RU2486239C2 - Polypeptides for enantioselective enzymatic restoration of intermediate compounds - Google Patents
Polypeptides for enantioselective enzymatic restoration of intermediate compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2486239C2 RU2486239C2 RU2010116394A RU2010116394A RU2486239C2 RU 2486239 C2 RU2486239 C2 RU 2486239C2 RU 2010116394 A RU2010116394 A RU 2010116394A RU 2010116394 A RU2010116394 A RU 2010116394A RU 2486239 C2 RU2486239 C2 RU 2486239C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- formula
- compound
- general formula
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 38
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 title abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- -1 keto compound Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims abstract description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract 7
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 36
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 36
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims 6
- 230000001681 protective Effects 0.000 claims 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 abstract description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N Nicotinamide adenine dinucleotide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 13
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 11
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 241000222292 [Candida] magnoliae Species 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 7
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 4-Methyl-2-pentanol Chemical compound CC(C)CC(C)O WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 241000096640 Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 Species 0.000 description 5
- ZKJOXOJMGXFSPF-QYZPTAICSA-N [[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2R,3S,4R,5R)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate;hydrate Chemical compound O.NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 ZKJOXOJMGXFSPF-QYZPTAICSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 5
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 2-Butanol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N 2-Pentanol Chemical compound CCCC(C)O JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007698 EC 1.1.1.1 Human genes 0.000 description 4
- 108010021809 EC 1.1.1.1 Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 3
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 3
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 3
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- SJWFXCIHNDVPSH-UHFFFAOYSA-N octan-2-ol Chemical compound CCCCCCC(C)O SJWFXCIHNDVPSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- CETWDUZRCINIHU-UHFFFAOYSA-N 2-Heptanol Chemical compound CCCCCC(C)O CETWDUZRCINIHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N Cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 102100005410 LINE-1 retrotransposable element ORF2 protein Human genes 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M Lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N MeOtBu Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229940052665 NADH Drugs 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 0 *CC([C@@](Cc1ccccc1)N*)=O Chemical compound *CC([C@@](Cc1ccccc1)N*)=O 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;iron(3+) Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 3-Pentanol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQWCXKGKQLNYQG-UHFFFAOYSA-N 4-methylcyclohexan-1-ol Chemical compound CC1CCC(O)CC1 MQWCXKGKQLNYQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 9-β-D-XYLOFURANOSYL-ADENINE Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N Adenosine Natural products Nc1ncnc2c1ncn2[C@@H]3O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]3O OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N Ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N Amprenavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1COCC1)C1=CC=CC=C1 YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N 0.000 description 1
- AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N Atazanavir Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)[C@@H](O)CN(CC=1C=CC(=CC=1)C=1N=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 229940044172 CALCIUM FORMATE Drugs 0.000 description 1
- CBOCVOKPQGJKKJ-UHFFFAOYSA-L Calcium formate Chemical compound [Ca+2].[O-]C=O.[O-]C=O CBOCVOKPQGJKKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 229940055022 Candida parapsilosis Drugs 0.000 description 1
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N Carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001665089 Chloroflexus aurantiacus J-10-fl Species 0.000 description 1
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- MLBVMOWEQCZNCC-OEMFJLHTSA-N Fosamprenavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](OP(O)(O)=O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1COCC1)C1=CC=CC=C1 MLBVMOWEQCZNCC-OEMFJLHTSA-N 0.000 description 1
- 241000708559 Geobacillus thermodenitrificans subsp. thermodenitrificans DSM 465 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N Isoamyl alcohol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001304302 Kuraishia capsulata Species 0.000 description 1
- 241001112724 Lactobacillales Species 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 description 1
- 241000192003 Leuconostoc carnosum Species 0.000 description 1
- 229910015621 MoO Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N Ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M Sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 description 1
- 241000202739 [Candida] geochares Species 0.000 description 1
- 241000192420 [Candida] gropengiesseri Species 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229960001830 amprenavir Drugs 0.000 description 1
- 229960003277 atazanavir Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019255 calcium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004281 calcium formate Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Chemical group 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 150000001924 cycloalkanes Chemical class 0.000 description 1
- 229960005107 darunavir Drugs 0.000 description 1
- CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N darunavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1[C@@H]2CCO[C@@H]2OC1)C1=CC=CC=C1 CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical class OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003142 fosamprenavir Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atoms Chemical class [H]* 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010084715 isopropanol dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N n-heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000003799 water insoluble solvent Substances 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к способу энантиоселективного ферментативного восстановления кетосоединения общей формулы I:The present invention relates to a method for enantioselective enzymatic reduction of a keto compound of the general formula I:
где R может представлять собой любую защитную группу для функциональных аминогрупп (трет-бутилоксикарбонильную группу, бензилоксикарбонильную группу, 9-флуоренилметоксикарбонильную группу), и X означает -Cl, -CN, -OH, Br, F,where R may be any protecting group for amino functional groups (tert-butyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl group), and X is —Cl, —CN, —OH, Br, F,
до соединений формул II (R,S-спирт) и III (S,S-спирт), соответственно, с помощью оксидоредуктазы в присутствии кофактора.to compounds of formulas II (R, S-alcohol) and III (S, S-alcohol), respectively, using oxidoreductase in the presence of a cofactor.
Предпочтительные соединения формулы I содержат бутилоксикарбонильную группу или бензилоксикарбонильную группу в качестве аминозащитной группы и атом хлора в положении X.Preferred compounds of formula I contain a butyloxycarbonyl group or a benzyloxycarbonyl group as an amino protecting group and a chlorine atom in position X.
Хиральные спирты общих формул II и III представляют собой важные промежуточные соединения при получении протеазных ингибиторов, предназначенных для терапии ВИЧ. Такие протеазные ингибиторы представляют собой, например, ритонавир, ампренавир, фосампренавир, атазанавир или дарунавир.Chiral alcohols of the general formulas II and III are important intermediates in the preparation of protease inhibitors for the treatment of HIV. Such protease inhibitors are, for example, ritonavir, amprenavir, fosamprenavir, atazanavir or darunavir.
Промежуточные соединения формул II (R,S-спирт) и III (S,S-спирт) соответственно могут быть получены, например, энантиоселективным восстановлением соответствующих кетосоединений формулы I, которое в существующих в настоящее время способах получения осуществляется химическими методами. При этом химически катализируемое восстановление имеет такой недостаток, что, с одной стороны, оно может привести в результате к получению побочных продуктов благодаря жестким условиям реакции и, с другой стороны, приводит к получению неудовлетворительных энантиомерных или диастереомерных избытков, соответственно, а также оно технически реализуется только ценой больших усилий. Таким образом, промежуточное соединение формулы II (R,S-спирт) в его энантиомерно обогащенной форме при химических методах менее доступен, чем соединение формулы III (S,S-спирт).Intermediate compounds of formulas II (R, S-alcohol) and III (S, S-alcohol), respectively, can be obtained, for example, by enantioselective reduction of the corresponding keto compounds of formula I, which is carried out by chemical methods in the currently existing methods. In this case, the chemically catalyzed reduction has such a disadvantage that, on the one hand, it can result in by-products due to harsh reaction conditions and, on the other hand, leads to unsatisfactory enantiomeric or diastereomeric excesses, respectively, and it is also technically realized only at the cost of great effort. Thus, the intermediate compound of formula II (R, S-alcohol) in its enantiomerically enriched form is less accessible by chemical methods than the compound of formula III (S, S-alcohol).
По этой причине в течение некоторого времени проводились попытки разработки биокаталитических способов, которые позволяют осуществление энантиоселективного восстановления указанных промежуточных соединений. Биокатилитические способы обычно осуществляются в умеренных условиях, по этой причине, они, как можно ожидать, дают возможность проводить восстановление кетосоединений формулы I без образования дополнительных побочных продуктов. Однако до сих пор было невозможно выявить какие-либо подходящие биокатализаторы, посредством которых будет возможно ферментативное восстановление с помощью отдельных ферментов.For this reason, for some time, attempts have been made to develop biocatalytic methods that allow the implementation of enantioselective recovery of these intermediates. Biocatalytic methods are usually carried out under moderate conditions, for this reason, they can be expected to make it possible to carry out the reduction of keto compounds of formula I without the formation of additional by-products. However, until now it has not been possible to identify any suitable biocatalysts by which enzymatic reduction using individual enzymes would be possible.
Насколько известно авторам настоящего изобретения, существует только несколько публикаций, в которых описаны реакции восстановления кетонов формулы I с помощью штаммов Rhodococcus или Streptomyces в способах с использованием цельных клеток (Tetrahedron Asymmetry 14 (2003) 3105-3109, Tetrahedron Asymmetry 8 (1997) p.2547). Однако таким образом осуществлялись реакции только с цельными клетками и лизатами, соответственно, штаммов дикого типа и, таким образом, проводились только при очень низких концентрациях, намного ниже 2% и без регенерации кофермента. Способы ферментативного восстановления, используемые в промышленном масштабе, до сих пор недоступны, и ферменты, вовлеченные в реакцию, никогда не были ни выделены, ни идентифицированы.As far as the authors of the present invention are aware, there are only a few publications that describe the reduction reactions of ketones of formula I using Rhodococcus or Streptomyces strains in methods using whole cells (Tetrahedron Asymmetry 14 (2003) 3105-3109, Tetrahedron Asymmetry 8 (1997) p. 2547). However, in this way reactions were carried out only with whole cells and lysates, respectively, of wild-type strains and, thus, were carried out only at very low concentrations, much lower than 2% and without coenzyme regeneration. Industrial-scale enzymatic reduction methods are still not available, and the enzymes involved in the reaction have never been isolated or identified.
Целью изобретения является предоставление способа, который дает возможность осуществления экономичного получения энантиомерно чистых и, соответственно, энантиомерно обогащенных промежуточных соединений общих формул II и III с высоким выходом и с высокой степенью энантиомерной чистоты при отсутствии каких-либо побочных продуктов. Согласно настоящему изобретению указанная цель достигается с помощью способа изначально указанного типа, который отличается тем, что оксидоредуктаза, используемая для получения соединения формулы II (R,S-спирт),The aim of the invention is the provision of a method that makes it possible to economically obtain enantiomerically pure and, accordingly, enantiomerically enriched intermediates of the general formulas II and III in high yield and with a high degree of enantiomeric purity in the absence of any by-products. According to the present invention, this goal is achieved using a method of the originally indicated type, which is characterized in that the oxidoreductase used to produce the compound of formula II (R, S-alcohol),
a) включает аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4, илиa) includes the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or
b) включает аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере 60% аминокислот идентичны аминокислотам аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, илиb) comprises an amino acid sequence in which at least 60% of the amino acids are identical to the amino acids of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or
c) включает аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере 70% аминокислот идентичны аминокислотам аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, илиc) includes an amino acid sequence in which at least 70% of the amino acids are identical to the amino acids of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or
d) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, илиd) encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, or
e) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизована с SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 в жестких условиях, илиe) encoded by a nucleic acid sequence that is hybridized with SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 under stringent conditions, or
f) имеет длину от 220 до 260 аминокислот и включает одну или несколько из неполных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:51, и восстанавливает соединение формулы I до соединения формулы II.f) has a length of 220 to 260 amino acids and includes one or more of the partial sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 51, and reduces the compound of formula I to the compound of formula II.
nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51),nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51),
vlaklp (36), vkaklp (37),vlaklp (36), vkaklp (37),
fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40),fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40),
spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),
avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),
pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) и pisgwi (50).pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) and pisgwi (50).
Кроме того, указанная цель достигается с помощью способа изначально указанного типа, который отличается тем, что оксидоредуктаза, используемая для получения соединения формулы III (S,S-спирт),In addition, this goal is achieved using a method of the originally specified type, which is characterized in that the oxidoreductase used to obtain the compounds of formula III (S, S-alcohol),
a) включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15,a) includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
b) включает аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере 60% аминокислот идентичны аминокислотам аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, илиb) includes an amino acid sequence in which at least 60% of the amino acids are identical to the amino acids of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, or
c) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:30, илиc) encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30, or
d) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизована с SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:30 в жестких условиях, илиd) encoded by a nucleic acid sequence that is hybridized with SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 under severe conditions, or
e) имеет длину от 220 до 260 аминокислот, и включает одну или несколько из неполных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:66, и восстанавливает соединение формулы I до соединения формулы III.e) has a length of 220 to 260 amino acids, and includes one or more of the incomplete sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 66, and reduces the compound of formula I to the compound of formula III.
nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51),nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51),
vlaklp (36), vkaklp (37),vlaklp (36), vkaklp (37),
fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40), fkaaplpa (52), fkgsplpa (53),fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40), fkaaplpa (52), fkgsplpa (53),
spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),
avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),
pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) and pisgwi (50),pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) and pisgwi (50),
gigrat (54), gigrasa (55), gigret (56),gigrat (54), gigrasa (55), gigret (56),
nnagig (57), nnagieg (58),nnagig (57), nnagieg (58),
irwaiapg (59), irvnaiapg (60), irvnaicpg (61), irwgiapg (62),irwaiapg (59), irvnaiapg (60), irvnaicpg (61), irwgiapg (62),
peqiagav (63), peaianav (64), peevanav (65), peaianav (66).peqiagav (63), peaianav (64), peevanav (65), peaianav (66).
Понятно, что полипептид, который восстанавливает соединение формулы I предпочтительно до соединения формулы II, представляет собой такой полипептид, в котором максимальный энантиомерный изыток R,S-спирта достигает в оптимальных условиях реакции количества, составляющее по меньшей мере 50%. Таким образом, понятно, что оптимальные условия реакции являются такими условиями для полипептида, при которых полипептид дает наиболее высокий энантиомерный избыток R,S-спирта.It is understood that a polypeptide that reduces a compound of Formula I, preferably to a compound of Formula II, is a polypeptide in which the maximum enantiomeric excess of R, S-alcohol reaches an amount of at least 50% under optimal reaction conditions. Thus, it is understood that optimal reaction conditions are those for a polypeptide under which the polypeptide gives the highest enantiomeric excess of R, S-alcohol.
Было обнаружено, что полипептиды, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, показывают оксидоредуктазную активность и могут быть использованы для восстановления соединения формулы I предпочтительно до соединения формулы II (R,S-соединения). Достигаемый энантиомерный избыток количества R,S-спирта составляет >50%, предпочтительно, >80% и, наиболее предпочтительно, >95%. Энантиомерный избыток, достигаемый при использовании последовательности SEQ ID NO:1, может, например, обеспечивать количество R,S-соединения (формула II), составляющее до >99%.It has been found that polypeptides comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 show oxidoreductase activity and can be used to reduce a compound of formula I, preferably to a compound of formula II (R, S-compounds). The enantiomeric excess achieved in the amount of R, S-alcohol is> 50%, preferably> 80%, and most preferably> 95%. The enantiomeric excess achieved using the sequence of SEQ ID NO: 1 can, for example, provide an amount of R, S-compound (Formula II) up to> 99%.
Подобным образом, было обнаружено, что полипептиды, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15, показывают оксидоредуктазную активность и могут быть использованы для восстановления соединения формулы I предпочтительно до соединения формулы III (S,S-соединения). Достигаемый энантиомерный избыток количества R,S-спирта составляет >80%, предпочтительно, >90% и, наиболее предпочтительно, >95%. Энантиомерный избыток, достигаемый при использовании последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:12, может обеспечивать количество R,S-соединения (формула II), составляющее до >99%.Similarly, it was found that polypeptides comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 15 show oxidoreductase activity and can be used to reduce a compound of formula I, preferably to a compound of formula III (S, S-compound). The enantiomeric excess achieved in the amount of R, S-alcohol is> 80%, preferably> 90%, and most preferably> 95%. The enantiomeric excess achieved using the sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 12 can provide an amount of R, S compound (Formula II) of up to> 99%.
Ряд приведенных оксидоредуктаз, таких как, например, SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 15 обладают дополнительным преимуществом, состоящим в том, что они способны регенерировать окисленный кофактор, образованный во время восстановления, путем восстановления вторичного спирта. Таким образом, конкретное экономическое преимущество состоит также в том, что не нужно использовать дополнительный фермент для регенерации кофактора, в отличие от способов, известных в данной области.A number of these oxidoreductases, such as, for example, SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 7, and 15 have the additional advantage that they are able to regenerate the oxidized cofactor formed during the reduction by reducing secondary alcohol . Thus, a particular economic advantage also lies in the fact that it is not necessary to use an additional enzyme for the regeneration of the cofactor, in contrast to the methods known in this field.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:20, которая кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:5, можно получить, например, из генома организма Rubrobacter xylanophilus DSM 9941.The DNA sequence of SEQ ID NO: 20, which encodes a polypeptide comprising SEQ ID NO: 5, can be obtained, for example, from the genome of the organism Rubrobacter xylanophilus DSM 9941.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:21, которая кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:6, можно получить, например, из генома организма Geobacillus thermodenitrificans DSM 465.The DNA sequence of SEQ ID NO: 21, which encodes a polypeptide comprising SEQ ID NO: 6, can be obtained, for example, from the genome of the organism Geobacillus thermodenitrificans DSM 465.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:22, которая кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:7, можно получить, например, из генома организма Chloroflexus aurantiacus DSM 635.The DNA sequence of SEQ ID NO: 22, which encodes a polypeptide comprising SEQ ID NO: 7, can be obtained, for example, from the genome of the organism Chloroflexus aurantiacus DSM 635.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:23 или ДНК-последовательность SEQ ID NO:24, которые кодируют полипептид, включающий SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9, соответственно, можно получить, например, из организма Candida magnoliae DSMZ 70638.The DNA sequence of SEQ ID NO: 23 or the DNA sequence of SEQ ID NO: 24, which encode a polypeptide comprising SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, respectively, can be obtained, for example, from the organism of Candida magnoliae DSMZ 70638.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:26, которая кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:11, можно получить, например, из организма Candida magnoliae DSMZ 70639.The DNA sequence of SEQ ID NO: 26, which encodes a polypeptide comprising SEQ ID NO: 11, can be obtained, for example, from Candida magnoliae DSMZ 70639.
ДНК-последовательность SEQ ID NO:16, которая кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:1, можно получить, например, из организма Candida magnoliae CBS 6396.The DNA sequence of SEQ ID NO: 16, which encodes a polypeptide comprising SEQ ID NO: 1, can be obtained, for example, from Candida magnoliae CBS 6396.
Кроме того, оксидоредуктазы SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15 могут быть получены, например, с помощью скрининга гомологии с использованием штаммов Candida magnoliae CBS 5659, CBS 7318, CBS 2798, JCM 9448, Candida geochares MUCL 29832, Candida spec. MUCL 40660, Candida gropengiesseri MUCL 29836.In addition, oxidoreductases SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 can be obtained, for example using homology screening using strains of Candida magnoliae CBS 5659, CBS 7318, CBS 2798, JCM 9448, Candida geochares MUCL 29832, Candida spec. MUCL 40660, Candida gropengiesseri MUCL 29836.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу восстановления кетосоединений общей формулы I до соединений общих формул II и III, соответственно, отличающемуся тем, что одно из соединений II или III образуется явно в избытке, с использованием полипептида, включающего одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15, или полипептида, который включает аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 50% одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15, т.e. с использованием полипептида, который может быть получен из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15 путем замены, вставки, делеции или добавления по меньшей мере одной аминокислоты, или с использованием полипептида, который кодируется одной из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:30, или который кодируется последовательностями нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях с одной из SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:30.Thus, the present invention relates to a method for reducing keto compounds of general formula I to compounds of general formulas II and III, respectively, characterized in that one of compounds II or III is formed explicitly in excess using a polypeptide comprising one of the amino acid sequences of SEQ ID NO : 1-SEQ ID NO: 15, or a polypeptide that comprises an amino acid sequence that is at least 50% identical to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15, i.e. using a polypeptide that can be obtained from SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 by substitution, insertion, deletion or addition of at least one amino acid, or using a polypeptide that is encoded by one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 30, or which is encoded by nucleic acid sequences that hybridize under stringent conditions with one of SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 30.
Понятно, что последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях, например, c SEQ ID NO:16, представляет собой полинуклеотид, который может быть идентифицирован методом гибридизации колоний, методом гибридизации бляшек, методом гибридизации по Саузерну или аналогичными методами, с использованием в качестве ДНК-зонда последовательности SEQ ID NO:16.It is understood that a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions, for example, with SEQ ID NO: 16, is a polynucleotide that can be identified by colony hybridization, plaque hybridization, Southern hybridization, or similar methods, using as DNA probe sequence SEQ ID NO: 16.
Для этой цели полинуклеотид, иммобилизованный на фильтре, гибридизуют, например, c SEQ ID NO:16 в 0,7-1M растворе NaCl при 60°C. Гибридизацию осуществляют, как описано, например, в руководстве Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или в подобных публикациях. Затем фильтр отмывают раствором 0,1х-2xSSC при 65°C, где понятно, что раствор 1xSSC представляет собой смесь, состоящую из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия.For this purpose, a polynucleotide immobilized on a filter is hybridized, for example, with SEQ ID NO: 16 in a 0.7-1M NaCl solution at 60 ° C. Hybridization is carried out as described, for example, in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) or similar publications. The filter is then washed with a 0.1x-2xSSC solution at 65 ° C, where it is understood that the 1xSSC solution is a mixture consisting of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate.
Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептидам аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15, а также к полипептидам, которые идентичны по меньшей мере на 55%, предпочтительно, на 65%-75%, наиболее предпочтительно, более чем на 75%, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15, т.e. относится к полипептидам, которые могут быть получены из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15 путем замены, вставки, делеции или добавления по меньшей мере одной аминокислоты. Кроме того, изобретение относится к полипептидам, которые кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:30 или последовательностями нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях с одной из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:30.In addition, the present invention relates to polypeptides of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, as well as polypeptides that are at least 55% identical, preferably 65% -75%, most preferably more than 75%, of one of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, i.e. relates to polypeptides that can be obtained from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 by substitution, insertion, deletion or addition of at least one amino acid. In addition, the invention relates to polypeptides that are encoded by the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 or nucleic acid sequences that hybridize under stringent conditions with one of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30.
В способе настоящего изобретения полипептиды, включающие последовательности SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15, и полипептиды, получаемые из указанных полипептидов, соответственно, могут использоваться либо в полностью очищенной форме, в частично очищенной форме, либо в виде клеток, содержащих один из полипептидов SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15. Таким образом, используемые клетки могут быть предоставлены в нативной форме, пермеабилизованной или в лизированной форме. Предпочтительно, полипептиды, включающие последовательности SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15 и полученные из них производные, соответственно, сверхэкспрессируются в подходящем организме-хозяине, таком как, например, Escherichia coli, и рекомбинантный полипептид используют для восстановления гидроксикетона общей формулы I.In the method of the present invention, polypeptides comprising the sequences of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 and polypeptides derived from these polypeptides, respectively, can be used either in fully purified form, in partially purified form, or in the form of cells containing one from the polypeptides of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15. Thus, the cells used can be provided in native form, permeabilized or in lysed form. Preferably, polypeptides comprising the sequences of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 and derivatives derived from them, respectively, are overexpressed in a suitable host organism, such as, for example, Escherichia coli, and a recombinant polypeptide is used to restore hydroxyketone of the general formula I .
Ферментативное восстановление согласно настоящему изобретению осуществляют в мягких условиях таким образом, чтобы можно было в большей степени избежать деградации нестабильных соединений формулы I и, следовательно, образования нежелательных побочных продуктов. Способ согласно настоящему изобретению обладает энантиомерной чистотой соединения формулы II (R,S-соединения), достигающей до 99%, хотя бы по меньшей мере 50%-энантиомерной чистотой R,S-соединения в зависимости от используемого полипептида.The enzymatic reduction according to the present invention is carried out under mild conditions so that the degradation of unstable compounds of formula I and, therefore, the formation of undesirable by-products can be more avoided. The method according to the present invention has an enantiomeric purity of the compound of formula II (R, S-compound), reaching up to 99%, at least at least 50% -enantiomeric purity of the R, S-compound, depending on the polypeptide used.
Для соединения формулы III (S,S-соединения), способ согласно настоящему изобретению обладает энантиомерной чистотой соединения формулы III (S,S-соединения), достигающей до 99%, хотя бы по меньшей мере 80%-энантиомерной чистотой R,S-соединения в зависимости от используемого полипептида.For a compound of formula III (S, S-compound), the method according to the present invention has an enantiomeric purity of a compound of formula III (S, S-compound), reaching up to 99%, at least at least 80% enantiomeric purity of R, S-compound depending on the polypeptide used.
Предпочтительный вариант осуществления изобретения отличается тем, что кофактор, используемый в способе, непрерывно восстанавливается с помощью субстрата. Предпочтительно, NAD(P)H используют в качестве кофактора вместе с образующимся NAD(P), который в процессе восстановления обратно восстанавливается до NAD(P)H с помощью косубстрата.A preferred embodiment of the invention is characterized in that the cofactor used in the method is continuously restored using a substrate. Preferably, NAD (P) H is used as a cofactor along with the resulting NAD (P), which is restored back to NAD (P) H in the recovery process using cosubstrate.
В способе согласно настоящему изобретению окисленный кофактор NAD или NADP, образованные с помощью оксидоредуктазы/дегидрогеназы, предпочтительно непрерывно регенерируются.In the method according to the present invention, the oxidized cofactor NAD or NADP formed by oxidoreductase / dehydrogenase is preferably continuously regenerated.
Согласно предпочтительному варианту осуществления всех способов согласно настоящему изобретению окисленный кофактор NAD или NADP регенерируется путем окисления спирта.According to a preferred embodiment of all the methods of the present invention, the oxidized cofactor NAD or NADP is regenerated by oxidizing the alcohol.
Для регенерации кофермента используют вторичные спирты, такие как 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 3-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гептанол, 2-октанол или циклогексанол. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения для регенерации кофермента используются 2-пропанол или 4-метил-2-пентанол. Количество косубстрата для регенерации может находиться в интервале, составляющем от 5 до 95% по объему от общего объема.Secondary alcohols, such as 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-heptanol, 2-octanol or cyclohexanol, are used to regenerate the coenzyme. According to a particular embodiment of the invention, 2-propanol or 4-methyl-2-pentanol is used to regenerate the coenzyme. The amount of cosubstrate for regeneration may be in the range of 5 to 95% by volume of the total volume.
Предпочтительно, для регенерации кофактора используют вторичый спирт общей формулы RxRyCHOH, где Rx и Ry независимо представляют собой водород, разветвленную или неразветвленную С1-С8алкильную группу и Собщий≥3.Preferably, a secondary alcohol of the general formula R x R y CHOH is used to regenerate the cofactor, where R x and R y independently represent hydrogen, a branched or unbranched C1-C8 alkyl group, and C total ≥3.
Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению для регенерации кофактора дополнительно добавляют оксидоредуктазу/дегидрогеназу.According to a further preferred embodiment of the method according to the present invention, oxidoreductase / dehydrogenase is additionally added to regenerate the cofactor.
В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения, для регенерации кофактора может быть дополнительно добавлена спирт-дегидрогеназа. Подходящие NADH-зависимые спирт-дегидрогеназы можно получить, например, из пекарских дрожжей, из Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 и US 5763236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8), Pichia capsulata (DE 10327454.4), из Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol,. 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26) или из Rhodococcus ruber (J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6). Подходящие косубстраты для таких спирт-дегидрогеназ, представляют собой, например, указанные выше вторичные спирты, такие как 2-пропанол (изопропанол), 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-октанол или циклогексанол.In a further preferred embodiment of the invention, alcohol-dehydrogenase may be further added to regenerate the cofactor. Suitable NADH-dependent alcohol dehydrogenases can be obtained, for example, from baker's yeast, from Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 and US 5763236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15 (11): 950-8), Pichia capsulata ( DE 10327454.4), from Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol, 2003, 62 (4 ): 380-6; Epub 2003, Apr. 26) or from Rhodococcus ruber (J. Org. Chem., 2003, 68 (2): 402-6). Suitable cosubstrates for such alcohol dehydrogenases are, for example, the above-mentioned secondary alcohols, such as 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-octanol or cyclohexanol.
Подходящие вторичные спирт-дегидрогеназы для регенерации NADPH представляют собой, например, такие, как описано выше, и выделенные из организмов рода Lactobacillales, например, Lactobacillus kefir (US 5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE 101 19274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N) или, как описано, из Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus или Clostridium beijerinckii. Однако другие ферментативные системы также могут в принципе использоваться для регенерации кофактора. Например, регенерация кофактора может быть осуществлена с использованием NAD- или NADP-зависимой формиат-дегидрогеназы (Tishkov et al., J. BiotechNol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). Подходящие косубстраты формиат-дегидрогеназы представляют собой, например, соли муравьиной кислоты, такие как формиат аммония, формиат натрия или формиат кальция.Suitable secondary alcohol dehydrogenases for NADPH regeneration are, for example, those described above and isolated from organisms of the genus Lactobacillales, for example Lactobacillus kefir (US 5,200,335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr 2000 Dec; 56 Pt 12: 1696-8), Lactobacillus minor (DE 101 19274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N) or, as described, from Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus or Clostridium beijerinckii. However, other enzymatic systems can also, in principle, be used to regenerate the cofactor. For example, cofactor regeneration can be accomplished using NAD- or NADP-dependent formate dehydrogenase (Tishkov et al., J. BiotechNol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). Suitable cosubstrates of formate dehydrogenase are, for example, formic acid salts such as ammonium formate, sodium formate or calcium formate.
В способе согласно настоящему изобретению в реакционной смеси используется соединение общей формулы I, предпочтительно, в количестве, составляющем от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно, от 25 г/л до 300 г/л, наиболее предпочтительно, от 50 г/л до 200 г/л, от общего объема.In the method according to the present invention, a compound of general formula I is used in the reaction mixture, preferably in an amount of 10 g / l to 500 g / l, preferably 25 g / l to 300 g / l, most preferably 50 g / l to 200 g / l, of the total volume.
Водная часть реакционной смеси, в которой происходит ферментативное восстановление, предпочтительно содержит буфер, например, фосфатно-калиевый буфер, трис/HCl или триэтаноламин, имеющий pH со значением от 5 до 10, предпочтительно, pH от 6 до 9. Кроме того, буфер может содержать ионы для стабилизации или активации ферментов, таких как, например, ионы цинка или ионы магния.The aqueous portion of the reaction mixture in which enzymatic reduction takes place preferably contains a buffer, for example, potassium phosphate buffer, Tris / HCl or triethanolamine having a pH of 5 to 10, preferably a pH of 6 to 9. In addition, the buffer may contain ions to stabilize or activate enzymes, such as, for example, zinc ions or magnesium ions.
Во время осуществления способа согласно настоящему изобретению температура подходящим образом поддерживается в интервале примерно от 10°C до 70°C, предпочтительно, от 20°C до 45°C.During the implementation of the method according to the present invention, the temperature is suitably maintained in the range of from about 10 ° C to 70 ° C, preferably from 20 ° C to 45 ° C.
В следующем предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению, ферментативную реакцию проводят в присутствии органического растворителя, который не смешивается с водой или смешивается только в ограниченной степени. Указанный растворитель представляет собой, например, симметричный или несимметричный ди(C1-C6)алкиловый эфир, алкан с линейной цепью или алкан с разветвленной цепью, или циклоалкан или не растворимый в воде вторичный спирт, который одновременно представляет собой косубстрат. Предпочтительные органические растворители представляют собой диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, бутилацетат, гептан, гексан, 2-октанол, 2-гептанол, 4-метил-2-пентанол и циклогексанол. В данном случае, растворитель может одновременно служить в качестве косубстрата для регенерации кофактора.In a further preferred embodiment of the method according to the present invention, the enzymatic reaction is carried out in the presence of an organic solvent which is not miscible with water or only miscible to a limited extent. Said solvent is, for example, symmetric or asymmetric di (C1-C6) alkyl ether, linear alkane or branched alkane, or cycloalkane or water-insoluble secondary alcohol, which at the same time is a cosubstrate. Preferred organic solvents are diethyl ether, methyl tert-butyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, butyl acetate, heptane, hexane, 2-octanol, 2-heptanol, 4-methyl-2-pentanol and cyclohexanol. In this case, the solvent can simultaneously serve as a cosubstrate for the regeneration of the cofactor.
Если используются нерастворимые в воде растворители и косубстраты, соответственно, то реакционная смесь состоит из водной фазы и органической фазы. Согласно его растворимости, соединение распределено между органической фазой и водной фазой. Как правило, органическая фаза имеет пропорцию, составляющую от 5 до 95%, предпочтительно, от 10 до 90%, от общего реакционного объема. Две жидких фазы предпочтительно смешивают механически, чтобы между ними генерировалась большая площадь поверхности. Также в данном варианте осуществления изобретения, например, NAD(P), образованный во время ферментативного восстановления, может быть восстановлен обратно до NAD(P)H с помощью косубстрата, такого, как описано выше.If water-insoluble solvents and cosubstrates are used, respectively, then the reaction mixture consists of an aqueous phase and an organic phase. According to its solubility, the compound is distributed between the organic phase and the aqueous phase. Typically, the organic phase has a proportion of 5 to 95%, preferably 10 to 90%, of the total reaction volume. The two liquid phases are preferably mixed mechanically so that a large surface area is generated between them. Also in this embodiment, for example, NAD (P) formed during enzymatic reduction can be reduced back to NAD (P) H using a cosubstrate such as described above.
Концентрация кофактора в водной фазе, в частности, NADH или NADPH, соответственно, находится в интервале, составляющем от 0,001 мМ до 10 мМ, в частности от 0,01 мМ до 1 мМ.The concentration of the cofactor in the aqueous phase, in particular NADH or NADPH, respectively, is in the range of from 0.001 mm to 10 mm, in particular from 0.01 mm to 1 mm.
TTN (общее число превращений равно количеству молей восстановленного соединения формулы I/количество молей использованного кофактора) обычно достигает в способах согласно настоящему изобретению интервалов, составляющих от 102 до 105, однако, предпочтительно, составляет ≥103.TTN (total number of conversions equal to the number of moles of the recovered compound of formula I / number of moles of cofactor used) usually reaches intervals of 10 2 to 10 5 in the methods of the present invention, however, it is preferably ≥10 3 .
В способе согласно настоящему изобретению также может быть использован стабилизатор оксидоредуктазы/дегидрогеназы. Подходящие стабилизаторы представляют собой, например, глицерин, сорбит, 1,4-DL-дитиотреитол (DTT) или диметилсульфоксид (ДМСО).An oxidoreductase / dehydrogenase stabilizer may also be used in the method of the present invention. Suitable stabilizers are, for example, glycerol, sorbitol, 1,4-DL-dithiothreitol (DTT) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
Способ согласно настоящему изобретению осуществляют, например, в закрытом реакционном сосуде, сделанном из стекла или металла. По этой причине компоненты переносят в реакционный сосуд по отдельности и перемешивают в атмосфере, например, азота или на воздухе.The method according to the present invention is carried out, for example, in a closed reaction vessel made of glass or metal. For this reason, the components are transferred separately to the reaction vessel and mixed in an atmosphere, for example, nitrogen or in air.
Согласно другому возможному варианту осуществления изобретения окисленный косубстрат (например, ацетон) может удаляться непрерывно, и/или косубстрат (например, 2-пропанол) может вновь непрерывно добавляться, чтобы сдвигать равновесие реакции в сторону продукта реакции.According to another possible embodiment of the invention, an oxidized cosubstrate (e.g. acetone) can be removed continuously and / or a cosubstrate (e.g. 2-propanol) can be continuously added again to shift the reaction equilibrium towards the reaction product.
В следующем варианте осуществления изобретения, добавление оксидоредуктаз SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15 и/или косубстрата также может осуществляться постепенно в ходе осуществления способа согласно настоящему изобретению.In a further embodiment of the invention, the addition of oxidoreductases SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 and / or cosubstrate can also be carried out gradually during the implementation of the method according to the present invention.
После завершения восстановления, реакционную смесь обрабатывают. Для этой цели, например, необязательно отделяют водную фазу от органической фазы, и органическую фазу, содержащую продукт, фильтруют. Необязательно в дальнейшем водная фаза может быть экстрагирована и обработана подобно органической фазе. Затем растворитель выпаривают из органической фазы и получают продукт общей формулы II или III в виде неочищенного продукта. Неочищенный продукт может быть затем дополнительно очищен или может использоваться непосредственно для синтеза конечного продукта реакции. Ниже изобретение дополнительно иллюстрируется с помощью примеров.After completion of the reduction, the reaction mixture is treated. For this purpose, for example, the aqueous phase is not necessarily separated from the organic phase, and the organic phase containing the product is filtered. Optionally, in the future, the aqueous phase can be extracted and treated like an organic phase. Then, the solvent was evaporated from the organic phase to obtain the product of general formula II or III as a crude product. The crude product may then be further purified or may be used directly to synthesize the final reaction product. The invention is further illustrated below by way of examples.
Пример 1Example 1
Клонирование и получение оксидоредуктазы из Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 (SEQ ID NO:5)Cloning and preparation of oxidoreductases from Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 (SEQ ID NO: 5)
A) Культивирование Rubrobacter xylanophilus DSM 9941A) Cultivation of Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
Клетки Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 культивировали в следующей среде при 50°C (pH 7,2) при перемешивании при 140 об/мин в бактериальном шейкере: 0,1% дрожжевой экстракт, 0,1% триптон, 0,004% CaSO4×2H2O, 0,02% MgCl2×6H2O, 0,01% нитрилтриуксусной кислоты, 100 мл фосфатного буфера [5,44 г/л KH2PO4, 43 г/л Na2HPO4×12H2O], 500 мкл/л 0,01M цитрата железа, 500 мкл/л микроэлемента [500 мкл/л H2SO4, 2,28 г/л MnSO4×H2O, 500 мг/л ZnSO4×7H2O, 500 мг H3BO3, 25 мг/л CuSO4×5H2O, 25 мг/л Na2MoO4×2H2O, 45 мг/л CoCl2×6H2O]. На 6 день культивирования клетки отделяли от культуральной среды с помощью центрифугирования и хранили при -80°C.Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 cells were cultured in the following medium at 50 ° C (pH 7.2) with stirring at 140 rpm in a bacterial shaker: 0.1% yeast extract, 0.1% tryptone, 0.004% CaSO 4 × 2H 2 O, 0.02% MgCl 2 × 6H 2 O, 0.01% nitrile triacetic acid, 100 ml of phosphate buffer [5.44 g / l KH 2 PO 4 , 43 g / l Na 2 HPO 4 × 12H 2 O], 500 μl / L 0.01M iron citrate, 500 μl / L trace element [500 μl / L H 2 SO 4 , 2.28 g / L MnSO 4 × H 2 O, 500 mg / L ZnSO 4 × 7H 2 O, 500 mg H 3 BO 3 , 25 mg / l CuSO 4 × 5H 2 O, 25 mg / l Na 2 MoO 4 × 2H 2 O, 45 mg / l CoCl 2 × 6H 2 O]. On
B) Амплификация гена, кодирующего селективную оксидоредуктазуB) Amplification of a gene encoding selective oxidoreductase
Геномную ДНК экстрагировали согласно методу, описанному в "Molecular Cloning", Manniatis & Sambrook. Полученная в результате нуклеиновая кислота служила в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающей специфичные праймеры, которые получали из генной последовательности, зарегистрированной под номером 46106817 в базе данных NCBI. При этом праймеры получали в направлении от 5'-концевого положения вместе с сайтами рестрикции эндонуклеаз Nde I и Hind III или Sph I, соответственно (SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69), для последующего клонирования в экспрессирующий вектор.Genomic DNA was extracted according to the method described in "Molecular Cloning", Manniatis & Sambrook. The resulting nucleic acid served as a template in the polymerase chain reaction (PCR), including specific primers, which were obtained from the gene sequence registered under number 46106817 in the NCBI database. The primers were obtained in the direction from the 5'-terminal position together with the restriction sites of the endonucleases Nde I and Hind III or Sph I, respectively (SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69), for subsequent cloning into an expression vector.
Амплификацию проводили в ПЦР-буфере [10 мМ Трис-HCl, (pH 8,0); 50 мМ KCl; 10 мМ MgSO4; 1 мМ dNTP-Микс; в каждом случае использовали 20 пмоль праймера и 2,5 Ед. ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen)] вместе с 500 нг геномной ДНК и с использованием следующих температурных циклов:Amplification was performed in PCR buffer [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO 4 ; 1 mM dNTP Mix; in each case, 20 pmol of primer and 2.5 U were used. Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)] together with 500 ng of genomic DNA and using the following temperature cycles:
Полученный в результате ПЦР-продукт, имеющий размер, составляющий примерно 750 п.о., после очистки в 1% агарозном геле подвергали рестрикции с помощью эндонуклеаз Nde I и Hind III или Sph I и Hind III, соответственно, и лигировали в структуру вектора pET21a (Novagen) или вектора pQE70 (Qiagen), соответственно, структура которых была обработана аналогичной эндонуклеазой. После трансформирования 2 мкл лигазной смеси в клетки E.coli Top 10 F' (Invitrogen), плазмидную ДНК устойчивых к ампициллину колоний тестировали на присутствие вставки, имеющей размер, составляющий 750 п.о., с помощью рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз Nde I и Hind III или Sph I и Hind III, соответственно. Плазмидные препараты из клонов, которые были положительными на предмет присутствия фрагмента, подвергали секвенированию и затем трансформировали в Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) и в E.coli RB791 (genetic stock, Yale), соответственно.The resulting PCR product, having a size of approximately 750 bp, after purification in a 1% agarose gel was subjected to restriction using endonucleases Nde I and Hind III or Sph I and Hind III, respectively, and ligated into the structure of the vector pET21a (Novagen) or pQE70 vector (Qiagen), respectively, whose structure was treated with a similar endonuclease. After transforming 2 μl of the ligase mixture into E. coli Top 10 F 'cells (Invitrogen), the plasmid DNA of ampicillin-resistant colonies was tested for the presence of an insert having a size of 750 bp using restriction analysis using Nde I endonucleases and Hind III or Sph I and Hind III, respectively. Plasmid preparations from clones that were positive for the presence of the fragment were sequenced and then transformed into Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) and E. coli RB791 (genetic stock, Yale), respectively.
C.) Эффективная экспрессия полипептида SEQ ID NO:5 в клетках Escherichia coliC.) Effective expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 5 in Escherichia coli cells
Для эффективной экспрессии полипептида SEQ ID NO:5 в клетках Escherichia coli, кодирующую ДНК SEQ ID NO:70 использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции для клонирования в экспрессирующий вектор. Прежде всего данная последовательность ДНК отличалась 153 основаниями от известной ранее последовательности ДНК (SEQ ID NO:20). Такая модификация является консервативной и не приводит в результате к получению измененной аминокислотной последовательности.For efficient expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 5 in Escherichia coli cells, the DNA encoding SEQ ID NO: 70 was used as a template in a PCR reaction for cloning into an expression vector. First of all, this DNA sequence differed 153 bases from the previously known DNA sequence (SEQ ID NO: 20). Such a modification is conservative and does not result in a modified amino acid sequence.
Амплификацию проводили в ПЦР-буфере [10 мМ Трис-HCl, (pH 8,0); 50 мМ KCl; 10 мМ MgSO4; 1 мМ dNTP-микс; в каждом случае использовали 20 пмоль праймера (SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:68) и 2,5 Ед ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen)] вместе с 50 нг ДНК SEQ ID NO:70 в качестве матрицы, и использовали следующие температурные циклы:Amplification was performed in PCR buffer [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO 4 ; 1 mM dNTP mix; in each case, 20 pmol of primer (SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 68) and 2.5 U of Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen)] were used together with 50 ng of SEQ ID NO: 70 DNA as a template, and used following temperature cycles:
Полученный в результате ПЦР-продукт, имеющий размер, составляющий примерно 750 п.о., после очистки в 1% агарозном лигировали с помощью эндонуклеаз Nhe I и Hind III в структуру вектора pET21a (Novagen), структура которых была обработана с помощью аналогичных эндонуклеаз. После трансформирования 2 мкл лигазной смеси в клетки E.coli Top 10 F' (Invitrogen), плазмидную ДНК устойчивых к ампициллину колоний тестировали на присутствие вставки, имеющей размер, составляющий 750 п.о., с помощью рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз Nhe I и Hind III. Плазмидные препараты из клонов, которые были положительными на предмет присутствия фрагмента, подвергали секвенированию и затем трансформировали в Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen).The resulting PCR product, having a size of approximately 750 bp, after purification in 1% agarose was ligated with Nhe I and Hind III endonucleases into the structure of the pET21a vector (Novagen), the structure of which was processed using similar endonucleases. After transforming 2 μl of the ligase mixture into E. coli Top 10 F 'cells (Invitrogen), the plasmid DNA of the ampicillin-resistant colonies was tested for the presence of an insert having a size of 750 bp using restriction analysis using Nhe I endonucleases and Hind iii. Plasmid preparations from clones that were positive for the presence of the fragment were sequenced and then transformed into Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen).
D.) Получение оксидоредуктазы из Rubrobacter xylanophilus DSM 9941D.) Obtaining oxidoreductase from Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
Штаммы Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и RB791 (E.coli, генетический фонд, Йель, США), соответственно, которые трансформировали с помощью экспрессирующей конструкции, культивировали в среде (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) в присутствии ампициллина (50 мкг/мл) до тех пор, пока оптическая плотность не достигала 0,5 при измерении при 550 нм. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали путем добавления изопропилтиогалактозида (IPTG) в концентрации 0,1 мМ. Через 16 часов после индуцирования при 25°C и 220 об/мин клетки собирали и замораживали при -20°C.Strains Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) and RB791 (E. coli, genetic fund, Yale, USA), respectively, which were transformed using an expression construct, were cultured in medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract , 1% NaCl) in the presence of ampicillin (50 μg / ml) until the optical density reaches 0.5 when measured at 550 nm. The expression of the recombinant protein was induced by the addition of isopropylthiogalactoside (IPTG) at a concentration of 0.1 mM. 16 hours after induction at 25 ° C and 220 rpm, the cells were harvested and frozen at -20 ° C.
Для извлечения фермента, 30 г клеток суспендировали в 150 мл буфера триэтаноламина (100 мМ, pH 7, 2 мМ MgCl2, 10% глицерин) и разрушали с использованием гомогенизатора высокого давления. Затем раствор фермента смешивали вместе с 150 мл глицерина и хранили при -20°C.To extract the enzyme, 30 g of cells were suspended in 150 ml of triethanolamine buffer (100 mM,
Полученный таким образом раствор фермента использовали для восстановления соединения I (пример 3).The enzyme solution thus obtained was used to reduce compound I (Example 3).
Аналогично методике, приведенной в примере 2, также могут быть получены оксидоредуктазы SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7.Similarly to the procedure described in example 2, oxidoreductases SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 can also be obtained.
Пример 2Example 2
Клонирование и получение оксидоредуктазы из Candida magnoliae с помощью молекулярного скрининга (SEQ ID NO:1)Cloning and Obtaining Oxidoreductase from Candida magnoliae Using Molecular Screening (SEQ ID NO: 1)
A) Молекулярный скрининг на предмет поиска оксидоредуктазыA) Molecular Screening for Oxidoreductase Search
Геномную ДНК, изолированную из клеток Candida magnoliae CBS 6396, использовали в качестве матрицы для молекулярного скрининга посредством ПЦР. При этом амплификацию проводили в ПЦР-буфере [16 мМ (NH4)2SO4; 67 мМ Трис-HCl pH 8,3 (при 25°C); 1,5 мМ MgCl2; 0,01% Tween 20; 0,2 мМ dNTP-микс; в каждом случае использовали 30 пмоль праймера (SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73) и 1,25 Ед Полимеразы Bio Therm Star Polymerase (Genecraft)] вместе с 50 нг геномной ДНК, изолированной из клеток Candida magnoliae CBS 6396, в качестве матрицы и использовали следующие циклы:Genomic DNA isolated from Candida magnoliae CBS 6396 cells was used as a matrix for molecular screening by PCR. The amplification was carried out in PCR buffer [16 mm (NH 4 ) 2SO 4 ; 67 mM Tris-HCl pH 8.3 (at 25 ° C); 1.5 mM MgCl 2 ; 0.01
После фракционирования полной ПЦР-смеси в 1% агарозном геле, фрагмент размером примерно 400 п.о. идентифицировали и клонировали с помощью выступающих компонентов аденозина в вектор Topo-TA (Invitrogen) для определения последовательности ДНК.After fractionation of the complete PCR mixture in a 1% agarose gel, a fragment of approximately 400 bp identified and cloned using the protruding components of adenosine into the Topo-TA vector (Invitrogen) to determine the DNA sequence.
ДНК-фрагмент, полученный в результате проведения реакции скрининга, показал наличие открытой рамки считывания, соответствующей фрагменту оксидоредуктазы, размером 137 аминокислотных остатков.The DNA fragment obtained from the screening reaction showed the presence of an open reading frame corresponding to the oxidoreductase fragment of 137 amino acid residues.
B) Выделение (общей РНК и мРНК)B) Isolation (total RNA and mRNA)
600 мг свежевыращенных клеток ресуспендировали в 2,5 мл ледяного буфера LETS. К указанной суспензии добавляли 5 мл (примерно 20 г) стеклянных шариков, промытых в азотной кислоте и уравновешенных 3 мл фенола (pH 7,0). Альтернативно, полную смесь затем обрабатывали следующим образом: по 30 секунд встряхивания и по 30 секунд охлаждения на льду, всего 10 минут. Затем добавляли 5 мл ледяного буфера LETS и снова интенсивно встряхивали. Указанную суспензию клеток центрифугировали при 4°C и при 11000 g в течение 5 мин. Водную фазу отделяли и экстрагировали дважды равным объемом раствора фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (24:24:1). Затем экстрагировали хлороформом. После конечной экстракции общую РНК осаждали при -20°C в течение 4 ч путем добавления 1/10 объема 5M LiCl2.600 mg of freshly grown cells were resuspended in 2.5 ml of ice-cold LETS buffer. To this suspension was added 5 ml (about 20 g) of glass beads washed with nitric acid and equilibrated with 3 ml of phenol (pH 7.0). Alternatively, the complete mixture was then processed as follows: 30 seconds of shaking and 30 seconds of cooling on ice, only 10 minutes. Then 5 ml of LETS ice-cold buffer was added and again shaken vigorously. Said cell suspension was centrifuged at 4 ° C and at 11000 g for 5 minutes. The aqueous phase was separated and extracted twice with an equal volume of a phenol: chloroform: isoamyl alcohol solution (24: 24: 1). Then it was extracted with chloroform. After final extraction, total RNA was besieged at -20 ° C for 4 hours by adding 1/10 volume of 5M LiCl 2 .
Полученный таким образом 1 мг общей РНК использовали для обработки олиго-dT целлюлозой (NEB Biolabs) для обогащения молекул мРНК.Thus obtained 1 mg of total RNA was used for processing oligo-dT cellulose (NEB Biolabs) to enrich mRNA molecules.
Определение полной последовательности, кодирующей оксидоредуктазу, осуществляли RACE (быстрая амплификация концов кДНК), согласно методу описанному в руководстве "Molecular Cloning", Manniatis & Sambrook.The complete sequence encoding oxidoreductase was determined by RACE (rapid amplification of cDNA ends) according to the method described in the Molecular Cloning manual, Manniatis & Sambrook.
Последовательность гена, кодирующего оксидоредуктазу, включает 720 пар оснований и эквивалентна длине 239 аминокислотных остатков.The sequence of the gene encoding oxidoreductase includes 720 base pairs and is equivalent to a length of 239 amino acid residues.
C) Синтез с помощью ПЦР полноразмерного транскрипта, кодирующего форму ADH с короткой цепью из Candida magnoliae CBS 6396C) Synthesis using PCR of a full-sized transcript encoding the short-chain ADH form of Candida magnoliae CBS 6396
Конкретные праймеры конструировали для последующего клонирования полноразмерного транскрипта в подходящие экспрессирующие системы. При этом модифицировали 5'-праймер путем введения последовательности распознавания для Nde I и 3'-праймер путем введения последовательности распознавания для Hind III (SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75). Геномная ДНК, выделенная из клеток Candida magnoliae CBS 6396, служила в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции. Амплификацию проводили в ПЦР-буфере [10 мМ Трис-HCl, (pH 8,0); 50 мМ KCl; 10 мМ MgSO4; 1 мМ dNTP-микс; в каждом случае использовали 20 пмоль праймера и 2,5 Ед ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen)] вместе с 50 нг ДНК SEQ ID NO:70 в качестве матрицы, и использовали следующие температурные циклы:Specific primers were designed for subsequent cloning of the full-size transcript into suitable expression systems. The 5'-primer was modified by introducing a recognition sequence for Nde I and the 3'-primer by introducing a recognition sequence for Hind III (SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75). Genomic DNA isolated from Candida magnoliae CBS 6396 cells served as a template for the polymerase chain reaction. Amplification was performed in PCR buffer [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO 4 ; 1 mM dNTP mix; in each case, 20 pmol of primer and 2.5 U of Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen)] were used together with 50 ng of SEQ ID NO: 70 DNA as a template, and the following temperature cycles were used:
Полученный в результате ПЦР-продукт, имеющий размер, составляющий примерно 750 п.о., после очистки в 1% агарозном геле подвергали рестрикции с помощью эндонуклеаз Nde I и Hind III и лигировали в структуру вектора pET21a (Novagen), структура которых была обработана с помощью аналогичных эндонуклеаз. После трансформирования 2 мкл лигазной смеси в клетки E.coli Top 10 F' (Invitrogen), плазмидную ДНК устойчивых к ампициллину (или канамицину) колоний тестировали на присутствие вставки, имеющей размер, составляющий 750 п.о., с помощью рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз Nde I и Hind III. Экспрессирующие конструкции pET21-MIX секвенировали. Ген из Candida magnoliae, кодирующий осидоредуктазу с короткой цепью, имеет открытую рамку считывания, содержащую всего 720 п.о. (SEQ ID NO:16), которая соответствует белку из 239 аминокислот (SEQ ID NO:1).The resulting PCR product, having a size of approximately 750 bp, was purified by restriction with Nde I and Hind III endonucleases after purification in a 1% agarose gel and ligated into the structure of the pET21a vector (Novagen), the structure of which was processed with using similar endonucleases. After transforming 2 μl of the ligase mixture into E. coli Top 10 F 'cells (Invitrogen), the plasmid DNA of the ampicillin (or kanamycin) resistant colonies was tested for the presence of an insert having a size of 750 bp using restriction analysis using endonuclease Nde I and Hind III. The expression constructs of pET21-MIX were sequenced. The gene from Candida magnoliae encoding short-chain osidoreductase has an open reading frame containing only 720 bp. (SEQ ID NO: 16), which corresponds to a protein of 239 amino acids (SEQ ID NO: 1).
D) Экспрессия рекомбинантной оксидоредуктазы в клетках E.coliD) Expression of recombinant oxidoreductase in E. coli cells
Компетентные клетки Escherichia coli Star BL21(De3) (Invitrogen) и клетки RB791 (E.coli genetic stock, Yale, USA), соответственно, трансформировали экспрессирующими конструкциями pET21-MIX, кодирующими оксидоредуктазу. Колонии Escherichia coli, трансформированные экспрессирующими конструкциями, затем культивировали в 200 мл среды LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина или 40 мкг/мл канамицина, соответственно, до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет значения 0,5 по измерениям при 550 нм. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали путем добавления изопропилтиогалактозида (IPTG) с концентрацией 0,1 мМ. Через 16 часов после индуцирования при 25°C и при 220 об/мин, клетки собирали и замораживали на -20°C. Для проведения теста на активность, 10 мг клеток смешивали с 500 мкл 100 мМ буфера TEA pH 7, 1 мМ MgCl2 и 500 мкл стеклянных шариков и гидролизовали в течение 10 мин с использованием шаровой мельницы. Полученный лизат затем использовали в разведенном состоянии для соответствующих измерений.Competent Escherichia coli Star BL21 (De3) cells (Invitrogen) and RB791 cells (E. coli genetic stock, Yale, USA), respectively, were transformed with pET21-MIX expression constructs encoding oxidoreductase. Escherichia coli colonies transformed with expression constructs were then cultured in 200 ml of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) in the presence of 50 μg / ml ampicillin or 40 μg / ml kanamycin, respectively, until until the optical density reaches a value of 0.5 according to measurements at 550 nm. The expression of the recombinant protein was induced by the addition of 0.1 mM isopropylthiogalactoside (IPTG). 16 hours after induction at 25 ° C and at 220 rpm, the cells were harvested and frozen at -20 ° C. To conduct an activity test, 10 mg of cells were mixed with 500 μl of 100
Тест на активность проводили следующим образом: 960 мкл 100 мМ буфера TEA pH 7, 1 мМ MgCl2, 160 мкг NADPH, 10 мкл разведенного клеточного лизата. Реакцию запускали путем добавления к реакционной смеси 10 мкл 100 мМ раствора субстрата.The activity test was carried out as follows: 960 μl of 100 mm
Для извлечения фермента в больших количествах, 30 г клеток ресуспендировали в 150 мл буфера триэтаноламина (100 мМ, pH 7, 2 мМ MgCl2, 10% глицерин) и гидролизовали с использованием гомогенизатора высокого давления. Затем раствор фермента смешивали с 150 мл глицерина и хранили при -20°C.To extract the enzyme in large quantities, 30 g of cells were resuspended in 150 ml of triethanolamine buffer (100 mM,
Аналогично методике, приведенной выше в примере 2, также могут быть получены оксидоредуктазы SEQ ID NO:2, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.Similarly to the procedure described above in example 2, oxidoreductases SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 can also be obtained.
Пример 3Example 3
Характеризация оксидоредуктаз SEO ID NO:1-SEQ ID NO:15 в отношении их способности восстанавливать соединения формулы ICharacterization of oxidoreductases SEO ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 with respect to their ability to reduce compounds of formula I
Оксидоредуктазы последовательностей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15 исследовали на предмет преобразования соединения формулы I, как описано ниже.The oxidoreductase sequences of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 15 were examined for the conversion of a compound of formula I as described below.
Реакционная смесь A (без регенерации кофермента)Reaction mixture A (without coenzyme regeneration)
160 мкл буфера (триэтаноламин 100 мМ pH 7, 1 мМ MgCl2, 10% глицерин)160 μl of buffer (
150 мкл NAD(P)H (40 мг/мл)=6 мг150 μl NAD (P) H (40 mg / ml) = 6 mg
20 мкл 2-пропанола20 μl of 2-propanol
2 мг соединения формулы I2 mg of the compound of formula I
50 мкл раствора фермента согласно примеру 1D50 μl of enzyme solution according to example 1D
Реакционная смесь B (с регенерацией кофермента)Reaction mixture B (with coenzyme regeneration)
400 мкл буфера (триэтаноламин 100 мМ pH 7, 1мМ MgCl2, 10% глицерин)400 μl of buffer (
0,05 мг NAD(P)H0.05 mg NAD (P) H
50 мкл 2-пропанола50 μl of 2-propanol
10 мг соединения формулы I10 mg of the compound of formula I
50 мкл раствора фермента согласно примеру 1D50 μl of enzyme solution according to example 1D
Через 24 ч инкубации образцов A и B, в каждом случае добавляли 1 мл ацетонитрила для завершения реакционных смесей, реакционные смеси центрифугировали и переносили в пробирку для ВЭЖХ-анализа (1 мг/мл).After 24 hours of incubation of samples A and B, in each
Реакционные смеси анализировали ВЭЖХ (Nucleodur 100 5 C18 ec, 125 мм, диаметр 4 мм, Macherey-Nagel). Использовали поток 1 мл/мин и систему растворителей из ацетонитрила (B) и воды (A). Соединения формул I, II и III можно было разделить в течение 10 мин при увеличении линейного градиента ацетонитрила от 40% до 80%.The reaction mixtures were analyzed by HPLC (
Время удерживания составило (кетон формулы I) 10 мин; (R,S-соединение формулы II) 9,3 мин и (S,S-соединение формулы III) 8,5 минThe retention time was (ketone of formula I) 10 min; (R, S-compound of formula II) 9.3 minutes and (S, S-compound of formula III) 8.5 minutes
Результатыresults
Пример 4Example 4
Преобразование соединения формулы I в соединение формулы II (R,S-соединение) с помощью оксидоредуктазы SEQ ID NO:1The conversion of the compounds of formula I to the compounds of formula II (R, S-compound) using oxidoreductase SEQ ID NO: 1
Для преобразования соединения формулы I в соединение формулы II (R,S-соединение), в каждом случае добавляли 2,25 мл суспензии фермента SEQ ID NO:1 (см. пример 1D) и 75 единиц (=2 мл) сверхэкспрессированной спирт-дегидрогеназы из Thermoanerobium brockii к смеси из 3 мл буфера (100 мМ TEA, pH 8, 10% глицерин), 1,5 г соединения формулы I, 0,3 мг NADP и 7 мл 4-метил-2-пентанола. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре при постоянном интенсивном перемешивании. Через 48 ч, более чем 95% использованного соединения формулы I было восстановлено до соединения формулы II. Энантиомерный избыток составил >98%.To convert a compound of formula I to a compound of formula II (R, S-compound), 2.25 ml of a suspension of the enzyme SEQ ID NO: 1 (see Example 1D) and 75 units (= 2 ml) of overexpressed alcohol dehydrogenase were added in each case. from Thermoanerobium brockii to a mixture of 3 ml of buffer (100 mM TEA,
Пример 5Example 5
Преобразование соединения формулы I в соединение формулы III (S,S-соединение) с помощью оксидоредуктазы SEQ ID NO:5The conversion of the compounds of formula I to the compounds of formula III (S, S-compound) using oxidoreductase SEQ ID NO: 5
Для дальнейшего преобразования соединения формулы I в соединение формулы III (S,S-соединение), смесь из 600 мкл буфера (100 мМ TEA, pH 9), 200 мкл 2-пропанола, 50 мг соединения формулы I, 0,1 мг NAD и 200 мкл суспензии фермента SEQ ID NO:5 (см. пример 1D) инкубировали в реакционной пробирке Eppendorf. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре при постоянном интенсивном перемешивании. Через 48 ч, более чем 90% использованного соединения формулы I было восстановлено до соединения формулы III (S,S). Энантиомерный избыток составил >98%.To further convert the compound of formula I to the compound of formula III (S, S-compound), a mixture of 600 μl of buffer (100 mM TEA, pH 9), 200 μl of 2-propanol, 50 mg of the compound of formula I, 0.1 mg NAD and 200 μl of a suspension of the enzyme SEQ ID NO: 5 (see Example 1D) was incubated in an Eppendorf reaction tube. The reaction mixture was incubated at room temperature with constant vigorous stirring. After 48 hours, more than 90% of the compound of formula I used was reduced to the compound of formula III (S, S). The enantiomeric excess was> 98%.
Claims (6)
,
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -ОН, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы II (R,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I.1. The polypeptide of the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, which has oxidoreductase activity and restores the keto compound of the general formula I:
,
where R is a protective group for functional amino groups, and X is —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula II (R, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -ОН, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы II (R,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I.2. A polypeptide that is encoded by a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, which has oxidoreductase activity and restores the keto compound of the general formula I:
where R is a protective group for functional amino groups, and X is —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula II (R, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -ОН, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы II (R,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I.3. A polypeptide that is encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with one of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, and which has an oxidoreductase activity and restores the keto compound general formula I:
where R is a protective group for functional amino groups, and X is —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula II (R, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -ОН, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы III (S,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I.4. The polypeptide of the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, which has oxidoreductase activity and restores the keto compound of the general formula I:
where R represents a protective group for functional amino groups, and X means —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula III (S, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -ОН, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы III (S,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I.5. A polypeptide that is encoded by a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, or SEQ ID NO: 30, which has oxidoreductase activity and restores the keto compound of the total formula I:
where R represents a protective group for functional amino groups, and X means —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula III (S, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
где R представляет собой защитную группу для функциональных аминогрупп, и Х означает -Cl, -CN, -OH, Br, F, до гидроксисоединения общей формулы III (S,S-соединения):
где R и Х имеют значения, как определено для формулы I. 6. A polypeptide that is encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with one of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30, and which has oxidoreductase activity and restores the keto compound of general formula I:
where R is a protective group for functional amino groups, and X is —Cl, —CN, —OH, Br, F, before the hydroxy compound of general formula III (S, S compounds):
where R and X are as defined for formula I.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT15302007 | 2007-09-27 | ||
| ATA1530/2007 | 2007-09-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010116394A RU2010116394A (en) | 2011-11-10 |
| RU2486239C2 true RU2486239C2 (en) | 2013-06-27 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8932835B2 (en) | Process for the enantioselective enzymatic reduction of intermediates | |
| US8980592B2 (en) | Process for the enantioselective enzymatic reduction of hydroxy keto compounds | |
| JP4845729B2 (en) | Pichia capsulata-derived oxidoreductase | |
| JP2007523617A6 (en) | Pichia capsulata-derived oxidoreductase | |
| JP5627546B2 (en) | Method for enantioselective enzymatic reduction of secodione derivatives | |
| KR101780510B1 (en) | Method for stereoselectively and enzymatically reducing keto compounds | |
| RU2486239C2 (en) | Polypeptides for enantioselective enzymatic restoration of intermediate compounds | |
| EP1236796B1 (en) | Novel enone reductases isolated from Kluyveromyces lactis, methods for producing same, and methods for selectively reducing a carbon-carbon double bond of an Alpha, Beta-unsaturated ketone using the reductases | |
| US20050244941A1 (en) | Process for producing levodione | |
| KR102291199B1 (en) | Biocatalytic process for the production of (r)-3-quinuclidinol | |
| WO2008074506A1 (en) | Optical resolution of a mixture of enantiomers of butynol or butenol | |
| JP5537796B2 (en) | Method for obtaining reductase gene and reductase gene | |
| JP2011205921A (en) | Recombinant rhodococcus bacterium and method for producing optically active (r)-3-quinuclidinol by using the same | |
| WO2009153325A1 (en) | Optical resolution of a mixture of enantiomers of butynol or butenol | |
| JPWO2005044973A1 (en) | Novel acetoacetyl CoA reductase and method for producing optically active alcohol |