JP4809660B2 - 3-quinuclidinone reductase and method for producing (R) -3-quinuclidinol using the same - Google Patents
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Description
本発明は、医薬および農薬に利用される光学活性な生理活性化合物として有用である(R)−3−キヌクリジノールの製造に関する。より詳細には、本発明は、3−キヌクリジノンを不斉還元して(R)−3−キヌクリジノールを生成する酵素、および該酵素を利用して(R)−3−キヌクリジノールを製造する方法に関する。 The present invention relates to the production of (R) -3-quinuclidinol which is useful as an optically active physiologically active compound used in medicines and agricultural chemicals. More specifically, the present invention relates to an enzyme that asymmetrically reduces 3-quinuclidinone to produce (R) -3-quinuclidinol, and a method for producing (R) -3-quinuclidinol using the enzyme.
現在、生理活性を有する多くの化合物は、その光学異性体の混合物として使用されている。しかし、望ましい活性は、一方の光学異性体のみに存在する場合が多い。さらに、所望の活性を有しない他方の光学異性体が、生体に対して毒性を有する場合があることも知られている。したがって、有効かつ安全な医薬または生理活性化合物を提供するためには、その原料または合成中間体として用いられる光学純度の高い光学活性物質の製造方法を開発することが強く要望されている。 At present, many compounds having physiological activity are used as a mixture of optical isomers. However, the desired activity is often present only in one optical isomer. It is also known that the other optical isomer that does not have the desired activity may be toxic to living organisms. Therefore, in order to provide an effective and safe pharmaceutical or physiologically active compound, it is strongly desired to develop a method for producing an optically active substance having a high optical purity used as a raw material or a synthetic intermediate.
3−キヌクリジノンの還元生成物である3−キヌクリジノールは、スクアレンシンターゼ阻害作用を有する動脈硬化症の治療剤、またはムスカリン受容体拮抗作用を有する気管支拡張剤、および胃腸運動抑制剤などの合成中間体として知られる化合物である(特許文献1〜5を参照)。
3-quinuclidinol, which is a reduction product of 3-quinuclidinone, is used as a synthetic intermediate such as a therapeutic agent for arteriosclerosis having a squalene synthase inhibitory activity, a bronchodilator having a muscarinic receptor antagonistic activity, and a gastrointestinal motility inhibitor. It is a known compound (see
不斉炭素原子を有する3−キヌクリジノールには、光学異性体が存在する。従って、合成中間体として有用な光学活性3−キヌクリジノールを分離する必要があり、現在までにいくつかの試みがなされている。 Optical isomers exist in 3-quinuclidinol having an asymmetric carbon atom. Therefore, it is necessary to isolate optically active 3-quinuclidinol useful as a synthetic intermediate, and several attempts have been made so far.
光学活性3−キヌクリジノールの製法として、これまでに、例えば、1−ベンジル−3−ヒドロキシキヌクリジウムクロライドをD−酒石酸誘導体で光学分割し、(S)−(+)−3−キヌクリジノールを生産する方法(非特許文献1)、およびD−グルコースからの(S)−(+)−3−キヌクリジノールの合成方法(非特許文献2)が報告されている。ロジウム錯化合物を触媒として3−キヌクリジノンのルイス酸付加物を不斉水素化して、光学活性3−キヌクリジノールを製造する方法(特許文献6)も報告されているが、光学純度が低く、工業的な製造方法ではない。 As a method for producing optically active 3-quinuclidinol, for example, 1-benzyl-3-hydroxyquinuclidium chloride is optically resolved with a D-tartaric acid derivative to produce (S)-(+)-3-quinuclidinol. A method (Non-Patent Document 1) and a method for synthesizing (S)-(+)-3-quinuclidinol from D-glucose have been reported (Non-Patent Document 2). A method for producing optically active 3-quinuclidinol by asymmetric hydrogenation of a Lewis acid adduct of 3-quinuclidinone using a rhodium complex compound as a catalyst (Patent Document 6) has also been reported. It is not a manufacturing method.
微生物や酵素を利用する方法として、例えば、(R,S)−キヌクリジニルブチレートに、馬血清ブチルコリンエステラーゼを作用させ、光学活性(S)−(+)−3−キヌクリジニルブチレートを残存させる方法(非特許文献3)、バチルス(Bacillus)属に属する微生物由来のプロテアーゼを作用させ、高い光学純度の光学活性(R)−(−)−3−キヌクリジノールを製造する方法(特許文献7)がある。ラセミ体の3−キヌクリジノールエステルを出発物質とする例として、ズブチリシンプロテアーゼを用いて(R)−3−キヌクリジノールを製造する方法(特許文献8)、アスペルギルス(Aspergillus)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物に由来するエステル分解酵素を用いてエステルを加水分解し、光学活性(R)−(−)−3−キヌクリジノールおよび(S)−(+)−3−キヌクリジノールを製造する方法(特許文献9)、およびアスペルギルス(Aspergillus)属、リゾプス(Rhizopus)属、キャンディダ(Candida)属、またはシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物菌体や酵素などによる不斉加水分解に基づいて、光学活性3−キヌクリジノールまたは光学活性3−キヌクリジノールエステルを製造する方法(特許文献10)も知られている。 As a method using a microorganism or an enzyme, for example, (R, S) -quinuclidinyl butyrate is allowed to act on horse serum butylcholinesterase to produce optically active (S)-(+)-3-quinuclidinyl butyrate. A method of leaving a rate (Non-patent Document 3), a method of producing optically active (R)-(−)-3-quinuclidinol with high optical purity by acting a protease derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus (patent) There is literature 7). As an example using a racemic 3-quinuclidinol ester as a starting material, a method of producing (R) -3-quinuclidinol using subtilisin protease (Patent Document 8), an Aspergillus genus or Pseudomonas ( Pseudomonas) A method for producing optically active (R)-(−)-3-quinuclidinol and (S)-(+)-3-quinuclidinol by hydrolyzing an ester using an esterolytic enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Pseudomonas) (Patent Document 9), and asymmetric hydrolysis by microorganisms and enzymes belonging to the genus Aspergillus, Rhizopus, Candida, or Pseudomonas, Process for producing active 3-quinuclidinol or optically active 3-quinuclidinol ester (patent text) 10) it is also known.
しかし、これらの方法では、光学純度が低いこと、合成工程の煩雑さから大量生産が容易でないことなどの問題がある。また、いずれの方法も、ラセミ体の3−キヌクリジノールを光学分割して目的の光学異性体を得る手法であるため、目的としない他方の光学異性体が残存する。そのため、これらの方法では、目的としない光学異性体に関して、その不斉炭素の立体配置を反転させて目的の光学異性体へ変換させる工程、あるいは目的としない光学異性体をラセミ化して、再度の光学分割による目的の光学異性体を得る工程を必要とし、生産コストが高くなるという問題がある。 However, these methods have problems such as low optical purity and difficulty in mass production due to the complexity of the synthesis process. In addition, any of these methods is a method of optically resolving racemic 3-quinuclidinol to obtain a target optical isomer, and therefore the other optical isomer that is not the target remains. Therefore, in these methods, for the non-target optical isomer, the configuration of the asymmetric carbon is reversed and converted to the target optical isomer, or the non-target optical isomer is racemized and reused again. There is a problem that a process for obtaining the desired optical isomer by optical resolution is required, resulting in high production costs.
さらに、キヌクリジノン(特に、3−キヌクリジノン)を出発物質としてキヌクリジノール(特に、3−キヌクリジノール)の光学活性体を効率よく生成するために、微生物またはその酵素による不斉還元反応を利用することが報告されている(特許文献11〜14)。特許文献11には、3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールを生成する微生物として、ナカザワウェア(Nakazawaea)属、キャンディダ(Candida)属、およびプロテウス(Proteus)属が含まれることが記載されている。特許文献12には、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、フィロバシディウム(Filobasidium)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、オーレオバシディウム(Aureobasidium)属、またはヤロウィア(Yarrowia)属に属し、かつ3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールを生成する能力を有する微生物を用いることが記載されており、ロドトルラ(Rhodotorula)属の微生物としては、ロドトルラ・アウランティアカ(Rhodotorula aurantica)が具体的に記載されている。特許文献13には、ゲオトリカム(Geotrichum)属、ツカムレラ(Tsukamurella)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、クルチア(Kurthia)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、アクレモニウム(Acremonium)属、またはムコー(Mucor)属に属し、かつ3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールを生成する能力を有する微生物を用いることが記載されている。特許文献14には、ロドトルラ(Rhodotorula)属、キャンディダ(Candida)属、スポリディオボルス(Sporidiobolus)属、ロドスポリディウム(Rhodosporidium)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ゴルドナ(Gordona)属、ピキア(Pichia)属、およびノカルディア(Nocardia)属に属する微生物が記載されており、ロドトルラ(Rhodotorula)属の微生物としては、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)が記載されている。ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)が(R)体を生成することも記載されている。これらの方法においては、不斉還元反応のために微生物の菌体を用いている。このような菌体での反応は、その菌体に由来する不純物、他の酵素による副反応などにより、生成物の単離が煩雑になることがしばしばある。 Furthermore, in order to efficiently produce an optically active form of quinuclidinol (particularly 3-quinuclidinol) using quinuclidinone (particularly 3-quinuclidinone) as a starting material, it has been reported that an asymmetric reduction reaction by a microorganism or its enzyme is used. (Patent Documents 11 to 14). Patent Document 11 describes that microorganisms that produce (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone include the genus Nakazawaea, the genus Candida, and the genus Proteus. ing. Patent Document 12 includes the genus Alcaligenes, Arthrobacter, Filobasidium, Rhodotorula, Aureobasidium, or Yarrowia. And a microorganism having the ability to produce (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone, and microorganisms belonging to the genus Rhodotorula include Rhodotorula aurantica. Is specifically described. Patent Document 13 includes the genus Geotrichum, the genus Tsukamurella, the genus Micrococcus, the genus Kurthia, the genus Microbacterium, the genus Kluyveromyces, the genus Acremonium. The use of a microorganism belonging to the genus (Acremonium) or the genus Mucor and having the ability to produce (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone is described. Patent Document 14 includes the genus Rhodotorula, the genus Candida, the genus Sporidiobolus, the genus Rhodosporidium, the genus Schizosaccharomyces, and the genus Cryptococcus. Microorganisms belonging to the genus Trichosporon, Gordona, Pichia, and Nocardia are described, and microorganisms belonging to the genus Rhodotorula include Rhodotorula. rubra). It is also described that Rhodotorula rubra produces (R) isomers. In these methods, microbial cells are used for the asymmetric reduction reaction. In such a cell reaction, isolation of the product is often complicated due to impurities derived from the cell, side reactions by other enzymes, and the like.
植物由来の酵素を利用する不斉還元反応によって、3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールを生成する方法が報告されている(特許文献15)。この方法では、ヨウシュチョウセンアサガオ(Datura stramonium)またはヒヨス(Hyoscyamus niger)に由来するトロピノン還元酵素−Iをグルコース脱水素酵素と大腸菌で共発現させて、補酵素の再生系と組み合わせて不斉還元反応により3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールを製造している。 A method for producing (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinol by an asymmetric reduction reaction utilizing a plant-derived enzyme has been reported (Patent Document 15). In this method, tropinone reductase-I derived from Datura stramonium or Hyoscyamus niger is co-expressed in glucose dehydrogenase and E. coli and combined with a coenzyme regeneration system to perform asymmetric reduction. (R) -3-quinuclidinol is produced from 3-quinuclidinone by reaction.
光学活性3−キヌクリジノールの製造のために、3−キヌクリジノンの不斉還元反応を触媒する新規な酵素を見出したことが報告されている(特許文献16)。この酵素は、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属する微生物より産生され、NADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を補酵素として、3−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、(R)−3−キヌクリジノールを生成する;および(2)3−キヌクリジノンを基質とした場合の至適pHが7.0から9.0の範囲内にあるという性質を有する。 It has been reported that a novel enzyme that catalyzes an asymmetric reduction reaction of 3-quinuclidinone has been found for the production of optically active 3-quinuclidinol (Patent Document 16). This enzyme is produced from a microorganism belonging to the genus Microbacterium, and reduces 3-quinuclidinone or a salt thereof using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as a coenzyme, and (R) -3-quinuclidinol. And (2) the optimum pH when 3-quinuclidinone is used as a substrate is in the range of 7.0 to 9.0.
このように、光学活性3−キヌクリジノールを効率よく製造するために、3−キヌクリジノンから(R)−3−キヌクリジノールに不斉還元する作用を有する酵素を発見する試みがなされている。
本発明は、3−キヌクリジノンを高い立体選択性で(R)体に還元する酵素、および該酵素を利用し、高い光学純度を有する光学活性(R)−3−キヌクリジノールを効率良く製造する方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to an enzyme that reduces 3-quinuclidinone to (R) isomer with high stereoselectivity, and a method for efficiently producing optically active (R) -3-quinuclidinol having high optical purity using the enzyme. The purpose is to provide.
本発明は、以下の生化学的性質を有する酵素を提供する:
(1)還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を補酵素として、3−キヌクリジノンまたはその塩を不斉還元し、(R)−3−キヌクリジノールを生成する;および
(2)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を補酵素とする3−キヌクリジノールの酸化反応を触媒しない。以下、この酵素を、「3−キヌクリジノン不斉還元酵素」という場合がある。
The present invention provides enzymes having the following biochemical properties:
(1) asymmetric reduction of 3-quinuclidinone or a salt thereof using reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) as a coenzyme to produce (R) -3-quinuclidinol; and (2) nicotinamide adenine It does not catalyze the oxidation reaction of 3-quinuclidinol using dinucleotide phosphate (NADP + ) as a coenzyme. Hereinafter, this enzyme may be referred to as “3-quinuclidinone asymmetric reductase”.
1つの実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、SDS−PAGEで測定した場合のサブユニットの分子量が30,000であり、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した場合の全分子量が93,000である。 In one embodiment, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase has a subunit molecular weight of 30,000 as measured by SDS-PAGE and a total molecular weight of 93,000 as measured by gel filtration chromatography.
別の実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、配列番号41に記載のアミノ酸配列を有する。 In another embodiment, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41.
さらに別の実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)に由来する。 In yet another embodiment, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase is derived from Rhodotolura rubra.
本発明はまた、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。 The present invention also provides a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase.
1つの実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号40に記載の塩基配列を有する。 In one embodiment, the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
本発明はまた、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。以下において、便宜上、このベクターを「3−キヌクリジノン不斉還元酵素発現用ベクター」ともいうが、これは、このベクターが、3−キヌクリジノン不斉還元酵素の遺伝子のみを発現することを意図しているわけではない。 The present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase. In the following, for the sake of convenience, this vector is also referred to as “3-quinuclidinone asymmetric reductase expression vector”, which is intended to express only the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene. Do not mean.
1つの実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素発現用ベクターは、tacプロモーターおよびlacIqリプレッサー遺伝子をさらに含み、上記tacプロモーターは、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを制御する。 In one embodiment, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase expression vector further comprises a tac promoter and a lacI q repressor gene, and the tac promoter comprises a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase. Control.
さらなる実施形態では、上記ベクターは、NADP+をNADPHに再生する酵素(以下、「NADPH再生酵素」ともいう)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。このベクターを、以下、「3−キヌクリジノン不斉還元酵素およびNADPH再生酵素同時発現用ベクター」ともいう。 In a further embodiment, the vector further comprises a polynucleotide encoding an enzyme that regenerates NADP + into NADPH (hereinafter also referred to as “NADPH regenerating enzyme”). Hereinafter, this vector is also referred to as “3-quinuclidinone asymmetric reductase and NADPH regenerating enzyme co-expression vector”.
1つの実施形態では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素およびNADPH再生酵素同時発現用ベクターは、lacIqリプレッサー遺伝子および2つのtacプロモーターを含み、上記2つのtacプロモーターの一方が、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを制御し、かつ他方が、上記NADP+をNADPHに再生する酵素をコードするポリヌクレオチドを制御する。 In one embodiment, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase and NADPH regenerating enzyme co-expression vector includes a lacI q repressor gene and two tac promoters, and one of the two tac promoters is the 3-quinuclidinone. It controls a polynucleotide encoding an asymmetric reductase, and the other controls a polynucleotide encoding an enzyme that regenerates the NADP + to NADPH.
別の実施形態では、上記NADP+をNADPHに再生する酵素はグルコース脱水素酵素である。 In another embodiment, the enzyme that regenerates NADP + to NADPH is glucose dehydrogenase.
さらなる実施形態では、上記グルコース脱水素酵素はバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来である。 In a further embodiment, the glucose dehydrogenase is derived from Bacillus megaterium.
本発明はまた、上記ベクターを発現可能に保持する形質転換体を提供する。 The present invention also provides a transformant that retains the vector in an expressible manner.
本発明は、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよびNADP+をNADPHに再生する酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをそれぞれ発現可能に保持する形質転換体を提供する。 The present invention provides a transformant that retains a vector containing a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase and a vector containing a polynucleotide encoding an enzyme that regenerates NADP + into NADPH in an expressible manner. .
1つの実施形態では、上記形質転換体において、宿主は大腸菌である。 In one embodiment, in the transformant, the host is E. coli.
さらなる実施形態では、上記大腸菌は、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌である。 In a further embodiment, the E. coli is an E. coli that is not deficient in the lactose operon.
本発明はまた、(R)−3−キヌクリジノールまたはその塩の製造方法を提供し、該方法は、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素または上記形質転換体、その培養液もしくは処理物を3−キヌクリジノンまたはその塩に作用させる工程を含む。 The present invention also provides a method for producing (R) -3-quinuclidinol or a salt thereof, wherein the method comprises converting the 3-quinuclidinone asymmetric reductase or the transformant, a culture solution or a treated product thereof to 3-quinuclidinone. Or the process made to act on its salt is included.
1つの実施形態では、上記作用工程において、NADP+がさらに添加される。 In one embodiment, NADP + is further added in the working step.
本発明によれば、3−キヌクリジノンを高い立体選択性で(R)体に還元する酵素が提供される。さらに、該酵素を高発現させることにより、高い光学純度を有する(R)−3−キヌクリジノールを効率良く製造する方法が提供される。 According to the present invention, there is provided an enzyme that reduces 3-quinuclidinone to (R) isomer with high stereoselectivity. Furthermore, by highly expressing the enzyme, a method for efficiently producing (R) -3-quinuclidinol having high optical purity is provided.
本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含まれる。酵素の精製は、例えば、アセトン処理物および細胞破砕物を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われ、種々の精製度の酵素(ほぼ均一までに精製された酵素を含む)が得られ得る。 In the present invention, the enzyme is not limited to a purified enzyme, and includes a crude product, an immobilized product, and the like. Enzyme purification is performed using methods well known to those skilled in the art, such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, and hydrophobic interaction chromatography using, for example, acetone-treated products and cell debris. Of enzymes (including enzymes purified to near homogeneity) can be obtained.
また、本発明において、形質転換体とは、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現した組換え微生物をいう。形質転換体の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。微生物菌体の処理物として、例えば、アセトン処理物、超音波処理などによる細胞破砕物、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処理したもの、それらの固定化物などが含まれる。これらは、当業者に周知の方法により調製され得る。例えば、アセトン処理物は、培養により得られた微生物菌体またはその懸濁液を、冷却した(例えば、−20℃)アセトン中に攪拌し、その後例えば濾過により得られる、上記の酵素活性を保持した粉体状の菌体処理物である。微生物菌体の固定化は、例えば、微生物菌体の存在下で、カラギーナンまたはアクリルアミドなどのゲル化剤をゲル化することによって行われる。 In the present invention, a transformant refers to a recombinant microorganism into which a gene encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention has been introduced and expressed. The culture solution of the transformant means both a culture solution containing microbial cells and a culture solution from which microbial cells have been removed by centrifugation or the like. Examples of treated microbial cells include acetone-treated products, cell disruptions by ultrasonic treatment, cell-free extracts obtained by disrupting cell walls by mechanical and enzymatic methods, surfactants, organic solvents, etc. , And their immobilizates. These can be prepared according to methods well known to those skilled in the art. For example, the acetone-treated product retains the above enzyme activity obtained by, for example, filtration, stirring a microbial cell obtained by culturing or a suspension thereof in cooled (for example, −20 ° C.) acetone. It is a processed powdery microbial cell product. Immobilization of microbial cells is performed, for example, by gelling a gelling agent such as carrageenan or acrylamide in the presence of microbial cells.
<3−キヌクリジノン不斉還元酵素>
本発明は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素を提供する。この酵素は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を補酵素として、3−キヌクリジノンまたはその塩を不斉還元し、(R)−3−キヌクリジノールを生成する能力を有する。この酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を補酵素とする3−キヌクリジノールの酸化反応を触媒しない。これらの活性を、以下の説明において、「3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性」という。なお、この酵素は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を補酵素として利用できない。
<3-Quinuclidinone asymmetric reductase>
The present invention provides 3-quinuclidinone asymmetric reductase. This enzyme has the ability to asymmetrically reduce 3-quinuclidinone or a salt thereof using reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) as a coenzyme to produce (R) -3-quinuclidinol. This enzyme does not catalyze the oxidation of 3-quinuclidinol using nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) as a coenzyme. These activities are referred to as “3-quinuclidinone asymmetric reductase activity” in the following description. This enzyme cannot use reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) as a coenzyme.
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)に由来する天然の酵素は、SDS−PAGE測定によるサブユニットの分子量が約30,000、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量が約93,000である。本酵素は、ホモトリマーである。 The 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention may vary slightly depending on the electrophoresis conditions. For example, a natural enzyme derived from Rhodotolura rubra has a subunit molecular weight of approximately about 0.1 by SDS-PAGE measurement. 30,000, molecular weight measured by gel filtration chromatography is about 93,000. This enzyme is a homotrimer.
また、本酵素は、3−キヌクリジノンを基質とした場合の至適pHが6.0から8.0の範囲内にある。本酵素は、37℃にて16時間処理した場合、pH6.0からpH8.5の広い範囲で安定である。 The enzyme has an optimum pH in the range of 6.0 to 8.0 when 3-quinuclidinone is used as a substrate. This enzyme is stable in a wide range from pH 6.0 to pH 8.5 when treated at 37 ° C. for 16 hours.
本酵素の至適温度は、好ましくは、0〜50℃であり、より好ましくは、40℃付近である。本酵素は、例えば、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中で30分間処理した場合、40℃まで安定である。 The optimum temperature of the enzyme is preferably 0 to 50 ° C, more preferably around 40 ° C. This enzyme is stable up to 40 ° C., for example, when treated for 30 minutes in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0).
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素の活性は、例えば、以下のようにして確認され得る。活性の測定は、基本的には、0.5Mの3−キヌクリジノン・塩酸塩、0.5mMのNADPH、および酵素溶液50μlを含む200μlの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を37℃でインキュベートし、波長340nmの吸光度の減少を測定することにより行われ得る。上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素の酵素量は、1分間に1マイクロモルのNADPHをNADP+に変換させる酵素量を1単位(U)として定義される。本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、上記のNADPHをNADHに代えて測定することにより、NADHを補酵素として利用しないことが確認され得る。また、基本的に、0.5Mの(R)−3−キヌクリジノール、0.5mMのNADP+、および酵素溶液50μlを含む200μlの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を37℃でインキュベートし、波長340nmの吸光度の増加を測定することにより、(R)−3−キヌクリジノールから3−キヌクリジノンへの酸化反応を触媒しないことが確認され得る。 The activity of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention can be confirmed, for example, as follows. The activity was measured basically by incubating 200 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.5 M of 3-quinuclidinone hydrochloride, 0.5 mM NADPH, and 50 μl of enzyme solution at 37 ° C. This can be done by measuring the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. The enzyme amount of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase is defined as 1 unit (U), which is the amount of enzyme that converts 1 micromole of NADPH to NADP + per minute. It can be confirmed that the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention does not utilize NADH as a coenzyme by measuring NADPH in place of NADH. Also, basically, 200 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.5 M (R) -3-quinuclidinol, 0.5 mM NADP + and 50 μl of enzyme solution was incubated at 37 ° C. By measuring the increase in absorbance at 340 nm, it can be confirmed that it does not catalyze the oxidation reaction of (R) -3-quinuclidinol to 3-quinuclidinone.
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、好ましくは、配列番号41に記載のアミノ酸配列を有する。本酵素は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有する限り、天然型酵素のアミノ酸配列(例えば、配列番号41に記載のアミノ酸配列)に対して1または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法(Nucleic Acid Res., 1982年, 10巻, pp.6487;Methods in Enzymol., 1983年, 100巻, pp.448;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989年;PCR A Practical Approach, IRL Press, 1991年, pp.200)などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および/または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および/または付加することができるアミノ酸残基数は、通常50以下、例えば30以下、あるいは20以下、好ましくは16以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは0〜3アミノ酸残基である。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあるので、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も、3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有する限り、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素に含まれる。 The 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41. As long as the enzyme has 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, or substituted for the amino acid sequence of the natural enzyme (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 41). And / or an enzyme having an added amino acid sequence. A person skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis (Nucleic Acid Res., 1982, 10, pp. 6487; Methods in Enzymol., 1983, 100, pp. 448; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; PCR A Practical Approach, IRL Press, 1991, pp. 200), etc. Alternatively, the structure of the protein can be altered by introducing additional mutations. In the present invention, the number of amino acid residues that can be substituted, deleted, inserted, and / or added is usually 50 or less, such as 30 or less, or 20 or less, preferably 16 or less, more preferably 5 or less, even more preferably. Is 0 to 3 amino acid residues. In addition, since amino acid mutations may occur in nature, not only enzymes that have artificially mutated amino acids, but also enzymes in which amino acids have been mutated in nature, as long as they have 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity. Included in 3-quinuclidinone asymmetric reductase.
上記天然型酵素のアミノ酸配列(例えば、配列番号41に記載のアミノ酸配列)に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有する限り、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素に含まれる。本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、好ましくは、配列番号41に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。タンパク質の相同性(ホモロジー)検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした推定アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。 As long as the protein having an amino acid sequence having homology to the amino acid sequence of the natural enzyme (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41) also has 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity, the 3- Included in quinuclidinone asymmetric reductase. The 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is preferably at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41, More preferably, it may be a protein having an amino acid sequence having at least 99% homology. Protein homology search, for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, and DAD, or databases related to DNA sequences such as DDBJ, EMBL, and Gene-Bank, and estimation based on DNA sequences For example, it can be performed through the Internet using a program such as BLAST or FASTA for a database relating to an amino acid sequence. Confirmation of the activity of the protein can be performed using the procedure described above.
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素の供給源は、特に制限されるものではないが、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、ロドトルラ(Rhodotorula)属などに属する微生物が挙げられる。好ましくは、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3785株、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM8113株、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM8117株、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotolura glutinis)IFO0389株、ロドトルラ・グラミニス(Rhodotolura graminis)IFO0190株、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotolura minuta)IFO0879株が挙げられる。特に好ましくは、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株である。なお、IFO番号およびJCM番号が付された菌株は公知であり、それぞれ財団法人発酵研究所および理化学研究所微生物系統保存施設から容易に入手することができる。 Although the supply source of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is not particularly limited, it can be obtained from living cells such as microorganisms. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Rhodotorula. Preferably, Rhodotolura rubra JCM3782 strain, Rhodotolura rubra JCM3785 strain, Rhodotolura rubra JCM8113 strain, Rhodotolura rubra JCM8117 strain, Rodotolura rubra JCM8117 strain, Examples include the IFO0389 strain, Rhodotolura graminis IFO0190 strain, and Rhodotolura minuta IFO0879 strain. Particularly preferred is Rhodotolura rubra JCM3782. Note that strains with IFO numbers and JCM numbers are known, and can be easily obtained from the Fermentation Research Institute and RIKEN Microbial System Storage Facility, respectively.
上記微生物の培養に使用される培地は、日常的に用いられる、当業者に公知の固体培地または液体培地のどちらでもよい。好ましくは、液体培地が用いられる。微生物の培養に使用される培地の炭素源および窒素源として、培養される微生物が利用できる任意の炭素源および窒素源を用いることができる。このような炭素源としては、好ましくは、デンプン、スクロースまたはグルコースなどの糖、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸(例えば、酢酸およびクエン酸)またはその塩(例えば、ナトリウム塩)が挙げられる。窒素源としては、好ましくは、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源および硫安、塩安、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。炭素源の濃度は1〜20%(w/v)、好ましくは1〜5%(w/v)の範囲である。窒素源の濃度は1〜20%(w/v)、好ましくは1〜5%(w/v)の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは20〜30℃である。培養時間は、上記の酵素が十分に産生される時間であり、好ましくは16〜48時間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振盪を用いて行うことができる。 The medium used for culturing the microorganism may be either a solid medium or a liquid medium that is used routinely and is known to those skilled in the art. Preferably, a liquid medium is used. As the carbon source and nitrogen source of the medium used for culturing the microorganism, any carbon source and nitrogen source that can be used by the microorganism to be cultured can be used. Such carbon sources preferably include sugars such as starch, sucrose or glucose, alcohols such as glycerol, and organic acids (eg acetic acid and citric acid) or salts thereof (eg sodium salts). Preferred nitrogen sources include natural nitrogen sources such as yeast extract, casein, corn steep liquor, peptone, meat extract, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium sulfate, and urea. The concentration of the carbon source is in the range of 1 to 20% (w / v), preferably 1 to 5% (w / v). The concentration of the nitrogen source is in the range of 1-20% (w / v), preferably 1-5% (w / v). The culture temperature is a temperature at which the above enzyme is stable and the cultured microorganism can sufficiently grow, and is preferably 20 to 30 ° C. The culture time is a time during which the above enzyme is sufficiently produced, and is preferably about 16 to 48 hours. Culturing can preferably be carried out under aerobic conditions, for example using aeration or shaking.
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素は、タンパク質の溶解度による分画(有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など);陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー;キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の菌体を破砕して無細胞抽出液を調製した後、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、赤色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー、および青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)においてほぼ単一バンドにまで精製することができる。 The 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is fractionated by protein solubility (precipitation by organic solvent, salting out by ammonium sulfate, etc.); cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography; chelate, Purification can be performed by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using dyes, antibodies, and the like. For example, after preparing the cell-free extract by disrupting the cells of the above microorganisms, ammonium sulfate fractionation, hydrophobic chromatography, affinity chromatography using a red dye as a ligand, and affinity chromatography using a blue dye as a ligand are performed. Thus, it can be purified to a single band in polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
<3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチド>
上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA−RNAのキメラ分子であり得る。本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号40に記載の塩基配列を含む。配列番号40に記載の塩基配列は、配列番号41に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による3−キヌクリジノン不斉還元酵素の好ましい形態を構成する。
<3-nucleotide encoding quinuclidinone asymmetric reductase>
A polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase is also included in the present invention. The polynucleotide of the present invention may be an artificial molecule including an artificial nucleotide derivative in addition to a natural polynucleotide such as DNA or RNA. The polynucleotide of the present invention may be a DNA-RNA chimeric molecule. The polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention includes, for example, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 40. The base sequence set forth in SEQ ID NO: 40 encodes a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41, and the protein comprising this amino acid sequence constitutes a preferred form of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase according to the present invention. To do.
本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、上記で説明したような配列番号41に記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、かつ3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号40に記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法(Nucleic Acid Res., 1982年, 10巻, pp.6487;Methods in Enzymol., 1983年, 100巻, pp.448;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989年;PCR A Practical Approach, IRL Press, 1991年, pp.200)などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および/または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。 As the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41 as described above. And a polynucleotide encoding a protein having the amino acid sequence and having 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity. Those skilled in the art will be able to introduce site-directed mutagenesis into the polynucleotide of SEQ ID NO: 40 (Nucleic Acid Res., 1982, 10, pp. 6487; Methods in Enzymol., 1983, 100, pp. 448; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; PCR A Practical Approach, IRL Press, 1991, pp. 200) It is possible to obtain polynucleotide homologs by introducing deletions, insertions, and / or addition mutations.
また、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号40に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。 Moreover, the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is hybridized under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 40. Also included are polynucleotides that can be produced and that encode proteins having 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity.
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記で説明した微生物から取得することができる。遺伝子の取得には、PCRやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、DNA合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを単離することができる。上記塩基配列情報に基づいて、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からPCR用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体DNAもしくはcDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。 The polynucleotide of the present invention can obtain the target gene from the microorganism described above based on the base sequence information described in the present specification. PCR and hybridization screening are used for gene acquisition. It is also possible to chemically synthesize the full length of a gene by DNA synthesis. Based on the base sequence information, a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase derived from an organism other than the above can also be obtained. For example, 3-quinuclidinone derived from various organisms can be obtained by designing a probe using the above base sequence or a partial sequence thereof and performing hybridization under conditions stringent to DNA prepared from another organism. A polynucleotide encoding an asymmetric reductase can be isolated. Based on the above base sequence information, PCR primers can be designed from regions with high homology using sequence information registered in DNA databases such as DNA Databank of JAPAN (DDBJ), EMBL, and Gene-Bank. it can. By using such primers and performing PCR using chromosomal DNA or cDNA as a template, the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase can also be isolated from various organisms.
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号40に記載の塩基配列中の任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40個、60個または100個の連続した配列を一つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system(Amersham Biosciences社製)を用いて、マニュアルに記載の条件(例えば、洗浄条件:42℃、0.5×SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。 The polynucleotide that can hybridize under stringent conditions refers to any at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive sequences in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 40. One or a plurality of probes are selected and designed using, for example, ECL direct nucleic acid labeling and detection system (manufactured by Amersham Biosciences) under the conditions described in the manual (for example, washing conditions: 42 ° C., primary containing 0.5 × SSC) In the wash buffer), it refers to the hybridizing polynucleotide.
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1% SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC、0.1% SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1% SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。 More specifically, “stringent conditions” are, for example, usually 42 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS conditions, preferably 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS conditions. More preferably, the conditions are 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions. Factors affecting the stringency of hybridization include a plurality of factors such as temperature and salt concentration, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
さらに、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号41に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性(ホモロジー)検索は、上で説明したとおりである。 Furthermore, the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, still more preferably the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41. It includes a polynucleotide that encodes a protein having an amino acid sequence with at least 95%, even more preferably at least 99% homology, and having 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity. The protein homology search is as described above.
上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。 The polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase can be expressed in the same or different host using genetic recombination techniques.
<ベクターおよび形質転換体>
本発明のベクターは、上記ポリヌクレオチドを含む。本発明の形質転換体は、本発明のベクターを発現可能に保持する。
<Vector and transformant>
The vector of the present invention contains the above polynucleotide. The transformant of the present invention holds the vector of the present invention so that it can be expressed.
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989年参照)。微生物中で、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5’側上流に、より好ましくはターミネーターを3’側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng., 1990年, 43巻, pp.75-102;Yeast, 1992年, 8巻, pp.423などに詳細に記述されている。 A procedure for producing a transformant and construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). In order to express a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention in a microorganism, this DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector that is stably present in the microorganism, and its genetic information is obtained. It is necessary to transcribe and translate. For this purpose, a promoter corresponding to a unit that controls transcription / translation may be incorporated upstream of the 5 ′ side of the DNA strand of the present invention, and more preferably a terminator may be incorporated downstream of the 3 ′ side. As the promoter and terminator, a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host are used. Regarding vectors, promoters, terminators and the like that can be used in these various microorganisms, “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan”, especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng., 1990, 43, pp. 75-102; Yeast, 1992, Vol. 8, pp.423.
例えば、大腸菌を宿主とする場合は、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドが利用できる。プロモーターとしては、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc(lac、trpの融合)、λファージPL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。発現効率の点から、tacプロモーターが好ましい。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを用いることができる。発現効率を高めるために、リプレッサー遺伝子(例えば、ラクトースリプレッサー遺伝子)をさらに含めることもできる。特に、高発現型であるlacIq遺伝子が好ましく使用できる。lacIq遺伝子は、lacIリプレッサータンパク質を過剰に発現できるように変異された制御プロモーター部位に接続されたlacI遺伝子である。プラスミド上に配置されたlacIq遺伝子が発現することにより、リプレッサータンパク質の生産量が高まるので、プロモーターによる目的遺伝子の発現をより効率よく制御し得る。なお、lacIq遺伝子がリプレッサーの遺伝子であることを明確にするために、「lacIqリプレッサー遺伝子」と表記する場合もある。 For example, when E. coli is used as a host, pBR and pUC plasmids can be used as plasmid vectors. As the promoter, promoters derived from lac (β-galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (fusion of lac, trp), λ phage PL, PR and the like can be used. From the viewpoint of expression efficiency, the tac promoter is preferable. Moreover, as the terminator, a terminator derived from trpA, phage, or rrnB ribosomal RNA can be used. In order to increase the expression efficiency, a repressor gene (for example, a lactose repressor gene) can be further included. In particular, the highly expressed lacI q gene can be preferably used. The lacI q gene is a lacI gene connected to a regulatory promoter site that has been mutated to allow overexpression of the lacI repressor protein. Since the production amount of the repressor protein is increased by the expression of the lacI q gene arranged on the plasmid, the expression of the target gene by the promoter can be controlled more efficiently. In addition, in order to clarify that the lacI q gene is a repressor gene, it may be referred to as “lacI q repressor gene”.
本発明の形質転換体は、補酵素NADP+のNADPHへの再生系が導入されていることが好ましい。3−キヌクリジノンを還元して(R)−3−キヌクリジノールを生成する過程で、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素はNADPHを要求する。この3−キヌクリジノン不斉還元酵素による還元反応に付随して、NADPHからNADP+が生成する。NADP+は、適当な基質の酸化反応を利用することによって、再び還元型であるNADPHに再生することができる。したがって、基質の還元反応の効率化のために、本発明の形質転換体では、NADP+をNADPHに再生する酵素(「NADPH再生酵素」)が発現されることが好ましい。本発明におけるNADPH再生酵素としては、グルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、およびグリセロール脱水素酵素が挙げられる。好ましくは、グルコース脱水素酵素(GDH)である。グルコース脱水素酵素は、好ましくは、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)に由来するグルコース脱水素酵素であり、より好ましくは、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株に由来するグルコース脱水素酵素である。バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株に由来するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子は既に単離され、その配列情報は、データベースに登録されている(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P39482)。データベースに登録されている塩基配列に基づいて、PCRやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微生物から取得することもできる。 In the transformant of the present invention, it is preferable that a regeneration system for coenzyme NADP + into NADPH is introduced. In the process of reducing 3-quinuclidinone to produce (R) -3-quinuclidinol, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention requires NADPH. Accompanying the reduction reaction by the 3-quinuclidinone asymmetric reductase, NADP + is produced from NADPH. NADP + can be regenerated back to NADPH, which is reduced, by utilizing the oxidation reaction of an appropriate substrate. Therefore, in order to increase the efficiency of the substrate reduction reaction, the transformant of the present invention preferably expresses an enzyme that regenerates NADP + into NADPH (“NADPH regenerating enzyme”). The NADPH regenerating enzyme in the present invention includes glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, formate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, phosphogluconate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase. Enzymes, and glycerol dehydrogenase. Glucose dehydrogenase (GDH) is preferable. The glucose dehydrogenase is preferably a glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium, and more preferably a glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium IAM1030. A gene encoding glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium strain IAM1030 has already been isolated, and its sequence information has been registered in a database (UniProtKB / Swiss-Prot Accession No. P39482). It can also be obtained from the microorganism by PCR or hybridization screening based on the base sequence registered in the database.
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結すること、およびラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることが可能である。 When multiple genes are introduced into a single vector, the regions involved in expression control such as promoters and terminators should be linked to each gene, and expressed as an operon containing multiple cistrons such as lactose operon. Is possible.
これらの2つまたはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源の異なる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、一方もしくは両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。 These two or more genes can be introduced into a host by a method of transforming the host with a recombinant vector in which genes are separately introduced into a plurality of vectors having different origins of replication in order to avoid incompatibility, A method of introducing both genes into one vector, a method of introducing one or both genes into a chromosome, and the like can be used.
3−キヌクリジノン不斉還元酵素の遺伝子の発現を高めるために、この酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、プロモーターとしてtacプロモーターを含み得る。さらに、高発現型であるlacIqリプレッサー遺伝子を含み得る。 In order to enhance the expression of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene, a vector containing a polynucleotide encoding this enzyme may contain a tac promoter as a promoter. Further, it may contain a lacI q repressor gene that is highly expressed.
3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドとNADPH再生酵素をコードするポリヌクレオチドとの宿主への導入について、a)単一のベクターに両遺伝子を導入する方法と、b)複製起源の異なる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法とに分けて説明する。 Regarding introduction of a polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase and a polynucleotide encoding NADPH regenerating enzyme into a host, a) a method of introducing both genes into a single vector, and b) different origins of replication The method will be described separately with a method of transforming a host with a recombinant vector in which genes are separately introduced into a plurality of vectors.
a)の場合は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素とNADPH再生酵素とを同時に大量に発現させるには、それぞれの遺伝子を別々に制御できるように2つの高発現型プロモーターを配置する。すなわち、2つの高発現型プロモーターの一方の下流に、3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドが配置され、そして他方の下流に、NADPH再生酵素をコードするポリヌクレオチドが配置されて、2つの発現ユニットが構成される。このプロモーターは、好ましくは、tacプロモーターである。これらの発現ユニットは、さらにターミネーターを備え得る。さらに、これら2つの発現ユニットを含むベクター上には、ラクトースリプレッサー遺伝子(好ましくは、lacIqリプレッサー遺伝子)が配置されることが好ましい。1つの実施形態では、本発明の「3−キヌクリジノン不斉還元酵素およびNADPH再生酵素同時発現用ベクター」は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびNADPH再生酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、lacIqリプレッサー遺伝子および2つのtacプロモーターを含み、上記2つのtacプロモーターの一方が、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを制御し、かつ他方が、上記NADP+をNADPHに再生する酵素をコードするポリヌクレオチドを制御する。 In the case of a), in order to simultaneously express a large amount of 3-quinuclidinone asymmetric reductase and NADPH regenerating enzyme, two high-expression promoters are arranged so that each gene can be controlled separately. That is, a polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase is disposed downstream of one of the two highly expressed promoters, and a polynucleotide encoding NADPH regenerating enzyme is disposed downstream of the other, One expression unit is constructed. This promoter is preferably the tac promoter. These expression units may further comprise a terminator. Furthermore, it is preferable that a lactose repressor gene (preferably, a lacI q repressor gene) is arranged on a vector containing these two expression units. In one embodiment, the “3-quinuclidinone asymmetric reductase and NADPH regenerating enzyme co-expression vector” of the present invention is a polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase and a polynucleotide encoding NADPH regenerating enzyme. In addition, it contains a lacI q repressor gene and two tac promoters, one of the two tac promoters controlling the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase, and the other comprising the NADP + Controls a polynucleotide encoding an enzyme that regenerates to NADPH.
b)の場合は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素発現用ベクターとNADPH再生酵素を発現するためのベクターとを用いる。3−キヌクリジノン不斉還元酵素の遺伝子の発現を高めるために、3−キヌクリジノン不斉還元酵素発現用ベクターは、上記のように、3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドの上流にtacプロモーターを含む発現ユニットを含み得る。この発現ユニットを含むベクター上に、ラクトースリプレッサー遺伝子(好ましくは、lacIqリプレッサー遺伝子)がさらに配置され得る。1つの実施形態では、本発明の「3−キヌクリジノン不斉還元酵素発現用ベクター」は、3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、tacプロモーターおよびlacIqリプレッサーを含み得る。ここで、このtacプロモーターは、3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを制御し得る。NADPH再生酵素を発現するためのベクターは、NADPH再生酵素をコードするポリヌクレオチドの上流に高発現型プロモーターを含む発現ユニットを含むことが好ましい。この高発現型プロモーターは、好ましくは、tacプロモーターである。これらの発現ユニットは、さらにターミネーターを備え得る。 In the case of b), a 3-quinuclidinone asymmetric reductase expression vector and a vector for expressing NADPH regenerating enzyme are used. In order to increase the expression of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase expression vector is a tac promoter upstream of the polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase as described above. An expression unit comprising A lactose repressor gene (preferably, a lacI q repressor gene) can be further arranged on a vector containing the expression unit. In one embodiment, the “3-quinuclidinone asymmetric reductase expression vector” of the present invention may contain a tac promoter and a lacI q repressor in addition to a polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase. Here, the tac promoter can control a polynucleotide encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase. The vector for expressing the NADPH regenerating enzyme preferably includes an expression unit including a high expression promoter upstream of the polynucleotide encoding the NADPH regenerating enzyme. This highly expressed promoter is preferably a tac promoter. These expression units may further comprise a terminator.
上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるために形質転換の対象となる宿主生物は、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、3−キヌクリジノン不斉還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)、放線菌(Streptomyces lividans)、麹菌(Aspergillus oryzae)などが利用され得る。遺伝子組換えの操作の容易性から、大腸菌が好ましい。特に、発現効率の点から、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌が好ましい。このような大腸菌としては、大腸菌SCS1株、W3110株、およびBL21株が挙げられる。 A host organism to be transformed in order to express a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase is transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase. There is no particular limitation as long as it is an organism capable of expressing 3-quinuclidinone asymmetric reductase activity. For example, Escherichia coli, Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae and the like can be used. E. coli is preferred because of the ease of genetic recombination operations. In particular, from the viewpoint of expression efficiency, Escherichia coli having no deficiency in the lactose operon is preferable. Examples of such Escherichia coli include Escherichia coli SCS1 strain, W3110 strain, and BL21 strain.
<(R)−3−キヌクリジノールの製造方法>
上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素または上記形質転換体、その培養液もしくは処理物を3−キヌクリジノンまたはその塩に作用させることにより、(R)−3−キヌクリジノールまたはその塩が効率よく生成される。「3−キヌクリジノンまたはその塩」とは、その窒素原子において有機酸、鉱酸などの塩を形成させたものもまた、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素による3−キヌクリジノンの不斉還元において使用できることを意図する。具体的には、鉱酸塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。有機酸塩としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン酸、シュウ酸などの脂肪族有機酸塩、安息香酸などの芳香族有機酸塩などが挙げられる。以下の説明においては、「3−キヌクリジノン」とのみ表記しているが、上記のような3−キヌクリジノンの塩もまた使用可能である。
<Production method of (R) -3-quinuclidinol>
(R) -3-quinuclidinol or a salt thereof is efficiently produced by allowing the 3-quinuclidinone asymmetric reductase or the transformant, a culture solution or a treated product thereof to act on 3-quinuclidinone or a salt thereof. “3-Quinuclidinone or a salt thereof” means that a compound formed with a salt of an organic acid, a mineral acid, or the like at its nitrogen atom can also be used in the asymmetric reduction of 3-quinuclidinone by the 3-quinuclidinone asymmetric reductase Intended. Specifically, the mineral acid salt includes hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate, and the like. Examples of the organic acid salt include aliphatic organic acid salts such as acetate, propionate, butyrate, fumaric acid, malonic acid, and oxalic acid, and aromatic organic acid salts such as benzoic acid. In the following description, only “3-quinuclidinone” is described, but a salt of 3-quinuclidinone as described above can also be used.
本発明の方法では、上記3−キヌクリジノン不斉還元酵素または上記形質転換体、その培養液もしくは処理物(以下では、これらをまとめて「生物学的触媒」ともいう)を含有する適切な反応液中で、例えば、3−キヌクリジノンを不斉還元し、生成物として(R)−3−キヌクリジノールを得る。 In the method of the present invention, an appropriate reaction solution containing the 3-quinuclidinone asymmetric reductase or the transformant, a culture solution or a processed product thereof (hereinafter collectively referred to as “biological catalyst”). In, for example, 3-quinuclidinone is asymmetrically reduced to obtain (R) -3-quinuclidinol as a product.
本発明の方法の1つの実施形態において、(R)−3−キヌクリジノールは、3−キヌクリジノンの存在下、上記の形質転換体を培養することによって得ることができる。培養液に添加する3−キヌクリジノンの量は、0.1〜30%(w/v)、好ましくは0.1〜10%(w/v)である。添加された3−キヌクリジノンは必ずしも完全に溶解させなくてもよい。添加された3−キヌクリジノンが完全に溶解しない場合、例えば、塩(例えば、塩酸塩)として溶解性を向上させてもよく、あるいはエタノールのような有機溶媒を、還元反応を実質的に阻害しない程度(例えば、5%)に添加してもよい。 In one embodiment of the method of the present invention, (R) -3-quinuclidinol can be obtained by culturing the above transformant in the presence of 3-quinuclidinone. The amount of 3-quinuclidinone added to the culture solution is 0.1 to 30% (w / v), preferably 0.1 to 10% (w / v). The added 3-quinuclidinone may not necessarily be completely dissolved. When the added 3-quinuclidinone is not completely dissolved, for example, the solubility may be improved as a salt (for example, hydrochloride), or an organic solvent such as ethanol is not substantially inhibited from the reduction reaction. (For example, 5%) may be added.
本発明の方法の別の実施形態において、(R)−3−キヌクリジノールは、適切な反応液(水または緩衝液)中で、培養された形質転換体の菌体またはその処理物(例えば、アセトン処理物)を3−キヌクリジノンと接触させることにより得ることができる。反応液に添加する3−キヌクリジノンの量は、0.1〜30%(w/v)、好ましくは0.1〜10%(w/v)である。添加された3−キヌクリジノンは必ずしも完全に溶解しなくてもよい。添加された3−キヌクリジノンが完全に溶解しない場合、例えば、塩(例えば、塩酸塩)として溶解性を向上させてもよく、あるいはエタノールのような溶媒を、生物学的触媒による還元反応を実質的に阻害しない濃度(例えば、5%まで)に添加してもよい。特に菌体処理物を使用する場合、補酵素としてNADPHを添加することが好ましい。この補酵素の添加量は、0.1〜1000mg/l、より好ましくは2〜200mg/lである。 In another embodiment of the method of the present invention, (R) -3-quinuclidinol is cultured in a suitable reaction solution (water or buffer), or the transformed transformant cells or treated product thereof (eg, acetone). The treated product) can be obtained by contacting with 3-quinuclidinone. The amount of 3-quinuclidinone added to the reaction solution is 0.1 to 30% (w / v), preferably 0.1 to 10% (w / v). The added 3-quinuclidinone may not necessarily be completely dissolved. If the added 3-quinuclidinone is not completely dissolved, for example, the solubility may be improved as a salt (eg, hydrochloride), or a solvent such as ethanol may be used to substantially reduce the reduction reaction with a biological catalyst. You may add to the density | concentration (for example, up to 5%) which does not inhibit in the. In particular, when a treated bacterial cell is used, NADPH is preferably added as a coenzyme. The amount of coenzyme added is 0.1 to 1000 mg / l, more preferably 2 to 200 mg / l.
反応は、制御されたpHのもとで行われ得る。反応のための至適なpHを保持するために、例えばリン酸緩衝液などの緩衝液が使用される。反応液のpHは、5〜9、好ましくは6〜8である。あるいは、反応の進行に伴って変化するpHをモニターしながら、酸(例えば、硫酸)およびアルカリ(例えば、水酸化ナトリウム)を添加することによって反応液のpHを至適なpHに維持および調節し得る。 The reaction can be performed under a controlled pH. In order to maintain an optimum pH for the reaction, a buffer solution such as a phosphate buffer solution is used. The pH of the reaction solution is 5 to 9, preferably 6 to 8. Alternatively, the pH of the reaction solution is maintained and adjusted to an optimum pH by adding an acid (for example, sulfuric acid) and an alkali (for example, sodium hydroxide) while monitoring the pH that changes as the reaction proceeds. obtain.
上記生物学的触媒の量は、その形状およびその活性により適宜決定され、特に制限はない。その基質である3−キヌクリジノンに対して、約0.1〜10g/基質mol、好ましくは約1〜5g/基質molであることが望ましい。 The amount of the biological catalyst is appropriately determined depending on its shape and its activity, and is not particularly limited. About 0.1 to 10 g / mol substrate, preferably about 1 to 5 g / mol substrate relative to 3-quinuclidinone as its substrate.
反応温度は10℃〜50℃、好ましくは25℃〜35℃である。 The reaction temperature is 10 ° C to 50 ° C, preferably 25 ° C to 35 ° C.
反応時間は、用いる生物学的触媒の量、反応温度、反応pHなどに依存して変動するが、通常1〜72時間程度である。 The reaction time varies depending on the amount of biological catalyst used, reaction temperature, reaction pH, etc., but is usually about 1 to 72 hours.
(R)−3−キヌクリジノールの製造方法においては、上で説明したような補酵素の再生系を組み合わせることが好ましい。NADP+からNADPHへの再生は、植物、微生物、形質転換体の含有するNADP+からNADPHを再生する酵素によって行うことができる。NADPHの再生反応を触媒する酵素は、単一であっても良いし、複数の酵素で構成される多段階反応であってもよい。複数の酵素によって目的とする酵素反応が支えられているとき、一連の酵素反応を構成する酵素の集合を酵素系と呼ぶ。NADP+還元能は、反応系にグルコース、スクロースなどの糖、有機酸、またはエタノール、イソプロパノールなどのアルコールを添加することにより、増強することができる。また、NADP+からNADPHを生成する能力を有する酵素を用いてNADPHの再生を行うことができる。NADPHの生成に有用な酵素としては、グルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、およびグリセロール脱水素酵素が挙げられる。これらの酵素としては、精製酵素のみならず、当該酵素を有する微生物、その処理物、あるいは部分精製酵素を用いることができる。例えば、グルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの酸化に伴ってNADP+からNADPHへの再生が行われる。 In the method for producing (R) -3-quinuclidinol, it is preferable to combine the coenzyme regeneration system as described above. Playback from NADP + to NADPH can be carried out by an enzyme to regenerate plants, microorganisms, and NADPH from NADP + containing transformants. The enzyme that catalyzes the regeneration reaction of NADPH may be a single enzyme or a multistage reaction composed of a plurality of enzymes. When a target enzyme reaction is supported by a plurality of enzymes, an assembly of enzymes constituting a series of enzyme reactions is called an enzyme system. The NADP + reducing ability can be enhanced by adding sugars such as glucose and sucrose, organic acids, or alcohols such as ethanol and isopropanol to the reaction system. In addition, NADPH can be regenerated using an enzyme capable of generating NADPH from NADP + . Enzymes useful for the production of NADPH include glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, formate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, phosphogluconate dehydrogenase, alcohol dehydration Elemental enzymes, and glycerol dehydrogenase. As these enzymes, not only purified enzymes but also microorganisms having the enzymes, processed products thereof, or partially purified enzymes can be used. For example, in the case of glucose dehydrogenase, regeneration from NADP + to NADPH is performed with oxidation of glucose to δ-gluconolactone.
これらのNADPH再生に必要な反応を構成する成分は、本発明を構成する3−キヌクリジノン不斉還元酵素反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはNADPHの交換が可能な膜を介して上記反応系に接触させることができる。 The components constituting the reaction necessary for NADPH regeneration can be added to or immobilized on the 3-quinuclidinone asymmetric reductase reaction system constituting the present invention. Alternatively, the reaction system can be contacted through a membrane capable of exchanging NADPH.
(R)−3−キヌクリジノールの製造方法において、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した形質転換体を利用する場合には、NADPH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADPH再生活性の高い生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NADPH再生用の酵素を添加することなく効率的な反応を行い得る。あるいは上記NADPH再生に利用可能な酵素の遺伝子を、本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするポリヌクレオチドと同時に導入した宿主を利用することもできる。このような形質転換体の利用によって、NADPH再生酵素および本発明の3−キヌクリジノン不斉還元酵素の発現、ならびに基質の還元反応を、より効率的に行うこともできる。 In the method for producing (R) -3-quinuclidinol, when a transformant transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention is used, for NADPH regeneration In some cases, an additional reaction system can be eliminated. That is, by using an organism having a high NADPH regeneration activity as a host, an efficient reaction can be performed in a reduction reaction using a transformant without adding an enzyme for NADPH regeneration. Alternatively, it is also possible to use a host into which the gene for an enzyme that can be used for NADPH regeneration is introduced at the same time as the polynucleotide encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention. By using such a transformant, the expression of NADPH regenerating enzyme and the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of the present invention and the reduction reaction of the substrate can be performed more efficiently.
補酵素の再生系が組み合わせられる場合、補酵素NADP+または/およびグルコース、スクロース、エタノール、メタノールなどのエネルギー源が上記培養液または反応液に添加され得る。上記補酵素NADP+またはエネルギー源の添加量は、基質である3−キヌクリジノンおよび上記生物学的触媒の量などに基づいて適宜決定され得る。反応は、上述したように、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら行い得る。場合によっては、反応の途中で反応基質である3−キヌクリジノンまたは/および上記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継続させてもよい。 When coenzyme regeneration systems are combined, an energy source such as coenzyme NADP + or / and glucose, sucrose, ethanol, methanol, etc. can be added to the culture or reaction. The amount of the coenzyme NADP + or energy source added can be appropriately determined based on the amount of the substrate 3-quinuclidinone and the biological catalyst. As described above, the reaction can be performed while controlling the reaction temperature and, if necessary, the pH of the reaction solution. Depending on the case, 3-quinuclidinone which is a reaction substrate or / and the above coenzyme and an energy source may be appropriately added during the reaction to continue the reaction.
本発明の方法では、生成した(R)−3−キヌクリジノールは、必要に応じて、基質の3−キヌクリジノンおよび生成した(R)−3−キヌクリジノールの化学的特性または物理的特性の差異を利用して分離され得る。本発明の方法では、光学純度が99.9%以上の(R)−3−キヌクリジノールが生成するため、(S)体と分離することなく(R)−3−キヌクリジノールを得ることができる。 In the method of the present invention, the produced (R) -3-quinuclidinol takes advantage of the difference in chemical or physical properties of the substrate 3-quinuclidinone and the produced (R) -3-quinuclidinol as required. Can be separated. In the method of the present invention, since (R) -3-quinuclidinol having an optical purity of 99.9% or more is generated, (R) -3-quinuclidinol can be obtained without separation from the (S) isomer.
生成した(R)−3−キヌクリジノールは、反応終了後、その性質(例えば、溶解度、疎水性)に依存して、例えば、溶媒抽出法、結晶析出法、カラムクロマトグラフ法などの当該分野で通常用いられる分離操作を用いて、未反応の3−キヌクリジノンと分離される。例えば、溶媒抽出法では、塩基性条件下、トルエンで反応液から未反応の3−キヌクリジノンを抽出した後、クロロホルム、ジクロロメタンなどの溶媒を用い、生成した(R)−3−キヌクリジノールを回収することができる。 The produced (R) -3-quinuclidinol is usually used in the field such as solvent extraction, crystal precipitation, column chromatography, etc., depending on its properties (for example, solubility, hydrophobicity) after completion of the reaction. The unreacted 3-quinuclidinone is separated using the separation procedure used. For example, in the solvent extraction method, unreacted 3-quinuclidinone is extracted from the reaction solution with toluene under basic conditions, and then the produced (R) -3-quinuclidinol is recovered using a solvent such as chloroform or dichloromethane. Can do.
得られた生成物は、必要に応じて、上記の手段を用いて、さらに精製され得る。この場合、第2の手段は、第1の手段と異なる方が好ましい(例えば、第1の手段として溶媒抽出を用いた場合、第2の手段として、例えばカラムクロマトグラフィーが挙げられる)。 The resulting product can be further purified using the above means if necessary. In this case, the second means is preferably different from the first means (for example, when solvent extraction is used as the first means, the second means includes, for example, column chromatography).
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
(実施例1:3−キヌクリジノン不斉還元酵素の精製)
以下の方法に従って、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株より、3−キヌクリジノン不斉還元酵素を、電気泳動的に単一に精製した。
(Example 1: Purification of 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
According to the following method, 3-quinuclidinone asymmetric reductase was electrophoretically purified from Rhodotolura rubra JCM3782 strain.
(培養)
YM培地(グルコース1%、ペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、pH5.5)8,400mlを調製し、3L容三角フラスコに600mlずつ分注して、121℃で20分間蒸気殺菌を行った。予め同培地中で前培養しておいたロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株の培養液を3mlずつ接種し、28℃で3日間振盪培養した。この培養液から遠心分離(8,600×g、10分間、4℃)により菌体を集め、脱塩水にて1回洗浄した。このようにして得られた湿菌体460gは、使用直前まで−20℃で凍結保存した。
(culture)
Prepare 8,400 ml of YM medium (
(無細胞抽出液の調製)
湿菌体213gを室温で融解し、220mlの1mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤混合錠剤(Roche製)を溶解させた20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。次いで、この菌体をミニモーターミル(アイガージャパン製)で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離(11,000×g、10分間、4℃)にて菌体残渣を取り除き、無細胞抽出液250mlを得た。
(Preparation of cell-free extract)
213 g of wet cells were thawed at room temperature and suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) in which 220 ml of 1 mM DTT and protease inhibitor mixed tablets (Roche) were dissolved. Subsequently, this microbial cell was crushed with a mini motor mill (manufactured by Eiger Japan). The cell residue was removed from the disrupted cells by centrifugation (11,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) to obtain 250 ml of a cell-free extract.
(硫安分画)
無細胞抽出液に35%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、溶解させた。次いで生じた沈殿を遠心分離(12,400×g、30分間、4℃)により除去し、270mlの35%飽和溶液を得た。この溶液に60%飽和となるようにさらに硫酸アンモニウムを添加して、4℃で一夜放置した。次いで、遠心分離(12,400×g、30分間、4℃)により塩析物を集めた。得られた塩析物を300mlの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、超遠心分離(100,000×g、60分間、4℃)により沈殿物を除去し、清澄な粗酵素液を得た。
(Ammonium sulfate fraction)
Ammonium sulfate was added to the cell-free extract to 35% saturation and dissolved. The resulting precipitate was then removed by centrifugation (12,400 × g, 30 minutes, 4 ° C.) to give 270 ml of 35% saturated solution. To this solution, ammonium sulfate was further added so as to be 60% saturation, and the solution was left at 4 ° C. overnight. The salted-out product was then collected by centrifugation (12,400 × g, 30 minutes, 4 ° C.). The obtained salted-out product was dissolved in 300 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), the precipitate was removed by ultracentrifugation (100,000 × g, 60 minutes, 4 ° C.), and a clear crude enzyme solution was obtained. Got.
(疎水クロマトグラフィー)
得られた粗酵素液に100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を添加して、硫酸アンモニウム濃度が30%飽和になるように調整し、550mlの粗酵素液を得た。これを、30%飽和硫酸アンモニウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で予め平衡化したButyl-Toyopearl(東ソー製)カラム100mlに添加し、同緩衝液で洗浄し、次いで硫酸アンモニウム(35%飽和から0%飽和まで)のリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。
(Hydrophobic chromatography)
A 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added to the resulting crude enzyme solution to adjust the ammonium sulfate concentration to 30% saturation to obtain 550 ml of the crude enzyme solution. This was added to 100 ml of a Butyl-Toyopearl (Tosoh) column pre-equilibrated with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 30% saturated ammonium sulfate, washed with the same buffer, and then ammonium sulfate (35% The active fraction was eluted with a linear gradient (from saturation to 0% saturation).
(赤色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー)
得られた活性画分(48ml)を集め、限外濾過による脱塩濃縮および20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)への置換を行い、同緩衝液で平衡化したRed-Toyopearl(東ソー製)カラム20mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化カリウム(0Mから0.5Mまで)のリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。
(Affinity chromatography using red dye as a ligand)
The obtained active fraction (48 ml) was collected, desalted and concentrated by ultrafiltration and replaced with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and equilibrated with the same buffer. Red-Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation) ) Added to 20 ml column. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of potassium chloride (from 0 M to 0.5 M).
(青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー)
得られた活性画分(81ml)を集め、限外濾過による脱塩濃縮を行い、予め20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したBlue-Toyopearl(東ソー製)カラム25mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化カリウム(0Mから0.5Mまで)のリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。各活性画分をSDS−PAGEにより解析した結果、1画分を除いた残り6画分において単一バンドであることが確認できた。これら6画分を集め、精製酵素標品を得た。
(Affinity chromatography with blue dye as ligand)
The obtained active fraction (81 ml) was collected, desalted and concentrated by ultrafiltration, and added to 25 ml of a Blue-Toyopearl (manufactured by Tosoh) column previously equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). . After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of potassium chloride (from 0 M to 0.5 M). As a result of analyzing each active fraction by SDS-PAGE, it was confirmed that it was a single band in the remaining 6 fractions excluding 1 fraction. These 6 fractions were collected to obtain a purified enzyme preparation.
(実施例2:3−キヌクリジノン不斉還元酵素の性質の測定)
実施例1において得られた精製酵素標品の酵素学的性質について検討した。
(Example 2: Measurement of properties of 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
The enzymatic properties of the purified enzyme preparation obtained in Example 1 were examined.
酵素活性の測定は、基本的には、以下の標準反応条件で行った:100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中に、0.5Mの基質3−キヌクリジノン・塩酸塩、0.5mMの補酵素NADPH、および酵素溶液50μlを含む200μlの反応液を37℃でインキュベートし、波長340nmの吸光度の減少を測定した。1分間に1マイクロモルのNADPHをNADP+に変換させる酵素量を1単位(U)とした。上記の精製酵素標品の酵素学的性質は以下の通りであった。 The enzyme activity was measured basically under the following standard reaction conditions: 0.5 M substrate 3-quinuclidinone hydrochloride, 0.5 mM coenzyme in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). 200 μl of the reaction solution containing NADPH and 50 μl of the enzyme solution was incubated at 37 ° C., and the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured. The amount of enzyme that converts 1 micromole of NADPH to NADP + per minute was defined as 1 unit (U). The enzymological properties of the purified enzyme preparation were as follows.
作用:上記標準反応条件にて生成される3−キヌクリジノールの定量および光学純度を、ガスクロマトグラフィー分析により測定した。ガスクロマトグラフィー分析には、検出器として水素炎イオン化検出器およびカラムとしてγ-DEX225キャピラリーカラム(0.25mm(内径)×30m;Spelco社製)を用いた。注入部温度は220℃、カラム温度は150℃(20分)、検出器温度は220℃であった。キャリアーガスとしてヘリウムを流量70KPaで使用した。その結果、NADPHを補酵素として、3−キヌクリジノンに作用し、光学純度99.9%ee以上の(R)−3−キヌクリジノールを生成した。 Action: The quantitative and optical purity of 3-quinuclidinol produced under the standard reaction conditions was measured by gas chromatography analysis. In the gas chromatography analysis, a flame ionization detector was used as a detector and a γ-DEX225 capillary column (0.25 mm (inner diameter) × 30 m; manufactured by Spelco) was used as a column. The inlet temperature was 220 ° C., the column temperature was 150 ° C. (20 minutes), and the detector temperature was 220 ° C. Helium was used as a carrier gas at a flow rate of 70 KPa. As a result, NADPH was used as a coenzyme to act on 3-quinuclidinone to produce (R) -3-quinuclidinol with an optical purity of 99.9% ee or higher.
補酵素:補酵素としてNADPHまたはNADHを用いて、上記標準反応条件に従って、(R)−3−キヌクリジノールの生成を測定した。NADPH依存性であり、NADHは補酵素として利用しないことがわかった。また、NADP+を補酵素とし、3−キヌクリジノールを基質として、上記標準反応条件に従って(R)−3−キヌクリジノールからの3−キヌクリジノンの生成を調べた場合、NADP+を補酵素とする3−キヌクリジノールの酸化反応も触媒しなかった。 Coenzyme: Production of (R) -3-quinuclidinol was measured according to the standard reaction conditions using NADPH or NADH as a coenzyme. It was NADPH-dependent and NADH was not used as a coenzyme. When the production of 3-quinuclidinone from (R) -3-quinuclidinol was examined according to the standard reaction conditions using NADP + as a coenzyme and 3-quinuclidinol as a substrate, 3-quinuclidinol using NADP + as a coenzyme The oxidation reaction was not catalyzed.
作用至適pH:100mMリン酸カリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、3−キヌクリジノン還元活性を測定した。反応の至適pHは7.0であり、pH6.0からpH8.0の広い範囲で最大活性の70%以上の活性を示した。 Optimal pH of action: 3-quinuclidinone reducing activity was measured by changing the pH using a 100 mM potassium phosphate buffer. The optimum pH of the reaction was 7.0, and showed an activity of 70% or more of the maximum activity in a wide range from pH 6.0 to pH 8.0.
pH安定性:精製酵素をpHの異なる100mMリン酸カリウム緩衝液中で37℃、16時間処理した後、その残存活性を上記の標準反応条件で測定した。pH6.0からpH8.5の広い範囲で80%以上の残存活性を示した。 pH stability: The purified enzyme was treated in 100 mM potassium phosphate buffer having a different pH at 37 ° C. for 16 hours, and then the residual activity was measured under the above standard reaction conditions. Residual activity of 80% or more was exhibited in a wide range from pH 6.0 to pH 8.5.
作用至適温度:上記標準反応条件のうち、温度のみを変化させて、3−キヌクリジノン還元活性を測定した。反応の至適温度は40℃付近にあった。 Optimum temperature of action: 3-quinuclidinone reducing activity was measured by changing only the temperature among the above standard reaction conditions. The optimum temperature for the reaction was around 40 ° C.
温度安定性:精製酵素を100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中で種々の温度で30分間処理し、残存活性を上記の標準反応条件で測定した。40℃までは、処理前の98%以上の活性が残存していた。 Temperature stability: The purified enzyme was treated in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) at various temperatures for 30 minutes, and the residual activity was measured under the standard reaction conditions described above. Up to 40 ° C., 98% or more of the activity before the treatment remained.
阻害剤:上記の標準反応条件における反応液に各種金属イオンまたは阻害剤を添加して3−キヌクリジノン還元活性を測定し、添加しない条件を100とした相対活性で示した。塩化水銀およびp−クロロメリクリ安息香酸によって阻害を受けた。 Inhibitor: Various metal ions or inhibitors were added to the reaction solution under the above standard reaction conditions, and 3-quinuclidinone reduction activity was measured. Inhibited by mercuric chloride and p-chloromellicribenzoic acid.
分子量:精製酵素のサブユニットの分子量をSDS−PAGEにより求めた結果、約30,000であった。また、スーパーデックスG200カラム(アマシャムバイオサイエンス製)によるゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量は、約93,000であった。これらの結果より、上記精製酵素標品は、ホモトリマーと予想された。 Molecular weight: The molecular weight of the purified enzyme subunit was determined by SDS-PAGE and found to be about 30,000. Further, the molecular weight measured by gel filtration chromatography using Superdex G200 column (manufactured by Amersham Bioscience) was about 93,000. From these results, the purified enzyme preparation was predicted to be a homotrimer.
Km値:上記の標準反応条件における反応液中の基質濃度を変化させて反応を行い、ラインウエーバー・バークのプロットにより得られたミカエリ定数Kmは、145mMであった。また、補酵素NADPHの濃度を変化させて求めたミカエリ定数Kmは、0.19mMであった。 Km value: The reaction was carried out by changing the substrate concentration in the reaction solution under the above standard reaction conditions, and the Michaelis constant Km obtained by the line Weber-Burk plot was 145 mM. Further, the Michaelis constant Km obtained by changing the concentration of the coenzyme NADPH was 0.19 mM.
(実施例3:3−キヌクリジノン不斉還元酵素の部分アミノ酸配列の解析)
実施例1で得られた精製3−キヌクリジノン不斉還元酵素を8M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ(和光純薬製)で消化し、得られた消化物をSmartシステム(アマシャムバイオサイエンス製)によって分離した。分取したペプチドピーク4種をペプチドK14、ペプチドK20、ペプチドK24、ペプチドK30とし、それぞれプロテインシーケンサー(Applied Biosystems製、model 476A)によりアミノ酸配列の解析を行った。ペプチドK14、ペプチドK20、ペプチドK24、およびペプチドK30のアミノ酸配列はそれぞれ、配列表中の配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4に示したとおりであった。
(Example 3: Analysis of partial amino acid sequence of 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
The purified 3-quinuclidinone asymmetric reductase obtained in Example 1 was denatured in the presence of 8M urea, and then digested with Achromobacter-derived lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Separation was performed using a Smart system (Amersham Bioscience). The four peptide peaks thus separated were designated as peptide K14, peptide K20, peptide K24, and peptide K30, and the amino acid sequence was analyzed using a protein sequencer (Applied Biosystems, model 476A). The amino acid sequences of peptide K14, peptide K20, peptide K24, and peptide K30 were as shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, respectively.
配列類似性検索プログラムBLASTおよびFASTAを用いることにより、これらのアミノ酸配列を3種類のタンパク質配列データベース(PTR、PRF、およびSWISS-PROT)内の配列と比較した。その結果、K14配列は、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のソルビトール代謝に関与すると推定される短鎖アルコール脱水素酵素(Nature, 2002年, 415巻, pp.871-880)の部分アミノ酸配列と類似し、そしてK30配列は、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)のペルオキシゾーム2,4−ジエノイル−CoA還元酵素(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998年, 95巻, pp.5150-5155)の部分アミノ酸配列と類似していた。これらの酵素は、短鎖型脱水素酵素/還元酵素(SDR)ファミリーに属する。しかし、K20およびK24には、データベース上のタンパク質との類似性は認められなかった。 By using the sequence similarity search programs BLAST and FASTA, these amino acid sequences were compared with sequences in three protein sequence databases (PTR, PRF, and SWISS-PROT). As a result, the K14 sequence is a partial amino acid sequence of a short-chain alcohol dehydrogenase (Nature, 2002, 415, pp.871-880) presumed to be involved in sorbitol metabolism in Schizosaccharomyces pombe. And the K30 sequence is Candida albicans peroxysome 2,4-dienoyl-CoA reductase (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, pp. 5150-). 5155) was similar to the partial amino acid sequence. These enzymes belong to the short chain dehydrogenase / reductase (SDR) family. However, there was no similarity between K20 and K24 with proteins on the database.
(実施例4:3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子のクローニング)
ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株をYM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Appl. Microbiool. Biotechnol., 2000年, 53巻, pp.415-419に記載の方法により行った。3−キヌクリジノン不斉還元酵素の内部ペプチド断片K14およびK30のアミノ酸配列に基づいて、PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーQR1(配列番号5)、QR2(配列番号6)、QR3(配列番号7)およびQR4(配列番号8)を設計した。QR1およびQR2は上流のプライマーとして、QR3およびQR4は下流のプライマーとして作製した。QR2およびQR3はそれぞれ、QR1およびQR4の内側のアミノ酸配列に基づいて設計し、QR1およびQR4で増幅したDNA断片の内側を増幅するように設計した。ここで、配列表中のRはAまたはG、Nは任意、HはG以外、YはCまたはTをそれぞれ表す。PCRの反応液組成は、次の通りである:鋳型DNA、10×Ex Taq Buffer10μl、プライマー(QR1またはQR2、各100μM)1μl、プライマー(QR4またはQR3、各100μM)1μl、dNTP混合物(各2.5mM)8μl、およびEX Taq0.5μlであり、蒸留水を100μlになるように添加した。PCR反応条件は、次の通りであった:ステップ1:94℃、10分;ステップ2:94℃、30秒;ステップ3:65℃、30秒;ステップ4:72℃、1分;ステップ5:94℃、30秒;ステップ6:65℃、30秒;ステップ7:72℃、1分;ステップ8:4℃、∞。1サイクル毎にアニーリング温度(ステップ3)を1℃ずつ下げて、ステップ2からステップ4を20サイクル繰り返す。ステップ5からステップ7を20サイクル繰り返した。
(Example 4: Cloning of 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene)
Rhodotolura rubra JCM3782 strain was cultured in YM medium to prepare bacterial cells. Purification of chromosomal DNA from the bacterial cells was performed by the method described in Appl. Microbiool. Biotechnol., 2000, 53, pp.415-419. Based on the amino acid sequences of the internal peptide fragments K14 and K30 of 3-quinuclidinone asymmetric reductase, degenerate oligonucleotide primers for PCR QR1 (SEQ ID NO: 5), QR2 (SEQ ID NO: 6), QR3 (SEQ ID NO: 7) and QR4 (SEQ ID NO: 8) was designed. QR1 and QR2 were prepared as upstream primers, and QR3 and QR4 were prepared as downstream primers. QR2 and QR3 were designed based on the amino acid sequence inside QR1 and QR4, respectively, and designed to amplify the inside of the DNA fragment amplified with QR1 and QR4. Here, R in the sequence listing is A or G, N is arbitrary, H is other than G, and Y is C or T. The PCR reaction solution composition is as follows: template DNA, 10 ×
まず、染色体DNA100ngを鋳型にし、プライマーQR1およびQR4を用いて1st-PCRを行った。次に、1st-PCRで増幅された反応液を10倍希釈した溶液を鋳型とし、プライマーQR2およびQR3を用いてNested-PCRを行い、約500bpの特異的な増幅産物を得た。このPCR反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の約500bpのバンド部分を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up(Promega製)によって精製した。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen製)を用いて、pCR4-TOPOベクターに結合させ、大腸菌TOP10株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン50μg/mlを含むLB培地(ペプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、pH7.0)中で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen製)を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pCR4-TOPOベクターに由来するT7プライマーおよびM13 reverseプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列(配列番号38)および推定アミノ酸配列(配列番号39)を図1に示す。図1において、下線で示した塩基配列は、イントロン領域と推定され、そして囲み線付きのアミノ酸配列は、精製酵素のアミノ酸配列解析により得られた配列と一致している。図1に示す配列解析の結果から、PCR産物が489bpのヌクレオチドからなり、推定アミノ酸配列が、実施例1で精製した天然の3−キヌクリジノン不斉還元酵素の内部アミノ酸配列(実施例3に示される)と一致することが明らかになった。また、K20ペプチドをコードする領域は、2つのイントロンにより分断されることも判明した。
First, 100 ng of chromosomal DNA was used as a template, and 1st-PCR was performed using primers QR1 and QR4. Next, Nested-PCR was performed using primers QR2 and QR3 using a solution obtained by diluting the reaction solution amplified by 1st-
(実施例5:3−キヌクリジノン不斉還元酵素のcDNAクローニング)
ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株の3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするゲノム領域には、イントロンが複数存在することが示唆された。3−キヌクリジノン不斉還元酵素のコード領域を明らかにするために、以下に示す方法により、3−キヌクリジノン不斉還元酵素のcDNAをクローニングした。
(Example 5: cDNA cloning of 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
It was suggested that there are multiple introns in the genomic region encoding the 3-quinuclidinone asymmetric reductase of Rhodotolura rubra JCM3782. In order to clarify the coding region of 3-quinuclidinone asymmetric reductase, cDNA of 3-quinuclidinone asymmetric reductase was cloned by the method shown below.
(3−キヌクリジノン不斉還元酵素生産菌ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株からのmRNAの抽出)
ロドトルラ・ルブラ(Rhodotolura rubra)JCM3782株をYM培地で培養し、得られた菌体を使用直前まで−80℃で凍結保存し、以下の手順で総RNAを調製した。凍結菌体約0.1gに0.5gのガラスビーズ(粒径0.5mm)、1mlのSepasol RNA I試薬(ナカライテスク製)を加え、ミニビードビーター(Biospec製)で破砕した。この溶液に200μlのクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離(16,500×g、15分間、4℃)した。上層の水層を分取して500μlのイソプロパノールを加え、室温で10分静置した。遠心分離(16,500×g、10分間、4℃)した後、上清を除き、1mlの75%エタノールを加えて、再度遠心分離(16,500×g、5分間、4℃)した。沈殿物を風乾してエタノールを完全に除去した後、100μlのRNase非含有水を加え、60℃で10分間インキュベートして総RNAを溶解した。総RNAからFast Track 2.0 kit(Invitrogen製)を用いてmRNAの精製を行った。
(Extraction of mRNA from 3-quinuclidinone asymmetric reductase-producing bacterium Rhodotolura rubra JCM3782)
Rhodotolura rubra JCM3782 strain was cultured in YM medium, and the resulting cells were stored frozen at −80 ° C. until immediately before use, and total RNA was prepared by the following procedure. To about 0.1 g of frozen cells, 0.5 g of glass beads (particle size 0.5 mm), 1 ml of Sepasol RNA I reagent (manufactured by Nacalai Tesque) were added and crushed with a mini bead beater (manufactured by Biospec). 200 μl of chloroform was added to this solution and stirred, followed by centrifugation (16,500 × g, 15 minutes, 4 ° C.). The upper aqueous layer was separated, 500 μl of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (16,500 × g, 10 minutes, 4 ° C.), the supernatant was removed, 1 ml of 75% ethanol was added, and the mixture was centrifuged again (16,500 × g, 5 minutes, 4 ° C.). After the precipitate was air-dried to completely remove ethanol, 100 μl of RNase-free water was added and incubated at 60 ° C. for 10 minutes to dissolve total RNA. MRNA was purified from the total RNA using Fast Track 2.0 kit (manufactured by Invitrogen).
(3’-RACE法による3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするmRNAの3’末端の塩基配列解析)
3−キヌクリジノン不斉還元酵素のC末端側アミノ酸配列をコードする塩基配列を3’-RACE法によって解析した。総RNAを鋳型として、3’-Full RACE Core Set(タカラバイオ製)を用いて、3’-RACE用の一本鎖cDNAを合成した。実施例4で得られた3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするDNA断片の塩基配列から、イントロン配列を含まない領域のDNA配列に基づいて、プライマーrace-for1(配列番号9)およびプライマーrace-for2(配列番号10)を設計した。これらのプライマーと3’-Full RACE Core Setに含まれる3sites Adaptor Primerとを用いて、PCRを行った。Nested-PCRによって約500bpの特異的な増幅産物が得られたので、これをpCR4-TOPOベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
(3′-RACE method for analyzing the nucleotide sequence of the 3 ′ end of mRNA encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
The base sequence encoding the C-terminal amino acid sequence of 3-quinuclidinone asymmetric reductase was analyzed by the 3′-RACE method. Single-stranded cDNA for 3′-RACE was synthesized using 3′-Full RACE Core Set (manufactured by Takara Bio Inc.) using total RNA as a template. Based on the DNA sequence of the DNA fragment encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase obtained in Example 4, the primer race-for1 (SEQ ID NO: 9) and primer race- for2 (SEQ ID NO: 10) was designed. PCR was performed using these primers and 3sites Adapter Primer included in 3′-Full RACE Core Set. Nested-PCR yielded a specific amplification product of about 500 bp, which was subcloned into the pCR4-TOPO vector and the nucleotide sequence was determined.
(5’-RACE法による3−キヌクリジノン不斉還元酵素mRNAの5’末端の塩基配列解析)
3−キヌクリジノン不斉還元酵素のN末端側アミノ酸配列をコードする塩基配列を5’-RACE法によって解析した。mRNAを鋳型として、Gene Racer Kit(Invitrogen製)を用いて、5’-RACE用の一本鎖cDNAを合成した。実施例4で得られたDNA断片の塩基配列から、イントロン配列を含まない領域のDNA配列に基づいて、プライマー5race−primer1(配列番号11)およびプライマー5race−primer2(配列番号12)を設計した。これらのプライマーとGene Racer Kitに含まれるGeneRacer 5’PrimerおよびGeneRacer 5’Nested Primerとを用いて、PCRを行った。Nested-PCRによって約350bpの特異的な増幅産物が得られたので、pCR4-TOPOベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
(A base sequence analysis of the 5 ′ end of 3-quinuclidinone asymmetric reductase mRNA by 5′-RACE method)
The base sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of 3-quinuclidinone asymmetric reductase was analyzed by 5′-RACE method. Single-stranded cDNA for 5′-RACE was synthesized using mRNA as a template and Gene Racer Kit (manufactured by Invitrogen). From the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in Example 4, primer 5race-primer1 (SEQ ID NO: 11) and primer 5race-primer2 (SEQ ID NO: 12) were designed based on the DNA sequence of the region not containing the intron sequence. PCR was performed using these primers and GeneRacer 5'Primer and GeneRacer 5'Nested Primer included in the Gene Racer Kit. Since a specific amplification product of about 350 bp was obtained by Nested-PCR, it was subcloned into the pCR4-TOPO vector and the nucleotide sequence was determined.
(3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするcDNAのクローニング)
5’-RACEおよび3’-RACEで得られた塩基配列に基づいて、開始コドンあるいは終止コドンを含むプライマーQR-forward-Eco(配列番号13)およびプライマーQR-reverse-Pst(配列番号14)を設計した。総RNAを鋳型として、First-strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ製)を用いて一本鎖cDNAを合成し、この一本鎖cDNAを鋳型としてPCRを行った。このPCRにより約820bpの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片をEcoRIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpKK223-3(アマシャムバイオサイエンス製)中のtacプロモーターの下流に位置するEcoRI−PstI部位に挿入して、組換えプラスミドpKQを得た。プラスミドpKK223-3上の配列をプライマーにして挿入断片の塩基配列を決定した。得られた3−キヌクリジノン不斉還元酵素をコードするcDNAの配列を図2(配列番号40)に、そして該遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を図3(配列番号41)に示す。この推定アミノ酸配列を、実施例3で得られたアミノ酸配列解析の結果と比較した。その結果、実施例1で精製した天然の3−キヌクリジノン不斉還元酵素の内部アミノ酸配列(実施例3に示される)が4つとも、cDNAの塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、完全に一致した。
(Cloning of cDNA encoding 3-quinuclidinone asymmetric reductase)
Based on the nucleotide sequences obtained with 5′-RACE and 3′-RACE, primer QR-forward-Eco (SEQ ID NO: 13) and primer QR-reverse-Pst (SEQ ID NO: 14) containing the start codon or stop codon are used. Designed. Single-stranded cDNA was synthesized using total RNA as a template using First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), and PCR was performed using this single-stranded cDNA as a template. By this PCR, a specific amplification product of about 820 bp was obtained. This amplified fragment was double-digested with EcoRI and PstI and inserted into the EcoRI-PstI site located downstream of the tac promoter in plasmid pKK223-3 (manufactured by Amersham Biosciences) to obtain recombinant plasmid pKQ . The nucleotide sequence of the inserted fragment was determined using the sequence on plasmid pKK223-3 as a primer. The sequence of the cDNA encoding the obtained 3-quinuclidinone asymmetric reductase is shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 40), and the deduced amino acid sequence encoded by the gene is shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 41). This deduced amino acid sequence was compared with the results of amino acid sequence analysis obtained in Example 3. As a result, all four internal amino acid sequences of natural 3-quinuclidinone asymmetric reductase purified in Example 1 (shown in Example 3) are present in the amino acid sequence deduced from the cDNA base sequence, Matched perfectly.
(実施例6:グルコース脱水素酵素遺伝子のクローニング)
補酵素NADP+の再生用としてバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株由来のグルコース脱水素酵素(以下、「GDHI」ともいう)を用いた。データベースに登録されているGDHI酵素(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P39482)に対応するDNA配列(DDBJ Accession No. D90043)に基づいて、PCR用にプライマーfwd-gdh-eco(配列番号15)およびプライマーrvs-gdh-pst(配列番号16)を設計した。QIAGEN Genomic-tipおよびGenomic DNA Buffer Set(共にQiagen製)を用いて調製したバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株の染色体DNAを鋳型として、上記の設計した2つのプライマーを用いて、GDHI酵素遺伝子を増幅した。得られたDNA断片をEcoRIおよびPstIで消化し、プラスミドpKK223-3中のtacプロモーターの下流に位置するEcoRI−PstI部位に挿入して、組換えプラスミドpKGを構築した。プラスミドpKK223-3上の配列をプライマーにして挿入断片の塩基配列を解析した結果、データベースに登録されているバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株のグルコース脱水素酵素遺伝子(GDHI)遺伝子と完全に一致した。
(Example 6: Cloning of glucose dehydrogenase gene)
Glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium IAM1030 strain (hereinafter also referred to as “GDHI”) was used for regeneration of the coenzyme NADP + . Based on the DNA sequence (DDBJ Accession No. D90043) corresponding to the GDHI enzyme (UniProtKB / Swiss-Prot Accession No. P39482) registered in the database, the primer fwd-gdh-eco (SEQ ID NO: 15) for PCR and The primer rvs-gdh-pst (SEQ ID NO: 16) was designed. Using chromosomal DNA of Bacillus megaterium IAM1030 prepared using QIAGEN Genomic-tip and Genomic DNA Buffer Set (both manufactured by Qiagen) as a template, using the two primers designed above, the GDHI enzyme gene Amplified. The obtained DNA fragment was digested with EcoRI and PstI and inserted into the EcoRI-PstI site located downstream of the tac promoter in plasmid pKK223-3 to construct a recombinant plasmid pKG. As a result of analyzing the nucleotide sequence of the inserted fragment using the sequence on the plasmid pKK223-3 as a primer, it completely matches the glucose dehydrogenase gene (GDHI) gene of Bacillus megaterium IAM1030 strain registered in the database did.
(実施例7:2遺伝子同時発現用の市販プラスミドを用いた3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌の作製)
市販の2遺伝子同時発現用プラスミドpETDuet-1(Novagen製)を用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素およびグルコース脱水素酵素の同時発現用プラスミドのpEQGおよびpEGQを構築し、これらのプラスミドで大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。プラスミドpEQGおよびpEGQは、以下の方法により作製した。当業者が通常用いる方法に従って大腸菌コンピテントセルを作製し、42℃にて30秒から1分間のヒートショック法を用いて、これらのプラスミドで形質転換した(以下の実施例も同様である)。
(Example 7: Production of recombinant Escherichia coli that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene using a commercially available plasmid for simultaneous expression of two genes)
Using plasmid pETDuet-1 (manufactured by Novagen) for simultaneous expression of two genes, plasmids pEQG and pEGQ for simultaneous expression of 3-quinuclidinone asymmetric reductase and glucose dehydrogenase were constructed. (DE3) strain was transformed. Plasmids pEQG and pEGQ were prepared by the following method. E. coli competent cells were prepared according to methods commonly used by those skilled in the art, and transformed with these plasmids using a heat shock method at 42 ° C. for 30 seconds to 1 minute (the same applies to the following examples).
(pEQG)
実施例5(d)で構築したプラスミドpKQを鋳型として、プライマーQR-forward-Bsa(配列番号17)および上記のプライマーQR-reverse-Pstを用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をBsaIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpETduet-1中の上流側のT7プロモーター1の下流に位置するNcoI−PstI部位に挿入し、プラスミドpEQを構築した。続いて、実施例6で構築したプラスミドpKGを鋳型として、プライマーGDH-forward-Nde(配列番号18)およびプライマーGDH-reverse-Xho(配列番号19)を用いて、GDHI構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をNdeIおよびXhoIで二重消化し、プラスミドpEQのT7プロモーター2の下流に位置するNdeI−XhoI部位に挿入し、プラスミドpEQGを構築した。
(PEQG)
Using the plasmid pKQ constructed in Example 5 (d) as a template, the primer QR-forward-Bsa (SEQ ID NO: 17) and the above-mentioned primer QR-reverse-Pst are used to amplify the 3-quinuclidinone asymmetric reductase structural gene did. The obtained amplified fragment was double-digested with BsaI and PstI and inserted into the NcoI-PstI site located downstream of the
(pEGQ)
実施例6で構築したプラスミドpKGを鋳型として、プライマーGDH-forward-Bsa(配列番号20)およびプライマーGDH-reverse-Pst(配列番号21)を用いて、GDHI構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をBsaIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpETduet-1中の上流側のT7プロモーター1の下流に位置するNcoI−PstI部位に挿入し、プラスミドpEGを構築した。続いて、実施例5(d)で構築したプラスミドpKQを鋳型として、プライマーQR-forward-Nde(配列番号22)およびプライマーQR-reverse-Xho(配列番号23)を用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をNdeIおよびXhoIで二重消化し、プラスミドpEG中の下流側のT7プロモーター2の下流に位置するNdeI−XhoI部位に挿入し、プラスミドpEGQを構築した。
(PEGQ)
Using the plasmid pKG constructed in Example 6 as a template, the GDHI structural gene was amplified using the primer GDH-forward-Bsa (SEQ ID NO: 20) and the primer GDH-reverse-Pst (SEQ ID NO: 21). The obtained amplified fragment was double-digested with BsaI and PstI and inserted into the NcoI-PstI site located downstream of
(実施例8:1つのプロモーターで2遺伝子を制御するプラスミドを用いた3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌の作製)
光学活性な1,3−ブタンジオールの工業生産では、市販の高発現用プラスミドpSE420(trcプロモーターにg10エンハンサーおよびミニシストロン配列を付加して転写量を増強させているものである。また、trcプロモーターの上流にlacIq遺伝子を含む;Invitrogen製)を利用して、種々の還元酵素遺伝子とGDH遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌を作製している(Asymmetric Catalysis on Industrial Scale、2004年, pp.217−231)。また、同様のシステムを用いて、別の還元酵素遺伝子をGDH遺伝子と同時発現させて、(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの生産(Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004年, 68巻, pp.638-649)あるいは(R)−3−キヌクリジノールの生産(特許文献15)が可能となっている。これらの事例を参考にして、3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現させるためのプラスミドpTrcQG、pTrcQsdG、およびpTrcGsdQを作製し、これらのプラスミドで大腸菌HB101株、W3110株、およびBL21株を形質転換した。共発現プラスミドの構築には、プラスミドpTrcHis(Invitrogen製)を使用した。このpTrcHisは、NcoI−HindIII部位(遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位を含む領域)を除いた部分ではpSE420と完全に一致し、trcプロモーター、g10エンハンサー、およびミニシストロンを含む。プラスミドpTrcQG、pTrcQsdG、およびpTrcGsdQの構築は、以下のようにして実施した。
(Example 8: Production of recombinant Escherichia coli that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene using a plasmid that controls two genes with one promoter)
In the industrial production of optically active 1,3-butanediol, a commercially available plasmid pSE420 for high expression (in which the transcription amount is enhanced by adding a g10 enhancer and a minicistron sequence to the trc promoter. Also, the trc promoter. The recombinant Escherichia coli co-expressing various reductase genes and the GDH gene has been produced using the lacI q gene upstream of (Invitrogen) (Asymmetric Catalysis on Industrial Scale, 2004, pp. 217-231). In addition, using the same system, another reductase gene was coexpressed with the GDH gene to produce (S) -4-chloro-3-hydroxybutyrate (Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, 68). Volume, pp. 638-649) or (R) -3-quinuclidinol can be produced (Patent Document 15). With reference to these cases, plasmids pTrcQG, pTrcQsdG, and pTrcGsdQ for co-expression of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and the glucose dehydrogenase gene were prepared. , And BL21 strains were transformed. For construction of the co-expression plasmid, plasmid pTrcHis (manufactured by Invitrogen) was used. This pTrcHis is completely identical to pSE420 except for the NcoI-HindIII site (the region containing the multiple cloning site for gene insertion), and contains the trc promoter, g10 enhancer, and minicistron. Construction of plasmids pTrcQG, pTrcQsdG, and pTrcGsdQ was performed as follows.
(pTrcQG)
実施例5(d)で構築したプラスミドpKQを鋳型として、上記QR-forward-Bsaプライマーおよび上記QR-reverse-Pstプライマーを用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をBsaIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpTrcHis中のtrcプロモーター、g10エンハンサー、およびミニシストロンの下流に位置するNcoI−PstI部位に挿入し、pTrcQを構築した。続いて、実施例6で構築したプラスミドpKGを鋳型として、上記プライマーfwd-gdh-ecoおよびプライマーGDH-reverse-Hind(配列番号24)を用いて、GDHI構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をEcoRIおよびHindIIIで二重消化し、プラスミドpTrcQ中の3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子の下流に位置するEcoRI−HindIII部位に挿入し、プラスミドpTrcQGを構築した。
(PTrcQG)
Using the plasmid pKQ constructed in Example 5 (d) as a template, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase structural gene was amplified using the QR-forward-Bsa primer and the QR-reverse-Pst primer. The obtained amplified fragment was double-digested with BsaI and PstI and inserted into the NcoI-PstI site located downstream of the trc promoter, g10 enhancer, and minicistron in the plasmid pTrcHis to construct pTrcQ. Subsequently, the GDHI structural gene was amplified using the plasmid pKG constructed in Example 6 as a template and the primer fwd-gdh-eco and the primer GDH-reverse-Hind (SEQ ID NO: 24). The obtained amplified fragment was double-digested with EcoRI and HindIII, and inserted into the EcoRI-HindIII site located downstream of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene in plasmid pTrcQ to construct plasmid pTrcQG.
(pTrcQsdG)
実施例6で構築したプラスミドpKGを鋳型として、プライマーGDH-forward-EcoW(配列番号25)および上記プライマーGDH-reverse-Hindを用いて、GDHI構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をEcoRIおよびHindIIIで二重消化し、プラスミドpTrcQ中の3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子の下流に位置するEcoRI−HindIII部位に挿入し、プラスミドpTrcQsdGを構築した。
(PTrcQsdG)
Using the plasmid pKG constructed in Example 6 as a template, the GDHI structural gene was amplified using the primer GDH-forward-EcoW (SEQ ID NO: 25) and the primer GDH-reverse-Hind. The obtained amplified fragment was double-digested with EcoRI and HindIII and inserted into the EcoRI-HindIII site located downstream of the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene in plasmid pTrcQ to construct plasmid pTrcQsdG.
(pTrcGsdQ)
実施例6で構築したプラスミドpKGを鋳型として、上記プライマーGDH-forward-Bsaおよび上記プライマーGDH-reverse-Pstを用いて、GDHI構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をBsaIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpTrcHis中のtrcプロモーター、g10エンハンサー、およびミニシストロンの下流に位置するNcoI−PstI部位に挿入し、pTrcGを構築した。続いて、実施例5(d)で構築したプラスミドpKQを鋳型として、プライマーQR-forward-EcoW(配列番号26)およびプライマーQR-reverse-Hind(配列番号27)を用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をEcoRIおよびHindIIIで二重消化し、プラスミドpTrcG中のGDHI遺伝子の下流に位置するEcoRI−HindIII部位に挿入し、プラスミドpTrcGsdQを構築した。
(PTrcGsdQ)
Using the plasmid pKG constructed in Example 6 as a template, the GDHI structural gene was amplified using the primer GDH-forward-Bsa and the primer GDH-reverse-Pst. The obtained amplified fragment was double-digested with BsaI and PstI and inserted into the NcoI-PstI site located downstream of the trc promoter, g10 enhancer, and minicistron in the plasmid pTrcHis to construct pTrcG. Subsequently, using the plasmid pKQ constructed in Example 5 (d) as a template, the primer QR-forward-EcoW (SEQ ID NO: 26) and the primer QR-reverse-Hind (SEQ ID NO: 27) were used to produce 3-quinuclidinone asymmetry. The reductase structural gene was amplified. The obtained amplified fragment was double-digested with EcoRI and HindIII and inserted into the EcoRI-HindIII site located downstream of the GDHI gene in plasmid pTrcG to construct plasmid pTrcGsdQ.
(実施例9:複製開始点の異なる2種類のプラスミドを用いた3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌の作製)
ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus lteus)由来の還元酵素BRDを利用した(S)−N−ベンジル−3−ピロリジノールの生産(国際特許出願公開第02/010399号公報)あるいはスポロボロマイセス・サルモニカラー(Sporobolomyces salmonicolor)由来のアルデヒド還元酵素ARを利用した(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの生産(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999年, 51巻, pp.486-490)では、1つのプロモーターで2遺伝子を制御するプラスミドを用いる場合よりも、複製開始点の異なる2種類のプラスミドを用いる方が高い活性を示している。これらの事例を参考にして、3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子を発現させるためのプラスミドpWKQおよびグルコース脱水素酵素遺伝子を発現させるためのプラスミドpAGを構築し、これらの2つのプラスミドを共に用いて大腸菌JM109を形質転換し、3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌JM109(pWKQ, pAG)を得た。以下に、プラスミドpWKQおよびpAGの構築法を記載する。
(Example 9: Production of recombinant E. coli that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene using two types of plasmids having different replication origins)
Production of (S) -N-benzyl-3-pyrrolidinol using the reductase BRD derived from Micrococcus lteus (International Patent Application Publication No. 02/010399) or Sporobolomyces salmonicolor In the production of (R) -4-chloro-3-hydroxybutyric acid ester using aldehyde reductase AR derived from salmonicolor (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 51, pp. 486-490) The use of two types of plasmids having different origins of replication shows higher activity than the case of using a plasmid that controls two genes with a promoter. With reference to these cases, a plasmid pWKQ for expressing the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and a plasmid pAG for expressing the glucose dehydrogenase gene were constructed, and these two plasmids were used together to produce Escherichia coli. JM109 was transformed to obtain recombinant E. coli JM109 (pWKQ, pAG) that co-expressed the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and the glucose dehydrogenase gene. The construction methods of plasmids pWKQ and pAG are described below.
(pWKQ)
実施例5(d)で構築したプラスミドpKQを鋳型として、上記QR-forward-EcoWプライマーおよび上記QR-reverse-Pstプライマーを用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素構造遺伝子を増幅した。得られた増幅断片をEcoRIおよびPstIで二重消化し、pBR322の複製開始点を保有するプラスミドpKK223-3中のtacプロモーターの下流に位置するEcoRI−PstI部位に挿入し、プラスミドpWKQを構築した。
(PWKQ)
Using the plasmid pKQ constructed in Example 5 (d) as a template, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase structural gene was amplified using the QR-forward-EcoW primer and the QR-reverse-Pst primer. The obtained amplified fragment was double-digested with EcoRI and PstI, and inserted into the EcoRI-PstI site located downstream of the tac promoter in the plasmid pKK223-3 carrying the pBR322 origin of replication to construct plasmid pWKQ.
(pAG)
実施例6で構築したプラスミドpKGをBamHIおよびPstIで二重消化し、tacプロモーターとその下流に連結したGDHI遺伝子とを含む約1kbpの断片を、アガロースゲル電気泳動法を用いて分離・精製した。この断片をpA15の複製開始点を保有するプラスミドpACYC177(ニッポンジーン製)のBamHI−PstI部位に挿入し、プラスミドpAGを構築した。
(PAG)
The plasmid pKG constructed in Example 6 was double-digested with BamHI and PstI, and an approximately 1 kbp fragment containing the tac promoter and the GDHI gene linked downstream thereof was separated and purified using agarose gel electrophoresis. This fragment was inserted into the BamHI-PstI site of plasmid pACYC177 (Nippon Gene) carrying the replication origin of pA15 to construct plasmid pAG.
(実施例10:3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌の3−キヌクリジノン還元活性)
実施例7および8のそれぞれで得られた組換え大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンとラクトース系プロモーターの発現誘導試薬であるOvernight Expression Kit(Novagen製)とを添加した5mlの2×YT培地(ペプトン1%、酵母エキス2%、塩化ナトリウム1%、pH7.2)あるいはTB培地(ペプトン1.2%、酵母エキス2.4%、グリセロール0.04%、KH2PO40.231%、K2HPO41.254%)中で培養した。
(Example 10: 3-quinuclidinone reducing activity of recombinant Escherichia coli co-expressing 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene)
The recombinant Escherichia coli obtained in each of Examples 7 and 8 was added to 5 ml of 2 × YT medium (peptone) supplemented with 50 μg / ml ampicillin and Overnight Expression Kit (manufactured by Novagen) which is a lactose promoter expression induction reagent. 1%,
実施例9で得られた大腸菌は、50μg/mlのアンピシリンと50μg/mlのカナマイシンとを添加したTB培地中にて培養した。 The Escherichia coli obtained in Example 9 was cultured in a TB medium supplemented with 50 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin.
培養液から遠心分離(16,500×g、10分間、10℃)により菌体を集め、−20℃に30分以上置いて完全に凍結させた。菌体を、反応直前に室温で5〜30分間放置することにより凍結融解処理を施した。この菌体に、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中に270mMの基質3−キヌクリジノン・塩酸塩、0.75mMの補酵素NADP+、0.4mMのグルコースを含む反応溶液を添加して、25℃で振盪反応させた。60分後、反応液の2分の1量の飽和炭酸カリウム溶液を添加し、反応液中の残存基質である3−キヌクリジノンと反応生成物である3−キヌクリジノールとを2.5倍量の2−エチルヘキサノールによって抽出した。これらの抽出物を、実施例2に記載の条件に従って、γ-DEX225キャピラリーカラム(Spelco製)を用いてガスクロマトグラフィー分析した。菌体活性を、この反応条件で培養液1ml分の菌体を使用したときの変換率(%/時間/ml)として表した。各菌体の活性を以下の表1に示す。 The cells were collected from the culture solution by centrifugation (16,500 × g, 10 minutes, 10 ° C.) and placed at −20 ° C. for 30 minutes or more to completely freeze. The cells were freeze-thawed by allowing them to stand at room temperature for 5 to 30 minutes immediately before the reaction. A reaction solution containing 270 mM substrate 3-quinuclidinone hydrochloride, 0.75 mM coenzyme NADP + , 0.4 mM glucose in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added to the cells, and 25 ° C. And shake reaction. After 60 minutes, a half amount of saturated potassium carbonate solution of the reaction solution was added, and 2.5 quinuclidinol and 3-quinuclidinol, which are residual substrates in the reaction solution, were added in 2.5 times the amount. -Extracted with ethylhexanol. These extracts were subjected to gas chromatography analysis using a γ-DEX225 capillary column (manufactured by Spelco) according to the conditions described in Example 2. The cell activity was expressed as a conversion rate (% / hour / ml) when cells of 1 ml of the culture solution were used under these reaction conditions. The activity of each cell is shown in Table 1 below.
いずれの反応においても生成した3−キヌクリジノールは(R)−体であり、その光学純度は99.9%ee以上であった。 The 3-quinuclidinol produced | generated in any reaction was the (R)-body, and the optical purity was 99.9% ee or more.
(実施例11:3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌BL21(DE3)(pEGQ)による3−キヌクリジノンからの(R)−3−キヌクリジノールの合成)
実施例7で得られた組換え大腸菌BL21(DE3)(pEGQ)を500ml容バッフル付三角フラスコ中で滅菌した50mlのTB培地(50μg/mlのアンピシリンとOvernight Expression Kitを含む)に接種し、37℃で24時間振盪培養した。この培養液から遠心分離(8,400×g、20分間、10℃)により菌体を集めて−20℃で凍結保存した。30ml容ビーカーに、3−キヌクリジノン・塩酸塩1g、グルコース1.6g、NADP+ 3mg、および培養液3ml相当の凍結保存菌体を入れ、水道水で容量を10mlにし、25℃でスターラー攪拌しながら反応させた。なお、反応中に生成するグルコン酸を、48%水酸化カリウム溶液を用いて中和することにより、反応液のpHを7.0に保ちながら反応させた。実施例10と同様にして反応抽出液の分析を行った。図4は、組換え大腸菌BL21(DE3)(pEGQ)による3−キヌクリジノンの還元の経時変化を示すグラフである。縦軸に反応率(%)を、そして横軸に反応時間(h:時間)を示す。図4から、21時間後には、変換率14.3%で光学純度99.9%ee以上の(R)−3−キヌクリジノールが生成していたことがわかる。
(Example 11: Synthesis of (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone by recombinant E. coli BL21 (DE3) (pEGQ) that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene)
Recombinant E. coli BL21 (DE3) (pEGQ) obtained in Example 7 was inoculated into 50 ml of TB medium (containing 50 μg / ml ampicillin and Overnight Expression Kit) sterilized in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask. The culture was shaken at 24 ° C. for 24 hours. The cells were collected from this culture by centrifugation (8,400 × g, 20 minutes, 10 ° C.) and stored frozen at −20 ° C. In a 30 ml beaker, put 1 g of 3-quinuclidinone hydrochloride, 1.6 g of glucose, 3 mg of NADP + and 3 ml of the cryopreserved cell, make the
(実施例12:2遺伝子同時発現用プラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2の作製)
大腸菌において3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時に大量発現させるために、2遺伝子同時発現用プラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2を構築した。これらのプラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2は、それぞれの遺伝子を別々に制御できるように配置された2つのtacプロモーターと、lacオペロンによる発現制御をより厳密にするリプレッサーを発現するlacIq遺伝子とを含む。図5は、これらのプラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2の構造を示す模式図である。以下に、プラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2の構築法を説明する。
(Example 12: Construction of plasmids pKLDuet-1 and pKLDuet-2 for simultaneous expression of two genes)
In order to simultaneously express a large amount of 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene in E. coli, plasmids pKLDuet-1 and pKLDuet-2 for simultaneous expression of two genes were constructed. These plasmids pKLDuet-1 and pKLDuet-2 consist of two tac promoters arranged so that each gene can be controlled separately, and a lacI q gene that expresses a repressor that makes expression control by the lac operon more strict. including. FIG. 5 is a schematic diagram showing the structures of these plasmids pKLDuet-1 and pKLDuet-2. Below, the construction method of plasmid pKLDuet-1 and pKLDuet-2 is demonstrated.
(pKLDuet-1)
2つのtacプロモーターとマルチクローニングサイトとを含む領域を設計した。この領域の配列は、図6(配列番号42)に示す通りである。1つ目の断片である図6のNcoI−HindIII領域を合成するために、それぞれ130merのオリゴヌクレオチドtac-MCS-tacForward(配列番号28)およびtac-MCS-tacReverse(配列番号29)とプライマーtac-MCSF-Nco(配列番号30)およびtac-MCSR-Hind(配列番号31)とを用いて、PCRを行った。PCRにより得られた約230bpの増幅産物をNcoIおよびPstIで二重消化した。2つ目の断片である図6のBamHI−NcoI領域を合成するために、プラスミドpKK223-3を鋳型にして、プライマーtac-upF-Bam(配列番号32)およびプライマーtac-upR-Nco(配列番号33)を用いて、PCRを行った。PCRにより得られた約260bpの増幅断片をBamHIおよびNcoIで二重消化した。3つ目の断片として、プラスミドpKK223-3をBamHIおよびPstIで二重消化し、約4,300bpのDNA断片を生成した。上記3つのDNA断片を結合させてプラスミドpTacDuet-1を合成した。次に、プラスミドpTrcHisを鋳型にしてプライマーBsa-lacI-forward(配列番号34)およびBam-lacI-reverse(配列番号35)を用いてPCRを行った。このPCRによって、その制御プロモーターを含むlacIq遺伝子を含む領域を増幅した。得られた約1400bpの増幅断片をBsaAIおよびBamHIで二重消化した。消化により得られた断片を、プラスミドpTacDuet-1中の上流側のtacプロモーターの上流に位置するBsaAI−BamHI部位に挿入して、プラスミドpKLDuet-1を得た(図5)。
(PKLDuet-1)
A region containing two tac promoters and a multiple cloning site was designed. The arrangement of this region is as shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 42). In order to synthesize the NcoI-HindIII region of FIG. 6 as the first fragment, 130-mer oligonucleotides tac-MCS-tacForward (SEQ ID NO: 28) and tac-MCS-tacReverse (SEQ ID NO: 29) and primer tac- PCR was performed using MCSF-Nco (SEQ ID NO: 30) and tac-MCSR-Hind (SEQ ID NO: 31). The amplification product of about 230 bp obtained by PCR was double-digested with NcoI and PstI. In order to synthesize the BamHI-NcoI region of FIG. 6, which is the second fragment, the plasmid tKK-upF-Bam (SEQ ID NO: 32) and the primer tac-upR-Nco (SEQ ID NO: 32) were used using the plasmid pKK223-3 as a template. 33) was used for PCR. The approximately 260 bp amplified fragment obtained by PCR was double digested with BamHI and NcoI. As a third fragment, plasmid pKK223-3 was double digested with BamHI and PstI to generate a DNA fragment of about 4,300 bp. Plasmid pTacDuet-1 was synthesized by ligating the above three DNA fragments. Next, PCR was performed using the plasmid pTrcHis as a template and primers Bsa-lacI-forward (SEQ ID NO: 34) and Bam-lacI-reverse (SEQ ID NO: 35). By this PCR, a region containing the lacI q gene containing the regulatory promoter was amplified. The obtained amplified fragment of about 1400 bp was double-digested with BsaAI and BamHI. The fragment obtained by digestion was inserted into the BsaAI-BamHI site located upstream of the tac promoter on the upstream side in the plasmid pTacDuet-1 to obtain the plasmid pKLDuet-1 (FIG. 5).
(pKLDuet-2)
pKLDuet-1の上流側のマルチクローニングサイトと下流側のtacプロモーターとの間にターミネーターを以下のようにして挿入し、プラスミドpKLDuet-2を合成した。プラスミドpKLDuet-2は、図5に示されるように、高発現に必要なプロモーターからターミネーターまでのユニットを2つ含む。
(PKLDuet-2)
A terminator was inserted between the multicloning site upstream of pKLDuet-1 and the tac promoter on the downstream side as follows to synthesize plasmid pKLDuet-2. As shown in FIG. 5, plasmid pKLDuet-2 contains two units from a promoter to a terminator necessary for high expression.
プラスミドpKK223-3を鋳型にして、プライマーtac-MCS-TTF-Not(配列番号36)およびプライマーtac-MCS-TTR-Afl(配列番号37)を用いて、PCRを行った。このPCRによって、ターミネーターrrnBT1T2を含む領域を増幅した。得られた約290bpの増幅断片をNotIおよびAflIIで二重消化した。消化により得られた断片を、プラスミドpTacDuet-1中の2つのtacプロモーターの間に位置するNotI−AflII部位に挿入し、pKLDuet-2を得た(図5)。 PCR was performed using the plasmid pKK223-3 as a template and the primer tac-MCS-TTF-Not (SEQ ID NO: 36) and the primer tac-MCS-TTR-Afl (SEQ ID NO: 37). By this PCR, the region containing the terminator rrnBT 1 T 2 was amplified. The obtained amplified fragment of about 290 bp was double digested with NotI and AflII. The fragment obtained by digestion was inserted into the NotI-AflII site located between the two tac promoters in the plasmid pTacDuet-1 to obtain pKLDuet-2 (FIG. 5).
(実施例13:1つのプラスミドを用いた3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時に発現する組換え大腸菌の作製)
実施例12で構築したプラスミドpKLDuet-1およびpKLDuet-2を用いて、3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時に発現させるためのプラスミドpKL1GQおよびpKL2GQを構築した。次いで、これらのプラスミドpKL1GQおよびpKL2GQを用いて大腸菌SCS1、W3110、およびBL21を形質転換した。以下に、プラスミドpKL1GQおよびpKL2GQの構築法を記載する。
(Example 13: Production of recombinant E. coli that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene using one plasmid)
Using the plasmids pKLDuet-1 and pKLDuet-2 constructed in Example 12, plasmids pKL1GQ and pKL2GQ for simultaneously expressing the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and the glucose dehydrogenase gene were constructed. These plasmids pKL1GQ and pKL2GQ were then used to transform E. coli SCS1, W3110, and BL21. The construction methods of plasmids pKL1GQ and pKL2GQ are described below.
(pKL1GQおよびpKL2GQ)
実施例7のプラスミドpEGQの構築時と同様にして増幅したGDHI遺伝子断片をBsaIおよびXhoIで二重消化した。二重消化により得られた断片を、上記プラスミドpKLDuet-1中の上流側のtacプロモーターの下流に位置するNcoI−XhoI部位に挿入し、プラスミドpKL1Gを構築した。続いて、実施例9のプラスミドpWKQの構築時と同様にして増幅した3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子断片をEcoRIおよびPstIで二重消化した。二重消化により得られた断片を、プラスミドpKL1G中の下流側のtacプロモーターの下流のEcoRI−PstI部位に挿入し、プラスミドpKL1GQを得た。
(PKL1GQ and pKL2GQ)
The GDHI gene fragment amplified in the same manner as in the construction of the plasmid pEGQ in Example 7 was double-digested with BsaI and XhoI. The fragment obtained by double digestion was inserted into the NcoI-XhoI site located downstream of the upstream tac promoter in the plasmid pKLDuet-1, to construct the plasmid pKL1G. Subsequently, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene fragment amplified in the same manner as in the construction of the plasmid pWKQ of Example 9 was double-digested with EcoRI and PstI. The fragment obtained by double digestion was inserted into the EcoRI-PstI site downstream of the tac promoter on the downstream side in the plasmid pKL1G to obtain the plasmid pKL1GQ.
pKL2GQについても、pKL1GQと同様にして作製した。すなわち、実施例7のプラスミドpEGQの構築時と同様にして増幅したGDHI遺伝子断片をBsaIおよびXhoIで二重消化した。二重消化により得られた断片を、プラスミドpKLDuet-2中の上流側のtacプロモーターの下流に位置するNcoI−XhoI部位に挿入し、プラスミドpKL2Gを構築した。続いて、実施例9のプラスミドpWKQの構築時と同様にして増幅した3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子断片をEcoRIおよびPstIで二重消化した。二重消化により得られた断片を、プラスミドpKL2G中の下流側のtacプロモーターの下流のEcoRI−PstI部位に挿入し、プラスミドpKL2GQを得た。 pKL2GQ was also prepared in the same manner as pKL1GQ. That is, the GDHI gene fragment amplified in the same manner as in the construction of the plasmid pEGQ of Example 7 was double-digested with BsaI and XhoI. The fragment obtained by double digestion was inserted into the NcoI-XhoI site located downstream of the upstream tac promoter in plasmid pKLDuet-2 to construct plasmid pKL2G. Subsequently, the 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene fragment amplified in the same manner as in the construction of the plasmid pWKQ of Example 9 was double-digested with EcoRI and PstI. The fragment obtained by double digestion was inserted into the EcoRI-PstI site downstream of the tac promoter on the downstream side in the plasmid pKL2G to obtain the plasmid pKL2GQ.
(実施例14:2種類のプラスミドを用いた3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時に発現する組換え大腸菌の作製)
実施例9で構築した組換え大腸菌のプラスミドpWKQ上にlacIqリプレッサーを挿入することにより、発現抑制を厳密にして発現量を増大させることを計画した。以下のようにしてプラスミドpWKLQを構築し、このプラスミドpWKLQとプラスミドpAGとを同時に用いて大腸菌SCS1、W3110、およびBL21を形質転換した。以下に、プラスミドpWKLQの構築法を記載する。
(Example 14: Production of recombinant E. coli that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene using two types of plasmids)
By inserting the lacI q repressor into the recombinant p. Coli plasmid pWKQ constructed in Example 9, it was planned to increase the expression level with strict expression suppression. Plasmid pWKLQ was constructed as follows, and E. coli SCS1, W3110, and BL21 were transformed using this plasmid pWKLQ and plasmid pAG simultaneously. Below, the construction method of plasmid pWKLQ is described.
(pWKLQ)
実施例12で増幅したlacIq遺伝子を含む断片をBsaAIおよびBamHIで二重消化した。二重消化により得られた断片を、プラスミドpWKQ中のtacプロモーターの上流に位置するBsaAI−BamHI部位に挿入して、プラスミドpWKLQを得た。
(PWKLQ)
The fragment containing the lacI q gene amplified in Example 12 was double digested with BsaAI and BamHI. The fragment obtained by double digestion was inserted into the BsaAI-BamHI site located upstream of the tac promoter in plasmid pWKQ to obtain plasmid pWKLQ.
(実施例15:3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌の3−キヌクリジノン還元活性)
実施例13で作製したそれぞれの組換え大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンとOvernight Expression Kit(Novagen製)とを添加した5mlのTB培地で培養した。実施例14で作製したそれぞれの組換え大腸菌は、さらに50μg/mlのカナマイシンを添加した上記培地にて培養した。得られた培養液を、実施例10と同様にして反応させ、そして3−キヌクリジノン還元活性を測定した。結果を以下の表2に示す。
Example 15: 3-Quinuclidinone Reducing Activity of Recombinant E. coli Coexpressing 3-Quinuclidinone Asymmetric Reductase Gene and Glucose Dehydrogenase Gene
Each recombinant Escherichia coli prepared in Example 13 was cultured in 5 ml of TB medium supplemented with 50 μg / ml ampicillin and Overnight Expression Kit (Novagen). Each recombinant Escherichia coli prepared in Example 14 was further cultured in the above medium supplemented with 50 μg / ml kanamycin. The obtained culture broth was reacted in the same manner as in Example 10, and 3-quinuclidinone reducing activity was measured. The results are shown in Table 2 below.
いずれの反応においても生成した3−キヌクリジノールは、(R)−体であり、その光学純度は99.9%ee以上であった。 The 3-quinuclidinol produced | generated in any reaction was the (R)-body, and the optical purity was 99.9% ee or more.
実施例13で作製した組換え大腸菌および実施例14で作製した組換え大腸菌は、既知の方法(実施例7、8、および9)で作製した組換え体の活性(実施例10に示される)に比べて、高い3−キヌクリジノン還元活性を示した。実施例13で作製した組換え大腸菌および実施例14で作製した組換え大腸菌は、以下の3つの条件を全て備えている:(1)2つの遺伝子をそれぞれ独立に制御するようにtacプロモーターが配置されている;(2)高発現型lacIqリプレッサーがプラスミド上に配置されている;および(3)ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌宿主である。したがって、上記条件を備えるように作製された組換え体は、既知の方法で作製された組換え体に比べて、高い3−キヌクリジノン還元活性を有することができる。 The recombinant E. coli produced in Example 13 and the recombinant E. coli produced in Example 14 are the activities of the recombinants produced by known methods (Examples 7, 8, and 9) (shown in Example 10). As compared with the above, it showed high 3-quinuclidinone reduction activity. The recombinant Escherichia coli prepared in Example 13 and the recombinant Escherichia coli prepared in Example 14 have all the following three conditions: (1) The tac promoter is arranged so as to control two genes independently. (2) a highly expressed lacI q repressor is placed on the plasmid; and (3) an E. coli host that is deficient in the lactose operon. Therefore, a recombinant produced to have the above conditions can have a higher 3-quinuclidinone reducing activity than a recombinant produced by a known method.
(実施例16:3−キヌクリジノン不斉還元酵素遺伝子とグルコース脱水素酵素遺伝子とを同時発現する組換え大腸菌W3110(pWKLQ, pAG)による3−キヌクリジノンからの(R)−3−キヌクリジノールの合成)
実施例14で得た組換え大腸菌W3110(pWKLQ, pAG)を、実施例11で使用した培地に50μg/mlのカナマイシンを添加して、24時間振盪培養した。培養液を遠心分離(8,400×g、20分間、10℃)により集菌して−20℃で凍結保存した。30ml容ビ−カ−に、3−キヌクリジノン・塩酸塩1g、グルコース1.4g、NADP+ 1.5mg、リン酸水素二カリウム0.35gおよび培養液3ml相当分の凍結菌体を入れ、水道水で容量を10mlにし、25℃でスターラー攪拌しながら反応させた。なお、反応中に生成するグルコン酸を、48%水酸化カリウム溶液を用いて中和することにより、反応液のpHを7.5に保ちながら反応させた。実施例10と同様にして反応抽出液の分析を行った。図7は、組換え大腸菌W3110(pWKLQ, pAG)による3−キヌクリジノンの還元の経時変化を示すグラフである。縦軸に反応率(%)を、そして横軸に反応時間(h:時間)を示す。図7から、21時間後には、変換率98.6%で光学純度99.9%ee以上の(R)−3−キヌクリジノールが生成したことがわかる。
(Example 16: Synthesis of (R) -3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone by recombinant E. coli W3110 (pWKLQ, pAG) that simultaneously expresses 3-quinuclidinone asymmetric reductase gene and glucose dehydrogenase gene)
Recombinant E. coli W3110 (pWKLQ, pAG) obtained in Example 14 was added with 50 μg / ml kanamycin to the medium used in Example 11, and cultured with shaking for 24 hours. The culture solution was collected by centrifugation (8,400 × g, 20 minutes, 10 ° C.) and stored frozen at −20 ° C. In a 30 ml beaker, put 1 g of 3-quinuclidinone hydrochloride, 1.4 g of glucose, NADP + 1.5 mg, 0.35 g of dipotassium hydrogenphosphate and 3 ml of frozen broth for 3 ml of the culture solution. The mixture was made 10 ml and reacted at 25 ° C. with stirring with a stirrer. The gluconic acid produced during the reaction was neutralized using a 48% potassium hydroxide solution, and the reaction was carried out while maintaining the pH of the reaction solution at 7.5. The reaction extract was analyzed in the same manner as in Example 10. FIG. 7 is a graph showing the time course of the reduction of 3-quinuclidinone by recombinant E. coli W3110 (pWKLQ, pAG). The vertical axis represents the reaction rate (%), and the horizontal axis represents the reaction time (h: time). FIG. 7 shows that (R) -3-quinuclidinol having a conversion rate of 98.6% and an optical purity of 99.9% ee or more was produced after 21 hours.
上記の(1)から(3)に示す3つの条件を備えた組換え大腸菌では、実施例11で使用したNADP+の添加量を2分の1にした条件でも、21時間の反応でほぼ理論収量の(R)−3−キヌクリジノールが得られた。 In the recombinant Escherichia coli having the three conditions shown in the above (1) to (3), even when the addition amount of NADP + used in Example 11 was halved, the reaction was almost theoretical in 21 hours. A yield of (R) -3-quinuclidinol was obtained.
本発明によれば、(R)−3−キヌクリジノールを高い光学純度で効率よく製造し得る酵素が提供される。本発明の酵素を高発現する形質転換体を用いることにより、高い光学純度を有する(R)−3−キヌクリジノールをさらに高い収率で製造する方法が提供される。得られる(R)−3−キヌクリジノールは、ムスカリン受容体に作用する医薬品の共通中間体として汎用性のある化合物であり、動脈硬化症、気管支喘息、痴呆症、または胃腸運動抑制などの治療剤を製造するための合成中間体として有用である。 According to the present invention, an enzyme capable of efficiently producing (R) -3-quinuclidinol with high optical purity is provided. By using a transformant that highly expresses the enzyme of the present invention, a method for producing (R) -3-quinuclidinol having high optical purity in a higher yield is provided. The obtained (R) -3-quinuclidinol is a versatile compound as a common intermediate of drugs acting on muscarinic receptors, and it is used as a therapeutic agent for arteriosclerosis, bronchial asthma, dementia, or gastrointestinal motility suppression. Useful as a synthetic intermediate for production.
Claims (18)
(a)配列番号41に記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号41に記載のアミノ酸配列において1〜30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および/または付加を有するアミノ酸配列;または
(c)配列番号41に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有するアミノ酸配列;
(1)還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を補酵素として、3−キヌクリジノンまたはその塩を不斉還元し、(R)−3−キヌクリジノールを生成する;および
(2)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を補酵素とする3−キヌクリジノールの酸化反応を触媒しない。 An enzyme having any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and having the following biochemical properties (1) and (2) :
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41;
(B) an amino acid sequence having 1 to 30 amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41; or
(C) an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41;
(1) asymmetric reduction of 3-quinuclidinone or a salt thereof using reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) as a coenzyme to produce (R) -3-quinuclidinol; and (2) nicotinamide adenine It does not catalyze the oxidation reaction of 3-quinuclidinol using dinucleotide phosphate (NADP + ) as a coenzyme.
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282135A (en) * | 2015-05-12 | 2017-01-04 | 河北省科学院生物研究所 | The preparation method of a kind of quinuclidone reductase RrQR and application in preparation (R)-3-quinuclidinol thereof |
US20200270656A1 (en) * | 2017-09-12 | 2020-08-27 | Unichem Laboratories Ltd | Highly efficient enzymatic process to produce (r)-3-quinuclidinol |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2423320A4 (en) * | 2009-04-23 | 2013-07-31 | Kaneka Corp | Process for production of (r)-3-quinuclidinol |
JP5703455B2 (en) * | 2010-01-19 | 2015-04-22 | 富山県 | Quinuclidinone reductase and method for producing optically active 3-quinuclidinol using the same |
CN101864370B (en) * | 2010-06-11 | 2012-06-06 | 河北省科学院生物研究所 | Yeast strain converting quinuclidone into R-3-quinuclidinol and conversion method thereof |
CN103228658A (en) * | 2010-10-08 | 2013-07-31 | 卡迪拉保健有限公司 | Process for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic conversion |
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DE102013104418B4 (en) | 2013-04-30 | 2018-09-27 | Cambrex Iep Gmbh | Biocatalytic process for the preparation of (R) -3-quinuclidinol |
WO2019123166A1 (en) * | 2017-12-18 | 2019-06-27 | Unichem Laboratories Ltd | Nucleotide sequences encoding 3-quinuclidinone reductase and glucose dehydrogenase and soluble expression thereof |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3891522B2 (en) * | 1998-01-07 | 2007-03-14 | 長瀬産業株式会社 | Process for producing optically active 3-quinuclidinol |
JP3858505B2 (en) * | 1999-03-05 | 2006-12-13 | 三菱化学株式会社 | Method for producing R-3-quinuclidinol |
-
2005
- 2005-11-01 JP JP2005318768A patent/JP4809660B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282135A (en) * | 2015-05-12 | 2017-01-04 | 河北省科学院生物研究所 | The preparation method of a kind of quinuclidone reductase RrQR and application in preparation (R)-3-quinuclidinol thereof |
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