JP4144876B2 - Hiv−1複製抑制剤 - Google Patents
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ヒト細胞株HeLaからSV total kit(Promega)を用いてmRNAを抽出し、Omniscript kit(Qiagen)を用いて15ntのpoly(dT)をプライマーとしてcDNAライブラリーを作製した。RT−PCRによってヒトトリステトラプロリンをクローニングした。RT−PCRには、TTPF(5'−CGTGAATTCATGGATCTGACTGCCATCTACGAGAGCCT−3';配列番号3)と、TTPR(5'−GACCGGGCAGGCGGCCGCTCACTCAGAAACAGAGAT−3';配列番号4)をそれぞれプライマーとして用いた(EcoRIとNotIサイトをそれぞれ下線で示した。)。ヒトトリステトラプロリンcDNAのシークエンスを確認した後、哺乳類発現ベクターpcDNA4/HisMax−C(Invitrogen Life Technologies)のEcoRI、NotIサイトへ挿入しpchTTPwtとした。
HIV−1は1本鎖直鎖状RNAウイルスで染色体上のプロウイルスとしては9,709bpの長さを有する。HIV−1のプロウイルスDNAを含むベクターpNL43(1986年にAdachi等が発表)を哺乳類細胞へ導入することによりHIV−1蛋白群が転写、翻訳され、感染性を有する粒子が培養細胞上清に放出される。
実施例2記載のHIV−1のプロウイルスDNAを含むベクターpNL43を0.2μgと、実施例1で得られたヒトトリステトラプロリン発現ベクターpchTTPwtを0.02μg、0.2μg又は空の哺乳類発現ベクターpcDNA4/HisMax−Cを0.2μgとを、同時にヒト由来の293T細胞へ哺乳細胞遺伝子導入試薬Fugene6(Rosche)を用いて導入し、1mlの培養液で培養した。
遺伝子導入から48時間後、上清のHIV−1抗原(P24)を抗原ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)(ZeptoMetrix, Buffalo, NewYork)によって定量した。ヒトトリステトラプロリンを発現したヒト293T細胞から得られたウイルス量を空の発現ベクターを導入した細胞由来のウイルス量と比較した結果を図1に示す。図1から、ヒトトリステトラプロリンの発現により、ウイルス産生量は5.2分の1となることがわかる。また、感染価は12分の1になった。トリステトラプロリンの発現量に依存してHIV−1ウイルス産生と感染価が減少しているこれらの結果は、ヒトトリステトラプロリンによりHIV−1 RNAの分解が細胞内で促進され、ウイルス産生量が低下したことを示している。
上清からからSV total kit(Promega)を用いてRNAを抽出し、Omniscript kit(Qiagen)を用いて15ntのpoly(dT)をプライマーとしてcDNAライブラリーを作製した。cDNAはreal-time, 5'-exonuclease PCR-based assay (TaqMan)によって定量解析された。QuantiTect Probe PCR kit (Qiagen)を用い、PCRの条件は、95℃15分、95℃15秒、60℃1分を1サイクルとして45サイクルとした。PCRには、1459F(5'−GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG−3';配列番号5)と、1535R(5'−TGTAGCCATCCATCCTTGTCAA−3';配列番号6)をプライマーとして使用した。また、プローブとしては、1491P(5'−FAM−TCCGGAAGCGACCAACGCCTT−TAMRA−3';配列番号7)を用いた。なお、1491Pにおいて、FAMは6−カルボキシフルオレセイン(6-carboxyfluorescein)を、TAMRAはN,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine)を表す。結果を図2に示す。その結果、上清のウイルスRNA量は10分の1以下になった。トリステトラプロリンの発現により上精のウイルスRNA量が減少しているこれらの結果は、ヒトトリステトラプロリンによりHIV−1 RNAの複製が細胞内で阻害され、ウイルス産生量が低下し、ウイルスRNA量が低下したことを示している。
Claims (6)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有するHIV−1複製抑制剤。
- 配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、HIV−1ゲノムRNAの分解作用を有するポリペプチドを有効成分として含有するHIV−1複製抑制剤。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるDNAを有効成分として含有するHIV−1複製抑制剤。
- 配列番号1で表される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHIV−1ゲノムRNAの分解作用を有するポリペプチドをコードするDNAを有効成分として含有するHIV−1複製抑制剤。
- DNAを組換えベクターとして含有することを特徴とする請求項3又は4記載のHIV−1複製抑制剤。
- 請求項1〜5のいずれか記載のHIV−1複製抑制剤を含有することを特徴とするエイズ予防・治療薬。
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