JP4125543B2

JP4125543B2 - Alcohol dehydrogenase and method for producing optically active 3-quinuclidinol using the same

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Publication number: JP4125543B2
Application number: JP2002146098A
Authority: JP
Inventors: 伸哉伊藤
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2022-05-21
Also published as: JP2003334069A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用且つ新規なアルコール脱水素酵素酵素およびその作用による光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する方法に関する。これらの光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩は種々の医農薬品等の原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
酵素不斉還元による光学活性３−キヌクリジノールは特開平10-243795、特開平11-196890および特開2000-245495に微生物菌体を利用した方法が提案されている。しかし、これらの方法で使用されている触媒は、特開平10-243795では、ナカザワエア（Nakazawaea）属、カンジダ（Candida）属、プロテウス（Proteus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属およびロドスポリジウム（Rhodosporidium）属の菌体のみであり、特開平11-196890ではロドトルウラ（Rhodotorula）属、カンジダ（Candida）属、スポリジオボルウス（Sporidiobolus）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、スシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属およびノカルデイア（Nocardia ）属の菌体のみであり、また、特開2000-245495ではアルアリゲネス（Alcaligenes）属、コルネバクテリウム（Corynebacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、ロドトルウラ（Rhodotorula）属、オウレオバシジウム（Aureobasidium）属およびヤロウィア（Yarrowia）属の菌体のみを用いている。これらの菌体での反応はそれ由来の不純物、あるいは他の酵素による副反応等により、生成物の単離が煩雑になることがしばしばある。
【０００３】
一方、光学活性３−キヌクリジノールの製法として精製あるいは粗精製の酵素レベルでの本反応は知られていない。
本発明により提供されるような新規酵素およびそれらを利用してのＲ−３−キヌクリジノールあるいはその塩の有用な合成方法が望まれていた。
【０００４】
その他、光学活性３-キヌクリジノールの製法としては、これまでに、例えば、光学活性酒石酸等を分割剤とする優先晶析法により光学活性３−キヌクリジノール誘導体に導く方法（ Acta. Pharm. Suec., 16, 281-3 (1979) ）等が報告されている。微生物等の触媒を利用する方法としては、３−キヌクリジノールの低級脂肪酸エステルを酵素により不斉加水分解して光学活性３−キヌクリジノールに分割する方法（米国特許5,215,918、特開平10-136995、特開平10-210997および Life Sic. 21, 1293-1302 (1977)）が知られている。しかし、これらの方法は、ラセミ体を出発原料とし、光学分割して目的の光学異性体を得る手法であり、目的としない対掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にある。
【０００５】
一方、ルイス酸付加物をロジウム錯化合物を触媒として不斉還元により、３-キヌクリジノンから、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法（特開平９−１９４４８０）が報告されているが、この方法は光学純度が低く、工業的に有利な製造方法とは言い難い。
従って、本発明のより提供されるような新規酵素による有用な合成方法が望まれていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、新たなアルコール脱水素酵素を提供するとともに、医農薬合成中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を、その酵素による不斉還元反応により、工業的に有利な製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の微生物が３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用し、そのＲ体へ立体選択的に還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールあるいはその塩を生成する能力を有することに着目し、さらにその酵素を精製し、その酵素化学的性質について鋭意検討を行った結果、高い立体選択性でＲ体を優先的に還元する性状を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の（１）および（２）に示す性状を有するアルコール脱水素酵素である。
（1）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する。
（2）３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。
【０００９】
さらに、本発明は、該酵素、該酵素を産生する微生物または、形質転換微生物もしくはそれらの処理物を３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用させすることを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールまたはその塩の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明であるアルコール脱水素酵素はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有する。補酵素としては他にも、一般には数種類が知られているが、ＮＡＤＨ以外のもであってもＲ−３−キヌクリジノールを生成能が発揮できれば特に制限はないが、ＮＡＤＨ依存性であることが望ましい。
【００１１】
本酵素は３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。この範囲内に至適ｐＨがあれば特に限定はないが、好ましくは至適ｐＨが7.5〜8.0であることが望ましい。
【００１２】
さらに、本酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合が約52,000。ゲル濾過（高速液体クロマトグラフィー）で測定した場合、約220,000であることが好ましい。
【００１３】
本発明におけるアルコール脱水素酵素の供給源としては特に制限されるものではないが、微生物等の生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、Microbacterium属等に属する微生物が挙げられる。好ましくは、Microbacterium estevoaromaticum IFO 3751、Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM 9171、Microbacterium luteolum JCM 9174が挙げられる。特に好ましくはMicrobacterium luteolum JCM 9174が挙げられる。
【００１４】
なお、IFO番号およびJCM番号が付された菌株は公知で、それぞれ財団法人発酵研究所および理化学研究所微生物系統保存施設から容易に入手することができる。
【００１５】
本酵素の単離精製方法は、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepharose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200 pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー等を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００１６】
本発明において、３−キヌクリジノンおよび３−キヌクリジノールの塩とは、その窒素原子を、有機酸あるいは鉱酸等の塩を形成させたものを意図する。具体的には鉱酸塩として塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が例示できる。有機酸塩としては酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン酸、シュウ酸等の脂肪族有機酸塩、安息香酸等の芳香族有機酸塩等が例示される。
本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物等も含まれる。また、本発明において、形質転換微生物とは本発明の酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現した組換え微生物をいう。その宿主としては、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ピキア（Pichia）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属などが挙げられる。さらに、形質転換微生物処理物とは、アセトン乾燥微生物菌体、凍結乾燥微生物菌体、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処理したものあるいはそれらの固定化物などをいう。
【００１７】
本発明において、不斉還元反応によるＲ−３−キヌクリジノールあるいはその塩の生産は、以下の方法で行うことができる。必要に応じて補酵素（NADH、NADPH、NAD⁺、NADP⁺）あるいは／およびグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源の存在下、水または緩衝液等の反応溶媒中で３−キヌクリジノンあるいはその塩に酵素、形質転換微生物、または該菌体処理物を接触させることにより行うことができる。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応基質（３−キヌクリジノンあるいはその塩）あるいは／および前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継続させることもある。
【００１８】
また、還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ⁺の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ⁺還元能（解糖系など）を用いて行うことができる場合がある。
これらＮＡＤ⁺還元能は、反応系にグルコースやエタノールを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ⁺からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。
【００１９】
反応液の基質濃度は、０．０１〜５０重量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．０５〜３０重量％の濃度で実施するのが好ましい。
反応液中の酵素等の触媒の濃度は、その形状およびその活性により適宜決定され、特に制限はない。
反応液のpHは用いる酵素の至適pH等を考慮し、総合的に決定され、特に制限はないが、好ましくはpH５〜１０である。本酵素の至適ｐＨ7.0から9.0の範囲で実施することがさらに好ましい。また、反応が進行するに従いpHが変化してくるが、この場合は適当な中和剤を添加して最適pHに調整することが望ましい。
反応温度は０〜６０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。
【００２０】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、３−キヌクリジノンあるいはその塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２１】
また、これらの有機溶媒あるいは界面活性剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上することも多い。反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
尚、以上のような基質濃度、補酵素濃度、酵素濃度、pH、温度、溶媒、反応時間およびその他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮して目的とする光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００２２】
反応終了混合液からの目的物の単離は除菌後、濃縮、抽出、カラム分離、結晶化等通常の公知の方法によって行うことができる。
例えば、ｐＨをアルカリ性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、イソブタノール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般的な溶媒により抽出分離することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２４】
＜実施例１＞ Microbacterium luteolum JCM 9174の培養
ペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム0.3％、スクロース1.0％（ｐＨ7.0）を含む培地により、30℃で前培養を行い、続いて本培養は同前培養培地に消泡剤0.1％添加した組成の培養液3リットルを使用し、30℃24時間実施した。
【００２５】
＜実施例２＞本酵素の精製を以下に示す。なお全工程を4℃にて行った。
１）粗酵素液の調製
前記培養方法により６リットルの培養液から菌体湿重量33.8gを得た。170mlの1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1ｍＭMgCl2、プロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡＦＲＥＥ(Roche社製；1 tablet/50ml)を含む20ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ7.0で懸濁し、菌体破砕を超音波破砕装置(201M ultrasonic oscillator，久保田製作所)を用いて180Ｗ、0℃で8分間行った。破砕液を9000g、20分4℃で遠心を行い、上清を粗酵素液として回収した。以後特に述べない限りでは、緩衝液は1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1ｍＭMgCl2を含む20ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を使用した。(以降、緩衝液Ａ)
【００２６】
２）硫安分画
粗酵素液について硫安分画を行い、0〜55％飽和画分の沈殿を回収した。得られら沈殿を緩衝液Ａに溶解し、さらに同緩衝液にて透析した。
【００２７】
３）Blue-Sepharose カラムクロマトグラフィー
緩衝液Ａで平衡化した Blue-Sepharose(φ2.5mm×24mm)に酵素液を供し、同緩衝液にて非吸着成分を洗い流したところ、酵素活性は未吸着画分に溶出された。
【００２８】
４）DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラフィー
緩衝液Ａで平衡化したDEAT-Toyopearl 650Ｍ（東ソー、φ20mm×210mm）に、酵素液を吸着させた後、同緩衝液にてカラムを洗浄した後、NaClの0〜0.8Ｍ濃度勾配にて、カラムに結合した酵素を溶出した。溶出パターンを図１に示す。
【００２９】
５）Hiload Superdex 200 pg FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜(旭化成ペンシル型モジュール；分画分子量 6000)により濃縮後50ｍＭ NaClを含む緩衝液Ａ（ｐＨ7.5）で平衡化したHiload Superdex 200 pg(Phamacia Biotech、φ16mm×600mm)に吸着させた。酵素液は流速2ml/minにて溶出を行い、4ml/fractionにて分取した。溶出パターンを図２に示す。
【００３０】
６）HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を5ｍＭ緩衝液Ａ（ｐＨ7.7）で限外ろ過膜にて濃縮および透析を行い、同緩衝液にて平衡化した HAP-C-BEADS hydroxypatite(Sangi社製)クロマトグラフィー(Sangi、φ16mm×100mm)に吸着させた。同緩衝液を流速2ml/minで洗浄後、0〜1Ｍの緩衝液Ａ(pH7.7)の直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。溶出パターンを図３に示す。
【００３１】
７）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィー
限外ろ過法によって濃縮透析した酵素液を10ｍＭ緩衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M(PerSeptive Biosystems MA、USA、φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図４に示す。
【００３２】
８）BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜（アミコン centriprep；分画分子量 6000）により濃縮透析し、緩衝液Ａ(pH7.0)にて平衡化したBioAssistQ (東ソー、φ4.6mm×50mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、1ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図５に示す。
【００３３】
９）（２回目）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜によりにより濃縮透析し、10mM緩衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M (φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、たんぱく質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め精製酵素とした。溶出パターンを図６に示す。
各精製の結果を表１に示す。
【００３４】
＜表１＞

各精製時におけるタンパク質濃度は280nmにおける吸収又はProtein Assay Kit(Bio Rad)を用い算出した。なお、３−キヌクリジノン還元酵素の活性測定は必要に応じて以下の２法により適宜実施した。
【００３５】
（活性測定方法A）ガスクロマトグラフィーを用いた活性測定
50ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌクリジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、酵素液を250μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。25℃、6時間の反応の後、6Ｎの水酸化ナトリウム30μｌにより、ｐＨを12.0にして反応を停止し、1-ブタノールにより生成物を抽出した後、硫酸ナトリウムで脱水し測定サンプルを調整した。キラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）により、生成したＲ-3-キヌクリジノールを定量した。なお、1分間あたりに1ｎｍｏｌの3-キヌクリジノンｍＭを生成する酵素活性量を1unitと定義した。
【００３６】
（活性測定方法B）分光光学法を用いた活性測定
50ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、0.3ｍＭＮＡＤＨ、酵素液20μｌを加えブランク反応を確認した後、基質である20ｍＭ 3-キヌクリジノンを添加して全量1.5ｍｌとした。ＮＡＤＨの340ｎｍのおける吸収の減少を測定し25℃で1分間あたりに1ｎｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ^＋に変換する酵素活性量を1unitと定義した。酵素の総活性（Ｕ）は下記の計算式を用いて算出した。
【００３７】

＊6220：ＮＡＤＨの340ｎｍにおける分子吸光係数
【００３８】
＜実施例３＞アルコール脱水素酵素の安定化剤の検討
本酵素の粗酵素を用い、図７に示す各種添加剤を1ｍＭになるように加え（一部濃度が異なる）、4℃中における0、12、24、48、60、216時間後の粗酵素の安定性を調べた。酵素活性測定はA法により実施した。ＦＡＤ、ＦＭＮ、Pyridoxal-5’-phosphateの３添加剤については0.1ｍＭになるよう加えた。その結果を図７に示す。
【００３９】
＜実施例４＞アルコール脱水素酵素のミカエリス定数（Km）の測定
酵素量を一定にとし、ＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノン濃度を各々変化させて、それぞれにおける生成ＮＡＤ＋の量を測定した。得られたデータについてLineweaver-Burkの両逆数プロットを行うことでＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノンに対するKm値を算出した（図８および９を参照）。３−キヌクリジノンおよびＮＡＤＨに対するKm値はそれぞれ7.5mMおよび9.0μMであった。
【００４０】
＜実施例５＞アルコール脱水素酵素の至適ｐＨの検討
本酵素活性の至適pHの測定はは各100mMの酢酸ナトリウムpH5.0〜6.0リン酸カリウムpH6.0〜7.5、Tris-HCl pH7.5〜9.0、グリシン-KOH pH 9.0〜10.0の各緩衝液を使用した。なお活性測定は活性測定方法Aよって行った。結果を図10に示す。本酵素の３−キヌクリジノンに対する至適ｐHは7.5〜8.0付近であることが示された。
【００４１】
＜実施例６＞アルコール脱水素酵素の分子量およびポリアクリルアミドゲル電気泳動
本酵素の分子量は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用い、以下の条件で検討した。カラムにTSK-GEL G3000SW×X（東ソー株式会社）、溶離液に0.1M NaClを含む0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)を使用し、流速1.0ml/min、で行った。溶出液を分別回収し、各画分における本酵素の活性化のアッセイ結果によりR-3-キヌクリジノールの溶出時間を求め、分子量マーカー(MW-Marker；オリエンタル酵母工業株式会社)の溶出時間と比較し分子量を求めた。図11および12を参照。
native 電気泳動は5〜20％濃度勾配の電気泳動既製ゲルPAGEL(ATOO CORPORATION)のを使用した。またSDS-PAGEは12.5％(w/v)ポリアクリルアミドゲルを使用した。タンパク質の検出はクマジーブリリアントブルーR-250を用いて行った。native-PAGEおよびSDS-PAGEの結果をそれぞれ図13（A）および（B）に示す。
これらの結果から、本酵素の分子量は約220,000であることが示された。また、SDS-PAGEの結果より、サブユニット分子量52,000の４量体と推定された。
【００４２】
＜実施例７＞アルコール脱水素酵素の金属塩の影響
表２に示す各種金属化合物を反応液へ１ｍＭになるよう添加し、活性測定方法Aに従い、その影響を検討した。ごくわずかであるがＭｇイオンにより活性化をうけた一方、ＺｎＳＯ4では強い阻害が見られた。
【００４３】
＜表２＞

【００４４】
＜実施例８＞アルコール脱水素酵素の基質特異性
表３に示す各種基質化合物を活性測定法Ｂに従い反応液を調整し、その相対活性を検討した。
【００４５】
＜表３＞

【００４６】
＜実施例９＞アルコール脱水素酵素のN末端アミノ酸配列の解析
精製酵素を定法に従い、N末端アミノ酸配列を決定した。具体的には、SDS-PAGEにて分離した精製酵素を電気的にポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜にブロットした。PVDF膜に吸着した酵素蛋白質のＮ末配列をエドマン分解法により、アプライドバイオシステム社製のProcise491シ-ケンサを使用して決定した。その結果、以下に示す配列が確認された。
【００４７】
N末端アミノ酸配列：ＰＥＡＳＡＮＩＧＶＶＧＬＡＭＧＳＮＬＡ
【００４８】
＜実施例10＞アルコール脱水素酵素によるＲ−３−キヌクリジノールの合成
50ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌクリジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、精製酵素液を250μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。この反応液を25℃で反応させた。経時的にＲ−３−キヌクリジノールの生成量および光学純度を定量した。定量はキラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）により実施した。生成量の経時変化を図14に示す。尚、光学純度はＲ体100％eeであった。
【００４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図２】 Hiload Superdex 200 pg FPLC カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図３】 HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図４】 Pros HQ/M FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図５】 BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図６】（２回め）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図７】アルコール脱水素酵素の安定化剤の検討結果を示す図である。
【図８】アルコール脱水素酵素の３−キヌクリジノンに対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
【図９】アルコール脱水素酵素のＮＡＤＨに対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
【図１０】アルコール脱水素酵素の至適ｐＨの検討結果を示す図である。
【図１１】アルコール脱水素酵素の高速液体クロマトグラフィー溶出パターンを示す図である。
【図１２】高速液体クロマトグラフィーによる標準蛋白質の検量線およびアルコール脱水素酵素の分子量測定結果を示す図である。
【図１３】（A）は精製アルコール脱水素酵素のnative-PAGEにおけるパターンを示す図である。（B）は精製アルコール脱水素酵素のSDS-PAGEにおけるパターンを示す図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製アルコール脱水素酵素を示す。
【図１４】アルコール脱水素酵素を用いたＲ−３−キヌクリジノールの生成量の経時変化結果を示す図である。
【００５０】
【配列表】

【００５１】
【発明の効果】
本発明により、医農薬合成中間体として重要なＲ−３−キヌクリジノールの製造能を有する有用なアルコール脱水素酵素が提供されるとともに、それらを利用してに効率的な生産が可能となる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a useful and novel alcohol dehydrogenase enzyme and a method for producing optically active 3-quinuclidinol or a salt thereof by its action. These optically active 3-quinuclidinols or salts thereof are useful as raw materials for various medical and agrochemical products.
[0002]
[Prior art]
JP-A-10-243795, JP-A-11-196890, and JP-A-2000-245495 propose a method using microbial cells for optically active 3-quinuclidinol by enzyme asymmetric reduction. However, the catalysts used in these methods, the JP-A 10-243795, Nakazawaea (Nakazawaea) genus Candida (Candida) spp, Proteus (Proteus) genus Arthrobacter (Arthrobacter) genus Pseudomonas (Pseudomonas) but only genus and Rhodosporidium (Rhodosporidium) spp body, in JP-a 11-196890 Rodotoruura (Rhodotorula) genus Candida (Candida) spp, scan poly geo Bol mouse (Sporidiobolus) genus, Rhodosporidium (Rhodosporidium) genus, sushi Schizosaccharomyces Saccharomyces Seth (Schizosaccharomyces) genus Cryptococcus (Cryptococcus) genus Trichosporon (Trichosporon) genus Gordona (Gordona) genus Pichia (Pichia) is only bacteria of genus and Nokarudeia (Nocardia) genus, also, JP 2000-245495 in the genus Alcaligenes , Coryneba Only cells of the genus cterium , Arthrobacter , Filobasidium , Rhodotorula , Aureobasidium, and Yarrowia are used. In the reaction with these cells, the isolation of the product is often complicated due to impurities derived therefrom or side reactions with other enzymes.
[0003]
On the other hand, this reaction at a purified or roughly purified enzyme level is not known as a method for producing optically active 3-quinuclidinol.
A novel enzyme as provided by the present invention and a useful method for synthesizing R-3-quinuclidinol or salts thereof using the same have been desired.
[0004]
In addition, as a method for producing optically active 3-quinuclidinol, for example, a method of leading to an optically active 3-quinuclidinol derivative by a preferential crystallization method using, for example, optically active tartaric acid as a resolving agent (Acta. Pharm. Suec., 16 , 281-3 (1979)). As a method of utilizing a catalyst such as a microorganism, a method in which a lower fatty acid ester of 3-quinuclidinol is asymmetrically hydrolyzed with an enzyme to divide it into optically active 3-quinuclidinol (US Pat. -210997 and Life Sic. 21, 1293-1302 (1977)) are known. However, these methods are methods in which a racemic body is used as a starting material and optically resolved to obtain a target optical isomer, and since the target enantiomer remains, production costs tend to increase.
[0005]
Meanwhile, a method for producing optically active 3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone by asymmetric reduction using a Lewis acid adduct as a catalyst with a rhodium complex compound (Japanese Patent Laid-Open No. 9-194480) has been reported. It is difficult to say that this is an industrially advantageous production method with low purity.
Therefore, a useful synthesis method using a novel enzyme as provided by the present invention has been desired.
[0006]
[Problems to be solved by the present invention]
The present invention provides a novel alcohol dehydrogenase and an industrially advantageous production method for optically active 3-quinuclidinol or a salt thereof useful as a pharmaceutical and agrochemical synthesis intermediate by an asymmetric reduction reaction using the enzyme. Is to provide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors pay attention to the ability of a specific microorganism to act on 3-quinuclidinone or a salt thereof, and stereoselectively reduce to the R form thereof to generate R-3-quinuclidinol or a salt thereof, Furthermore, as a result of purifying the enzyme and intensively studying its enzyme chemical properties, it was found that it has the property of preferentially reducing the R form with high stereoselectivity, and the present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention is an alcohol dehydrogenase having the properties shown in the following (1) and (2).
(1) Using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as a coenzyme, 3-quinuclidinone or a salt thereof is reduced to produce R-3-quinuclidinol.
(2) The optimum pH when 3-quinuclidinone is used as the substrate is in the range of 7.0 to 9.0.
[0009]
Furthermore, the present invention relates to R-3-quinuclidinol or a salt thereof characterized by allowing the enzyme, a microorganism producing the enzyme, a transformed microorganism or a processed product thereof to act on 3-quinuclidinone or a salt thereof. It is a manufacturing method.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The alcohol dehydrogenase of the present invention has the ability to reduce 3-quinuclidinone or a salt thereof using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as a coenzyme to produce R-3-quinuclidinol. Several other types of coenzymes are generally known, but even if it is other than NADH, there is no particular limitation as long as it can produce R-3-quinuclidinol, but it may be NADH-dependent. desirable.
[0011]
This enzyme has an optimum pH in the range of 7.0 to 9.0 when 3-quinuclidinone is used as a substrate. The optimum pH is not particularly limited as long as the optimum pH is within this range, but the optimum pH is preferably 7.5 to 8.0.
[0012]
Furthermore, the molecular weight of this enzyme is about 52,000 when measured by SDS-PAGE. When measured by gel filtration (high performance liquid chromatography), it is preferably about 220,000.
[0013]
Although it does not restrict | limit especially as a supply source of alcohol dehydrogenase in this invention, It can obtain from living cells, such as microorganisms. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Microbacterium . Preferred examples include Microbacterium estevoaromaticum IFO 3751, Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM 9171, and Microbacterium luteolum JCM 9174. Particularly preferred is Microbacterium luteolum JCM 9174.
[0014]
The strains with IFO numbers and JCM numbers are known and can be easily obtained from the Fermentation Research Institute and RIKEN Microbial System Storage Facility, respectively.
[0015]
Isolation and purification methods of this enzyme include protein fractionation (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.), cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, chelate, dye, Purification can be performed by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using antibodies. For example, after disrupting cells, ammonium sulfate precipitation, Blue-Sepharose column, DEAT-Toyopearl, Hiload Superdex 200 pg FPLC column, HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC column, Pros HQ / M FPLC column, BioAssistQ FPLC column chromatography, etc. By performing this, it can be purified to a single band by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
[0016]
In the present invention, the salt of 3-quinuclidinone and 3-quinuclidinol is intended to have a nitrogen atom formed as a salt of an organic acid or a mineral acid. Specific examples of the mineral acid salt include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate. Examples of organic acid salts include aliphatic organic acid salts such as acetate, propionate, butyrate, fumaric acid, malonic acid, and oxalic acid, and aromatic organic acid salts such as benzoic acid.
In the present invention, the enzyme is not limited to a purified enzyme, and includes a crude product, an immobilized product, and the like. In the present invention, a transformed microorganism refers to a recombinant microorganism into which a gene encoding the enzyme of the present invention has been introduced and expressed. As the host, for example, Escherichia (Escherichia) genus Bacillus (Bacillus) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus Pichia (Pichia) sp., Candida (Candida) spp, and the like Aspergillus (Aspergillus) genus. Furthermore, the transformed microorganism treated product includes acetone-dried microbial cells, freeze-dried microbial cells, cell-free extracts obtained by disrupting cell walls by mechanical and enzymatic methods, surfactants, organic solvents, and the like, or These are immobilization products.
[0017]
In the present invention, production of R-3-quinuclidinol or a salt thereof by an asymmetric reduction reaction can be performed by the following method. As needed, 3-quinuclidinone or coenzyme (NADH, NADPH, NAD ⁺ , NADP ⁺ ) or / and 3-quinuclidinone in a reaction solvent such as water or buffer in the presence of an energy source such as glucose, sucrose, ethanol, methanol, etc. It can be carried out by bringing the salt into contact with an enzyme, a transformed microorganism, or a treated product thereof. Then, the reaction is carried out while controlling the reaction temperature and, if necessary, the pH of the reaction solution. In some cases, the reaction substrate (3-quinuclidinone or a salt thereof) and / or the coenzyme or energy source is appropriately added during the reaction to continue the reaction.
[0018]
In some cases, NAD ⁺ produced from NADH accompanying the reduction reaction can be regenerated to NADH using the NAD ⁺ reducing ability (such as glycolysis) of microorganisms.
These NAD ⁺ reducing ability can be enhanced by adding glucose or ethanol to the reaction system. Moreover, it can also carry out by adding the microorganisms which have the capability to produce | generate NADH from NAD ⁺ , its processed material, and an enzyme to a reaction system.
[0019]
The substrate concentration of the reaction solution is not particularly limited between 0.01 and 50% by weight, but it is preferably carried out at a concentration of 0.05 to 30% by weight in consideration of productivity and the like.
The concentration of a catalyst such as an enzyme in the reaction solution is appropriately determined depending on its shape and its activity, and is not particularly limited.
The pH of the reaction solution is comprehensively determined in consideration of the optimum pH of the enzyme to be used, and is not particularly limited, but is preferably 5 to 10. It is more preferable to carry out the reaction at an optimum pH of 7.0 to 9.0. In addition, the pH changes as the reaction proceeds. In this case, it is desirable to adjust to an optimum pH by adding an appropriate neutralizing agent.
The reaction temperature is preferably 0 to 60 ° C, more preferably 5 to 50 ° C.
[0020]
As the reaction solvent, an aqueous medium such as ion-exchanged water or a buffer solution is usually used, but the reaction can also be performed in a system containing an organic solvent or a surfactant in order to promote dissolution of 3-quinuclidinone or a salt thereof. . Examples of the organic solvent include alcohol solvents such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, t-butyl alcohol, and t-amyl alcohol, and aliphatic hydrocarbon solvents such as pentane, hexane, heptane, and octane. , Aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene and xylene, halogenated hydrocarbon solvents such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride and dichloroethane, ether solvents such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran and dioxane, acetic acid Ester solvents such as ethyl, propyl acetate and butyl acetate, ketone solvents such as acetone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone, acetonitrile, N, N-dimethylformamide and the like can be used as appropriate.
[0021]
It is also possible to carry out the reaction in a two-layer system by adding these organic solvents or surfactants in excess of the solubility in water. By allowing an organic solvent to coexist in the reaction system, the selectivity, conversion rate, yield, etc. are often improved. The reaction time is usually 1 hour to 1 week, preferably 1 to 72 hours, and it is preferable to select reaction conditions for completing the reaction in such a time.
The substrate concentration, coenzyme concentration, enzyme concentration, pH, temperature, solvent, reaction time, and other reaction conditions as described above are the target optically active 3-quinuclidinol or the reaction yield under the conditions. It is desirable to appropriately select conditions under which the most salt can be collected.
[0022]
The target product can be isolated from the reaction mixture after completion of sterilization by conventional methods such as concentration, extraction, column separation, and crystallization.
For example, after adjusting the pH to alkaline, ethers such as diethyl ether and diisopropyl ether; esters such as ethyl acetate; hydrocarbons such as hexane, benzene and toluene; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride; butanol, iso Extraction and separation can be performed using a general solvent such as an alcohol solvent such as butanol or t-amyl alcohol.
[0023]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to the scope of these examples.
[0024]
<Example 1> Culture of Microbacterium luteolum JCM 9174 Precultured at 30 ° C in a medium containing 1.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 0.3% sodium L-glutamate, 1.0% sucrose (pH 7.0) Subsequently, the main culture was performed at 30 ° C. for 24 hours using 3 liters of a culture solution having a composition in which 0.1% of an antifoaming agent was added to the same culture medium.
[0025]
<Example 2> Purification of this enzyme is shown below. All steps were performed at 4 ° C.
1) Preparation of crude enzyme solution 33.8 g of wet cell weight was obtained from 6 liters of the culture solution by the above culture method. Suspend in 20 mM phosphate buffer pH 7.0 containing 170 ml of 1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM MgCl 2, protease inhibitor EDTA FREE (Roche; 1 tablet / 50 ml), and crush the cells (201M ultrasonic) (Oscillator, Kubota Corporation) for 8 minutes at 180W and 0 ° C. The disrupted solution was centrifuged at 9000 g for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered as a crude enzyme solution. Unless otherwise specified, a 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM 2-mercaptoethanol and 1 mM MgCl 2 was used as the buffer. (Hereinafter buffer A)
[0026]
2) Ammonium sulfate fraction The crude enzyme solution was subjected to ammonium sulfate fractionation, and the precipitate of 0 to 55% saturated fraction was recovered. The resulting precipitate was dissolved in buffer A and dialyzed against the same buffer.
[0027]
3) Blue-Sepharose column chromatography buffer A equilibrated with Blue-Sepharose (φ2.5mm × 24mm), and the enzyme activity was not adsorbed. Eluted in minutes.
[0028]
4) After the enzyme solution was adsorbed on DEAT-Toyopearl 650M (Tosoh, φ20mm × 210mm) equilibrated with DEAT-Toyopearl column chromatography buffer A, the column was washed with the same buffer, The enzyme bound to the column was eluted with a ~ 0.8M gradient. The elution pattern is shown in FIG.
[0029]
5) Hiload Superdex 200 pg FPLC Column chromatography active fraction was concentrated by ultrafiltration membrane (Asahi Kasei pencil type module; molecular weight cut off 6000) and equilibrated with buffer A (pH 7.5) containing 50 mM NaCl. Adsorbed to 200 pg (Phamacia Biotech, φ16 mm × 600 mm). The enzyme solution was eluted at a flow rate of 2 ml / min and fractionated at 4 ml / fraction. The elution pattern is shown in FIG.
[0030]
6) HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC Column chromatography active fraction was concentrated and dialyzed with 5 mM buffer A (pH 7.7) on an ultrafiltration membrane, and equilibrated with the same buffer. It was adsorbed on BEADS hydroxypatite (Sangi) chromatography (Sangi, φ16 mm × 100 mm). The same buffer was washed at a flow rate of 2 ml / min, and eluted with a linear concentration gradient of 0 to 1 M buffer A (pH 7.7) to collect the active fraction. The elution pattern is shown in FIG.
[0031]
7) Pros HQ / M FPLC column chromatography Pros HQ / M (PerSeptive Biosystems MA, USA, φ4.6mm ×) equilibrated with 10 mM buffer A (pH 7.5) 100 mm). After washing the column with the same buffer, the protein was eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.8 M NaCl (flow rate 1 ml / min, 2 ml / fraction). The active fraction was collected and used as an enzyme solution. The elution pattern is shown in FIG.
[0032]
8) BioAssistQ FPLC column chromatography active fraction was concentrated and dialyzed with an ultrafiltration membrane (Amicon centriprep; molecular weight cut off 6000) and equilibrated with buffer A (pH 7.0) (Tosoh, φ4.6 mm × 50 mm). After washing the column with the same buffer, the protein was eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.8 M NaCl (flow rate: 1 ml / min, 1 ml / fraction). The active fraction was collected and used as an enzyme solution. The elution pattern is shown in FIG.
[0033]
9) (Second time) Pros HQ / M FPLC column chromatography active fraction is concentrated and dialyzed with an ultrafiltration membrane and adsorbed to Pros HQ / M (φ4.6mm × 100mm) equilibrated with 10mM buffer A (pH7.5). It was. After washing the column with the same buffer, the protein was eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.8 M NaCl (flow rate: 1 ml / min, 2 ml / fraction). The active fraction was collected and used as a purified enzyme. The elution pattern is shown in FIG.
The results of each purification are shown in Table 1.
[0034]
<Table 1>

The protein concentration at the time of each purification was calculated by absorption at 280 nm or using Protein Assay Kit (Bio Rad). The activity of 3-quinuclidinone reductase was appropriately measured by the following two methods as needed.
[0035]
(Activity measurement method A) Activity measurement using gas chromatography
To 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 10 μm 3-quinuclidinone, formic acid dehydrase (FDH, manufactured by Roche) 0.02 U, formic acid 200 mM, NADH 0.5 mM, and 250 μl of enzyme solution were added to a total volume of 1.0 ml. After the reaction at 25 ° C. for 6 hours, the reaction was stopped with 30 μl of 6N sodium hydroxide to a pH of 12.0, the product was extracted with 1-butanol, and dehydrated with sodium sulfate to prepare a measurement sample. The produced R-3-quinuclidinol was quantified by gas chromatography using a chiral column (Hewlett Packard HP 6890 Series, CP-cyclodextrin-N19 column, 0.25 mm ID × 25 m). The amount of enzyme activity that produces 1 nmol of 3-quinuclidinone mM per minute was defined as 1 unit.
[0036]
(Activity measurement method B) Activity measurement using spectroscopic method
A blank reaction was confirmed by adding 0.3 μm NADH and 20 μl of enzyme solution to 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and then 20 mM 3-quinuclidinone as a substrate was added to make a total volume of 1.5 ml. The decrease in NADH absorption at 340 nm was measured, and the amount of enzyme activity for converting 1 nmol of NADH to NAD ⁺ per minute at 25 ° C. was defined as 1 unit. The total activity (U) of the enzyme was calculated using the following formula.
[0037]

* 6220: Molecular absorption coefficient of NADH at 340 nm
<Example 3> Examination of Stabilizer for Alcohol Dehydrogenase Using the crude enzyme of this enzyme, various additives shown in FIG. 7 were added so as to have a concentration of 1 mM (partial concentrations differ). The stability of the crude enzyme was examined after 12, 24, 48, 60, and 216 hours. Enzyme activity was measured by method A. About 3 additives of FAD, FMN, and Pyridoxal-5'-phosphate, it added so that it might be set to 0.1 mM. The result is shown in FIG.
[0039]
<Example 4> Measurement of Michaelis constant (Km) of alcohol dehydrogenase The amount of produced NAD + in each was measured with the amount of NADH and 3-quinuclidinone being varied while keeping the amount of enzyme constant. Km values for NADH and 3-quinuclidinone were calculated by performing a Lineweaver-Burk reciprocal plot on the obtained data (see FIGS. 8 and 9). The Km values for 3-quinuclidinone and NADH were 7.5 mM and 9.0 μM, respectively.
[0040]
<Example 5> Examination of optimum pH of alcohol dehydrogenase The optimum pH of this enzyme activity was measured using 100 mM sodium acetate pH 5.0 to 6.0 potassium phosphate pH 6.0 to 7.5, Tris-HCl pH 7. Buffers of 5 to 9.0 and glycine-KOH pH 9.0 to 10.0 were used. The activity was measured by activity measurement method A. The results are shown in FIG. It was shown that the optimum pH of the enzyme for 3-quinuclidinone is around 7.5 to 8.0.
[0041]
<Example 6> The molecular weight of the alcohol dehydrogenase and the molecular weight of the polyacrylamide gel electrophoresis were examined under the following conditions using high performance liquid chromatography (HPLC). TSK-GEL G3000SW × X (Tosoh Corporation) was used for the column, 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1M NaCl was used as the eluent, and the flow rate was 1.0 ml / min. The eluate was collected separately, and the elution time of R-3-quinuclidinol was determined from the assay results of activation of this enzyme in each fraction, and compared with the elution time of the molecular weight marker (MW-Marker; Oriental Yeast Co., Ltd.). The molecular weight was determined. See Figures 11 and 12.
native Electrophoresis was performed using a pre-made gel PAGEL (ATOO CORPORATION) with a 5 to 20% concentration gradient. For SDS-PAGE, a 12.5% (w / v) polyacrylamide gel was used. Protein detection was performed using Coomassie Brilliant Blue R-250. The results of native-PAGE and SDS-PAGE are shown in FIGS. 13 (A) and (B), respectively.
From these results, it was shown that the molecular weight of this enzyme is about 220,000. From the results of SDS-PAGE, it was estimated to be a tetramer with a subunit molecular weight of 52,000.
[0042]
<Example 7> Effect of metal salt of alcohol dehydrogenase Various metal compounds shown in Table 2 were added to the reaction solution so as to have a concentration of 1 mM, and the effect was examined according to activity measurement method A. Although it was negligibly activated by Mg ions, ZnSO4 showed strong inhibition.
[0043]
<Table 2>

[0044]
<Example 8> Substrate Specificity of Alcohol Dehydrogenase Reaction solutions of various substrate compounds shown in Table 3 were prepared according to activity measurement method B, and their relative activities were examined.
[0045]
<Table 3>

[0046]
<Example 9> Analysis of N-terminal amino acid sequence of alcohol dehydrogenase The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was determined according to a conventional method. Specifically, the purified enzyme separated by SDS-PAGE was electrically blotted onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane. The N-terminal sequence of the enzyme protein adsorbed on the PVDF membrane was determined by Edman degradation method using a Procise491 sequencer manufactured by Applied Biosystems. As a result, the following sequences were confirmed.
[0047]
N-terminal amino acid sequence: PEASANIGVVGLAMGSNLA
[0048]
<Example 10> Synthesis of R-3-quinuclidinol by alcohol dehydrogenase
To 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 10 μm 3-quinuclidinone, formic acid dehydrase (FDH, manufactured by Roche) 0.02 U, formic acid 200 mM, NADH 0.5 mM, and 250 μl of purified enzyme solution were added to a total volume of 1.0 ml. This reaction solution was reacted at 25 ° C. The production amount and optical purity of R-3-quinuclidinol were quantified over time. Quantification was performed by gas chromatography using a chiral column (Hewlett Packard HP 6890 Series, CP-cyclodextrin-N19 column, 0.25 mm ID × 25 m). FIG. 14 shows the change over time in the generation amount. The optical purity was 100% ee in R form.
[0049]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an elution pattern of DEAT-Toyopearl column chromatography.
FIG. 2 is a diagram showing an elution pattern of Hiload Superdex 200 pg FPLC column chromatography.
FIG. 3 is a diagram showing an elution pattern of HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC column chromatography.
FIG. 4 is a diagram showing an elution pattern of Pros HQ / M FPLC column chromatography.
FIG. 5 is a diagram showing an elution pattern of BioAssistQ FPLC column chromatography.
FIG. 6 shows the elution pattern of (second time) Pros HQ / M FPLC column chromatography column chromatography.
FIG. 7 is a graph showing the results of study on a stabilizer for alcohol dehydrogenase.
FIG. 8 is a graph showing the measurement results of the Michaelis constant (Km) for 3-quinuclidinone of alcohol dehydrogenase.
FIG. 9 is a graph showing a measurement result of Michaelis constant (Km) for NADH of alcohol dehydrogenase.
FIG. 10 is a graph showing the results of examining the optimum pH of alcohol dehydrogenase.
FIG. 11 is a diagram showing a high performance liquid chromatography elution pattern of alcohol dehydrogenase.
FIG. 12 is a diagram showing a standard protein calibration curve and results of molecular weight measurement of alcohol dehydrogenase by high performance liquid chromatography.
FIG. 13 (A) is a diagram showing a native-PAGE pattern of purified alcohol dehydrogenase. (B) is a figure which shows the pattern in SDS-PAGE of purified alcohol dehydrogenase. Lane 1 shows a molecular weight marker, and lane 2 shows a purified alcohol dehydrogenase.
FIG. 14 is a graph showing the results of changes over time in the amount of R-3-quinuclidinol produced using alcohol dehydrogenase.
[0050]
[Sequence Listing]

[0051]
【The invention's effect】
The present invention provides a useful alcohol dehydrogenase having the ability to produce R-3-quinuclidinol, which is important as a pharmaceutical and agrochemical synthesis intermediate, and enables efficient production using these alcohol dehydrogenases.

Claims

An alcohol dehydrogenase having the physicochemical properties shown in the following (1) to (3).
(1) Using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as a coenzyme, 3-quinuclidinone or a salt thereof is reduced to produce R-3-quinuclidinol.
(2) The optimum pH in the case of using 3-quinuclidinone as a substrate is in the range of 7.0 to 9.0.
(3) The molecular weight is about 52,000 when measured by SDS-PAGE and about 220,000 when measured by gel filtration.