検定するための機序を提供する。これは特に染色体分離の欠陥から生ずるダウン症候群における使用である。

１°タンパク質は、例えばゲルシフト検定により容易に検出される。ヒトネオセントロメアを規定する本発明の核酸分子を消化し、標識化し、１°タンパク質を含むと推定される核抽出物と接触させ、そしてゲル上で分離する。１°タンパク質はネオセントロメアの結合部分を保持する断片に結合すると、ＤＮＡ断片は結合したタンパク質のためより遅い速度でゲル中を移動する。

本発明は主題であるセントロメアと結合できる精製した１°タンパク質に及び、それをコードする遺伝子配列に及び、そしてそれに対する抗体にも及ぶ。

本発明のネオセントロメアは、例えば、ヒト線維肉腫細胞系統を用いて容易に同定され特性決定される。例えば、ネオセントロメアを保持すると疑われるＤＮＡは、一般的にはテロメア配列と共に線形形状で線維肉腫細胞中に導入される。次いで、人工染色体と呼ばれる、複製する染色体外の分離する因子の存在についてこの細胞をスクリーニングする。

本発明はさらに複製する染色体外の分離する核酸分子を保持する真核細胞を包含する。この真核細胞は哺乳動物細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることが最も好ましい。本発明のこの側面の核酸分子が本明細書に記載されるように好ましい。

下記の細胞系統はポートン・ダウン、サリズベリ、ウィルツ、ＳＰ４０ＪＧ、英国のＥＣＡＣＣ、センター・フォア・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・リサーチに２０００年１２月２０日に下記の受託番号の下に寄託された。

本発明は下記の非限定的実施例によりさらに説明される。

細胞培養及び化学物質
ＢＥ２Ｃ１−１８−５ｆ（５ｆと略称する）を先に記述したように（２７）培養した。ＨＴ１０８０及び誘導体を１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ）中で培養した。培地にハイグロマイシン（ロッシュ）、ピューロマイシン（シグマ社）、又はゼオシン（インビトロゲン）を、それぞれ２５０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、又は２００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。培地に１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ）を補充した。全ての細胞系統はサブコンフルエンスで維持した。微小細管解重合剤であるコルセミド（colcemid)(ギブコＢＲＬ）又はノカダゾール（nocadazole)(シグマ) を細胞収穫の前にそれぞれ１０μＭの濃度で１時間又は０．１μｇ／ｍｌの濃度で６〜１２時間培地に添加した。使用した化学物質は全て分子生物学的グレードのもので、市販のものを購入した。

細胞系統のトランスフェクション
５ｆ及びＺＢ３０細胞系統のトランスフェクションは電気穿孔法を用いて行なった。簡単に述べると、１０⁷個の対数増殖期の細胞を収穫し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、８００μｌの電気穿孔用緩衝液（２０ｍＭヘペス，ｐＨ 7.0、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのグルコース、2.5 ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄）中に再懸濁した。0.4 ｃｍキューベット中で線形化したＤＮＡ２０μｇを細胞と混合し、バイオラド・ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて細胞を 1.2ｋＶ，２５μＦで電気穿孔した。ＨＴ１０８０細胞又は誘導体細胞のトランスフェクションは先に述べた（３０）ような電気穿孔法又はリポフェクションのいずれかを用いて行なった。リポフェクションのためには、細胞を、トランスフェクションの１日前に、１５０ｍｍプレートの上の４０ｍｌに１〜３×１０⁵細胞／ｍｌで塗布した。これは実験の当日に５０〜７０％コンフルエンシーをもたらした。２ｍｌの無血清ＤＭＥＭを用いて１００μｌのフジーン６トランスフェクション試薬（ベーリンガー・マンハイム）を希釈し、この懸濁液を３７℃で５分間インキュベートした。２０μｇのＤＮＡも２ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中に希釈した。次いで、希釈されたフジーン６をＤＮＡ懸濁液中に滴下して添加した。この混合物を軽く叩き、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後、このＤＮＡ／フジーン６混合物を細胞の上に滴下して添加した。細胞を９６穴プレートに播種し、トランスフェクションの２４〜４８時間後に選別を行なった。

微小核体により媒介されるＨＴ１０８０への染色体移送
微小核体融合は先に記述した（３８）ように行なった。対数増殖期のドナーＺＢ３０細胞をコルセミド（１μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートした。４８時間後に細胞を収穫し、２０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（シグマ）を補充したパーコール／無血清ＤＭＥＭ（１：１）中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液をオークリッジ管（ナルジーン）に入れ３２℃で９０分間１８０００ｒｐｍで遠心分離に掛けた。細胞混合物の両方のバンドをペレットとし、無血清ＤＭＥＭで１回洗浄した後、３０、８、及び５μＭの等孔膜（ミリポア社，ＭＡ）を通して濾過した。次に微小核体を１０μｇ／ｍｌのＰＨＡＰ（ディフコ，ウェスト・モルシー，ＵＫ）を含む無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁し、３７℃で４５分間受容体ＨＴ１０８０細胞と凝集させた。凝集の後、５０％ｗ／ｖＰＥＧ（ベーリンガー・マンハイム）を添加することにより細胞を融合させ、室温で２分間インキュベートした後無血清ＤＭＥＭで濯いだ。インキュベーションの後、１０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で細胞を一晩培養した。次いで、その培地を２００μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＤＭＥＭで置換し、細胞を１４日の期間選別しながら維持した、後コロニーをさらなる特性決定のために釣り上げた。

ＦＩＳＨ／免疫蛍光
ＦＩＳＨ／免疫蛍光の結合は先に記述した（２５，５１）方法の改良法を用いて行なった。パン−α−サテライトプローブｐＴＲＡ７を用いるＦＩＳＨ及びテロメア配列（パースペクチブズ・バイオシステム，ＭＡ）のＰＮＡ−ＦＩＳＨは先に記述した（３９，４０）ように行なった。エピフルオレッセンス・ミクロスコピーは適当なフィルターセットを搭載したツァイス・アクソプランII (カール・ツァイス, カーネギー, オーストラリア) を用いて行なった。画像は、ソフトウェアIP Lab Version 2.5.5 (Scanalytics Inc., Fairfax, VA, USA) により制御されたパワーマックＧ３パーソナルコンピュータに連結した冷却電荷結合素子ビデオカメラ（SenSys 2, Photometrics, Tuscon, AZ, USA)を用いてデジタルで収録した。染色体ペインティング実験はＷＣＰ染色体ペイントキット（Vysis Inc.) を用いて製造者の説明書に従って行なった。部分染色体−１０（subchromosome-10) ペイントは、Ｍ．ロッキ（M. Rocchi)（ユニバーシティ・オブ・バリ）から得た体細胞放射ハイブリッドゲノムＤＮＡから誘導した。体細胞ハイブリッドＤＮＡのインター−アル・アンプリフィケーション（inter-Alu amplification)は、先に記述した（４１）ように、プライマー５’ＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＹＲＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号：１）及び５’ＲＣＣＡＹＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ（配列番号：２）を用いて行なった。ペイントプローブ及びＦＩＳＨの標識化は標準的方法を用いて行なった。

ポリクローナル抗ＣＥＮＰ−Ａ、モノクローナル抗ＣＥＮＰ−Ｂ、ポリクローナル抗ＣＥＮＰ−Ｃ、及びＣＲＥＳＴ−６抗血清は先に記述した（４２，４３，４４，２７）。ポリクローナル抗ＣＥＮＰ−Ｅ（４５）、抗ＣＥＮＰ−Ｆ（４６）、及び抗ｈＢＵＢ１（４７）はＴ．Ｊ．イェン（Fox Chase Cancer Center)により、ポリクローナル抗ｈＺＷ１０（４８）はＢ．ウィリアムズ及びＭ．Ｌ．ゴールドバーク（コーネル・ユニバーシティ）により、そしてポリクローナルｐ５５ＣＤＣ（４９）はＪ．ワインシュタイン（Amgen 社) により、そしてポリクローナル抗ＴＲＦ１（３２）はチチアデランゲ（ロックフェラー・ユニバーシティ，ＮＹ）により提供された。抗血清ＣＲＥＳＴ−６は自己免疫ＣＲＥＳＴ病の患者由来のもので、ＣＥＮＰ−Ａ及びＣＥＮＰ−Ｂを含むセントロメア成分に対する抗体を含む（５１）。他の二次的抗体はジャクソン・イミュノリサーチ・ラボラトリー・インク（ウェストグローブ，ペンシルベニア，USA ）から購入した。

トランケーション構築物
トランケーション構築物はｐＧＫ：ハイグロマイシン耐性遺伝子カセット、ｐＧＫ：ピューロマイシン耐性遺伝子カセット、又はｐＧＫ：ネオマイシン耐性遺伝子カセットのいずれかを含んでいた。ヒトテロメア反復の２ｋｂアレーは pBS Sal-tel(5) プラスミドから得られた（２８，５０）。マーデル（１０）のｐ’腕及びｑ’腕に対応するＤＮＡを含むゲノムコスミドクローンは先に記述された。高コピー反復ＤＮＡ配列を欠く５〜１０ｋｂ断片（サザンハイブリダイゼーション後のＣＯＴ−１ハイブリダイゼーションの欠如により明らかである）は、標準的方法を用いて、両方の方向でトランケーションベクター中にサブクローニングした。または、ゲノムＤＮＡをトランケーションベクター中にクローニングするためロングレインジＰＣＲキット（ベーリンガー・マンハイム）を用いてＢＡＣクローンから直接ＰＣＲ増幅した。トランケーション構築物はすべてｐＡｌｔｅｒ（プロメガ社）ベクター骨格中で作成した。

ゼオシン耐性マーカーのコンカテマー化（concatamerization)
ｐＺｅｏＳＶ２（＋）プラスミド（インビトロゲン）由来のゼオシン耐性カセットを、両側を挟むＮｏｔＩ制限部位を添加してＰＣＲ増幅した。これをｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社）中にクローニングした。このプラスミド１００μｇをＮｏｔＩで消化し、フェノール／クロロホルム抽出により精製した。コンカテマー（鎖状体）を作成するため、消化されたＤＮＡ（総容量１００μｌ）に、１０μｌのリガーゼ緩衝液、４０ユニットのＴ４リガーゼ及び５μｌの１００ｍＭのＡＴＰを添加した。この結合反応は一晩行い、完了した反応液の１μｌをパルスフィールドゲル電気泳動により試験して生じたコンカテマーのサイズを求めた。ＤＮＡは、トランスフェクションの前に、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。

ドットブロットハイブリダイゼーションを用いるｐ’腕トランケーションスクリーニング
２４穴プレート中の細胞をトリプシン処理により収穫し、真空下でハイボンドＮ＋（アマシャム社）を含むミニフォールド・ドット・ブロッティング・アパレイタス（９６パーブロット，シュレリヒェ・アンド・シュル・インク）に直接移した。移送後、ハイボンドＮ＋を１０分間変性し（１ＭのＮａＯＨ，１ＭのＮａＣｌ）、５分間で２回中和した（１Ｍトリス塩酸，1.5 ＭのＮａＣｌ）後、２×ＳＳＣ中で最終洗浄を行なった。次いで、膜を８０℃で 1.5時間焼き、標準的方法を用い、³²Ｐ標識化ｐＡｌｔｅｒベクター（プロメガ社）ＤＮＡを用いて精査した。

マーデル（１０）標識化及びＨＴ１０８０細胞中への移送
マーデル（１０）染色体を含むＣＨＯに基づく体細胞ハイブリッド系統（５ｆと命名）（２７）を用いた。先に記述した（９，１２，２８）系に類似の系を用いて、最初のテロメア関連染色体トランケーション（ＴＡＣＴ）を図１Ａ（以下に述べる）に示すトランケーションベクターを用い５ｆに対して行なった。異なるトランケーションベクターでトランスフェクトされた２５０００個を超える薬剤耐性コロニーについての徹底的なスクリーニングによっても陽性のトランケーション事象は得られなかった。このことはこの５ｆ細胞系統がＴＡＣＴの適当な宿主でなかったことを示唆する。次いで、本発明者らはマーデル（１０）染色体をヒトＨＴ１０８０細胞中に移送することを決定した。何故なら、この細胞系統は相同組換えに優れていることが知られており（２９，３０）、テロメア活性を示し（３１，３２，３３）、そして微小核体により媒介される染色体移送の良好な受容体である（３４，３５）からである。ｐＧＥＭ−Ｔベクター中にクローニングされたゼオシン耐性遺伝子で５ｆ細胞中のマーデル（１０）を標識するため無作為挿入アプローチが最初に用いられた。染色体標識化についてのその後のＦＩＳＨスクリーニングを容易にするため、ゼオシン耐性遺伝子を含むZEO(登録商標)/pGEM-T構築物をコンカテマー化し、５０ｋｂより大きなＤＮＡ断片のみを用いて５ｆ細胞をトランスフェクトした。６３個の個々のゼオシン耐性コロニーをスクリーニングして、マーデル（１０）がその遠位のｑ’領域で標識化された１個の細胞系統（ＺＢ３０と命名）を同定した（図２Ａ）。この細胞系統は微小核体により媒介されるＨＴ１０８０細胞中への染色体移送におけるドナーとして使用された。６０個のゼオシン耐性微小核体融合コロニーのうちの１５個はマーデル（１０）を含むことが示された。ネオセントロメア領域由来のＢＡＣｓ、パン−α−サテライト、ＣＨＯゲノムＤＮＡ、及び抗セントロメア抗体の宿主を用いてこれらの細胞系統を広範なＦＩＳＨ分析及び免疫蛍光分析により、マーデル（１０）染色体及びそのネオセントロメアが無傷であり、染色体への如何なるα−サテライト反復又はＣＨＯ・ＤＮＡの組み込みも起こらなかったことが確認された。ＺＢＨＴ−１４と命名されたこれらの細胞系統の一つが、以後のトランケーション実験に用いられた。

無傷のマーデル（１０）を獲得したＺＢＨＴ−１４などの細胞系統に加え、この染色体の無作為にトランケーションされた誘導体を含む幾つかの細胞系統も融合生成物中に検出された。このような破損した染色体断片の形成及び移送は微小核体融合手順と関連する比較的普通の出来事であるように見えた（３６）。一つの細胞系統（ＮＣ−ＭｉＣ１と命名）は、それが先に位置付けられた１０ｑ２５ネオセントロメアドメイン（２７）の周りの約２ＭｂのＤＮＡを含むことがＦＩＳＨにより明らかにされたミニ染色体を保持していたので興味深かった（図１Ｃ）。この細胞系統はさらなる特性決定及びトランケーション研究のために保持された。

トランケーション構築物
１０ｑ２５ネオセントロメア領域の約３Ｍｂをカバーする５０個以上のＢＡＣクローン及びコスミドクローンを含む完全な物理的地図が調製された（図１Ｃ）。この地図に基づいて、この領域由来の異なるターゲティングＤＮＡを含む幾つかのトランケーション構築物が設計された。これらの構築物は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｑ’腕トランケーション用）、ネオマイシン耐性遺伝子、又はピューロマイシン（ｐ’腕トランケーション用）耐性遺伝子のいずれか、末端にクローニングされたヒトテロメア配列、及びマーデル（１０）のｑ’腕又はｐ’腕のいずれか由来の５〜１０ｋｂのターゲティングＤＮＡを含んでいた（図１Ａ）。最初のＴＡＣＴ実験はｑ’腕について行なわれ、その後ｐ’腕のトランケーションが行なわれた（図１Ｂ）。

ｑ’腕のトランケーション
ｑ’トランケーション実験にはＺＢＨＴ−１４細胞系統及びＮＣ−ＭｉＣ１細胞系統が用いられた。両細胞系統ともＹ３Ｃ９４コスミド（これはＢＡＣ・Ｂ７９Ｅ１６と重なり合う、図１Ｃ）由来の６ｋｂターゲティングＤＮＡを含む hyg( 登録商標)(ハイグロマイシン耐性) トランケーション構築物でトランスフェクトされた。このターゲティング部位は抗セントロメア抗体結合性ＮＣドメインから約 0.2Ｍｂに位置している（２７）。

ＺＢＨＴ−１４細胞系統については、マーデル（１０）のｑ’トランケーションについての最初のスクリーニングが生じたハイグロマイシン耐性コロニーをゼオシン中に塗布することにより行なわれた。これは、マーデル（１０）のゼオシン含有染色体部分を喪失した細胞系統を同定させ、従って、ゼオシン感受性であった。総数７３００個のハイグロマイシン耐性コロニーから、２１０個がゼオシン感受性であることが示された。ＦＩＳＨ分析により、これらのコロニーの大部分が無作為トランケーション又は他の未知の再配列を含んでいることが明らかにされた。一つの細胞系統（ＮＣ−ＭｉＣ２と命名）は所望の標的化トランケーションを受けたように見え、さらに特性決定された。

１０ｑ２５ネオセントロメア領域に沿って位置付けられた既知のコスミドクローン又はＢＡＣクローンの宿主を用いたＮＣ−ＭｉＣ２のＦＩＳＨ分析により、ターゲティングＤＮＡの上又は近位のクローンが存在した（例えば、Ｙ３Ｃ９４、図２Ｂ）が、ターゲティングＤＮＡに遠位のクローンは全て（例えば、Ｙ３Ｃ１０９、図２Ｃ）存在しなかったことが明らかにされた（図１Ｃに要約されている）。トランケーションの部位をより正確に決定するため、意図されたターゲティング部位（図１Ｄ）の両側の直ぐ隣にある約１０ｋｂの３個のＰＣＲ断片（Ｆ１〜Ｆ３）を調製し、ＦＩＳＨ分析に使用した。その結果はターゲティングＤＮＡの近くに位置した断片（Ｆ１）のみが陽性シグナルを与えた（図２Ｄ）が、二つの遠位の断片Ｆ２及びＦ３は両方とも陰性であった（図２Ｅ）。ＴＴＡＧＧＧテロメア反復ぺプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを用いたさらなるＦＩＳＨはトランケーションされた染色体の上のテロメア配列の種を証明した（図２Ｈ）。パン−α−サテライトプローブを用いる低度のストリンジェンシーのＦＩＳＨ及び抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体を用いる免疫蛍光（図２Ｆ）は、α−サテライトＤＮＡがトランケーションされた染色体の中に挿入されなかったことを確認した。これらのデータは、ＮＣ−ＭｉＣ２の生産の際に、マーデル（１０）のｑ’腕の大部分の除去をもたらす標的化されたトランケーション事象が起こることを強く支持する。

ＮＣ−ＭｉＣ２の有糸分裂時の安定性は、２０回以上の細胞分裂をハイグロマイシンの存在下又は非存在下で成長した細胞を比較することにより決定された。薬物選択の存在又は非存在下で成長した細胞について８５％という類似の保持割合が観察された。このことはＮＣ−ＭｉＣ２が有糸分裂の際安定であったことを示唆する。この染色体が機能性のネオセントロメアを維持するか否かさらに研究するため、ＣＲＥＳＴ−６自己免疫血清（２７）及びヒストンＨ３様タンパク質であるＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｃ及びキネシン（kinesin)様運動性タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｅに対する特異的抗体を用いて免疫蛍光研究を行なった。ネオセントロメア（ＮＣ）ドメインに先に位置付けられたＥ８ＢＡＣ（３７）と同じ位置に位置付けられた強力な抗血清シグナルが試験された全てのタンパク質について観察され（例えば、図２Ｇ）、これによりＮＣ−ＭｉＣ２の上でのネオセントロメア機能が証明された。

ＮＣ−ＭｉＣ１細胞系統を、Ｙ３Ｃ９４ＤＮＡ含有ｑ’トランケーション構築物でトランスフェクトすると、１０００を超えるハイグロマイシン耐性コロニーが生じた。これらは、標的化されたトランケーション事象の証拠である該構築物（図１Ａ及び実施例７を参照）中に含まれるベクターＤＮＡの喪失についてスクリーニングされた。得られた一つの細胞系統であるＮＣ−ＭｉＣ３をｑ’コスミド及びＢＡＣｓで、及びＰＣＲプローブであるＦ１〜Ｆ３を用いて詳細なＦＩＳＨ分析を行なうと、意図されたＹ３Ｃ９４部位で正確に標的化されたトランケーションが起こったことが明らかにされた（ＦＩＳＨの結果の例は図３Ａ〜Ｂに示し、図１Ｃに要約する）。さらなるｐ’の地図化及びＮＣ−ＭｉＣ３の分析は以下に述べる。

ｐ’腕のトランケーション
ＮＣ−ＭｉＣ２は、ピューロマイシン又はネオマイシンマーカーを保持する構築物及び３個の異なるｐ’領域由来のターゲティングＤＮＡ（図１Ｃ）を用いてさらなるトランケーションに付した。数回の独立したトランスフェクション実験により形成されたピューロマイシン耐性及びネオマイシン耐性コロニーを上記のようにベクターＤＮＡの喪失について精査することにより、並びにトランケーションされたＮＣ−ＭｉＣ２誘導体を同定するためＥ８・ＢＡＣ及び遠位のｐ’腕ＢＡＣ（Ｂ１０Ｋ１）（図１Ｂを参照）を用いる二重着色ＦＩＳＨにより、可能なターゲティングについてスクリーニングした。この分析は大部分のコロニーがＮＣ−ＭｉＣ２の意図され標的化された染色体トランケーションを含むようには見えないことを示した。しかしながら、ネオセントロメア抗原結合領域に比較的近いｐ’部位でトランケーションを示した二つの細胞系統（ＮＣ−ＭｉＣ４及びＮＣ−ＭｉＣ５）が同定された（２７）。これらはより詳細に特性決定された。

ＮＣ−ＭｉＣｓ３、４及び５の構造
図１Ｃは地図位置が既知のプローブを用いて行なわれたＮＣ−ＭｉＣｓ３、４及び５の詳細なＦＩＳＨ地図化の結果のまとめである（図３〜５に実例の一部が示してある）。３個のＮＣ−ＭｉＣｓは全てＹ３Ｃ９４内に予想されたｑ’トランケーションを示した。ｐ’腕については、ＮＣ−ＭｉＣ３（及びその先祖であるＮＣ−ＭｉＣ１）、ＮＣ−ＭｉＣ４、及びＮＣ−ＭｉＣ５それぞれについて、染色体トランケーションはＢＡＣｓ・Ｙ１３Ｃ１２（存在）／Ｂ１７９Ｎ３（非存在）、Ｙ１３Ｃ１２（存在）／Ｂ４３Ａ１１（非存在）、及びＢＡ４８Ｌ２４（存在）／ＢＡ６９Ｋ１０（非存在）の間で見られた（図３Ｃ／Ｄ、４Ａ／Ｂ及び５Ａ／Ｂ）。異なるＮＣ−ＭｉＣｓの上での陽性ＦＩＳＨシグナルの強度は、試験されたコスミドプローブ及びＢＡＣプローブの全てについて、ＨＴ１０８０細胞における正常な染色体１０上で見られたものとは区別できなかった。このことは、ＮＣ−ＭｉＣｓの形成の途中ではＤＮＡの二本化（duplication)は起こらなかったことを示唆する。パン−α−サテライトＤＮＡプローブ（図３Ｅ、４Ｃ及び５Ｃ）を用いる低ストリンジェンシーＦＩＳＨハイブリダイゼーション及び抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体（図４Ｅ及び５Ｄ）を用いる免疫蛍光はセントロメアαサテライトＤＮＡの非存在を明らかにした。異なるＮＣ−ＭｉＣ細胞系統を、２４個のヒト染色体全てについて全染色体ペイントを用いたＦＩＳＨにより分析すると、染色体１０ペイントのみがＮＣ−ＭｉＣｓの上で陽性のシグナルを形成した。このことは、他の染色体由来のゲノムＤＮＡは検出可能な量でそれらの形成の間にＮＣ−ＭｉＣｓの上に転座しなかったことを示唆する（図６Ａ）。幾つかの部分染色体１０ペイントを用いるさらなる分析（位置については図１Ｂを参照）は、ＮＣ−ＭｉＣｓの上の非１０ｑ２５領域由来のＤＮＡが存在しないことを同様に証明した（図６Ｂ）。従って、ＮＣ−ＭｉＣｓ３、４及び５はそれぞれ１０ｑ２５ネオセントロメア領域からのみ由来した１個のコピーＤＮＡを含み、それらの全サイズは、それぞれ約 1.6、1.6 及び 0.8Ｍｂであると推定されると結論できる（図１Ｃ）。

高分子量ゲノムＤＮＡを異なる細胞系統から調製し、６ＭｂまでのＤＮＡを分離する種々の条件の下でパルス・フィールド・ゲル電気泳動にかけた。ＮＣ−ＭｉＣ３のみがゲルを移動した。このことは、これが線形のミニ染色体であることを示唆し、他のＮＣ−ＭｉＣｓは環状構造である可能性を提起する。酵母染色体マーカーとの比較から、ＮＣ−ＭｉＣ３については、ＰＦＧＥゲル上で、 1.6Ｍｂのサイズと推定された。パン−テロメアプローブを用いるＦＩＳＨ又はテロメア反復結合因子ＴＲＦ１に対する抗体を用いる免疫蛍光は、ＨＴ１０８０細胞中の正常染色体全てのテロメア末端上にシグナルを生じたが、線形のＮＣ−ＭｉＣ３（例えば、図４Ｄ）を含めＮＣ−ＭｉＣｓのいずれの上にも生じなかった。これは、テロメア配列の低レベルを検出することが技術的に不可能であること及び／又はＮＣ−ＭｉＣｓの環状性によるものであろう。

ＮＣ−ＭｉＣ安定性及びネオセントロメア活性
ＮＣ−ＭｉＣｓ３、４及び５の有糸分裂安定性は、選択の存在下又は非存在下で培養培地中での２０回以上の細胞分裂の後に検定した。ＮＣ−ＭｉＣｓを同定するためＢＡＣ・Ｅ８をＦＩＳＨ実験で用い、各細胞系統について１００個の細胞を評価した。ＮＣ−ＭｉＣ３とＮＣ−ＭｉＣ４の両者については、薬物選択の存在下又は非存在下で約８０％という類似の保持割合が観察された。これは、両染色体誘導体が選択圧の非存在下でさえも安定であったことを示唆する。選択の存在下でＮＣ−ＭｉＣ５細胞系統については３６％という保持割合が最初観察された。選択を除去した後、２０分裂の間培養すると、細胞の３７％がＮＣ−ＭｉＣ５を保持した。これは再び選択圧の非存在下での有糸分裂安定性を示唆する。ＮＣ−ＭｉＣｓ３及び４と比べ、ＮＣ−ＭｉＣ５の保持割合が減少したのは、この特定の細胞系統で見られた固有のゲノム不安定性と最も関係が深そうである。

ＮＣ−ＭｉＣ５は構築された最も小さな誘導体であるようであったので、そして元の細胞系統において骨格ゲノムの不安定性が観察されたので、本発明者らはこの系統をサブクローニングし、得られたクローン中におけるＮＣ−ＭｉＣ５の安定性を検討した。これらのサブクローン２個（ＮＣ−ＭｉＣ５ａ及びＮＣ−ＭｉＣ５ｂ）はＮＣ−ＭｉＣ５の安定性の大きな増加を示した。薬物選択の非存在下での５０回以上の細胞分裂の後、これら二つの細胞系統はそれぞれ９０％及び９３％の保持割合を示した。これらの保持割合は選択の存在下での同数の分裂を経た細胞中で見られたもの（それぞれ、９０％及び９１％）とは有意に異ならなかった。ＮＣ−ＭｉＣ５ａ細胞はミニ染色体を１コピー（細胞の７６％）か２コピー（細胞の１４％）かを含んでいたが、ＮＣ−ＭｉＣ５ｂ細胞では常に１コピーだけしか検出されなかった。ＮＣ−ＭｉＣ５ａ及び５ｂの構造は詳細なＦＩＳＨ分析により元のＮＣ−ＭｉＣ５染色体と同一であることが示された（図１Ｃ及び５）。

ＮＣ−ＭｉＣｓ上のネオセントロメアの機能の状態を研究するため免疫蛍光検出が用いられた。ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ、ＣＥＮＰ−Ｃ、ＣＥＮＰ−Ｅ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ｈＺＷ１０、ｐ５５ＣＤＣ及びＢＵＢ１を含むセントロメア関連タンパク質の宿主に対する抗血清を試験した。ＣＥＮＰ−Ｂを除く全てのタンパク質はＮＣ−ＭｉＣｓのそれぞれの上で明瞭に検出された（一部の例は図３Ｆ〜Ｇ、４Ｆ〜Ｈ、５Ｅ〜Ｇに示す）。これらのタンパク質分布様相は、親のマーデル（１０）染色体で先に確立されたものと区別できなかった（２５，２７）。このことはＮＣ−ＭｉＣ誘導体がネオセントロメアの全活性を含むことを確認させる。

ＮＣ−ＭｉＣ２の細胞培養及びトランスフェクション
ＮＣ−ＭｉＣ２を、１０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ）中で培養した。培地に２５０μｇ／ｍｌの濃度でハイグロマイシン（ロッシュ）を添加した。ＮＣ−ＭｉＣ２のトランスフェクションは電気穿孔法又はリポフェクションを用いて行なった。電気穿孔はバイオラド・ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて（0.4 ｋＶ，２５０μＦ）行なった。リポフェクションのためには、トランスフェクションの１日前に細胞をプレートに塗布し、トランスフェクション時点で６０〜７０％コンフルエンシーとなるようにした。希釈したフジーン６トランスフェクション試薬（２ｍｌの総量中の１００μｌは２０μｇのＤＮＡを含む）（ベーリンガー・マンハイム）の２ｍｌを細胞の上に滴下して添加した。トランスフェクションに使用したＤＮＡは、ヒトテロメア配列 htel 、ネオマイシン耐性遺伝子を挟む二つの loxP 部位、ターゲティングゲノムＤＮＡ、及びブラストサイジン耐性遺伝子を含むＴＡＣＴ構築物であった（図７Ａ）。抗生物質選択はトランスフェクションの２４〜４８時間後に、２５０μｇ／ｍｌの濃度で、１４日の期間、適用された後、さらなる特性決定のためコロニーを釣り上げた。

ＮＣ−ＭｉＣ２のｐ’腕のトランケーション
ＴＡＣＴ実験は、Ｙ１３Ｃ１５コスミド／Ｂ１３７ｉｌ・ＢＡＣから誘導された４ｋｂのターゲティングＤＮＡ、ターゲティングＤＮＡの外側の二つの loxP 部位、ネオマイシン耐性遺伝子、及びブラストサイジン耐性遺伝子を含むネオマイシン耐性トランケーション構築物を用いて、ＮＣ−ＭｉＣ２細胞中でｐ’腕について行なわれた。ターゲティング事象の成功はブラストサイジン耐性遺伝子の喪失を生ずるであろう。１００００個のネオマイシン耐性細胞系統のうちで、約１０％がブラストサイジン感受性であった。ブラストサイジンへの感受性は該クローンをブラストサイジン５μｇ／ｍｌ中で培養することにより測定された。ネオマイシン耐性であるがブラストサイジン感受性であったクローンをＦＩＳＨ分析に掛けた。

ＮＣ−ＭｉＣ６の特性決定
一つの細胞系統（ＮＣ−ＭｉＣ６）が標的化されたトランケーションを受けたように見えたので、ＦＩＳＨにより広範に特性決定を行なった。ターゲティング部位に近くでコスミド及びＢＡＣｓが存在することが見出されたが、この部位から遠くのクローンは全て存在しなかった（図７Ｃに要約する）。本発明者らのＦＩＳＨ及び最近利用可能なゲノム配列データに基づいて、本発明者らはＮＣ−ＭｉＣ６のサイズが１．２Ｍｂであると推定した。

α−サテライト（ｐＴＲＡ７）及びＣＥＮＰ−Ｂへの結合はトランケーションされた染色体上では検出されなかった。ＣＲＥＳＴ−６自己免疫血清を用いた免疫蛍光法により、ＮＣ−ＭｉＣ６の上にネオセントロメア活性が確認された。従って、これらのデータは、標的化されたトランケーション事象がＮＣ−ＭｉＣ２中のマーデル（１０）のｐ’腕の大部分を除去したことを支持する。ＮＣ−ＭｉＣ６の有糸分裂安定性は、培養中選択の存在下及び非存在下で６０回分裂まで検定した。選択の非存在下では、２０回の細胞分裂後に８０％を超え、４０回の細胞分裂で７５％、そして６０回の分裂で７０％の保持割合が観察された（図８）。ネオマイシンの存在下では、４０回の分裂後にＮＣ−ＭｉＣ６の８５％が維持され、そして６０回を超える細胞分裂後にも７５％という高さが保持され、分裂当たりの損失割合は 0.42 ％であった。このことはＮＣ−ＭｉＣ６が有糸分裂において何回にもわたって安定であったことを示唆する。

二つの loxP 部位の存在はネオマイシン耐性遺伝子の切断及び CRE−リコンビナーゼを用いる特異的部位への新たな遺伝子の挿入のために使用されうる。遺伝子のこの切断及び挿入は、 CRE−リコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドの一過性トランスフェクション又は CRE−リコンビナーゼのタンパク質トランスフェクションのいずれかを経て行なわれる。

ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現するマウス胚幹ＥＳ細胞へ及びマウスＦ９奇形癌細胞ヘの微小核体により媒介される染色体移送
２０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＥＳ培地（ギブコＢＲＬ）中でマウス胚幹細胞を培養した。マウスＦ９細胞は１０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＤＭＥＭ（トレース・バイオサイエンシーズ）中で培養した。ＥＳ細胞のトランスフェクションは、バイオラド・ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用い、 0.8 kV 、３μＦで、電気穿孔法を用いて行なった。トランスフェクションに使用したＤＮＡは、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＥＧＲＰ−Ｎ１（クローンテック）であった。抗生物質選択（２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８ネオマイシン）は、トランスフェクションの２４〜４８時間後に１４日の期間適用した後、コロニーを釣り上げ、スクリーニングのために大量培養した。

微小核体融合は先に記述したように行なった。４８時間コルセミド中で阻止された対数増殖期のドナーＺＢ３０細胞を、２０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（シグマ）を補充したパーコール／無血清ＤＭＥＭ（１：１）中に再懸濁した。次に、この細胞懸濁液を３２℃で９０分間１８０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。細胞混合物の二つのバンドをペレット化し、無血清ＤＭＥＭで洗浄し、３０、８及び５μＭの等孔膜（ミリポア社，ＭＡ）を通して濾過した。次いで微小核体を５０％ｗ／ｖＰＥＧ（ロッシュ）を室温で２分間添加することにより受容体のネオマイシン耐性ＥＳ−ＧＦＰ細胞又はＦ９細胞と融合させた。インキュベーションの後、細胞を濯ぎ、２０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＥＳ培地又は１０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で一晩培養した後、２４時間後に抗生物質選択（ＥＳ細胞については２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８ネオマイシン及び１００μｇ／ｍｌのゼオシン、そしてＦ９細胞については１００μｇ／ｍｌのゼオシン）を添加した。

ＥＳ−ＧＦＰｍａｒ（１０）＃１細胞系統及びＦ９−４−５ｍａｒ（１０）細胞系統の特性決定
ＥＳ−ＧＦＰｍａｒ（１０）＃１及びＦ９−４−５ｍａｒ（１）の広範なＦＩＳＨ分析により、マーデル（１０）染色体及びその中に含まれるネオセントロメアは無傷であったことが証明された。マウスのセントロメア／ペリセントロメアの主要及び微量サテライトＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡは両細胞系統のマーカー染色体上には検出されなかった。さらに、マーデル（１０）はこれらの細胞系統に存在する唯一のヒト染色体であった。マーデル（１０）の安定性は培養中の４５分裂まで選択の存在下で検定した。そしてマーカー染色体は両細胞系統において有糸分裂に際して安定であることを示した。

当業者は、本明細書で記載された発明が具体的に記述されたもの以外に変更や修正を受けうることを認めるであろう。本発明はこのような変更及び修正を全て含むことが理解されるべきである。また、本発明は本明細書で個々に又は集合的に言及され指摘された工程、特徴、組成物及び化合物、及び該工程又は特徴の任意の二以上のあらゆる組み合わせを全て含む。

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図１は、マーデル（１０）染色体からのネオセントロメアに基づくミニ染色体（ＮＣ−ＭｉＣと略す）形成を示す図式的表示である。図１ＡはＴＡＣＴ標的に向かう構築物の構造を示す。マーデル（１０）の p' 又は q' 腕由来の標的に向かうＤＮＡを、哺乳動物の選択可能マーカー（ハイグロマイシン（登録商標）、ネオマイシン（登録商標）、又はピューロマイシン（登録商標））に隣接させて、クローニングされたヒトテロメアＤＮＡ（Ｈｔｅｌ）の小さなアレーを含むベクター中にクローニングした。構築物をベクターＤＮＡとテロメア反復の間の制限部位で線形化し末端にあるテロメア配列を露出させた。相同組換え事象の後に、このベクターＤＮＡを宿主染色体中に組み込むべきではない。ベクターＤＮＡの喪失は可能な組換え事象のスクリーニング検定法の設計を可能とする。図１Ｂはマーデル（１０）及びＮＣ−ＭｉＣｓの形成の図式を示す。白矢はマーデル（１０）が形成する際の正常な染色体１０上の切断点を示す。マーデル（１０）の長い腕及び短い腕はそれぞれ q' 及び p' と命名される。ＮＣ−ＭｉＣｓ１〜５を生成させるトランケーション事象はＴｃ１及びＴｃ２により表される。マーデル（１０）に挿入されたゼオシン耐性遺伝子の位置は星印で示される。 p' 腕の喪失についてのスクリーニング検定で用いられたＢＡＣ・Ｂ１０Ｋ１の位置は示してある。染色体１０の上方の太い線はＮＣ−ＭｉＣｓの特性決定をするために用いられた部分染色体ＤＮＡペイントの位置及び命名を示す。図１ＣはＮＣ−ＭｉＣｓの地図化。約３Ｍｂをカバーし、１０ｑ２５ネオセントロメア領域まで先に地図化された順序付けられたコスミド及びＢＡＣクローンが示してある。縦の影の部分はセントロメアタンパク質に結合するネオセントロメア（ＮＣ）ドメインを含むＥ８ＢＡＣを表す（２３，２７）。Ｅ８の左及び右への白矢じりは q' 及び p' トランケーション構築物を用いて標的化されたトランケーションの意図された位置を示す。（＋）はＮＣ−ＭｉＣに対するＢＡＣプローブ又はコスミドプローブについての陽性のＦＩＳＨ結果を示すが、（−）は陰性のＦＩＳＨ結果を示す。これらの異なるＮＣ−ＭｉＣｓのおおよそのサイズは括弧の中に示してある。

図１Ｄは標的化された q' トランケーション部位の特性決定を示す。 q' トランケーションを標的とするＤＮＡは、コスミドＹ３Ｃ９４（ＢＡＣ・Ｂ７９Ｅ１６中にも存在する）からサブクローニングされた６ｋｂＸｂａＩ断片であって斜線を引いたボックスで表される。Ｂ７９Ｅ１６由来のＰＣＲプローブの位置は二重頭の矢により示されＦ１、Ｆ２及びＦ３と命名される。これらのプローブのＮＣ−ＭｉＣｓ上でのハイブリダイゼーション状態は（＋）又は（−）で示され、 q' トランケーションが標的化事象の結果であったことを確認させる。
図２は、ＺＢ３０及びＮＣ−ＭｉＣ２のＦＩＳＨ分析及び／又は免疫蛍光分析の写真である。

（Ａ）ＺＢ３０のＦＩＳＨ分析はＥ８（緑色）及びマーデル（１０）（矢じり）の標識のゼオシン耐性遺伝子（赤色）とのハイブリダイゼーションを示す。

（Ｂ〜Ｈ）ＮＣ−ＭｉＣ２についてのＦＩＳＨ分析及び／又は免疫蛍光分析。正常な染色体１０は矢じりにより示され、ＮＣ−ＭｉＣ２は矢によって示される。（i 〜 iv)それぞれ緑色、赤色、及びＤＡＰＩについての結合画像及び分離画像。

（Ｂ）Ｅ８プローブ（緑色）及びＹ３Ｃ９４コスミドプローブ（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であり、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＹ３Ｃ９４が存在することを示す。

（Ｃ）Ｅ８（緑色）及び q' コスミドＹ３Ｃ１０９（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＹ３Ｃ１０９が存在しないことを示す。

（Ｄ）Ｅ８（緑色）及びＹ３Ｃ９４／Ｂ７９Ｅ１６に由来し q' を標的とするＤＮＡと重なり合う（図１Ｄを参照）ＰＣＲ断片Ｆ１（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＦ１ＤＮＡが存在することを示す。

（Ｅ）Ｅ８（緑色）及び標的に向かうＤＮＡ（図１Ｄ参照）に直ぐ遠位の領域にあるＢ７９Ｅ１６に由来するＰＣＲ断片Ｆ２（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＦ２ＤＮＡが存在しないことを示す。

（Ｆ）Ｅ８（緑色）を用いるＦＩＳＨ及び抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＣＥＮＰ−Ｂが存在しないことを示す。

（Ｇ）Ｅ８（緑色）を用いるＦＩＳＨ及び抗ＣＥＮＰ−Ｅ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上にＣＥＮＰ−Ｅタンパク質が存在することを示す。

（Ｈ）Ｅ８（緑色）及びテロメア反復ＰＮＡプローブ（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ２上のテロメア配列を示す。
図３はＮＣ−ＭｉＣ３についてのＦＩＳＨ分析及び／又は免疫蛍光分析の写真である。正常な染色体１０は矢じりによって示され、ＮＣ−ＭｉＣ３は矢によって示される。（i 〜 iv)それぞれ緑色、赤色、及びＤＡＰＩについての結合画像及び分離画像。

（Ａ）Ｅ８（緑色）及び q' ＢＡＣ・Ｂ７９Ｅ１６（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＢ７９Ｅ１６が存在することを示す。

（Ｂ）Ｅ８（緑色）及び q' コスミドＹ３Ｃ１０９（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＹ３Ｃ１０９が存在しないことを示す。

（Ｃ）Ｅ８（緑色）及びｐ’コスミドＹ１３Ｃ１２（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＹ１３Ｃ１２が存在することを示す。

（Ｄ）Ｅ８（緑色）及びｐ’ＢＡＣ・Ｂ１７９Ｎ３（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＢ１７９Ｎ３が存在しないことを示す。

（Ｅ）Ｅ８（緑色）及びパン−α−サテライトｐＴＲＡ−７プローブ（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にα−サテライトが存在しないことを示す。

（Ｆ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｅ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＣＥＮＰ−Ｅが存在することを示す。

（Ｇ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｆ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ３上にＣＥＮＰ−Ｆが存在することを示す。
図４は、ＮＣ−ＭｉＣ４のＦＩＳＨ分析及び／又は免疫蛍光分析の写真である。正常な染色体１０は矢じりにより、ＮＣ−ＭｉＣ４は矢により示される。（i 〜 iv)それぞれ緑色、赤色及びＤＡＰＩについての結合画像及び分離画像。

（Ａ）Ｅ８（緑色）及びｐ’コスミドＹ１３Ｃ１２（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＹ１３Ｃ１２が存在することを示す。

（Ｂ）Ｅ８（緑色）及びｐ’ＢＡＣ・Ｂ４３Ａ１１（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＢ４３Ａ１１が存在しないことを示す。

（Ｃ）Ｅ８（緑色）及びパン−α−サテライトｐＴＲＡ−７プローブ（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にα−サテライトが存在しないことを示す。

（Ｄ）ＴＴＡＧＧＧテロメア反復ＰＮＡプローブを用いたＦＩＳＨ分析であって、全てのヒトテロメアの上で陽性シグナルを示すがＮＣ−ＭｉＣ４の上では示さない。

（Ｅ）Ｅ８（緑色）を用いるＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＣＥＮＰ−Ｂが存在しないことを示す。

（Ｆ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＣＥＮＰ−Ｃが存在することを示す。

（Ｇ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｅ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＣＥＮＰ−Ｅが存在することを示す。

（Ｈ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析及び抗ＣＥＮＰ−Ｆ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ４の上にＣＥＮＰ−Ｆが存在することを示す。
図５はＮＣ−ＭｉＣ５のＦＩＳＨ分析及び／又は免疫蛍光分析の写真である。正常な染色体１０は矢じりによりそしてＮＣ−ＭｉＣ５は矢により示される。（i 〜 iv)それぞれ緑色、赤色、及びＤＡＰＩについての結合画像及び分離画像。

（Ａ）Ｅ８（緑色）及びｐ’ＢＡＣ・ＢＡ４８Ｌ２４（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＢＡ４８Ｌ２４が存在することを示す。（Ｂ）Ｅ８（緑色）及びｐ’ＢＡＣ・ＢＡ６９Ｋ１０（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＢＡ６９Ｋ１０が存在しないことを示す。

（Ｃ）Ｅ８（緑色）及びパン−α−サテライトｐＴＲＡ−７プローブ（赤色）を用いたＦＩＳＨ分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にα−サテライトが存在しないことを示す。

（Ｄ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析、及び抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＣＥＮＰ−Ｂが存在しないことを示す。

（Ｅ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析、及び抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＣＥＮＰ−Ａが存在することを示す。

（Ｆ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析、及び抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＣＥＮＰ−Ｃが存在することを示す。

（Ｇ）Ｅ８（緑色）を用いたＦＩＳＨ分析、及び抗ＣＥＮＰ−Ｅ抗体（赤色）を用いた免疫蛍光分析であって、ＮＣ−ＭｉＣ５の上にＣＥＮＰ−Ｅが存在することを示す。
図６はＮＣ−ＭｉＣｓの染色体ペインティング分析の写真である。

図６Ａは２４のヒト染色体（１〜２２，Ｘ，Ｙ）全てについての全染色体ペイントを示す。左側のパネルは、近点ヘテロ染色体領域を除く正常なヒト染色体の上の陽性ペインティング（緑色）、及び末端動原体の染色体の短腕及びＹのｑ１２領域の上の陽性ペインティングを示す。上方右パネルはＮＣ−ＭｉＣ４の上の対応するペインティングの結果を示すが、下方の右パネルはＮＣ−ＭｉＣ５の結果を示す。染色体ペイントは染色体１０を除き全て、重なりペイント（緑色）及びＥ８（赤色）シグナルが欠如していることから明らかなように（示していない分離個別画像により確認された）ＮＣ−ＭｉＣｓの上では陰性であるが、染色体１０のペイントシグナルはＮＣ−ＭｉＣｓの上で明らかに見られる。これは、結合黄色を生ずる赤と緑のシグナルの重なりにより明らかである。
図６ＢはＮＣ−ＭｉＣ５の上での部分染色体−１０のペイントを示す。染色体１０の上でのこれらの部分染色体ペイントの位置は図１Ｂに図式的に示してある。左手のパネルはこれらのペイントの名前及び正常な染色体１０の上でのＦＩＳＨの結果（緑色）を示す。右手のパネルはＮＣ−ＭｉＣ５の上でのこれらのペイントについて得られた陰性の結果を示す。Ｅ８シグナルは赤色である。染色体及びＮＣ−ＭｉＣｓはスケールに示していない。図７はＮＣ−ＭｉＣ２のトランケーションを経由するＮＣ−ＭｉＣ６構築を示す図式的表示である。

図７ＡはＮＣ−ＭｉＣ２から p' 腕をトランケーションするために使用した標的に向かうＴＡＣＴ構築物の構造を示す。マーデル（１０）の p' 腕から得た標的に向かうＤＮＡ及び哺乳動物の選択可能マーカー（ブラストサイジン耐性遺伝子，blasticidin(登録商標))を、抗生物質耐性遺伝子，neomycin (登録商標) に隣接したクローニングされたヒトテロメアＤＮＡ（Ｈｔｅｌ）の小さなアレーを含むベクター中にクローニングした。構築物をベクターＤＮＡとテロメア反復の間の制限部位で線形化して末端のテロメア配列を露出させた。相同組換え事象の後では、該ブラストサイジン耐性遺伝子は宿主染色体中に組み込まれてはならない。ブラストサイジン耐性遺伝子の喪失により、可能な組換え事象についてのスクリーニング検定を設計することが可能となる。
図７Ｂはマーデル（１０）及びＮＣ−ＭｉＣｓの図式的形成を示す。白矢は、マーデル（１０）を作成する際の正常染色体１０の上の切断点を示す。マーデル（１０）の長腕及び短腕はそれぞれ q' 及び p' と命名する。ＮＣ−ＭｉＣ２はマーデル（１０）から（先に記述したように）Ｂ７９ｅ１６／Ｙ３Ｃ９４でトランケーションされた（Ｔｃ１）のに対し、ＮＣ−ＭｉＣ６は、（Ａ）で記述されたＴＡＣＴ構築物を用いたＢ１３７ｉＬ／Ｙ１３ｃ１５におけるトランケーション２，Ｔｃ２の結果である。図７ＣははＮＣ−ＭｉＣｓ２及び６の地図化である。約３Ｍｂをカバーし、１０ｑ２５ネオセントロメア領域まで先に地図化された順序付けられたコスミドクローン及びＢＡＣクローンが示してある。垂直の影を付した領域はセントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ａに結合するドメインを表す（５１）。白矢じりは標的化されたトランケーションの位置を示す。（＋）はＮＣ−ＭｉＣの上でのＢＡＣプローブ若しくはコスミドプローブについての陽性のＦＩＳＨ結果を示すが、（−）は陰性のＦＩＳＨ結果を示す。異なるＮＣ−ＭｉＣｓのサイズの概略は括弧内に示してある。図８は、１５０μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン薬Ｇ４１８の存在下若しくは非存在下のいずれかで６０分裂の間ＮＣ−ＭｉＣ６を培養した後、安定性を試験するため種々の間隔でそれを収穫した場合の結果を示す表及び図式的表示である。そのＸ軸は分裂の数を表し、Ｙ軸はＦＩＳＨ分析で求められた培養中に存在するＮＣ−ＭｉＣのパーセンテージを表す。その結果はＧ４１８の存在下又は非存在下におけるＮＣ−ＭｉＣ６の有糸分裂安定性を示した。

Claims

ECACCに受託番号00122001 (CHO/BE ZB30)、受託番号00122002 (HT1080-MIC 1)、受託番号00122003 (HT1080-MIC 2)、受託番号00122004 (HT1080-MIC 3)、受託番号00122005 (HT1080-MIC 4)、受託番号00122006 (HT1080-MIC 5)、受託番号00122007 (HT1080-MIC 5a)または受託番号00122008 (HT1080-MIC 5b)のもとで寄託された細胞株により供される、ヒトミニ染色体。
ECACCに受託番号00122001 (CHO/BE ZB30)、受託番号00122002 (HT1080-MIC 1)、受託番号00122003 (HT1080-MIC 2)、受託番号00122004 (HT1080-MIC 3)、受託番号00122005 (HT1080-MIC 4)、受託番号00122006 (HT1080-MIC 5)、受託番号00122007 (HT1080-MIC 5a)または受託番号00122008 (HT1080-MIC 5b)のもとで寄託された単離細胞株。