JP4124965B2 - ゲル透過クロマトグラフィーを用いる重合体分布の分子量及び固有粘度の決定システム及び方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）計装装置からのデータの分析に関し、詳細には、データを分析して絶対分子量及び固有粘度を決定するコンピュータ・システム及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
合成重合体の分子構造は、その最終用途、及び、硬度、引張り強さ、絞り性（ｄｒａｗａｂｉｌｉｔｙ）、弾性係数及び溶融粘度のような、そのプロセス特性を決定する。合成重合体の分子構造を規定する最も重要な決定要素は、それらの繰り返し単位、それらの分子量分布（ＭＷＤ）及びそれらの分子トポロジー（分岐化）の化学的性質である。
【０００３】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による重合体サンプルの分離及びそれに続く検出は、人が高分子サンプルの分子量分布（ＭＷＤ）及び固有粘度法則（ＩＶＬ）を決定するのを可能にする。ＩＶＬは、サンプルの分岐特性を明らかにすることができる。ＧＰＣに対して用いられる別の用語は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）システムである。
【０００４】
ＧＰＣ分離において、本質的にその分子量ではなく分子の実効サイズが、その溶出容量を決定する。例えば、２つの重合体は、同じ分子量を有し得るが、しかし組成又は分岐トポロジーにおいて異なり得る。そのような相違は、異なる溶出容量を導くことができる。こうして、溶出容量は、単独で、サンプルの分子量分布を絶対的意味ではなく相対的な意味で決定する。
【０００５】
分離に続いて、１つ以上の検出器は、溶離剤の流れの物理的特性を記録する。それはこれらのデータの数学的分析であり、その数学的分析からサンプルのＭＷＤ及びＩＶＬを得ることができる。
【０００６】
既知の分子量（ＭＷ）の狭い標準、即ち分子の中の全ての原子の原子量の和が利用可能であり、かつこれらの標準がサンプルと同じ重合体材料であるとき、分子量較正は、直接実行すべきである。狭い標準の注入は、クロマトグラフィー・カラム・セットのＭＷ較正曲線（ｌｏｇＭＷ対溶出容量）を決定する。これらの状況の下で、（屈折率（ＲＩ）検出器のような）単一の濃度検出器のみがＭＷＤを決定することが必要とされる。
【０００７】
そのような標準が利用可能でない場合、二重検出手法が、サンプルのＭＷＤを検出するのに用いられることができる。第１の典型的な二重検出システムは、屈折率（ＲＩ）及び光散乱（ＬＳ）検出を用いる。第２の既知のシステムは、ＲＩ及び粘性（Ｖ）検出を用いる。そのような双方のシステムからのデータを用いて、サンプルのＭＷＤを決定することができる。
【０００８】
ＲＩ−Ｖ検出システムは、その固有粘度法則（ＩＶＬ）のプロットを通して重合体の分子トポロジーの追加の決定を可能にする。サンプルのＩＶＬは、その分子量の関数としてのその固有粘度である。固有粘度は、サンプルの比粘度（粘度計により測定される）のその濃度（濃度検出器により測定される）に対する比である。
【０００９】
ＲＩ−Ｖ検出のケースにおいては、重合体較正標準は、ＭＷＤ及びＩＶＬを決定するため必要とされるが、繰り返し単位は、重合体サンプルの化学的性質と同じ化学的性質を有することを必要とする。ＲＩ−ＬＳ検出方法は、追加の較正標準を必要としない。
【００１０】
両方のシステムに対して、ＲＩ検出器は、ピーク濃度プロフィールを測定するため用いられる。ＲＩ検出器の代わりに、適切に較正されたＵＶ／Ｖの吸光度検出器、気化光散乱検出器（ＥＶＳ）、又は赤外線（ＩＲ）検出器が同じ機能を実行するため代用され得る。
【００１１】
ＬＳ及びＶ検出器は、通常「分子量感応」検出器と呼ばれる。そのような検出器は、サンプルの濃度と、その分子量をある数でべき乗したものとの積に応答する。
【００１２】
濃度検出器と分子量感応検出器の組合わせは、典型的な分析から利用可能な情報内容を著しく増大させる。しかし、その利用可能な情報の増大は、データ分析の複雑さを拡大する。両方のシステムに対して、アルゴリズム方法は、サンプルのＭＷＤを得るため検出器応答を分析するのに必要とされる。ＲＩ−Ｖシステムにおいて、追加のアルゴリズム方法は、サンプルのＩＶＬを決定するため必要とされる。
【００１３】
ＭＷＤ及びＩＶＬの正確さ及び精度は、それぞれのクロマトグラフィー・システムから得られるデータの質に依存するばかりでなく、またデータ分析方法論の詳細にも依存する。こうして、データ分析方法は、重合体のＧＰＣ分析における本質的要素となる。
【００１４】
等分に離間した時間間隔で、分離されたサンプルがカラムから溶出し、検出器の流れセルを通るとき、各検出器は、分離されたサンプルの特性の測定値を記録する。狭い時間領域にわたり平均化された各測定値は、サンプルの分子量分布における狭い領域に対応する。単一の時間間隔に記録された測定値に対応する分子量領域は、「スライス（ｓｌｉｃｅ）」と呼ばれる。
【００１５】
スライスは、そのスライス番号、その溶出時間、又はその溶出容量により参照され得る。典型的には、溶出容量は、スライスの溶出時間にポンプの公称流量を乗算することにより得られる。特定のスライスは、通常、一般性を失うことなく、そのスライス番号又は溶出容量により言及される。
【００１６】
ＲＩ検出器、ＬＳ検出器及びＶ検出器を用いてそれぞれ、各スライスｉに対して濃度ｃi、レイリー比Ｒi及び比粘度ｓｐ，ｉを測定する。
１対のクロマトグラフ・プロフィールが２つの検出器から得られる場合、それぞれの応答の比が有用な量を得るため形成されることができる。例えば、ｃi及びＲiがｉ番目のスライスから濃度及びレイリー比の測定値である場合、比ｉ＝Ｒi／ｃiは、そのスライスの分子量に比例する。ｃi及びｓｐ，ｉが濃度及び比粘度のスライス測定値である場合、比［］ｉ＝ｓｐ，ｉ／ｃiは、スライスの固有粘度に等しい。
【００１７】
ＭＷＤ及びＩＶＬの双方は、ピーク領域全体にわたり測定されることが必要である。典型的には、これは、これらの比に対して、パラメータ化された滑らかなモデルをスライス番号又は溶出容量の関数として適合させることにより達成される。比の対数ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）の双方は溶出容量のほぼ線形関数である傾向をもち、そこで溶出容量の関数としての低次多項式は通常これらの量に適合される。
【００１８】
主要問題は、検出器応答の中に存在する雑音がスライス測定値から計算された量の中に誤差を導入することである。ＧＰＣに用いられる既知の各検出器は、非理想的性質をそれらの応答の中に含む。典型的には、これらの非理想的性質は、２つのカテゴリー、即ち基線ドリフト及び確率的検出器雑音に分けられる。検出器雑音はまた、システム雑音と呼ばれる。熱的に安定化されたクロマトグラフにおける基線ドリフトは、基線訂正処置により正確に補償される。
【００１９】
検出器雑音は、測定プロセスの既約成分である。この雑音の源は、基線における揺らぎとして見られ、幾つかの基本的現象の結果である。１つは、ＲＩ検出器及びＬＳ検出器におけるような光源のショット雑音である。他の源は、全ての検出器の中の増幅器に関連した熱雑音、ポンプ流量の揺らぎ、及び熱変動である。微粒子、汚染物質及びあわもまた、追加の雑音成分を信号に追加する。
【００２０】
これらの影響の正味の結果は、各スライス測定値に加えられる確率的雑音の中に現れる。そのような追加の雑音は、ゼロ平均、及び明確に定義された標準偏差を有する。雑音の標準偏差は、一般に、異なる検出器に対して異なるであろうが、しかし各検出器の雑音は、分離全体を通して一定である。
【００２１】
スライス測定値の中の検出器雑音により誘発された誤差の影響は、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に誤差を導入することである。ｃiは分母であるので、これらの量における雑音は、濃度プロフィールにおける応答が低減するにつれ増大する。対数の故に、これらの量における雑音はまた、分子量感応検出器の応答が低減するにつれ増大する。こうして、ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）における雑音は、クロマトグラフ・ピークの端部（前縁及び後縁）において著しく増大する。
【００２２】
更に、ピーク端部近くで、応答における雑音は、比が負の値を有するようにさせる。負数の対数は定義されない。そのようなスライス・データを排除するのは結果を偏らせる。応答比の対数を扱うこの問題は、Ｐ．Ｔａｃｋｘ及びＦ．Ｆｏｓｓｃｈｅｒ著の最近の論文「多角度レーザ光散乱と結合されたサイズ排除クロマトグラフィーにおけるランダム雑音レベルに起因したシステム偏差（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｄｕｅ ｔｏ Ｒａｎｄｏｍ Ｎｏｉｓｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｏｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉ Ａｎｇｅｌ Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）」（１９９７年、Ａｎａｌ．Ｃｏｍｍ．３４、２９５−２９７頁）に十分記載されている。
【００２３】
検出器の雑音の存在が与えられた場合、滑らかなモデルをｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に対して完全なピーク・プロフィールにわたって適合させる仕方に関する問題が残っている。
【００２４】
本発明以前においては、ピーク端部において、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）が雑音により支配されているように見えた故に、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）が有用な情報を含まなかったと決めてかかっていた。従って、モデルの最小２乗適合は、比の信号対雑音比（ＳＮＲ）が高いピークの「心臓部（ｈｅａｒｔ）」に限定された。ユーザは、モデルが適合される領域とモデル適合から排除すべき領域との間の境界画定を手動で決定することを要求された。
【００２５】
しかしながら、ＭＷＤ及びＩＶＬをピーク全体にわたり決定するため、これらの量の値が、それにも拘わらず、ピーク端部において必要とされた。従来の操作は、モデル結果をピーク端部へ外挿することであった。Ｔａｃｋｘ及びＦｏｓｓｃｈｅｒが指摘するように、そのような外挿から得られた結果は、適合領域及び外挿方法の選定に対して著しく敏感である。
【００２６】
発明の概要
本発明は、重合体サンプルの分子量分布（ＭＷＤ）及び固有粘度法則（ＩＶＬ）を決定するため検出器から取得されたデータに対して適用されることができる正確なデータ分析方法を提供する。
【００２７】
本発明に従って、１対のクロマトグラフ・プロフィールが、２つの検出器から得られ、そして１組の応答が別の組みの応答の関数であるモデルと比較される。例えば、ｃi及びＲiがｉ番目のスライスに対する濃度及びレイリー比の測定値である場合、量Ｒiは、ｃiから得られたＲiのモデルと比較される。ｃi及びｓｐ，ｉがｉ番目のスライスからの濃度及び比粘度の測定値である場合、量ｓｐ，ｉは、ｃiから得られたｓｐ，ｉのモデルと比較される。従って、この方法は、プロフィールの比及びこれらの比の対数を取る必要性を排除し、それによりピーク端部における領域を含む、ピーク・プロフィール全体にわたり作られたスライス測定値の使用を可能にする。
【００２８】
本発明の第１の実施形態において、ＧＰＣ又はＳＥＣ分離の技術及び２つ以上の検出器を用いて重合体サンプルのＭＷＤ及びＩＶを決定する正確な方法が提供される。
【００２９】
本発明の第１の実施形態の第１の実施は、第１の検出器信号を取り出す最小２乗最小化を用いる方法を含み、そしてサンプル特性を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いて初期モデル曲線を構成する。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器信号に関して実行され、最良モデル曲線及びパラメータを生成する。
【００３０】
第１の実施形態の第２の実施は、２つ以上の検出器を用いるサンプルの分子量較正曲線を決定する方法を含む。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成され、そしてｌｏｇＭ（対数分子量）対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いた初期モデル曲線が、発生される。この初期モデル曲線は、濃度検出器からのスライスのレイリー比を表すため用いられる。光散乱（ＬＳ）検出器からの第２のデータが処理されてスライスのレイリー比が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器データからのスライスのレイリー比に関して実行され、最良モデル曲線及びパラメータをもたらす。次いで、サンプル分子量分布（ＭＷＤ）が計算される。
【００３１】
本発明の第１の実施形態の第３の実施は、２つ以上の検出器を用いたサンプルの固有粘度対溶出容量を決定する方法を含む。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成され、そしてｌｏｇ［］対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いた初期モデル曲線が、発生される。この初期モデル曲線は、濃度検出器からのスライスの比粘度を表す。粘度計（Ｖ）検出器からの第２のデータが処理されてスライスの比粘度が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器データからのスライスの比粘度に関して実行され、ｌｏｇ［］対溶出容量を表す最良モデル曲線をもたらす。
【００３２】
本発明の第２の実施形態において、２つ以上の検出器からのデータを用いたサンプルのＭＷＤ及びＩＶＬの同時決定が実行される。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成される。初期モデル曲線が、このデータを用いて、またサンプルに対するｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表すパラメータ化されたモデル曲線を用いて、更に汎用較正曲線からのスライスの流体力学容量を用いて構成される。この初期モデル曲線は、スライスの比粘度を濃度検出器応答の関数として表す。粘度計（Ｖ）検出器からの第２のデータが処理されてそれぞれのスライスの比粘度が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線、及び第２の検出器データからのそれぞれのスライスの比粘度に関して実行され、ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表す最良モデル曲線をもたらす。この最良モデル曲線から、ＩＶＬ及びＭＷＤが決定される。
【００３３】
本発明の第３の実施形態は、比及び対数の使用を排除するため最小２乗最小化適合の再形成を含み、それによりその適合が全てのデータをピーク全体にわたり含むのを可能にする。
【００３４】
本発明の第４の実施形態は、比較された量における雑音がピーク領域の全体にわたり変わる重み付けされた最小２乗最小化適合を用いることを含み、それにより最小２乗適合が、ピーク領域の全体にわたり実行されることができる。
【００３５】
本発明の利点は、それが無信号、例えば、いずれかの検出器、又は両方の検出器からの、ゼロの周りで揺らぐ基線応答を含む領域の包含を可能にすることである。本発明の別の利点は、考慮下の２つのシステムにより決定されるように、サンプルのＭＷＤの正確さと精度の改善をもたらす。更に、最小２乗問題は、雑音の多いデータの比又は比の対数を取ることを避けるため定式化される。また、本発明は、測定値誤差に対して、特にピークの端部において、かなり敏感でない。本発明は、第２の実施形態に対してＩＶＬの正確さ及び精度の改善を与える。
【００３６】
本発明の更に別の利点は、ＩＶ法則及び分子量較正が全てのスライス・データに対する単一の適合から推定されることである。追加の適合を実行することから生じるシステム誤差が回避されるように、複数回の適合及び外挿を実行する必要性が回避される。
【００３７】
本発明の前述及び他の特徴及び利点は、添付図面と関係した、例示的実施形態の以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【００３８】
詳細な説明
本発明に従った分子量分布を分析するための例示的ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムが、図１に図示されている。溶媒貯留槽１０は、溶媒ポンプ１２により送出される溶媒を与える。注入弁１３において、重合体サンプル１４は、溶媒の流れの中に導入される。次いで、溶媒は、重合体サンプル１４と共に、クロマトグラフ・ベッドを含む１組のカラム１６を通る。次いで、溶媒は、検出器１８を通り、そこにおける１つ又は幾つかの検出器は、その溶媒を分析し、重合体連鎖の存在及び特性を決定する。この情報は、矢印２２により示されるように、データ・プロセッサ２０に供給される。次いで、不用溶媒は、容器２４に収集される。
【００３９】
ＧＰＣカラム１６は、細孔のある大きさの分布を持つ充填ビーズ（クロマトグラフ・ベッド）を含む。そのようなシステムの例示的実施形態は、両方ともＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州（０１７５７）３４ Ｍａｐｌｅ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍｉｌｆｏｒｄ）により製造されたＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システム及びスティレーゲル（Ｓｔｙｒａｇｅｌ）カラムである。
【００４０】
サンプル１４を流体流れの中に注入することにより、サンプル１４はカラム・セット１６の中へ押し込まれる。細孔は、大きい分子を排除し、小さい分子を保持する。大きい分子は、比較的小さい実効容量を有するカラム・セットを知覚する。小さい分子は、比較的大きい実効容量を有するカラム・セットを知覚する。従って、大きい分子は最初に溶出し、小さい分子は遅く溶出する。検出器１８は、カラム・セット１６に続き、溶離剤の物理的特性を測定する。
【００４１】
図２のデータ・プロセッサ２０は、データベース２６及びプロセッサ２８を含む。データベース２６は、磁気ディスク、テープ及び光磁気ディスクのような長期間記憶装置を含む。この例示的実施形態におけるデータベース２６は、関係型データベースである。プロセッサ２８は、情報を処理し生成するためデータベース２６に記憶されているデータにアクセスし、その情報は、データベース２６に戻すよう記憶され、又はワークステーション３０に表示され、又はプリントされ（図示せず）得る。データ・プロセッサ２０はまた、Ａ／Ｄ（アナログ／ディジタル）変換回路、サンプル及びホールド回路及び他の装置（図示せず）を含む、データ２２を処理し変換するための装置を含んでよい。
【００４２】
例示的実施形態において、データ・プロセッサは、マイクロソフト・ウインドウズ（登録商標）９５又はウインドウズＮＴを実行するインテル・ペンティアム（登録商標）ベースのパーソナル・コンピュータのような汎用コンピュータである。処理アプリケーション・ソフトウエアは、マサチューセッツ州ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたミレニアム32（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32）（登録商標）である。ミレニアム32は、クロマトグラフィー操作者が装置を制御し、検出器から得られたデータを取得し、記憶し、検索するのを可能にするクロマトグラフィー情報及びシステム・マネジャである。それはまた、クロマトグラフィー操作者がそのデータを処理し、処理された結果を図形及び表形式で記憶し、検索し、表示し、及びプリントするのを可能にする。
【００４３】
ミレニアム32ソフトウエア製品は、幾つかの構成要素を含む。１つのソフトウエア構成要素は、装置（溶媒ポンプ１２、自動注入器１３及び検出器１８）を制御し、データを（主に検出器から）取得する。別の構成要素は、情報を記憶し供給するオラクルのデータベースであるデータベース２６である。
【００４４】
別の構成要素は、情報を処理し、情報をデータから抽出し、それをレポートに与えるアプリケーション・ソフトウエアである。レポート発生器は、ユーザがレポートを作成し、管理し、プリントするのを可能にする。グラフィック・ユーザ・インタフェース（ＧＵＩ）は、ユーザがモニタ３０からの全てのこれらのサブシステム及び構成要素と対話するのを可能にする。本発明の例示的実施形態は、ミレニアム32のデータ処理構成要素内で実施される。
【００４５】
２つのカテゴリーの検出器は、ミレニアム32に対して信号入力２２を与えることができる。一方のカテゴリーは、Ｗａｔｅｒｓにより製造された検出器から構成され、他方のカテゴリーは、第三者の検出器を含む。Ｗａｔｅｒｓの検出器からの出力は、ＩＥＥＥ−４８８インタフェースを介して通信する（ＩＥＥＥ−４８８は、プログラマブル装置（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用ＩＥＥＥ基準ディジタル・インタフェース、即ちＡＮＳＩ／ＩＥＥＥ基準４８８−１９８７である。）。検出器からの信号は、ＩＥＥＥ−４８８ケーブル上のアナログ形式である。ＩＥＥＥ−４８８ケーブルは、当該技術において既知のように、ＰＣマザーボード上のＩＳＡスロットにプラグ・インされた印刷回路板を介してミレニアム32に接続する。この印刷回路板は、ＢｕｓＬＡＣＥと呼ばれるＷａｔｅｒｓ製品である。ＢｕｓＬＡＣＥは、信号をディジタル化し、ＰＣと通信する。ＩＥＥＥ−４８８インタフェースは、デイジーチェーン・ネットワークとして実施され、それにより複数の検出器モジュール及び装置がＢｕｓＬＡＣＥ上の１つのＩＥＥＥ−４８８コネクタにプラグ・インすることができる。
【００４６】
第三者検出器１８からの出力２２は、アナログ形式であると仮定する。検出器出力信号は、遮蔽されたケーブル内に包囲された１対のワイヤ上に印加される。遮蔽されたケーブルは、ＳＡＴ／ＩＮ（衛星入力）と呼ばれるＷａｔｅｒｓ電子機器ハードウエアの１つに接続する。ＳＡＴ／ＩＮは、アナログ入力を２つの装置から取り込み、そしてアナログ入力信号をディジタル化する。ＳＡＴ／ＩＮの出力はＲＳ−２３２線であり、そのＲＳ−２３２線は入力をＢｕｓＬＡＣＥへ与える。こうして、ＢｕｓＬＡＣＥは、２つの全く異なるタイプの入力、即ちＷａｔｅｒｓハードウエアからのＩＥＥＥ−４８８信号、及び第三者検出器からのＲＳ−２３２信号を受け入れる。
【００４７】
検出器１８は、屈折率（ＲＩ）検出器、光散乱（ＬＳ）検出器、及び粘度計（Ｖ）検出器を含む。
ＲＩ検出器は、溶液の屈折率に応答する。この検出器の出力が与えられた場合、検出器の基線応答を差し引きかつサンプルに対して屈折率の増分ｄｎ／ｄｃで除算することにより、ｉ番目のスライスに対するサンプルの濃度プロフィールｃiが与えられる。
【００４８】
ＲＩ検出器を用いて、ピークの濃度プロフィールを測定する。適切に較正されたＵＶ／Ｖｉｓ吸収検出器又は蒸発光散乱検出器（ＥＶＳ）は、同じ機能を実行するためＲＩｋｅの代わりに代用され得る。濃度検出器として働き得るいずれの検出器は、ＲＩ検出器の代わりに用いることができ、本発明の範囲内である。一例のＲＩ検出器は、Ｗａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システムである。
【００４９】
ＬＳ検出器は、光を散乱することによりサンプルに応答する。検出器の基線応答を差し引きかつ検出器較正処置を適用することにより、各スライスに対して、サンプルＲiに起因する過剰レイリー比が与えられる。一例のＬＳ検出器は、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ ＢａｒｂａｒａのＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．からのミニＤＡＷＮ３角度レーザ光拡散検出器である。
【００５０】
粘度計（Ｖ）検出器は、サンプルに溶媒を加えたものの粘度に応答する。検出器の基線応答を差し引きかつ基線の粘度で除算することにより、各スライスに対するサンプルの比粘度ｓｐ，ｉが与えられる。一例のＶ検出器は、Ｗａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システムに組み込まれている検出器である。
【００５１】
ＬＳ検出器及びＶ検出器は、通常、検出器の応答がサンプルの分子量のある関数により乗算されたサンプルの濃度に比例する点で、「分子量感応」検出器と呼ばれる。光散乱のケースにおいて、ＬＳ検出器は、濃度と分子量の積に応答する。粘性（Ｖ）検出のケースにおいて、粘度計は、分子量の累乗により乗算された濃度に応答する。
【００５２】
従って、各スライスに対して、検出器は、そのスライスに対して、濃度ｃi、過剰レイリー比Ｒi及び比粘度ｓｐ，ｉを与える。
重合体サンプル１４は、連鎖長の分布を含む。サンプルのＭＷＤは、分子量の単位間隔当たりの相対質量（又は濃度）により表されることができる。重合体の合成を支配する動力学のため、これらの分布は、通常、図３に図示されるように、ＭＷの対数の単位当たりの相対質量により表される。水平軸はｌｏｇＭＷであり、垂直軸は任意である。前述のように、分布のｌｏｇＭＷにおける狭いがしかし限定された間隔は、スライスと呼ばれる。
【００５３】
説明のため、図３に示されるシミュレートされたＭＷＤ ３５が用いられるであろう。カラムに注入された質量が与えられたとすると、このプロフィールは、正規化され、ｄｍ／ｄ（ｌｏｇＭ）、即ちＭＷの単位対数間隔当たりの質量を与える。
【００５４】
図５は、カラム・セットの分子量較正曲線をプロットし、それはＭＷの対数対溶出容量である。図５におけるｘ軸は溶出容量であり、ｙ軸はｌｏｇＭＷである。高い分子量端Ｖｏにおける漸近線は排除された合計容量を表し、低い分子量端Ｖｔにおける漸近線は合計カラム容量を表す。
【００５５】
この線は、細孔サイズ分布によりセットされたカラムに関する限界を表す漸近線を高いＭＷ及び低いＭＷにおいて有する。各漸近線は、高い分子量端Ｖｏにおいてビーズにより排除された容量を表し、そして低い分子量端Ｖｔにおいて合計カラム容量を表す。理想的には、ＶｏとＶｔとの間に、ｌｏｇＭＷ対溶出容量のプロットが殆ど線形である溶出領域がある。この較正曲線はサンプルに依存し、そして、それはまた、溶媒、カラム及び温度の選定に依存する。
【００５６】
ＭＷＤに適用される図５のカラム較正は、図６にプロットされるように、サンプルがカラム・セットから溶出するときのサンプルの濃度対溶出容量３９又はｃ（Ｖ）を与える。ｘ軸は溶出容量であり、ｙ軸は濃度である。
【００５７】
各重合体サンプルは、ｄｎ／ｄｃ、即ちサンプル濃度の単位変化当たりの溶液の屈折率の変化により表される屈折率増分を持つ。濃度プロフィールに屈折率増分ｄｎ／ｄｃを乗算することにより、図７における屈折率対溶液容量のプロット４０が与えられる。これは、ＲＩ検出器応答のシミュレーションである。
【００５８】
過剰レイリー比は、入射光の波長λが重合体連鎖のサイズに匹敵するかそれより大きいとき、重合体連鎖により散乱された入射光の割合を表す。強度Ｉｏの偏光されてない光の入射ビーム、低いサンプル濃度ｃ、低い散乱角θ及び小さい粒子サイズを仮定する。溶液の単位容量の中のサンプルが光をビームに関して方向θの方に散乱させると仮定する。サンプルにより散乱されかつ距離ｒで受け取られた光の強度のその部分Ｉ（θ）は、次式により与えられる。
【００５９】
【数１】
【００６０】
ここで、Ｋ*は、次式のように、数値的かつ物理的定数によって表される光学的定数である。
【００６１】
【数２】
【００６２】
ここで、ＮＡはアボガドロ数であり、ｎｏは溶媒の屈折率である。
装置のジオメトリーに依存するよう定義される過剰レイリー比は、次式により与えられる。
【００６３】
【数３】
【００６４】
従って、小さい角度においては、スライスｉに対して、式（１）は次式のようになる。
【００６５】
【数４】
式（４）Ｒi＝ｃiＭiＫ*
そのため、過剰レイリー比は、単純に、スライスの濃度ｃi、分子量Ｍi及び光学的定数Ｋ*の積である。
【００６６】
過剰レイリー比対溶出容量４２がまた図７に図示されている。レイリー比は、図６の濃度プロフィールにおける各スライスにＭiＫ*を乗算することにより得られる。これは、ＬＳ検出器により測定されたプロフィールのシミュレーションである。
【００６７】
比粘度ｓｐは、サンプルが粘度計の中に存在することに起因する粘度の部分的増分である。一定流量では、毛管Ｐの両端間の圧力降下は、毛管を流れる液体の粘度に比例する。Ｐｏが溶媒のみに起因する圧力降下である場合、溶液の中に重合体を含むスライスの比粘度ｓｐは、次式により定義される。
【００６８】
【数５】
【００６９】
ここで、Ｐは重合体プラス溶媒の溶液に起因する圧力降下である。この式は、ｓｐが重合体を溶媒に追加することにより生じた粘度の増大の尺度となることを示す。
【００７０】
各スライスは固有粘度［］を有する。固有粘度（ＩＶ）は、低い濃度の制限内においてスライスの比粘度ｓｐをその濃度ｃで除算した比として定義される。
【００７１】
【数６】
【００７２】
ＧＰＣ分離において、濃度は、スライスに対する固有粘度が次のようにスライス比であるよう取られる程十分低い。
【００７３】
【数７】
【００７４】
重合体の固有粘度は、その分子量と共に変わる。固有粘度法則（ＩＶＬ）は、サンプルの固有粘度の対数がその分子量の対数に依存することを表す。
分岐していない重合体に対して、ＩＶの対数は、一般に、連鎖の分子量の対数に比例する。経験的なマルク−ホウインク（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ）固有粘度法則は、この線形関係を次式のように表す。
【００７５】
【数８】
式（８）ｌｏｇ［η］i＝ｌｏｇＫ＋αｌｏｇＭi
この式は、マルク−ホウインク定数Ｋ及びαのパラメータにより表されている。
【００７６】
重合体は分岐することができる。ジム（Ｚｉｍｍ）及びストックメイヤー（Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒ）は、長い連鎖で分岐した重合体の物理的モデルを開発し、それは１９４９年、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１７、１３０１−１３１４頁においてＺｉｍｍ，Ｂ．及びＳｔｏｃｋｍｅｙｅｒ，Ｗ．により表され、それは本明細書に援用されている。この研究から出発して、長い連鎖の分岐している重合体に対する固有粘度を表すモデルが開発され、それはジム−ストックメイヤー（ＺＳ）法則と呼ばれる。
【００７７】
ＺＳ法則において、分布の固有粘度は、４つのパラメータＫ、α及びλにより表される。
ＺＳ法則は、低分子量で、重合体は本質的に分岐しないと仮定する。この体制においては、固有粘度法則は漸近的に直線である。低分子量での固有粘度法則の漸近的勾配は、マルク−ホウインク定数Ｋ及びαにより表される。
【００７８】
高分子量において、分岐が優勢であるとき、固有粘度法則の漸近的勾配は、αより小さく、（α−／２）により与えられ、それは重合体の形状係数である。それに対する値は、重合体／溶媒系により決定される。例えば、それは、ＴＣＢにおける分岐したポリエチレンに対してほぼ０．９である。それに対する値は、０．５から１．５までの範囲に分布する。
【００７９】
重合体が分岐する分子量は、分岐確率により表される確率的プロセスである。値λは、１ダルトン当たりの分岐確率として定義される。λに対する典型的な値は１ダルトン当たり０．００００１である。
【００８０】
各スライスｉに対するＺＳ法則の固有粘度は、そのスライスの分子量Ｍiの関数であり、パラメータＫ、α、λに依存し、次式のとおりである。
【００８１】
【数９】
【００８２】
ＺＳ法則は、２つの有り得るタイプの分岐した重合体、即ち、３分岐点及び４分岐点を表すため実施される。
３分岐点に対する係数はｃ１＝９／４及びｃ２＝７である。４分岐点に対する係数はｃ１＝３／４及びｃ２＝６である。図４は、ジム−ストックメイヤーＩＶ法則を図示する。３つの固有粘度法則がプロットされ、それらは、マルク−ホウインク法則３６、ジム−ストックメイヤー法則３７及び多項式法則３８である。
【００８３】
第３の固有粘度法則（多項式）は、単純に、多項拡張に基づくサンプルの固有粘度の経験的記述である。この「法則」は、次のようにマルク−ホウインク法則の拡張と見なすことができる。
【００８４】
【数１０】
【００８５】
ここで、Ｎは多項式の次数であり、Ｋ及びαはマルク−ホウインク定数である。
比粘度は、図６の濃度プロフィールにおける各スライスにそのスライスに対する固有粘度法則（ＩＶＬ）を乗算することによりシミュレートされる。そのスライスに対するＩＶは、図４にプロットされた、ＩＶＬ曲線３７から得られる。図７は、粘度計の検出器から得られるであろう比粘度対溶出容量のこのシミュレーション、即ちプロット４４をプロットする。
【００８６】
従って、図７は、図６に表された濃度プロフィールに対する装置応答に基づく検出器プロフィールを図示する。シミュレーションを完成させるため、検出器雑音の適当なレベルが、シミュレートされた各信号に対して加えられねばならない。図８は、各検出器応答に基線雑音を加えた後のプロフィールを図示する。ＲＩ検出器４０′、ＬＳ検出器４２′及びＶ検出器４４′の各応答が示されている。図７及び図８において、それぞれのプロフィールは、正規化され、プロットにおける明確さのため同じピーク高さを有する。
【００８７】
カラム・セット及び溶媒を所与のサンプルと共に含む、所与のクロマトグラフ・システムに対して、保持容量は、連鎖の分子量の単調減少関数である。ｌｏｇＭＷ対溶出容量のプロットは、サンプルに対する分子量較正と称される。
【００８８】
理想的には、この曲線は、それが全てのサンプルに対して適用するであろうという意味で汎用であろう。不都合にも、この曲線は、サンプルに依存（並びに、溶媒及びカラム・セットに依存）する。
【００８９】
所与のカラム、溶媒及びサンプルの組合わせからＭＷ較正曲線を決定する演繹的手段はない。実際に、ＭＷ較正曲線は、収集されたデータを採用する較正手順により決定されねばならない。
【００９０】
ＲＩ−ＬＳ検出に対するＭＷ較正の基礎は、各スライスに対するレイリー比、分子量及び濃度間の関係である。この関係は、ゼロ角度及び低サンプル濃度での拡散の限界においてのみ考慮される必要がある。この限界において、これらのパラメータ間の関係は、次式のとおりである。
【００９１】
【数１１】
【００９２】
より一般的なレイリー拡散法則は、拡散角度に関する過剰レイリー比、分子の回転半径、及び第２のビリアル係数への依存性を含む。本発明の方法は、このより単純な表現（式）か、又はより複雑な表現（式）かのいずれかに対して適用する。
【００９３】
式（１１）により表される関係の意味は、ＲＩ検出器及びＬＳ検出器の応答（曲線４０及び４２、又は４０′及び４２′）のみがサンプルの分子量較正曲線を得るため必要とされることである。
【００９４】
検出器雑音が存在しない場合、ＲＩ及びＬＳのプロフィールは、図７におけるように、雑音が無く、サンプルのＭＷ較正及びＭＷＤは、直接得られるであろう。式（１１）に続いて、各スライスｉに対して４２、即ちＲiのＬＳ応答は、４０、即ちそれぞれのＲＩ応答ｃiにより除算されるであろう。その結果生じる比をＫ*により除算することにより、そのスライスに対する分子量Ｍiの測定値が得られる。ｌｏｇＭi対溶出容量のプロットは、サンプルの分子量較正曲線を正確に決定し、それは、図５においてプロットされた曲線に正確に対応するであろう。ＲＩ応答により表される濃度分布４０と組み合わされて、図３に示されるシミュレートされた正確なＭＷＤが再生されるであろう。
【００９５】
検出器雑音が常にＲＩ及びＬＳのプロフィールに存在するので、先の方法は、ピークの中央領域においてのみ許容可能である結果を与えるであろう。図８に図示されている現実の状況を参照すると、各スライスｉに対して、４２′、即ち雑音に影響されたＬＳ応答Ｒiが４０′、即ちそれぞれの雑音に影響されたＲＩ応答ｃiで除算される。各スライス−比はＫ*で除算され、そしてｌｏｇＭi対溶出容量のプロットは、図９に４６としてプロットされている。
【００９６】
従って、図９は、式（１１）の直接適用を通して図８のＲＬ−ＳＬスライス・データから得られた分子量較正曲線４６を図示する。雑音の存在は、このｌｏｇＭの推定に影響を及ぼすのは明らかであり、そのｌｏｇＭは、ピークの端部領域における高い振幅を有して揺らぐ。
【００９７】
これらのスライスにより決定された数を、分布の端部におけるＭＷの推定として直接用いることは明らかな誤りであろう。例えば、分子量較正は、溶出容量が増加するにつれ単調に増加しなければならない。
【００９８】
従来技術においては、ＭＷＤを推定するため、用いられた手法は、各スライスに対して比の対数、
【００９９】
【数１２】
ｌｏｇＭi＝ｌｏｇ（Ｒi／（Ｋ*ｃi））
を最初形成することである。第２のステップは、低次の多項式曲線をｌｏｇＭi対溶出容量に適合させることである。適合された低次の多項式はこの分離に対するカラム・セットのＭＷ較正に対して正確に表すと仮定する。低次の多項式以外の他の滑らかな曲線を用いることができる。
【０１００】
従来技術において、最小２乗適合処置は次のとおり表されることができる。
【０１０１】
【数１３】
【０１０２】
ここで、右辺の左の項は、ＲＩ検出器応答とＬＳ検出器応答の組合わせから各スライスに対して推量された分子量である。右の項は、一例として用いられる多項モデルであり、その形状は、パラメータ値Ｐ０，…，ＰＭにより特定される。
ここで、その項は、
【０１０３】
【数１４】
【０１０４】
であり、値ｉは、溶出容量スライスの指標である。関数Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）は、スライスｉに対する分子量の対数である。従って、
【０１０５】
【数１５】
ｌｏｇＭi＝Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）
及びこの関係は、分子量較正曲線をスライスｉの関数として表す。
【０１０６】
記号Ｍは、本明細書において２つの意味で用いられている。スライスに言及するとき、Ｍ又はＭｉは、分子量を表す。しかし、多項モデル曲線に言及するとき、Ｍは、その展開式における最高次の指数であり、モデル曲線は、Ｍ＋１個の調整可能なパラメータＰ０，…，ＰＭにより特定されるであろう。汎用モデル曲線に言及するとき、Ｍは、そのモデル曲線を特定するため必要とされる調整可能なパラメータの最大数であり、従ってモデル曲線は、Ｐ１，…，ＰＭのパラメータにより表されるであろう。記号Ｐは、文脈に応じてパラメータＰ０，…，ＰＭ、又はＰ１，…，ＰＭの組を表すであろう。
【０１０７】
関数Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）は、独立のスライス指標ｉの関数として表される。Ｆは、そのような溶出容量又は溶出時間のような、スライス指標に比例する値によって等価的に表されることができる。
【０１０８】
式（１３）において、加算がスライスのｉ＝１からＮまで実行される。但し、Ｎはスライス数である。Ｍ＋１個のパラメータＰ０，…，ＰＭは、Ｘ32を最小化するＰ０，…，ＰＭのそれらの値を見つける適切な最適化アルゴリズムにより調整される。この手段により、モデル曲線を決定する最小２乗解法、
【０１０９】
【数１６】
【０１１０】
が、得られる。
ＲＩ−ＬＳ検出に対して、この最小２乗適合の定式化は、３つの周知の問題を有し、それらの全ては、ピークの端部で生じ、そして検出器の雑音がＲi及びｃiデータの中に存在するためである。最初の問題は、この雑音のため、Ｒi又はｃiが端部で負に揺らぐことがあり、そのため比が負であり得る。対数は、負の量に対して定義されない。第２に、項ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））において誘発される雑音は、対数がその独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔ）の線形関数でないので、平均値に関して対称でない。第３に、項ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））において誘発される雑音が、ピーク端部において大きくなる。
【０１１１】
従来技術において、これらの制限は、曲線
【０１１２】
【数１７】
【０１１３】
が適合される領域を限定することにより対処されてきた。適合領域は、一般的に、ピークの心臓部をまたがるよう選定されている。次いで、この適合からの結果は、端部へ外挿される。しかし、多項式モデルの外挿は、一般的に、信頼できない結果を与える。更に、多項式適合のための領域、及び外挿される領域を特定する仕方が明瞭でない。適合の結果は、この適合領域の選定に対して非常に敏感である。
【０１１４】
本発明に従った方法は、最尤法の理論に基づいており、その最尤法は、本明細書に援用されるＢ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ著「物理学者のための統計学（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉｓｔｓ）」（１９７１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋ）の８５−８９頁に記載されているように、多変量モデルにおけるパラメータの最適推定を与える。
【０１１５】
多変量曲線を、確率的雑音を含むデータに適合させることは、データの統計的分析における共通問題である。最尤法の理論は、バイアスされてなくかつデータの中の雑音に対して最小感度を有するパラメータ値を見つける仕方を示す。理論の一部は、後述のようにＲＩ−ＬＳ及びＲＩ−Ｖデータの分析に適用される。
【０１１６】
ＲＩ検出器、ＬＳ検出器及びＶ検出器の中の確率的雑音は、最も共通のタイプの装置雑音に対応し、その最も共通のタイプの装置雑音は、加法的であり、ゼロ平均を有し、そして標準偏差のパラメータにより表されるガウス分布により表される。これらの統計学により表される雑音に対して、重み付けされた最小２乗適合に基づく推定手順は一般的に最適である。
【０１１７】
本発明に従った重み付けされた最小２乗方法において、最初のステップは、１組のデータｄｉで始まり、そこでｉは１からＮまで移動し、但しＮは測定値の合計数である。そのデータは、モデルＤi（Ｐi，…，ＰM）で表され、ここでＭ個のパラメータＰは、モデル値Ｄｉを表す。モデル値Ｄｉは、データ値ｄｉを説明することができる多項式曲線のような関数から導出される。各データｄｉは、ゼロ平均で標準偏差σｉのガウス分布を有する雑音だけモデルから偏移する。
【０１１８】
パラメータＰの最適（雑音に対する感応が最小である）推定は、Ｘ2に対する以下の式を最小にするそれらのパラメータ値を見つけることにより得られる。
【０１１９】
【数１８】
【０１２０】
量2は、２組の量ｄとＤの差の関数である。量2は、２組の量ｄとＤの２点間の差の２乗の和である。加算における各項は、ｄに対する値とＤに対する値の２乗差であり、そしてそこにおいてこの差は、標準偏差σｉの２乗により重み付けされる。
【０１２１】
σｉに対する正しい推定を得るため、相対雑音値のみが重要である。例えば、全ての項は、同じ雑音分散を持つ場合、全ての項に対してσｉ＝１をセット（重み付けされない最小２乗）することは、パラメータに対して正しい値を依然生じるであろう。
【０１２２】
次いで、最小２乗適合は、量2を最小にするそれらのパラメータＰを見つけることにより実行される。量2を最小にするＰのそれらの値は、最小２乗の意味においてデータを最良に適合させるＤのモデルを表す。
【０１２３】
最小２乗適合が実行されるため、アルゴリズムを用いて、量2を最小にするパラメータＰ１，…，ＰＭを見つけなければならない。いずれの最小化手順におけるように、Ｐ１，…，ＰＭに対する最終値は、量2の中の最小が実際に見つけられる限り、最小化を実行するため採用されるアルゴリズムの詳細に依存しないであろう。
【０１２４】
一般的に、そのような最小化手順は、初期パラメータ値が見つけられ、かつ量2に対する初期値が計算されることを要求する。次いで、これらのパラメータは、量2の最小が見つけられるまで繰り返し調整される。
【０１２５】
以下に説明される量2の定式化において、初期パラメータ値の決定は、種々の標準方法により達成されることができる。そのような方法は、期待された最終パラメータ値の近似値を求めるため知られている値の手動推定、パラメータの典型的な値の採用、又は分析されるべきデータのサブセットから初期パラメータ値を決定する別個のアルゴリズムの実行を含む。
【０１２６】
以下に説明される定式化において、パラメータの後続の反復調整は、種々の標準偏差により達成されることができる。Ｎ個の変数の関数の最小を見つける方法は、ニュートン−レフソン（Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ）、レーベンベルグ−マルカッド（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｄｔ）、単体（ｓｉｍｐｌｅｘ）、勾配探索（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ）、及び力任せ探索（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）を含む。そのような反復調整手順は、本明細書に援用されている、Ｓ．Ａ．Ｔｅｕｋｏｌｓｋｙ、Ｗ．Ｔ．Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ及びＢ．Ｐ．Ｆｌａｎｎｅｒｙ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）著「Ｃ、科学的計算技術、第２版（Ｃ，ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（１９９２年、Ｗ．Ｈ．Ｐｒｅｓｓ発行）の３９４−４５５頁に記載されている。
【０１２７】
従来技術において、ＲＩ−ＬＳデータに対する最小２乗適合手順は、次のように表される。
【０１２８】
【数１９】
【０１２９】
量2に対する上記の式は、最小２乗最小化であり、それは、一瞥では最適推定の理論に基づいているように見える。しかしながら、そうではない。
従来技術において、データ・モデルは正しい。なぜなら、多項式
【０１３０】
【数２０】
【０１３１】
が一般的に分子較正曲線の適切な表示であるからである。しかし、雑音モデルは正しくない。
ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））における測定誤差は、非ガウス的（ｎｏｎ−Ｇａｕｓｓｉａｎ）であり、そしてゼロに関して非対称である。また、各項の雑音分散が異なるにも拘わらず、重み付け係数がない。
【０１３２】
従来技術の方法において、重み付けされない最小２乗は、パラメータの推定において、過剰雑音を含む項の影響を増大させかつ良好な信号対雑音を有する項の影響を低減する効果を有する。
【０１３３】
最小２乗モデル適合の全ての実行は、２組の量を比較しなければならない。式（１４）において、比較される量は、データ点ｄ及びデータ点Ｄのモデルである。ＲＬ−ＬＳ検出において、比較するための３組のスライス依存量が存在する。これらは、ＬＳ検出器により測定されたレイリー比Ｒi、ＲＩ検出器により測定された濃度ｃi、及びスライスの分子量対溶出容量に対するモデル
【０１３４】
【数２１】
【０１３５】
である。
最小２乗最小化の定式化の２つの連続的改良をここで説明する。最小２乗最小化の第２の定式化は、最適推定理論と一致する。全ての定式化は、従来技術におけるように、測定された同じデータ値、及びデータの同じパラメータ化されたモデルを用いるが、しかし最小２乗適合を実行する際に異なる量を比較する。異なる量を比較することは、雑音モデルに変化をもたらす。
【０１３６】
第１の改善は、式（１５）における両方の項を累乗化することにより対数を除去する。次いで、最小２乗比較が修正され、次のようになる。
【０１３７】
【数２２】
【０１３８】
この再構成は、対数に起因する偏りを除去し、Ｒiの負の値を含むことを可能にする。しかしながら、ｃiが分母にあるので、ピーク端部におけるｃiの小さい値は、この比に大きな揺らぎを生じさせるであろう。
【０１３９】
第２の改善は、両方の項にｃiを乗算して、比較するための新しい量に到達する。
【０１４０】
【数２３】
【０１４１】
この再構成は、ｃiに対する値が小さいことを可能にする。
濃度ｃi、光学的定数Ｋ*及び多項式モデルＦの積は、レイリー比Ｒiと比較される。Ｒi及びｃiの誤差がゼロ平均を有すると仮定され、かつガウス分布されるので、式（１８）の右辺の各項の誤差はまた、ゼロ平均でありかつガウス分布するであろう。
【０１４２】
式（１８）の定式化において、Ｒiに対する測定値がゼロと一致していてかつ実際に雑音に起因する負の値を有する点を含む、適合における全てのプロフィール・データを含むことができる。これは、分布の端部におけるデータを用いる問題を解決する。従って、上記式を用いて、端部を含む、ピーク領域全体にわたりデータに対して適合させることができる。
【０１４３】
ゼロに近いＲiに対して値を適合させることができることは、ＲＩ−ＳＬデータの適合において重要な利点を表す。ゼロに近いそのようなデータの包含は、モデル適合に制約を加えるのを助ける情報を加える。負に行く揺らぎの包含は、実際に、従来技術の方法で用いられなかった適合に対して有効な情報を与える。
【０１４４】
式（１８）におけるモデルＦiは、多項展開として表される。しかしながら、本発明は、この多項展開の代わりにいずれのパラメータ化された滑らかなモデル曲線を組み込むことができる。
【０１４５】
式（１８）は、重み付けされない最小２乗に対応する。一般的に、ＲＬ−ＬＳシステムにおいて、ＲＩ測定値の中の雑音は、ＲＩプロフィールにおけるピーク先端の信号対雑音比（ＳＮＲ）がＬＳプロフィールのピーク先端におけるＳＮＲより高いという意味でＬＳ測定値の中の雑音より小さい。ＬＳ測定値のみが雑音が多く、かつＲＩ測定値が本質的に無視し得る雑音を有すると仮定される場合、重み付けされない最小２乗は、パラメータＰの最適かつ最尤推定を生じる。
【０１４６】
図１０は、シミュレートされた分離に対するｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））対各スライス番号を曲線５０としてプロットする。モデル
【０１４７】
【数２４】
【０１４８】
を計算した２つの異なる方法が、スライス・データ上に重ね合わされている。１つは、式（１８）の最小２乗定式化においてｘ2を最小にすることによるもので、曲線５２を与える。他方は、式（１５）の最小２乗定式化においてｘ2を最小にすることによるもので、曲線５４を与える。曲線５６は、図５にプロットされた曲線５６の中央部分に対応する真のｌｏｇＭ較正曲線である。例示的方法により生成された曲線適合は、分布の端部での雑音に無感応である。従来技術の方法により生成された曲線適合は、分布の端部で雑音が優勢である。
【０１４９】
測定された量ｃiは、雑音を含むものである。注目したように、最小２乗定式化は、次のようにそれを含むよう一般化することができる。
【０１５０】
【数２５】
【０１５１】
ここで、ｉは次のように両方の項からの分散を考慮することができる。
【０１５２】
【数２６】
【０１５３】
ここで、ｉ及びｉは、ＬＳ検出器及びＲＩ検出器と関連した誤差の標準偏差である。括弧の中の項は、これらの雑音源の相対的寄与を調整し、それによりそれらは、分子の分散に一致する。ここで、σｉに対する値は、ＬＳ検出器及びＲＩ検出器における組み合わされた誤差を表す。この定式化は、正確に、パラメータＰ０，…，ＰＭの最適推定を与えかつ最尤理論に一致する定式化である。
【０１５４】
たとえｃiが著しい雑音を含んでいても、重み付けされない最小２乗、即ち式（１８）を依然用いることができる。重み付けされない最小２乗を用いる場合、適合の中の全てのデータは、依然含まれることができる。パラメータ値の推定は、依然偏移されていない。重み付け関数の省略は、プロフィールにおける検出器雑音の存在に対してやや増大した感度をもたらすであろう。
【０１５５】
式（１８）における量の追加の再構成は、最小２乗定式化が
【０１５６】
【数２７】
【０１５７】
を比較するように実行されることができる。ＲＩ測定値の中の雑音がＬＳ測定値の中の雑音より大きいとき、この再構成は、重み付けされない最小２乗を用いて、パラメータＰの最適推定を与える。
【０１５８】
次に考慮すべきことは、屈折率検出器及び粘度計（ＲＩ−Ｖ）による検出である。ＲＩ−Ｖ検出の目的は、サンプルのＭＷＤ及びそのＩＶＬを決定することである。これらの決定は、両方とも汎用較正の仮定を利用する。
【０１５９】
サンプルのＭＷＤを決定するため、我々は、最初に、サンプルの分子量較正曲線、即ち分子量の対数であるｌｏｇＭi対スライス番号又は溶出容量を決定しなければならない。サンプルのＩＶＬ、即ちｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiを決定するため、我々は、最初に、ｌｏｇ［］i即ち固有粘度対溶出容量を決定しなければならない。ｌｏｇ［］iをｌｏｇＭiと組み合わせることにより、サンプルの固有粘度法則が与えられる。
【０１６０】
粘度計はサンプルの比粘度を決定し、そしてＲＩ検出器は各スライスにおけるサンプルの濃度を決定する。スライスの固有粘度は、その比粘度のその濃度に対する比である。固有粘度は、広いサンプル分布における各スライスに対して次のように計算される。
【０１６１】
【数２８】
式（２１） ［η］i＝ηsp,i／ｃi
ここで、下つき文字ｉはｉ番目のデータ・スライスを意味し、そして［］iはスライスｉの固有粘度であり、ｓｐ，ｉは比粘度であり、ｃiはスライスの濃度である。
【０１６２】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分離において、その分離は、重合体連鎖とクロマトグラフ・ベッドとの間のサイズに依存するが質量に依存しない相互作用による影響を受ける。Ｂｅｎｏｉｔ［Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰａｒｔＢ，５，７５３（１９６７年）の中のＺ．Ｇｒｕｂｉｓｔｉｃ、Ｒ．Ｒｅｍｐｐ及びＨ．Ｂｅｎｏｉｔ論文（これは本明細書に援用されている。）］により導入された汎用較正（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の仮定は、連鎖の溶出容量は連鎖の流体力学容量にのみ依存するということである。流体力学容量は、化学種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の分子量にその固有粘度を掛けた積であるよう定義される。スライス量に関して表すと、この関係は次のとおりである。
【０１６３】
【数２９】
式（２２） Ｈi＝Ｍi［ηi］
この定義の物理的重要さは、固有粘度の定義を代用して次式を得ることにより認められることができる。
【０１６４】
【数３０】
【０１６５】
それは、分子の化学種の数密度である。従って、流体力学容量は、固有粘度とは対照的に、連鎖当たりの粘度を測定する。なお、固有粘度は、単位濃度当たりの粘度を測定する。
【０１６６】
各スライスに対する流体力学容量は、既知の分子量の狭い重合体標準の使用により得られる。ＲＩ−Ｖ検出は、各標準に対する流体力学容量を決定する。標準の流体力学容量対溶出容量をプロットすることができ、そして重合体曲線がこのデータに適合され、流体力学容量較正曲線を決定する。この曲線は、狭い標準により架けられた（ｓｐａｎｎｅｄ）各スライス又は溶出容量に対するカラムの流体力学容量を与える。この曲線は、カラム・セットの汎用較正か、又は流体力学容量較正曲線かのいずれかと称される。
【０１６７】
汎用較正の仮定は、粘度計及びＲＩ検出器から得られた応答を用いて、サンプルの分布の絶対分子量分布を計算する方法に導く。汎用較正曲線（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）からの各スライスに対する流体力学容量、及び各スライスから得られた固有粘度の値が与えられると、我々は、単純に上記定義から各スライスの分子量を計算することができる。
【０１６８】
【数３１】
【０１６９】
ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiを決定するための式（２１）及び式（２４）の直接的適用は、ピーク先端上に中心付けされたピークのその部分に対してのみ可能である。光散乱のケースにおけるように、これらの量の中の雑音は、ピーク端部で著しく増大する。それは、量ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiは双方、量ｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に依存し、それは雑音の影響を受けた検出器応答の対数を取ることを要するからである。
【０１７０】
特に、式（２４）の比からの分子量の計算は、通常、分布の端部で物理的に意味のある値を生成しないであろう。即ち、スライス比から計算された分子量に対する値は、溶出容量の増大と共に単調に低減しないであろう。プロフィールの開始点及び終了点の近くで、それらは、各スライスに対する［］iの計算における検出器雑音の影響のため負となるよう計算することができる。
【０１７１】
しかしながら、ｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iの双方は、ピーク端部を含む、ピーク領域全体にわたって測定されることが必要である。再び、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるように、これは、通常、パラメータ化された滑らかなモデルをｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iに対してスライス番号の関数又は溶出容量の関数として適合させることにより達成される。量ｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iの双方が溶出容量のほぼ線形関数である傾向であるので、溶出容量の関数としての低次の多項式は、通常これらの量に適合される。
【０１７２】
従来技術の操作のデータ分析が、各スライスに対して測定された固有粘度の対数対溶出容量のためのモデル曲線を決定する方法がここで説明される。次の形式の式が用いられる。
【０１７３】
【数３２】
【０１７４】
ここで、ｌｏｇ［］iは、固有粘度をスライスｉ及びＭ個のパラメータＰ０，…，ＰＭの関数として表すモデル曲線であり、従って次式のとおりである。
【０１７５】
【数３３】
【０１７６】
パラメータＰ０，…，ＰＭは、量2に対する値を最小にするよう調整される。典型的には、
【０１７７】
【数３４】
ｌｏｇ［］i＝ｌｏｇ［（；Ｐ０，…，ＰＭ）］
に対する形式は、低次の多項式であり、従って次式のとおりである。
【０１７８】
【数３５】
【０１７９】
しかしながら、本発明は、この多項展開の代わりにいずれのパラメータ化された滑らかなモデル曲線を組み込むことができる。
加算における各項は、スライス値の対数とモデル曲線から得られた固有粘度との間の比較である。この最小化は、固有粘度対スライス番号又は溶出容量を表すパラメータの推定値を得る。
【０１８０】
このモデル曲線を適合させる際に、ＲＬ−ＬＳ分析において扱われたのと同じ問題に直面する。再び、低次の多項式が、雑音の影響を受けた検出器応答の比の対数に適合される。ｌｏｇ（ｓｐ，／ｃi）における雑音は端部で著しく増大し、そして負の量の対数は定義されない。端部での検出器雑音の影響のため、この方法は、ピークの心臓部のみに適用することができる。モデルが適合される領域間の境界画定を決定することはユーザ次第である。従来技術において、ピーク端部における固有粘度法則は、このモデルからの外挿により得られる。
【０１８１】
固有粘度対スライス番号を見つけるための実施形態において、本発明は、各スライスに対する比粘度の測定された値に対して比粘度のモデルをスライス番号又は溶出値の関数として適合させることにより最小２乗最小化を再定式化する。従って、最小化されるべき量2は次式のとおりである。
【０１８２】
【数３６】
【０１８３】
再び、ＩＶ曲線のためのモデルは式（２６）の形式である。この式は、ｓｐ，ｉを積［］iｃiと比較することにより最小２乗最小化を実行する。特に、この式は、固有粘度法則に対し、各スライスに対して、各スライスにおける被測定濃度の積に対する各スライスの被測定比粘度をモデル又は適合タイプと比較する。
【０１８４】
この式に到達すると、正確に同じ論理が、光散乱に対して行われたように最小２乗式を再定式化するのに用いられる。対数は指数化され、そして各項はｃiにより乗算される。
【０１８５】
ｃiにおける雑音が最小である場合、式（２８）における重み付けされない式は、パラメータＰｉに対して最適推定を与える。測定されたスライス値ｃiがかなりの雑音を含む場合、好適な式は次のとおりである。
【０１８６】
【数３７】
【０１８７】
この式はまた最尤理論に合致する。
これらの式の利点は、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるのと同じである。分子の中の量ηsp,i−［η］iｃiの中の雑音は、ピーク・プロフィール全体にわたりほぼ一定である。対照的に、量
【０１８８】
【数３８】
【０１８９】
の中の雑音は、ピーク端部において大きい。再び、この新しい方法は、ピーク全体にわたり、即ちピークの心臓部及びピーク端部における分布の固有粘度を決定することができる。
【０１９０】
一旦ｌｏｇ［］ｉに対するモデルが決定されると、ピーク全体にわたる各スライスに対する分子量は、式（２４）から決定されることができる。各スライスに対して、式（２４）が用いられ、式（２８）又は式（２９）を介して、本発明のモデル適合から得られる固有粘度に対する、汎用較正曲線から得られる流体力学容量の比としてＭｉを表す。式（２４）の両方のＨｉ及び［］ｉが滑らかなモデルから導出されるので、Ｍｉに対するその結果生じた値もまた、検出器応答の中の雑音による影響を著しくは受けないであろう。
【０１９１】
本発明は、ＲＩ−Ｖシステムにより得られたデータの分析からＭiの代替の決定を可能にする。この実施形態は、再び、各スライスに対して、比粘度のモデルを、スライス番号又は溶出容量の関数として、比粘度の被測定値に対して適合させる最小２乗最小化を採用する。しかし、ここで、比粘度のモデルは、各スライスに対するスライス値ｃi、流体力学容量Ｈi及び対数分子量に対するモデルに依存する。最小化されるべき量2は、次式のものである。
【０１９２】
【数３９】
【０１９３】
ここで、再び、ｌｏｇＭiはパラメータ化された滑らかなモデルにより表され、それは、典型的には、次のように、低次の多項式である。
【０１９４】
【数４０】
【０１９５】
再び、式（３０）の利点は、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるのと同じである。再び、重み付け関数は、適当な場合この定式化の中に組み込まれることができ、これらの定式化は、最適推定の理論と一致する。
【０１９６】
一旦分子量対スライス番号に対するモデルが得られると、サンプルのＭＷＤを見つけることができる。一旦分子量対スライス番号に対するモデルが得られ、かつ固有粘度対スライス番号に対するモデルが見つけられると、固有粘度法則、即ちｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiが分かる。
【０１９７】
次いで、固有粘度に対する物理的に動機づけられたモデルは、ｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するモデル値に適合されることができる。そのようなモデルの例は、マルク−ホウインク法則及びジム−ストックメイヤー法則、即ち式（８）及び式（９）である。そのような法則をｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するモデル値に適合させる利点は、これらのモデルを表すパラメータが調査中の重合体サンプルを有効に特徴付けることである。例えば、マルク−ホウインク・モデルは、分岐された重合体の低分子量領域の一部に適合されて、その領域に対するＫ及びαを得ることができる。ジム−ストックメイヤー（ＺＳ）モデルは、ｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するスライス値に対して、分岐された重合体の完全なピークにわたり適合されて、低分子量領域に対するＫ及びα、並びに重合体サンプルに対する分岐確率α及び形状係数を得ることができる。
【０１９８】
たとえ本発明の適用が従来技術の方法と比較してｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対する改善した値を生成するにしても、固有粘度法則の物理的パラメータの決定は、これらの方法における残りの欠点を蒙ることがある。固有粘度法則を表すパラメータに対する値は、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiの両方対スライス溶出容量を表すため仮定されたモデルの形式に依存する。これらの多項式（又は他の仮定された）モデルが、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭi対溶出容量の依存性を表すのに不正確である場合、固有粘度法則を表すパラメータの精度は、対応した不正確さを蒙るであろう。
【０１９９】
この不正確さの原因は検出器雑音のためでない。むしろ、それは、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭi対スライス溶出容量を表すため用いられたモデル曲線の形式における誤差から生じている。これらのモデルがカラムに対する分子量較正曲線並びに重合体の固有特性を説明しなければならないということに注目することは価値がある。
【０２００】
本発明の次の実施形態は、データ分析領域の全体にわたり同時に２つの関係を解決することにより固有粘度法則のパラメータを決定する方へ指向している。この方法において、ＩＶ法則は、スライス・データから直接決定され、追加の補助的モデルの仮定を必要としない。
【０２０１】
解決されるべき２つの関係は、次のとおりである。
１．被測定比粘度の比粘度予測値との最小２乗比較であって、それは固有粘度モデル法則と濃度のスライス測定値との積である。最小２乗比較は、次のとおりである。
【０２０２】
【数４１】
【０２０３】
ここで、χ2は、各スライスに対して計算された差の２乗の和である。この式において、固有粘度法則は分子量の対数の関数であり、固有粘度の形式は次のとおりである。
【０２０４】
【数４２】
【０２０５】
ＭＷ較正がここでは分からないので、この式の最小は、追加の情報なしに見つけることができない。この追加の情報は、解決されるべき第２の関係により与えられ、それは次のものである。
【０２０６】
２．各スライスｉに対する、流体力学容量、固有粘度及び分子量間の基本的関係。
【０２０７】
【数４３】
式（３４） Ｈi≡Ｍi［η］i
再び、固有粘度法則は式（３３）により表される。
【０２０８】
式（３４）を用いて、式（３３）におけるＭiの依存性、即ちサンプルのＩＶＬを排除する。従って、ＩＶＬの明示的形式が与えられる場合、本発明の重要な部分は、ＩＶＬを再度表すことを含み、それにより［］iは、パラメータＰ１，…，ＰＭ及び流体力学容量Ｈiのみに依存する。
【０２０９】
この代数的置換は、以下の線形ＩＶＬのケースにおいて明示的に証明されるであろう。式（９）及び式（１０）において表されるような、より複雑なＩＶＬのケースにおいて、単純な代数的置換は、［］iをＨiの関数として閉じた形式で決定するのに十分でない。式（３３）、Ｐ１，…，ＰＭ及びＨiに対する値が与えられる場合、式（３４）は、数値的方法を用いて解けて、［］iに対する値を与えることができる。これらの数値的方法（根決定による式の解法）は、本明細書に援用されているＳ．Ａ．Ｔｅｕｋｏｌｓｋｙ、Ｗ．Ｔ．Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ及びＢ．Ｐ．Ｆｌａｎｎｅｒｙ（Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）著「Ｃ、科学計算技術における数値レシピ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ，Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）」（第２版）（１９９２年、Ｗ．Ｈ．Ｐｒｅｓｓ発行）の３４７〜３９３頁に記載されている。
【０２１０】
従って、式（３２）は、ここで被測定量ｓｐ，ｉ、ｃi、Ｈi及びパラメータＰ１，…，ＰＭのみに明示的に依存する。式（３２）の最終公式においてｌｏｇＭを明示的に参照しない。また、従来技術とは対照的に、溶出容量を独立変数として参照してない。従って、ＩＶＬのパラメータは、被測定検出器応答に対する単一の適合により決定される。
【０２１１】
最小化後に、各スライスに対して［］ｉに対する適合された値が得られる。この値、及びＨi及びＭiに対する既知の値は、基本的関係、即ち
【０２１２】
【数４４】
Ｈi≡Ｍi［η］i
からの直接計算から決定される。それにより、サンプルのＭＷＤが得られる。再び、追加の適合が要求されない。
【０２１３】
図１１は、外挿に依拠する従来技術方法により決定されるＩＶ法則、及び本発明の例示的方法により決定されるＩＶ法則をプロットする。４つの曲線、即ち、スライスから決定されたＩＶ法則６０、本発明の例示的方法から決定されたＩＶ法則６２、従来技術の方法により決定されたＩＶ法則６４、及び図３における基準に対するサンプルのＭＷＤ ３５が重ねられている。
【０２１４】
光散乱のケースにおけるように、最小２乗問題は、ここで、雑音の多いデータの比の比又は対数を取ることを避けるため、定式化される。各項における雑音が同じ大きさであり、そのため重み付けされない最小２乗の使用は適切である。適合は、ピーク領域における基線を訂正されたデータの全てに対して実行されることができる。被測定値ｓｐ，ｉ及びｃiは、ゼロ近くであり、そしてこれらの応答をゼロの周りで揺らぐようにさせる雑音を含み得る。
【０２１５】
量2の定式化のための本発明において、ゼロ応答と一致する測定値の包含は、Ｋ及びαのようなＩＶＬを表すパラメータに関する制約を改善する。従って、本発明は、特にピークの端部において、測定誤差に対してかなり敏感でない。
【０２１６】
更に、２つの式を同時に適合させる利点は、ＩＶ法則及び分子量較正が全てのスライス・データに対する単一の適合から推定されることを意味する。複数の適合及び外挿の実行はもはや必要でない。従来技術において、追加の適合は、特別のカラム依存の適合タイプが仮定されねばならなかったので、系統的誤差の潜在的原因である。
【０２１７】
ＩＶ法則が線形であるケースにおいて、式（８）
【０２１８】
【数４５】
ｌｏｇ［η］＝ｌｏｇＫ＋αｌｏｇＭ
は、
【０２１９】
【数４６】
［η］＝ＫＭα
と再び表される。そこで、流体力学容量と分子量との関係は、
【０２２０】
【数４７】
Ｈ＝ＫＭα+1
である。
【０２２１】
従って、我々は、Ｍiを排除し、ＩＶＬを次のとおり表す。
【０２２２】
【数４８】
【０２２３】
次いで、最小化されるべき式は次のとおりである。
【０２２４】
【数４９】
【０２２５】
この最終の形式において、量2は、被測定スライス値ｓｐ，ｉ、Ｈi及びｃi、及びパラメータＫ及びαのみで表される。溶出容量に対する明示的参照はなされない。
【０２２６】
量2を最小化するＫ及びαの値が、ある適当な最小化アルゴリズムにより見つけられると仮定すると、各スライスの分子量は、次の関係
【０２２７】
【数５０】
Ｍi＝（Ｈi／Ｋ）1/(1+α)
から得られ、そしてスライスに対して［］iのためのモデル値が、式（３５）から得られる。
【０２２８】
例示的実施形態において、本発明は、式（８）、式（９）及び式（１０）に表される定式化を用いて実行され、それらの式は、対数の固有粘度法則に対する３つの適合タイプを定義する。分子量の対数の線形関数、長い連鎖分岐を表すジム−ストックメイヤー法則、及びより高次の多項式関数が存在する。
【０２２９】
図１２は、以下に詳細に説明されるような本発明の例示的実施形態により実行されるステップを図示する。第１の検出器から得られるデータ１００（例えば、濃度検出器からのスライス・データ）は、サンプル特性を表すパラメータ化されたモデル曲線１０３と組み合わされて、モデル曲線を構成する（ステップ１０４）。データ１０２は、第２の検出器から得られる（例えば、分子量に感応する検出器からのスライス・データ）。最小２乗最小化アルゴリズムが、実行される（ステップ１０８）。最小２乗最小化アルゴリズムの詳細が以下に記載される。その結果は、最適化モデル曲線及びパラメータである（ステップ１１０）。
【０２３０】
図１３は、以下に詳細に説明されるようにＲＩ−ＬＳ検出からサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）を推定する、一実施形態のためのステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータは処理され、スライスの濃度を得る（ステップ１０５）。ｌｏｇＭ対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル（式（１３））１０３ａは、濃度スライス１０５と共に用いられて、次の式によりスライスのレイリー比を表すモデル曲線を構成する（ステップ１０４ａ）。
【０２３１】
【数５１】
【０２３２】
（ＬＳ検出器のような）分子量感応検出器１８ｂからの第２のデータが、スライスの中に処理され、そしてレイリー比が、各スライスに対して決定される（ステップ１１２）。最小２乗最小化アルゴリズムが、式（１８）又は式（１９）を用いて実行され（ステップ１０８）、図１０における曲線５２により示されるように、ｌｏｇＭ対溶出容量を表す最適化モデル曲線をもたらす。次いで、サンプルの分子量分布が生成される（図１３のステップ１２０）。
【０２３３】
図１４は、以下に詳細に説明される、サンプル固有粘度をＲＩ−Ｖ検出から推定する実施形態のためのステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータはスライスの濃度として処理される（ステップ１０５）。ｌｏｇ［］対溶出容量（式（２７））を表すパラメータ化されたモデル１０３ｂを濃度スライス１０５と共に用いて、スライスの比粘度を表すモデル曲線を次式によりステップ１０４ｂにおいて構成する。
【０２３４】
【数５２】
【０２３５】
粘度検出器１８ｃからの第２のデータは、スライスに対する比粘度を用いて処理される（ステップ１１６）。最小２乗最小化が、式（２８）又は式（２９）を用いて実行される（ステップ１０８）。ｌｏｇ［］対溶出容量（式（２７））の最適化モデルが生成される（ステップ１１０ｂ）。
【０２３６】
図１５は、以下に詳細に説明される、本発明に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度及び分子量分布を同時に推定する別の実施形態に従って実行されるステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータは、スライスの濃度として処理される（ステップ１０５）。ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭ（ＩＶＬ）を表すパラメータ化されたモデル１０３ｃ、式（３３）をスライスの濃度と共に用いて、初期モデル曲線を構成する（ステップ１０４ｃ）。また、モデル曲線を構成するため、汎用較正曲線から得られたスライスの流体力学容量が用いられる（ステップ１１９）。ステップ１０４ｃで生成された初期モデル曲線は、スライス・データの固有粘度を表す制約を含む。
【０２３７】
粘度検出器１８ｃからの第２のデータが処理され、スライスに対する比粘度を得る（ステップ１１６）。最小２乗最小化（ステップ１０８）が、構成された初期モデル曲線１０４ｃ、及びスライス・データの比粘度１１６に関して実行される（式（３２））。ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表すモデル曲線が、生成される（ステップ１１０ｃ）（式（３３））。この曲線１１０ｃから、ｌｏｇＭ対溶出容量を表すモデル曲線が、
【０２３８】
【数５３】
式（３９） ｌｏｇＭi＝ｌｏｇＨi−ｌｏｇ［η］i
に従って生成され（ステップ１１０ａ）、次いでサンプルの分子量分布が生成される（ステップ１２０）。最後に、また曲線１１０ｃから、ｌｏｇ［］対溶出容量のモデル曲線が生成される（ステップ１１０ｂ）。
【０２３９】
図１６は、図１２から図１５の最小２乗最小化ステップをより詳細に図示する。（濃度検出器１８ａからのスライス・データから生成された）初期モデル曲線１０４は、式（１８）、（１９）、（２８）、（２９）、（３０）、（３２）及び（３６）を含む複数の式を用いて量2を計算ことにより、検出器１８ｂからのスライス・データ１０２と比較される。前述したように、モデル・パラメータは、調整され（ステップ１２６）、そして量2は、再び、その量2が最小化されるまで計算される（ステップ１２４）。この点で、最適化モデル曲線及び最適化モデル・パラメータが決定される（ステップ１１０）。
【０２４０】
ＲＩ検出器、Ｖ検出器及びＬＳ検出器の特定の例が本明細書において記載されたが、他のモデルのような、及び／又は他の製造業者からの他の検出器を実施できることが認められるであろう。
【０２４１】
本発明は、その例示的実施形態に関して示されかつ説明されたが、種々の他の変形、省略、及び追加がその形式及び細部において本発明の趣旨及び範囲から離れることなくなし得るであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明を含むシステムにより分析されるべきデータを与えるゲル透過クロマトグラフィー・システムの全体図である。
【図２】 図２は、本発明に従った、データを分析する例示的コンピュータ・システムである。
【図３】 図３は、質量がカラム上に注入された場合のサンプルのシミュレートされたＭＷＤであってｄｍ／ｄ（ｌｏｇＭ）を与えるため正規化されたＭＷＤのグラフ、即ちＭＷの単位対数間隔当たりの質量のグラフである。
【図４】 図４は、３つの固有粘度法則のプロットを示すグラフである。
【図５】 図５は、サンプル分子量較正曲線である。
【図６】 図６は、サンプル濃度対溶出容量を示すグラフである。
【図７】 図７は、図６に示される濃度プロフィールに対する計器応答に基づく検出器プロフィールを図示する。
【図８】 図８は、検出器雑音を含む、図７の検出器応答を図示する。
【図９】 図９は、スライス・データ対溶出容量から得られた分子量較正曲線を図示する。
【図１０】 図１０は、例示的実施形態から得られた分子量較正を従来技術の方法と比較して図示する。
【図１１】 図１１は、例示的実施形態に従ったＲＩ−Ｖ検出から決定されたサンプルのＩＶ法則を従来技術の方法と比較して示す。
【図１２】 図１２は、本発明の一実施形態に従って実行されるステップの全体図である。
【図１３】 図１３は、図１２の実施形態に従ったＲＩ−ＬＳ検出からサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）を推定するため実行されるステップの全体図である。
【図１４】 図１４は、図１２の実施形態に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度対溶出容量を推定するため実行されるステップの全体図である。
【図１５】 図１５は、本発明に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度法則及び分子量分布を推定するための別の実施形態に従って実行されるステップの全体図である。
【図１６】 図１６は、図１２から図１５に示される実施形態により利用される最小２乗適合ステップの全体図である。
発明の分野
本発明は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）計装装置からのデータの分析に関し、詳細には、データを分析して絶対分子量及び固有粘度を決定するコンピュータ・システム及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
合成重合体の分子構造は、その最終用途、及び、硬度、引張り強さ、絞り性（ｄｒａｗａｂｉｌｉｔｙ）、弾性係数及び溶融粘度のような、そのプロセス特性を決定する。合成重合体の分子構造を規定する最も重要な決定要素は、それらの繰り返し単位、それらの分子量分布（ＭＷＤ）及びそれらの分子トポロジー（分岐化）の化学的性質である。
【０００３】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による重合体サンプルの分離及びそれに続く検出は、人が高分子サンプルの分子量分布（ＭＷＤ）及び固有粘度法則（ＩＶＬ）を決定するのを可能にする。ＩＶＬは、サンプルの分岐特性を明らかにすることができる。ＧＰＣに対して用いられる別の用語は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）システムである。
【０００４】
ＧＰＣ分離において、本質的にその分子量ではなく分子の実効サイズが、その溶出容量を決定する。例えば、２つの重合体は、同じ分子量を有し得るが、しかし組成又は分岐トポロジーにおいて異なり得る。そのような相違は、異なる溶出容量を導くことができる。こうして、溶出容量は、単独で、サンプルの分子量分布を絶対的意味ではなく相対的な意味で決定する。
【０００５】
分離に続いて、１つ以上の検出器は、溶離剤の流れの物理的特性を記録する。それはこれらのデータの数学的分析であり、その数学的分析からサンプルのＭＷＤ及びＩＶＬを得ることができる。
【０００６】
既知の分子量（ＭＷ）の狭い標準、即ち分子の中の全ての原子の原子量の和が利用可能であり、かつこれらの標準がサンプルと同じ重合体材料であるとき、分子量較正は、直接実行すべきである。狭い標準の注入は、クロマトグラフィー・カラム・セットのＭＷ較正曲線（ｌｏｇＭＷ対溶出容量）を決定する。これらの状況の下で、（屈折率（ＲＩ）検出器のような）単一の濃度検出器のみがＭＷＤを決定することが必要とされる。
【０００７】
そのような標準が利用可能でない場合、二重検出手法が、サンプルのＭＷＤを検出するのに用いられることができる。第１の典型的な二重検出システムは、屈折率（ＲＩ）及び光散乱（ＬＳ）検出を用いる。第２の既知のシステムは、ＲＩ及び粘性（Ｖ）検出を用いる。そのような双方のシステムからのデータを用いて、サンプルのＭＷＤを決定することができる。
【０００８】
ＲＩ−Ｖ検出システムは、その固有粘度法則（ＩＶＬ）のプロットを通して重合体の分子トポロジーの追加の決定を可能にする。サンプルのＩＶＬは、その分子量の関数としてのその固有粘度である。固有粘度は、サンプルの比粘度（粘度計により測定される）のその濃度（濃度検出器により測定される）に対する比である。
【０００９】
ＲＩ−Ｖ検出のケースにおいては、重合体較正標準は、ＭＷＤ及びＩＶＬを決定するため必要とされるが、繰り返し単位は、重合体サンプルの化学的性質と同じ化学的性質を有することを必要とする。ＲＩ−ＬＳ検出方法は、追加の較正標準を必要としない。
【００１０】
両方のシステムに対して、ＲＩ検出器は、ピーク濃度プロフィールを測定するため用いられる。ＲＩ検出器の代わりに、適切に較正されたＵＶ／Ｖの吸光度検出器、気化光散乱検出器（ＥＶＳ）、又は赤外線（ＩＲ）検出器が同じ機能を実行するため代用され得る。
【００１１】
ＬＳ及びＶ検出器は、通常「分子量感応」検出器と呼ばれる。そのような検出器は、サンプルの濃度と、その分子量をある数でべき乗したものとの積に応答する。
【００１２】
濃度検出器と分子量感応検出器の組合わせは、典型的な分析から利用可能な情報内容を著しく増大させる。しかし、その利用可能な情報の増大は、データ分析の複雑さを拡大する。両方のシステムに対して、アルゴリズム方法は、サンプルのＭＷＤを得るため検出器応答を分析するのに必要とされる。ＲＩ−Ｖシステムにおいて、追加のアルゴリズム方法は、サンプルのＩＶＬを決定するため必要とされる。
【００１３】
ＭＷＤ及びＩＶＬの正確さ及び精度は、それぞれのクロマトグラフィー・システムから得られるデータの質に依存するばかりでなく、またデータ分析方法論の詳細にも依存する。こうして、データ分析方法は、重合体のＧＰＣ分析における本質的要素となる。
【００１４】
等分に離間した時間間隔で、分離されたサンプルがカラムから溶出し、検出器の流れセルを通るとき、各検出器は、分離されたサンプルの特性の測定値を記録する。狭い時間領域にわたり平均化された各測定値は、サンプルの分子量分布における狭い領域に対応する。単一の時間間隔に記録された測定値に対応する分子量領域は、「スライス（ｓｌｉｃｅ）」と呼ばれる。
【００１５】
スライスは、そのスライス番号、その溶出時間、又はその溶出容量により参照され得る。典型的には、溶出容量は、スライスの溶出時間にポンプの公称流量を乗算することにより得られる。特定のスライスは、通常、一般性を失うことなく、そのスライス番号又は溶出容量により言及される。
【００１６】
ＲＩ検出器、ＬＳ検出器及びＶ検出器を用いてそれぞれ、各スライスｉに対して濃度ｃi、レイリー比Ｒi及び比粘度ｓｐ，ｉを測定する。
１対のクロマトグラフ・プロフィールが２つの検出器から得られる場合、それぞれの応答の比が有用な量を得るため形成されることができる。例えば、ｃi及びＲiがｉ番目のスライスから濃度及びレイリー比の測定値である場合、比ｉ＝Ｒi／ｃiは、そのスライスの分子量に比例する。ｃi及びｓｐ，ｉが濃度及び比粘度のスライス測定値である場合、比［］ｉ＝ｓｐ，ｉ／ｃiは、スライスの固有粘度に等しい。
【００１７】
ＭＷＤ及びＩＶＬの双方は、ピーク領域全体にわたり測定されることが必要である。典型的には、これは、これらの比に対して、パラメータ化された滑らかなモデルをスライス番号又は溶出容量の関数として適合させることにより達成される。比の対数ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）の双方は溶出容量のほぼ線形関数である傾向をもち、そこで溶出容量の関数としての低次多項式は通常これらの量に適合される。
【００１８】
主要問題は、検出器応答の中に存在する雑音がスライス測定値から計算された量の中に誤差を導入することである。ＧＰＣに用いられる既知の各検出器は、非理想的性質をそれらの応答の中に含む。典型的には、これらの非理想的性質は、２つのカテゴリー、即ち基線ドリフト及び確率的検出器雑音に分けられる。検出器雑音はまた、システム雑音と呼ばれる。熱的に安定化されたクロマトグラフにおける基線ドリフトは、基線訂正処置により正確に補償される。
【００１９】
検出器雑音は、測定プロセスの既約成分である。この雑音の源は、基線における揺らぎとして見られ、幾つかの基本的現象の結果である。１つは、ＲＩ検出器及びＬＳ検出器におけるような光源のショット雑音である。他の源は、全ての検出器の中の増幅器に関連した熱雑音、ポンプ流量の揺らぎ、及び熱変動である。微粒子、汚染物質及びあわもまた、追加の雑音成分を信号に追加する。
【００２０】
これらの影響の正味の結果は、各スライス測定値に加えられる確率的雑音の中に現れる。そのような追加の雑音は、ゼロ平均、及び明確に定義された標準偏差を有する。雑音の標準偏差は、一般に、異なる検出器に対して異なるであろうが、しかし各検出器の雑音は、分離全体を通して一定である。
【００２１】
スライス測定値の中の検出器雑音により誘発された誤差の影響は、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に誤差を導入することである。ｃiは分母であるので、これらの量における雑音は、濃度プロフィールにおける応答が低減するにつれ増大する。対数の故に、これらの量における雑音はまた、分子量感応検出器の応答が低減するにつれ増大する。こうして、ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）における雑音は、クロマトグラフ・ピークの端部（前縁及び後縁）において著しく増大する。
【００２２】
更に、ピーク端部近くで、応答における雑音は、比が負の値を有するようにさせる。負数の対数は定義されない。そのようなスライス・データを排除するのは結果を偏らせる。応答比の対数を扱うこの問題は、Ｐ．Ｔａｃｋｘ及びＦ．Ｆｏｓｓｃｈｅｒ著の最近の論文「多角度レーザ光散乱と結合されたサイズ排除クロマトグラフィーにおけるランダム雑音レベルに起因したシステム偏差（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｄｕｅ ｔｏ Ｒａｎｄｏｍ Ｎｏｉｓｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｏｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉ Ａｎｇｅｌ Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）」（１９９７年、Ａｎａｌ．Ｃｏｍｍ．３４、２９５−２９７頁）に十分記載されている。
【００２３】
検出器の雑音の存在が与えられた場合、滑らかなモデルをｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に対して完全なピーク・プロフィールにわたって適合させる仕方に関する問題が残っている。
【００２４】
本発明以前においては、ピーク端部において、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）が雑音により支配されているように見えた故に、量ｌｏｇ（Ｒi／ｃi）及びｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）が有用な情報を含まなかったと決めてかかっていた。従って、モデルの最小２乗適合は、比の信号対雑音比（ＳＮＲ）が高いピークの「心臓部（ｈｅａｒｔ）」に限定された。ユーザは、モデルが適合される領域とモデル適合から排除すべき領域との間の境界画定を手動で決定することを要求された。
【００２５】
しかしながら、ＭＷＤ及びＩＶＬをピーク全体にわたり決定するため、これらの量の値が、それにも拘わらず、ピーク端部において必要とされた。従来の操作は、モデル結果をピーク端部へ外挿することであった。Ｔａｃｋｘ及びＦｏｓｓｃｈｅｒが指摘するように、そのような外挿から得られた結果は、適合領域及び外挿方法の選定に対して著しく敏感である。
【００２６】
発明の概要
本発明は、重合体サンプルの分子量分布（ＭＷＤ）及び固有粘度法則（ＩＶＬ）を決定するため検出器から取得されたデータに対して適用されることができる正確なデータ分析方法を提供する。
【００２７】
本発明に従って、１対のクロマトグラフ・プロフィールが、２つの検出器から得られ、そして１組の応答が別の組みの応答の関数であるモデルと比較される。例えば、ｃi及びＲiがｉ番目のスライスに対する濃度及びレイリー比の測定値である場合、量Ｒiは、ｃiから得られたＲiのモデルと比較される。ｃi及びｓｐ，ｉがｉ番目のスライスからの濃度及び比粘度の測定値である場合、量ｓｐ，ｉは、ｃiから得られたｓｐ，ｉのモデルと比較される。従って、この方法は、プロフィールの比及びこれらの比の対数を取る必要性を排除し、それによりピーク端部における領域を含む、ピーク・プロフィール全体にわたり作られたスライス測定値の使用を可能にする。
【００２８】
本発明の第１の実施形態において、ＧＰＣ又はＳＥＣ分離の技術及び２つ以上の検出器を用いて重合体サンプルのＭＷＤ及びＩＶを決定する正確な方法が提供される。
【００２９】
本発明の第１の実施形態の第１の実施は、第１の検出器信号を取り出す最小２乗最小化を用いる方法を含み、そしてサンプル特性を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いて初期モデル曲線を構成する。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器信号に関して実行され、最良モデル曲線及びパラメータを生成する。
【００３０】
第１の実施形態の第２の実施は、２つ以上の検出器を用いるサンプルの分子量較正曲線を決定する方法を含む。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成され、そしてｌｏｇＭ（対数分子量）対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いた初期モデル曲線が、発生される。この初期モデル曲線は、濃度検出器からのスライスのレイリー比を表すため用いられる。光散乱（ＬＳ）検出器からの第２のデータが処理されてスライスのレイリー比が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器データからのスライスのレイリー比に関して実行され、最良モデル曲線及びパラメータをもたらす。次いで、サンプル分子量分布（ＭＷＤ）が計算される。
【００３１】
本発明の第１の実施形態の第３の実施は、２つ以上の検出器を用いたサンプルの固有粘度対溶出容量を決定する方法を含む。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成され、そしてｌｏｇ［］対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル曲線を用いた初期モデル曲線が、発生される。この初期モデル曲線は、濃度検出器からのスライスの比粘度を表す。粘度計（Ｖ）検出器からの第２のデータが処理されてスライスの比粘度が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線及び第２の検出器データからのスライスの比粘度に関して実行され、ｌｏｇ［］対溶出容量を表す最良モデル曲線をもたらす。
【００３２】
本発明の第２の実施形態において、２つ以上の検出器からのデータを用いたサンプルのＭＷＤ及びＩＶＬの同時決定が実行される。濃度検出器からのデータが処理されてスライスが生成される。初期モデル曲線が、このデータを用いて、またサンプルに対するｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表すパラメータ化されたモデル曲線を用いて、更に汎用較正曲線からのスライスの流体力学容量を用いて構成される。この初期モデル曲線は、スライスの比粘度を濃度検出器応答の関数として表す。粘度計（Ｖ）検出器からの第２のデータが処理されてそれぞれのスライスの比粘度が生成される。次いで、最小２乗最小化が、初期モデル曲線、及び第２の検出器データからのそれぞれのスライスの比粘度に関して実行され、ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表す最良モデル曲線をもたらす。この最良モデル曲線から、ＩＶＬ及びＭＷＤが決定される。
【００３３】
本発明の第３の実施形態は、比及び対数の使用を排除するため最小２乗最小化適合の再形成を含み、それによりその適合が全てのデータをピーク全体にわたり含むのを可能にする。
【００３４】
本発明の第４の実施形態は、比較された量における雑音がピーク領域の全体にわたり変わる重み付けされた最小２乗最小化適合を用いることを含み、それにより最小２乗適合が、ピーク領域の全体にわたり実行されることができる。
【００３５】
本発明の利点は、それが無信号、例えば、いずれかの検出器、又は両方の検出器からの、ゼロの周りで揺らぐ基線応答を含む領域の包含を可能にすることである。本発明の別の利点は、考慮下の２つのシステムにより決定されるように、サンプルのＭＷＤの正確さと精度の改善をもたらす。更に、最小２乗問題は、雑音の多いデータの比又は比の対数を取ることを避けるため定式化される。また、本発明は、測定値誤差に対して、特にピークの端部において、かなり敏感でない。本発明は、第２の実施形態に対してＩＶＬの正確さ及び精度の改善を与える。
【００３６】
本発明の更に別の利点は、ＩＶ法則及び分子量較正が全てのスライス・データに対する単一の適合から推定されることである。追加の適合を実行することから生じるシステム誤差が回避されるように、複数回の適合及び外挿を実行する必要性が回避される。
【００３７】
本発明の前述及び他の特徴及び利点は、添付図面と関係した、例示的実施形態の以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【００３８】
詳細な説明
本発明に従った分子量分布を分析するための例示的ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムが、図１に図示されている。溶媒貯留槽１０は、溶媒ポンプ１２により送出される溶媒を与える。注入弁１３において、重合体サンプル１４は、溶媒の流れの中に導入される。次いで、溶媒は、重合体サンプル１４と共に、クロマトグラフ・ベッドを含む１組のカラム１６を通る。次いで、溶媒は、検出器１８を通り、そこにおける１つ又は幾つかの検出器は、その溶媒を分析し、重合体連鎖の存在及び特性を決定する。この情報は、矢印２２により示されるように、データ・プロセッサ２０に供給される。次いで、不用溶媒は、容器２４に収集される。
【００３９】
ＧＰＣカラム１６は、細孔のある大きさの分布を持つ充填ビーズ（クロマトグラフ・ベッド）を含む。そのようなシステムの例示的実施形態は、両方ともＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州（０１７５７）３４ Ｍａｐｌｅ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍｉｌｆｏｒｄ）により製造されたＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システム及びスティレーゲル（Ｓｔｙｒａｇｅｌ）カラムである。
【００４０】
サンプル１４を流体流れの中に注入することにより、サンプル１４はカラム・セット１６の中へ押し込まれる。細孔は、大きい分子を排除し、小さい分子を保持する。大きい分子は、比較的小さい実効容量を有するカラム・セットを知覚する。小さい分子は、比較的大きい実効容量を有するカラム・セットを知覚する。従って、大きい分子は最初に溶出し、小さい分子は遅く溶出する。検出器１８は、カラム・セット１６に続き、溶離剤の物理的特性を測定する。
【００４１】
図２のデータ・プロセッサ２０は、データベース２６及びプロセッサ２８を含む。データベース２６は、磁気ディスク、テープ及び光磁気ディスクのような長期間記憶装置を含む。この例示的実施形態におけるデータベース２６は、関係型データベースである。プロセッサ２８は、情報を処理し生成するためデータベース２６に記憶されているデータにアクセスし、その情報は、データベース２６に戻すよう記憶され、又はワークステーション３０に表示され、又はプリントされ（図示せず）得る。データ・プロセッサ２０はまた、Ａ／Ｄ（アナログ／ディジタル）変換回路、サンプル及びホールド回路及び他の装置（図示せず）を含む、データ２２を処理し変換するための装置を含んでよい。
【００４２】
例示的実施形態において、データ・プロセッサは、マイクロソフト・ウインドウズ（登録商標）９５又はウインドウズＮＴを実行するインテル・ペンティアム（登録商標）ベースのパーソナル・コンピュータのような汎用コンピュータである。処理アプリケーション・ソフトウエアは、マサチューセッツ州ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたミレニアム32（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32）（登録商標）である。ミレニアム32は、クロマトグラフィー操作者が装置を制御し、検出器から得られたデータを取得し、記憶し、検索するのを可能にするクロマトグラフィー情報及びシステム・マネジャである。それはまた、クロマトグラフィー操作者がそのデータを処理し、処理された結果を図形及び表形式で記憶し、検索し、表示し、及びプリントするのを可能にする。
【００４３】
ミレニアム32ソフトウエア製品は、幾つかの構成要素を含む。１つのソフトウエア構成要素は、装置（溶媒ポンプ１２、自動注入器１３及び検出器１８）を制御し、データを（主に検出器から）取得する。別の構成要素は、情報を記憶し供給するオラクルのデータベースであるデータベース２６である。
【００４４】
別の構成要素は、情報を処理し、情報をデータから抽出し、それをレポートに与えるアプリケーション・ソフトウエアである。レポート発生器は、ユーザがレポートを作成し、管理し、プリントするのを可能にする。グラフィック・ユーザ・インタフェース（ＧＵＩ）は、ユーザがモニタ３０からの全てのこれらのサブシステム及び構成要素と対話するのを可能にする。本発明の例示的実施形態は、ミレニアム32のデータ処理構成要素内で実施される。
【００４５】
２つのカテゴリーの検出器は、ミレニアム32に対して信号入力２２を与えることができる。一方のカテゴリーは、Ｗａｔｅｒｓにより製造された検出器から構成され、他方のカテゴリーは、第三者の検出器を含む。Ｗａｔｅｒｓの検出器からの出力は、ＩＥＥＥ−４８８インタフェースを介して通信する（ＩＥＥＥ−４８８は、プログラマブル装置（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用ＩＥＥＥ基準ディジタル・インタフェース、即ちＡＮＳＩ／ＩＥＥＥ基準４８８−１９８７である。）。検出器からの信号は、ＩＥＥＥ−４８８ケーブル上のアナログ形式である。ＩＥＥＥ−４８８ケーブルは、当該技術において既知のように、ＰＣマザーボード上のＩＳＡスロットにプラグ・インされた印刷回路板を介してミレニアム32に接続する。この印刷回路板は、ＢｕｓＬＡＣＥと呼ばれるＷａｔｅｒｓ製品である。ＢｕｓＬＡＣＥは、信号をディジタル化し、ＰＣと通信する。ＩＥＥＥ−４８８インタフェースは、デイジーチェーン・ネットワークとして実施され、それにより複数の検出器モジュール及び装置がＢｕｓＬＡＣＥ上の１つのＩＥＥＥ−４８８コネクタにプラグ・インすることができる。
【００４６】
第三者検出器１８からの出力２２は、アナログ形式であると仮定する。検出器出力信号は、遮蔽されたケーブル内に包囲された１対のワイヤ上に印加される。遮蔽されたケーブルは、ＳＡＴ／ＩＮ（衛星入力）と呼ばれるＷａｔｅｒｓ電子機器ハードウエアの１つに接続する。ＳＡＴ／ＩＮは、アナログ入力を２つの装置から取り込み、そしてアナログ入力信号をディジタル化する。ＳＡＴ／ＩＮの出力はＲＳ−２３２線であり、そのＲＳ−２３２線は入力をＢｕｓＬＡＣＥへ与える。こうして、ＢｕｓＬＡＣＥは、２つの全く異なるタイプの入力、即ちＷａｔｅｒｓハードウエアからのＩＥＥＥ−４８８信号、及び第三者検出器からのＲＳ−２３２信号を受け入れる。
【００４７】
検出器１８は、屈折率（ＲＩ）検出器、光散乱（ＬＳ）検出器、及び粘度計（Ｖ）検出器を含む。
ＲＩ検出器は、溶液の屈折率に応答する。この検出器の出力が与えられた場合、検出器の基線応答を差し引きかつサンプルに対して屈折率の増分ｄｎ／ｄｃで除算することにより、ｉ番目のスライスに対するサンプルの濃度プロフィールｃiが与えられる。
【００４８】
ＲＩ検出器を用いて、ピークの濃度プロフィールを測定する。適切に較正されたＵＶ／Ｖｉｓ吸収検出器又は蒸発光散乱検出器（ＥＶＳ）は、同じ機能を実行するためＲＩｋｅの代わりに代用され得る。濃度検出器として働き得るいずれの検出器は、ＲＩ検出器の代わりに用いることができ、本発明の範囲内である。一例のＲＩ検出器は、Ｗａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システムである。
【００４９】
ＬＳ検出器は、光を散乱することによりサンプルに応答する。検出器の基線応答を差し引きかつ検出器較正処置を適用することにより、各スライスに対して、サンプルＲiに起因する過剰レイリー比が与えられる。一例のＬＳ検出器は、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ ＢａｒｂａｒａのＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．からのミニＤＡＷＮ３角度レーザ光拡散検出器である。
【００５０】
粘度計（Ｖ）検出器は、サンプルに溶媒を加えたものの粘度に応答する。検出器の基線応答を差し引きかつ基線の粘度で除算することにより、各スライスに対するサンプルの比粘度ｓｐ，ｉが与えられる。一例のＶ検出器は、Ｗａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷａｔｅｒｓ１５０ＣＶ＋ＧＰＣ粘度計クロマトグラフィー・システムに組み込まれている検出器である。
【００５１】
ＬＳ検出器及びＶ検出器は、通常、検出器の応答がサンプルの分子量のある関数により乗算されたサンプルの濃度に比例する点で、「分子量感応」検出器と呼ばれる。光散乱のケースにおいて、ＬＳ検出器は、濃度と分子量の積に応答する。粘性（Ｖ）検出のケースにおいて、粘度計は、分子量の累乗により乗算された濃度に応答する。
【００５２】
従って、各スライスに対して、検出器は、そのスライスに対して、濃度ｃi、過剰レイリー比Ｒi及び比粘度ｓｐ，ｉを与える。
重合体サンプル１４は、連鎖長の分布を含む。サンプルのＭＷＤは、分子量の単位間隔当たりの相対質量（又は濃度）により表されることができる。重合体の合成を支配する動力学のため、これらの分布は、通常、図３に図示されるように、ＭＷの対数の単位当たりの相対質量により表される。水平軸はｌｏｇＭＷであり、垂直軸は任意である。前述のように、分布のｌｏｇＭＷにおける狭いがしかし限定された間隔は、スライスと呼ばれる。
【００５３】
説明のため、図３に示されるシミュレートされたＭＷＤ ３５が用いられるであろう。カラムに注入された質量が与えられたとすると、このプロフィールは、正規化され、ｄｍ／ｄ（ｌｏｇＭ）、即ちＭＷの単位対数間隔当たりの質量を与える。
【００５４】
図５は、カラム・セットの分子量較正曲線をプロットし、それはＭＷの対数対溶出容量である。図５におけるｘ軸は溶出容量であり、ｙ軸はｌｏｇＭＷである。高い分子量端Ｖｏにおける漸近線は排除された合計容量を表し、低い分子量端Ｖｔにおける漸近線は合計カラム容量を表す。
【００５５】
この線は、細孔サイズ分布によりセットされたカラムに関する限界を表す漸近線を高いＭＷ及び低いＭＷにおいて有する。各漸近線は、高い分子量端Ｖｏにおいてビーズにより排除された容量を表し、そして低い分子量端Ｖｔにおいて合計カラム容量を表す。理想的には、ＶｏとＶｔとの間に、ｌｏｇＭＷ対溶出容量のプロットが殆ど線形である溶出領域がある。この較正曲線はサンプルに依存し、そして、それはまた、溶媒、カラム及び温度の選定に依存する。
【００５６】
ＭＷＤに適用される図５のカラム較正は、図６にプロットされるように、サンプルがカラム・セットから溶出するときのサンプルの濃度対溶出容量３９又はｃ（Ｖ）を与える。ｘ軸は溶出容量であり、ｙ軸は濃度である。
【００５７】
各重合体サンプルは、ｄｎ／ｄｃ、即ちサンプル濃度の単位変化当たりの溶液の屈折率の変化により表される屈折率増分を持つ。濃度プロフィールに屈折率増分ｄｎ／ｄｃを乗算することにより、図７における屈折率対溶液容量のプロット４０が与えられる。これは、ＲＩ検出器応答のシミュレーションである。
【００５８】
過剰レイリー比は、入射光の波長λが重合体連鎖のサイズに匹敵するかそれより大きいとき、重合体連鎖により散乱された入射光の割合を表す。強度Ｉｏの偏光されてない光の入射ビーム、低いサンプル濃度ｃ、低い散乱角θ及び小さい粒子サイズを仮定する。溶液の単位容量の中のサンプルが光をビームに関して方向θの方に散乱させると仮定する。サンプルにより散乱されかつ距離ｒで受け取られた光の強度のその部分Ｉ（θ）は、次式により与えられる。
【００５９】
【数１】
ここで、Ｋ*は、次式のように、数値的かつ物理的定数によって表される光学的定数である。
【００６１】
【数２】
ここで、ＮＡはアボガドロ数であり、ｎｏは溶媒の屈折率である。
装置のジオメトリーに依存するよう定義される過剰レイリー比は、次式により与えられる。
【００６３】
【数３】
従って、小さい角度においては、スライスｉに対して、式（１）は次式のようになる。
【００６５】
【数４】
式（４）Ｒi＝ｃiＭiＫ*
そのため、過剰レイリー比は、単純に、スライスの濃度ｃi、分子量Ｍi及び光学的定数Ｋ*の積である。
【００６６】
過剰レイリー比対溶出容量４２がまた図７に図示されている。レイリー比は、図６の濃度プロフィールにおける各スライスにＭiＫ*を乗算することにより得られる。これは、ＬＳ検出器により測定されたプロフィールのシミュレーションである。
【００６７】
比粘度ｓｐは、サンプルが粘度計の中に存在することに起因する粘度の部分的増分である。一定流量では、毛管Ｐの両端間の圧力降下は、毛管を流れる液体の粘度に比例する。Ｐｏが溶媒のみに起因する圧力降下である場合、溶液の中に重合体を含むスライスの比粘度ｓｐは、次式により定義される。
【００６８】
【数５】
ここで、Ｐは重合体プラス溶媒の溶液に起因する圧力降下である。この式は、ｓｐが重合体を溶媒に追加することにより生じた粘度の増大の尺度となることを示す。
【００７０】
各スライスは固有粘度［］を有する。固有粘度（ＩＶ）は、低い濃度の制限内においてスライスの比粘度ｓｐをその濃度ｃで除算した比として定義される。
【００７１】
【数６】
ＧＰＣ分離において、濃度は、スライスに対する固有粘度が次のようにスライス比であるよう取られる程十分低い。
【００７３】
【数７】
重合体の固有粘度は、その分子量と共に変わる。固有粘度法則（ＩＶＬ）は、サンプルの固有粘度の対数がその分子量の対数に依存することを表す。
分岐していない重合体に対して、ＩＶの対数は、一般に、連鎖の分子量の対数に比例する。経験的なマルク−ホウインク（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ）固有粘度法則は、この線形関係を次式のように表す。
【００７５】
【数８】
式（８）ｌｏｇ［η］i＝ｌｏｇＫ＋αｌｏｇＭi
この式は、マルク−ホウインク定数Ｋ及びαのパラメータにより表されている。
【００７６】
重合体は分岐することができる。ジム（Ｚｉｍｍ）及びストックメイヤー（Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒ）は、長い連鎖で分岐した重合体の物理的モデルを開発し、それは１９４９年、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１７、１３０１−１３１４頁においてＺｉｍｍ，Ｂ．及びＳｔｏｃｋｍｅｙｅｒ，Ｗ．により表され、それは本明細書に援用されている。この研究から出発して、長い連鎖の分岐している重合体に対する固有粘度を表すモデルが開発され、それはジム−ストックメイヤー（ＺＳ）法則と呼ばれる。
【００７７】
ＺＳ法則において、分布の固有粘度は、４つのパラメータＫ、α及びλにより表される。
ＺＳ法則は、低分子量で、重合体は本質的に分岐しないと仮定する。この体制においては、固有粘度法則は漸近的に直線である。低分子量での固有粘度法則の漸近的勾配は、マルク−ホウインク定数Ｋ及びαにより表される。
【００７８】
高分子量において、分岐が優勢であるとき、固有粘度法則の漸近的勾配は、αより小さく、（α−／２）により与えられ、それは重合体の形状係数である。それに対する値は、重合体／溶媒系により決定される。例えば、それは、ＴＣＢにおける分岐したポリエチレンに対してほぼ０．９である。それに対する値は、０．５から１．５までの範囲に分布する。
【００７９】
重合体が分岐する分子量は、分岐確率により表される確率的プロセスである。値λは、１ダルトン当たりの分岐確率として定義される。λに対する典型的な値は１ダルトン当たり０．００００１である。
【００８０】
各スライスｉに対するＺＳ法則の固有粘度は、そのスライスの分子量Ｍiの関数であり、パラメータＫ、α、λに依存し、次式のとおりである。
【００８１】
【数９】
ＺＳ法則は、２つの有り得るタイプの分岐した重合体、即ち、３分岐点及び４分岐点を表すため実施される。
３分岐点に対する係数はｃ１＝９／４及びｃ２＝７である。４分岐点に対する係数はｃ１＝３／４及びｃ２＝６である。図４は、ジム−ストックメイヤーＩＶ法則を図示する。３つの固有粘度法則がプロットされ、それらは、マルク−ホウインク法則３６、ジム−ストックメイヤー法則３７及び多項式法則３８である。
【００８３】
第３の固有粘度法則（多項式）は、単純に、多項拡張に基づくサンプルの固有粘度の経験的記述である。この「法則」は、次のようにマルク−ホウインク法則の拡張と見なすことができる。
【００８４】
【数１０】
ここで、Ｎは多項式の次数であり、Ｋ及びαはマルク−ホウインク定数である。
比粘度は、図６の濃度プロフィールにおける各スライスにそのスライスに対する固有粘度法則（ＩＶＬ）を乗算することによりシミュレートされる。そのスライスに対するＩＶは、図４にプロットされた、ＩＶＬ曲線３７から得られる。図７は、粘度計の検出器から得られるであろう比粘度対溶出容量のこのシミュレーション、即ちプロット４４をプロットする。
【００８６】
従って、図７は、図６に表された濃度プロフィールに対する装置応答に基づく検出器プロフィールを図示する。シミュレーションを完成させるため、検出器雑音の適当なレベルが、シミュレートされた各信号に対して加えられねばならない。図８は、各検出器応答に基線雑音を加えた後のプロフィールを図示する。ＲＩ検出器４０′、ＬＳ検出器４２′及びＶ検出器４４′の各応答が示されている。図７及び図８において、それぞれのプロフィールは、正規化され、プロットにおける明確さのため同じピーク高さを有する。
【００８７】
カラム・セット及び溶媒を所与のサンプルと共に含む、所与のクロマトグラフ・システムに対して、保持容量は、連鎖の分子量の単調減少関数である。ｌｏｇＭＷ対溶出容量のプロットは、サンプルに対する分子量較正と称される。
【００８８】
理想的には、この曲線は、それが全てのサンプルに対して適用するであろうという意味で汎用であろう。不都合にも、この曲線は、サンプルに依存（並びに、溶媒及びカラム・セットに依存）する。
【００８９】
所与のカラム、溶媒及びサンプルの組合わせからＭＷ較正曲線を決定する演繹的手段はない。実際に、ＭＷ較正曲線は、収集されたデータを採用する較正手順により決定されねばならない。
【００９０】
ＲＩ−ＬＳ検出に対するＭＷ較正の基礎は、各スライスに対するレイリー比、分子量及び濃度間の関係である。この関係は、ゼロ角度及び低サンプル濃度での拡散の限界においてのみ考慮される必要がある。この限界において、これらのパラメータ間の関係は、次式のとおりである。
【００９１】
【数１１】
より一般的なレイリー拡散法則は、拡散角度に関する過剰レイリー比、分子の回転半径、及び第２のビリアル係数への依存性を含む。本発明の方法は、このより単純な表現（式）か、又はより複雑な表現（式）かのいずれかに対して適用する。
【００９３】
式（１１）により表される関係の意味は、ＲＩ検出器及びＬＳ検出器の応答（曲線４０及び４２、又は４０′及び４２′）のみがサンプルの分子量較正曲線を得るため必要とされることである。
【００９４】
検出器雑音が存在しない場合、ＲＩ及びＬＳのプロフィールは、図７におけるように、雑音が無く、サンプルのＭＷ較正及びＭＷＤは、直接得られるであろう。式（１１）に続いて、各スライスｉに対して４２、即ちＲiのＬＳ応答は、４０、即ちそれぞれのＲＩ応答ｃiにより除算されるであろう。その結果生じる比をＫ*により除算することにより、そのスライスに対する分子量Ｍiの測定値が得られる。ｌｏｇＭi対溶出容量のプロットは、サンプルの分子量較正曲線を正確に決定し、それは、図５においてプロットされた曲線に正確に対応するであろう。ＲＩ応答により表される濃度分布４０と組み合わされて、図３に示されるシミュレートされた正確なＭＷＤが再生されるであろう。
【００９５】
検出器雑音が常にＲＩ及びＬＳのプロフィールに存在するので、先の方法は、ピークの中央領域においてのみ許容可能である結果を与えるであろう。図８に図示されている現実の状況を参照すると、各スライスｉに対して、４２′、即ち雑音に影響されたＬＳ応答Ｒiが４０′、即ちそれぞれの雑音に影響されたＲＩ応答ｃiで除算される。各スライス−比はＫ*で除算され、そしてｌｏｇＭi対溶出容量のプロットは、図９に４６としてプロットされている。
【００９６】
従って、図９は、式（１１）の直接適用を通して図８のＲＬ−ＳＬスライス・データから得られた分子量較正曲線４６を図示する。雑音の存在は、このｌｏｇＭの推定に影響を及ぼすのは明らかであり、そのｌｏｇＭは、ピークの端部領域における高い振幅を有して揺らぐ。
【００９７】
これらのスライスにより決定された数を、分布の端部におけるＭＷの推定として直接用いることは明らかな誤りであろう。例えば、分子量較正は、溶出容量が増加するにつれ単調に増加しなければならない。
【００９８】
従来技術においては、ＭＷＤを推定するため、用いられた手法は、各スライスに対して比の対数、
【００９９】
【数１２】
ｌｏｇＭi＝ｌｏｇ（Ｒi／（Ｋ*ｃi））
を最初形成することである。第２のステップは、低次の多項式曲線をｌｏｇＭi対溶出容量に適合させることである。適合された低次の多項式はこの分離に対するカラム・セットのＭＷ較正に対して正確に表すと仮定する。低次の多項式以外の他の滑らかな曲線を用いることができる。
【０１００】
従来技術において、最小２乗適合処置は次のとおり表されることができる。
【０１０１】
【数１３】
ここで、右辺の左の項は、ＲＩ検出器応答とＬＳ検出器応答の組合わせから各スライスに対して推量された分子量である。右の項は、一例として用いられる多項モデルであり、その形状は、パラメータ値Ｐ０，…，ＰＭにより特定される。
ここで、その項は、
【０１０３】
【数１４】
であり、値ｉは、溶出容量スライスの指標である。関数Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）は、スライスｉに対する分子量の対数である。従って、
【０１０５】
【数１５】
ｌｏｇＭi＝Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）
及びこの関係は、分子量較正曲線をスライスｉの関数として表す。
【０１０６】
記号Ｍは、本明細書において２つの意味で用いられている。スライスに言及するとき、Ｍ又はＭｉは、分子量を表す。しかし、多項モデル曲線に言及するとき、Ｍは、その展開式における最高次の指数であり、モデル曲線は、Ｍ＋１個の調整可能なパラメータＰ０，…，ＰＭにより特定されるであろう。汎用モデル曲線に言及するとき、Ｍは、そのモデル曲線を特定するため必要とされる調整可能なパラメータの最大数であり、従ってモデル曲線は、Ｐ１，…，ＰＭのパラメータにより表されるであろう。記号Ｐは、文脈に応じてパラメータＰ０，…，ＰＭ、又はＰ１，…，ＰＭの組を表すであろう。
【０１０７】
関数Ｆi（Ｐ０，…，ＰＭ）は、独立のスライス指標ｉの関数として表される。Ｆは、そのような溶出容量又は溶出時間のような、スライス指標に比例する値によって等価的に表されることができる。
【０１０８】
式（１３）において、加算がスライスのｉ＝１からＮまで実行される。但し、Ｎはスライス数である。Ｍ＋１個のパラメータＰ０，…，ＰＭは、Ｘ32を最小化するＰ０，…，ＰＭのそれらの値を見つける適切な最適化アルゴリズムにより調整される。この手段により、モデル曲線を決定する最小２乗解法、
【０１０９】
【数１６】
が、得られる。
ＲＩ−ＬＳ検出に対して、この最小２乗適合の定式化は、３つの周知の問題を有し、それらの全ては、ピークの端部で生じ、そして検出器の雑音がＲi及びｃiデータの中に存在するためである。最初の問題は、この雑音のため、Ｒi又はｃiが端部で負に揺らぐことがあり、そのため比が負であり得る。対数は、負の量に対して定義されない。第２に、項ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））において誘発される雑音は、対数がその独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔ）の線形関数でないので、平均値に関して対称でない。第３に、項ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））において誘発される雑音が、ピーク端部において大きくなる。
【０１１１】
従来技術において、これらの制限は、曲線
【０１１２】
【数１７】
が適合される領域を限定することにより対処されてきた。適合領域は、一般的に、ピークの心臓部をまたがるよう選定されている。次いで、この適合からの結果は、端部へ外挿される。しかし、多項式モデルの外挿は、一般的に、信頼できない結果を与える。更に、多項式適合のための領域、及び外挿される領域を特定する仕方が明瞭でない。適合の結果は、この適合領域の選定に対して非常に敏感である。
【０１１４】
本発明に従った方法は、最尤法の理論に基づいており、その最尤法は、本明細書に援用されるＢ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ著「物理学者のための統計学（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉｓｔｓ）」（１９７１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋ）の８５−８９頁に記載されているように、多変量モデルにおけるパラメータの最適推定を与える。
【０１１５】
多変量曲線を、確率的雑音を含むデータに適合させることは、データの統計的分析における共通問題である。最尤法の理論は、バイアスされてなくかつデータの中の雑音に対して最小感度を有するパラメータ値を見つける仕方を示す。理論の一部は、後述のようにＲＩ−ＬＳ及びＲＩ−Ｖデータの分析に適用される。
【０１１６】
ＲＩ検出器、ＬＳ検出器及びＶ検出器の中の確率的雑音は、最も共通のタイプの装置雑音に対応し、その最も共通のタイプの装置雑音は、加法的であり、ゼロ平均を有し、そして標準偏差のパラメータにより表されるガウス分布により表される。これらの統計学により表される雑音に対して、重み付けされた最小２乗適合に基づく推定手順は一般的に最適である。
【０１１７】
本発明に従った重み付けされた最小２乗方法において、最初のステップは、１組のデータｄｉで始まり、そこでｉは１からＮまで移動し、但しＮは測定値の合計数である。そのデータは、モデルＤi（Ｐi，…，ＰM）で表され、ここでＭ個のパラメータＰは、モデル値Ｄｉを表す。モデル値Ｄｉは、データ値ｄｉを説明することができる多項式曲線のような関数から導出される。各データｄｉは、ゼロ平均で標準偏差σｉのガウス分布を有する雑音だけモデルから偏移する。
【０１１８】
パラメータＰの最適（雑音に対する感応が最小である）推定は、Ｘ2に対する以下の式を最小にするそれらのパラメータ値を見つけることにより得られる。
【０１１９】
【数１８】
量2は、２組の量ｄとＤの差の関数である。量2は、２組の量ｄとＤの２点間の差の２乗の和である。加算における各項は、ｄに対する値とＤに対する値の２乗差であり、そしてそこにおいてこの差は、標準偏差σｉの２乗により重み付けされる。
【０１２１】
σｉに対する正しい推定を得るため、相対雑音値のみが重要である。例えば、全ての項は、同じ雑音分散を持つ場合、全ての項に対してσｉ＝１をセット（重み付けされない最小２乗）することは、パラメータに対して正しい値を依然生じるであろう。
【０１２２】
次いで、最小２乗適合は、量2を最小にするそれらのパラメータＰを見つけることにより実行される。量2を最小にするＰのそれらの値は、最小２乗の意味においてデータを最良に適合させるＤのモデルを表す。
【０１２３】
最小２乗適合が実行されるため、アルゴリズムを用いて、量2を最小にするパラメータＰ１，…，ＰＭを見つけなければならない。いずれの最小化手順におけるように、Ｐ１，…，ＰＭに対する最終値は、量2の中の最小が実際に見つけられる限り、最小化を実行するため採用されるアルゴリズムの詳細に依存しないであろう。
【０１２４】
一般的に、そのような最小化手順は、初期パラメータ値が見つけられ、かつ量2に対する初期値が計算されることを要求する。次いで、これらのパラメータは、量2の最小が見つけられるまで繰り返し調整される。
【０１２５】
以下に説明される量2の定式化において、初期パラメータ値の決定は、種々の標準方法により達成されることができる。そのような方法は、期待された最終パラメータ値の近似値を求めるため知られている値の手動推定、パラメータの典型的な値の採用、又は分析されるべきデータのサブセットから初期パラメータ値を決定する別個のアルゴリズムの実行を含む。
【０１２６】
以下に説明される定式化において、パラメータの後続の反復調整は、種々の標準偏差により達成されることができる。Ｎ個の変数の関数の最小を見つける方法は、ニュートン−レフソン（Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ）、レーベンベルグ−マルカッド（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｄｔ）、単体（ｓｉｍｐｌｅｘ）、勾配探索（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ）、及び力任せ探索（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）を含む。そのような反復調整手順は、本明細書に援用されている、Ｓ．Ａ．Ｔｅｕｋｏｌｓｋｙ、Ｗ．Ｔ．Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ及びＢ．Ｐ．Ｆｌａｎｎｅｒｙ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）著「Ｃ、科学的計算技術、第２版（Ｃ，ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（１９９２年、Ｗ．Ｈ．Ｐｒｅｓｓ発行）の３９４−４５５頁に記載されている。
【０１２７】
従来技術において、ＲＩ−ＬＳデータに対する最小２乗適合手順は、次のように表される。
【０１２８】
【数１９】
量2に対する上記の式は、最小２乗最小化であり、それは、一瞥では最適推定の理論に基づいているように見える。しかしながら、そうではない。
従来技術において、データ・モデルは正しい。なぜなら、多項式
【０１３０】
【数２０】
が一般的に分子較正曲線の適切な表示であるからである。しかし、雑音モデルは正しくない。
ｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））における測定誤差は、非ガウス的（ｎｏｎ−Ｇａｕｓｓｉａｎ）であり、そしてゼロに関して非対称である。また、各項の雑音分散が異なるにも拘わらず、重み付け係数がない。
【０１３２】
従来技術の方法において、重み付けされない最小２乗は、パラメータの推定において、過剰雑音を含む項の影響を増大させかつ良好な信号対雑音を有する項の影響を低減する効果を有する。
【０１３３】
最小２乗モデル適合の全ての実行は、２組の量を比較しなければならない。式（１４）において、比較される量は、データ点ｄ及びデータ点Ｄのモデルである。ＲＬ−ＬＳ検出において、比較するための３組のスライス依存量が存在する。これらは、ＬＳ検出器により測定されたレイリー比Ｒi、ＲＩ検出器により測定された濃度ｃi、及びスライスの分子量対溶出容量に対するモデル
【０１３４】
【数２１】
である。
最小２乗最小化の定式化の２つの連続的改良をここで説明する。最小２乗最小化の第２の定式化は、最適推定理論と一致する。全ての定式化は、従来技術におけるように、測定された同じデータ値、及びデータの同じパラメータ化されたモデルを用いるが、しかし最小２乗適合を実行する際に異なる量を比較する。異なる量を比較することは、雑音モデルに変化をもたらす。
【０１３６】
第１の改善は、式（１５）における両方の項を累乗化することにより対数を除去する。次いで、最小２乗比較が修正され、次のようになる。
【０１３７】
【数２２】
この再構成は、対数に起因する偏りを除去し、Ｒiの負の値を含むことを可能にする。しかしながら、ｃiが分母にあるので、ピーク端部におけるｃiの小さい値は、この比に大きな揺らぎを生じさせるであろう。
【０１３９】
第２の改善は、両方の項にｃiを乗算して、比較するための新しい量に到達する。
【０１４０】
【数２３】
この再構成は、ｃiに対する値が小さいことを可能にする。
濃度ｃi、光学的定数Ｋ*及び多項式モデルＦの積は、レイリー比Ｒiと比較される。Ｒi及びｃiの誤差がゼロ平均を有すると仮定され、かつガウス分布されるので、式（１８）の右辺の各項の誤差はまた、ゼロ平均でありかつガウス分布するであろう。
【０１４２】
式（１８）の定式化において、Ｒiに対する測定値がゼロと一致していてかつ実際に雑音に起因する負の値を有する点を含む、適合における全てのプロフィール・データを含むことができる。これは、分布の端部におけるデータを用いる問題を解決する。従って、上記式を用いて、端部を含む、ピーク領域全体にわたりデータに対して適合させることができる。
【０１４３】
ゼロに近いＲiに対して値を適合させることができることは、ＲＩ−ＳＬデータの適合において重要な利点を表す。ゼロに近いそのようなデータの包含は、モデル適合に制約を加えるのを助ける情報を加える。負に行く揺らぎの包含は、実際に、従来技術の方法で用いられなかった適合に対して有効な情報を与える。
【０１４４】
式（１８）におけるモデルＦiは、多項展開として表される。しかしながら、本発明は、この多項展開の代わりにいずれのパラメータ化された滑らかなモデル曲線を組み込むことができる。
【０１４５】
式（１８）は、重み付けされない最小２乗に対応する。一般的に、ＲＬ−ＬＳシステムにおいて、ＲＩ測定値の中の雑音は、ＲＩプロフィールにおけるピーク先端の信号対雑音比（ＳＮＲ）がＬＳプロフィールのピーク先端におけるＳＮＲより高いという意味でＬＳ測定値の中の雑音より小さい。ＬＳ測定値のみが雑音が多く、かつＲＩ測定値が本質的に無視し得る雑音を有すると仮定される場合、重み付けされない最小２乗は、パラメータＰの最適かつ最尤推定を生じる。
【０１４６】
図１０は、シミュレートされた分離に対するｌｏｇ（（Ｒi／ｃi）×（１／Ｋ*））対各スライス番号を曲線５０としてプロットする。モデル
【０１４７】
【数２４】
を計算した２つの異なる方法が、スライス・データ上に重ね合わされている。１つは、式（１８）の最小２乗定式化においてｘ2を最小にすることによるもので、曲線５２を与える。他方は、式（１５）の最小２乗定式化においてｘ2を最小にすることによるもので、曲線５４を与える。曲線５６は、図５にプロットされた曲線５６の中央部分に対応する真のｌｏｇＭ較正曲線である。例示的方法により生成された曲線適合は、分布の端部での雑音に無感応である。従来技術の方法により生成された曲線適合は、分布の端部で雑音が優勢である。
【０１４９】
測定された量ｃiは、雑音を含むものである。注目したように、最小２乗定式化は、次のようにそれを含むよう一般化することができる。
【０１５０】
【数２５】
ここで、ｉは次のように両方の項からの分散を考慮することができる。
【０１５２】
【数２６】
ここで、ｉ及びｉは、ＬＳ検出器及びＲＩ検出器と関連した誤差の標準偏差である。括弧の中の項は、これらの雑音源の相対的寄与を調整し、それによりそれらは、分子の分散に一致する。ここで、σｉに対する値は、ＬＳ検出器及びＲＩ検出器における組み合わされた誤差を表す。この定式化は、正確に、パラメータＰ０，…，ＰＭの最適推定を与えかつ最尤理論に一致する定式化である。
【０１５４】
たとえｃiが著しい雑音を含んでいても、重み付けされない最小２乗、即ち式（１８）を依然用いることができる。重み付けされない最小２乗を用いる場合、適合の中の全てのデータは、依然含まれることができる。パラメータ値の推定は、依然偏移されていない。重み付け関数の省略は、プロフィールにおける検出器雑音の存在に対してやや増大した感度をもたらすであろう。
【０１５５】
式（１８）における量の追加の再構成は、最小２乗定式化が
【０１５６】
【数２７】
を比較するように実行されることができる。ＲＩ測定値の中の雑音がＬＳ測定値の中の雑音より大きいとき、この再構成は、重み付けされない最小２乗を用いて、パラメータＰの最適推定を与える。
【０１５８】
次に考慮すべきことは、屈折率検出器及び粘度計（ＲＩ−Ｖ）による検出である。ＲＩ−Ｖ検出の目的は、サンプルのＭＷＤ及びそのＩＶＬを決定することである。これらの決定は、両方とも汎用較正の仮定を利用する。
【０１５９】
サンプルのＭＷＤを決定するため、我々は、最初に、サンプルの分子量較正曲線、即ち分子量の対数であるｌｏｇＭi対スライス番号又は溶出容量を決定しなければならない。サンプルのＩＶＬ、即ちｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiを決定するため、我々は、最初に、ｌｏｇ［］i即ち固有粘度対溶出容量を決定しなければならない。ｌｏｇ［］iをｌｏｇＭiと組み合わせることにより、サンプルの固有粘度法則が与えられる。
【０１６０】
粘度計はサンプルの比粘度を決定し、そしてＲＩ検出器は各スライスにおけるサンプルの濃度を決定する。スライスの固有粘度は、その比粘度のその濃度に対する比である。固有粘度は、広いサンプル分布における各スライスに対して次のように計算される。
【０１６１】
【数２８】
式（２１） ［η］i＝ηsp,i／ｃi
ここで、下つき文字ｉはｉ番目のデータ・スライスを意味し、そして［］iはスライスｉの固有粘度であり、ｓｐ，ｉは比粘度であり、ｃiはスライスの濃度である。
【０１６２】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分離において、その分離は、重合体連鎖とクロマトグラフ・ベッドとの間のサイズに依存するが質量に依存しない相互作用による影響を受ける。Ｂｅｎｏｉｔ［Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰａｒｔＢ，５，７５３（１９６７年）の中のＺ．Ｇｒｕｂｉｓｔｉｃ、Ｒ．Ｒｅｍｐｐ及びＨ．Ｂｅｎｏｉｔ論文（これは本明細書に援用されている。）］により導入された汎用較正（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の仮定は、連鎖の溶出容量は連鎖の流体力学容量にのみ依存するということである。流体力学容量は、化学種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の分子量にその固有粘度を掛けた積であるよう定義される。スライス量に関して表すと、この関係は次のとおりである。
【０１６３】
【数２９】
式（２２） Ｈi＝Ｍi［ηi］
この定義の物理的重要さは、固有粘度の定義を代用して次式を得ることにより認められることができる。
【０１６４】
【数３０】
それは、分子の化学種の数密度である。従って、流体力学容量は、固有粘度とは対照的に、連鎖当たりの粘度を測定する。なお、固有粘度は、単位濃度当たりの粘度を測定する。
【０１６６】
各スライスに対する流体力学容量は、既知の分子量の狭い重合体標準の使用により得られる。ＲＩ−Ｖ検出は、各標準に対する流体力学容量を決定する。標準の流体力学容量対溶出容量をプロットすることができ、そして重合体曲線がこのデータに適合され、流体力学容量較正曲線を決定する。この曲線は、狭い標準により架けられた（ｓｐａｎｎｅｄ）各スライス又は溶出容量に対するカラムの流体力学容量を与える。この曲線は、カラム・セットの汎用較正か、又は流体力学容量較正曲線かのいずれかと称される。
【０１６７】
汎用較正の仮定は、粘度計及びＲＩ検出器から得られた応答を用いて、サンプルの分布の絶対分子量分布を計算する方法に導く。汎用較正曲線（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）からの各スライスに対する流体力学容量、及び各スライスから得られた固有粘度の値が与えられると、我々は、単純に上記定義から各スライスの分子量を計算することができる。
【０１６８】
【数３１】
ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiを決定するための式（２１）及び式（２４）の直接的適用は、ピーク先端上に中心付けされたピークのその部分に対してのみ可能である。光散乱のケースにおけるように、これらの量の中の雑音は、ピーク端部で著しく増大する。それは、量ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiは双方、量ｌｏｇ（ｓｐ，ｉ／ｃi）に依存し、それは雑音の影響を受けた検出器応答の対数を取ることを要するからである。
【０１７０】
特に、式（２４）の比からの分子量の計算は、通常、分布の端部で物理的に意味のある値を生成しないであろう。即ち、スライス比から計算された分子量に対する値は、溶出容量の増大と共に単調に低減しないであろう。プロフィールの開始点及び終了点の近くで、それらは、各スライスに対する［］iの計算における検出器雑音の影響のため負となるよう計算することができる。
【０１７１】
しかしながら、ｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iの双方は、ピーク端部を含む、ピーク領域全体にわたって測定されることが必要である。再び、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるように、これは、通常、パラメータ化された滑らかなモデルをｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iに対してスライス番号の関数又は溶出容量の関数として適合させることにより達成される。量ｌｏｇＭi及びｌｏｇ［］iの双方が溶出容量のほぼ線形関数である傾向であるので、溶出容量の関数としての低次の多項式は、通常これらの量に適合される。
【０１７２】
従来技術の操作のデータ分析が、各スライスに対して測定された固有粘度の対数対溶出容量のためのモデル曲線を決定する方法がここで説明される。次の形式の式が用いられる。
【０１７３】
【数３２】
ここで、ｌｏｇ［］iは、固有粘度をスライスｉ及びＭ個のパラメータＰ０，…，ＰＭの関数として表すモデル曲線であり、従って次式のとおりである。
【０１７５】
【数３３】
パラメータＰ０，…，ＰＭは、量2に対する値を最小にするよう調整される。典型的には、
【０１７７】
【数３４】
ｌｏｇ［］i＝ｌｏｇ［（；Ｐ０，…，ＰＭ）］
に対する形式は、低次の多項式であり、従って次式のとおりである。
【０１７８】
【数３５】
しかしながら、本発明は、この多項展開の代わりにいずれのパラメータ化された滑らかなモデル曲線を組み込むことができる。
加算における各項は、スライス値の対数とモデル曲線から得られた固有粘度との間の比較である。この最小化は、固有粘度対スライス番号又は溶出容量を表すパラメータの推定値を得る。
【０１８０】
このモデル曲線を適合させる際に、ＲＬ−ＬＳ分析において扱われたのと同じ問題に直面する。再び、低次の多項式が、雑音の影響を受けた検出器応答の比の対数に適合される。ｌｏｇ（ｓｐ，／ｃi）における雑音は端部で著しく増大し、そして負の量の対数は定義されない。端部での検出器雑音の影響のため、この方法は、ピークの心臓部のみに適用することができる。モデルが適合される領域間の境界画定を決定することはユーザ次第である。従来技術において、ピーク端部における固有粘度法則は、このモデルからの外挿により得られる。
【０１８１】
固有粘度対スライス番号を見つけるための実施形態において、本発明は、各スライスに対する比粘度の測定された値に対して比粘度のモデルをスライス番号又は溶出値の関数として適合させることにより最小２乗最小化を再定式化する。従って、最小化されるべき量2は次式のとおりである。
【０１８２】
【数３６】
再び、ＩＶ曲線のためのモデルは式（２６）の形式である。この式は、ｓｐ，ｉを積［］iｃiと比較することにより最小２乗最小化を実行する。特に、この式は、固有粘度法則に対し、各スライスに対して、各スライスにおける被測定濃度の積に対する各スライスの被測定比粘度をモデル又は適合タイプと比較する。
【０１８４】
この式に到達すると、正確に同じ論理が、光散乱に対して行われたように最小２乗式を再定式化するのに用いられる。対数は指数化され、そして各項はｃiにより乗算される。
【０１８５】
ｃiにおける雑音が最小である場合、式（２８）における重み付けされない式は、パラメータＰｉに対して最適推定を与える。測定されたスライス値ｃiがかなりの雑音を含む場合、好適な式は次のとおりである。
【０１８６】
【数３７】
この式はまた最尤理論に合致する。
これらの式の利点は、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるのと同じである。分子の中の量ηsp,i−［η］iｃiの中の雑音は、ピーク・プロフィール全体にわたりほぼ一定である。対照的に、量
【０１８８】
【数３８】
の中の雑音は、ピーク端部において大きい。再び、この新しい方法は、ピーク全体にわたり、即ちピークの心臓部及びピーク端部における分布の固有粘度を決定することができる。
【０１９０】
一旦ｌｏｇ［］ｉに対するモデルが決定されると、ピーク全体にわたる各スライスに対する分子量は、式（２４）から決定されることができる。各スライスに対して、式（２４）が用いられ、式（２８）又は式（２９）を介して、本発明のモデル適合から得られる固有粘度に対する、汎用較正曲線から得られる流体力学容量の比としてＭｉを表す。式（２４）の両方のＨｉ及び［］ｉが滑らかなモデルから導出されるので、Ｍｉに対するその結果生じた値もまた、検出器応答の中の雑音による影響を著しくは受けないであろう。
【０１９１】
本発明は、ＲＩ−Ｖシステムにより得られたデータの分析からＭiの代替の決定を可能にする。この実施形態は、再び、各スライスに対して、比粘度のモデルを、スライス番号又は溶出容量の関数として、比粘度の被測定値に対して適合させる最小２乗最小化を採用する。しかし、ここで、比粘度のモデルは、各スライスに対するスライス値ｃi、流体力学容量Ｈi及び対数分子量に対するモデルに依存する。最小化されるべき量2は、次式のものである。
【０１９２】
【数３９】
ここで、再び、ｌｏｇＭiはパラメータ化された滑らかなモデルにより表され、それは、典型的には、次のように、低次の多項式である。
【０１９４】
【数４０】
再び、式（３０）の利点は、ＲＩ−ＬＳのケースにおけるのと同じである。再び、重み付け関数は、適当な場合この定式化の中に組み込まれることができ、これらの定式化は、最適推定の理論と一致する。
【０１９６】
一旦分子量対スライス番号に対するモデルが得られると、サンプルのＭＷＤを見つけることができる。一旦分子量対スライス番号に対するモデルが得られ、かつ固有粘度対スライス番号に対するモデルが見つけられると、固有粘度法則、即ちｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiが分かる。
【０１９７】
次いで、固有粘度に対する物理的に動機づけられたモデルは、ｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するモデル値に適合されることができる。そのようなモデルの例は、マルク−ホウインク法則及びジム−ストックメイヤー法則、即ち式（８）及び式（９）である。そのような法則をｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するモデル値に適合させる利点は、これらのモデルを表すパラメータが調査中の重合体サンプルを有効に特徴付けることである。例えば、マルク−ホウインク・モデルは、分岐された重合体の低分子量領域の一部に適合されて、その領域に対するＫ及びαを得ることができる。ジム−ストックメイヤー（ＺＳ）モデルは、ｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対するスライス値に対して、分岐された重合体の完全なピークにわたり適合されて、低分子量領域に対するＫ及びα、並びに重合体サンプルに対する分岐確率α及び形状係数を得ることができる。
【０１９８】
たとえ本発明の適用が従来技術の方法と比較してｌｏｇ［］i対ｌｏｇＭiに対する改善した値を生成するにしても、固有粘度法則の物理的パラメータの決定は、これらの方法における残りの欠点を蒙ることがある。固有粘度法則を表すパラメータに対する値は、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭiの両方対スライス溶出容量を表すため仮定されたモデルの形式に依存する。これらの多項式（又は他の仮定された）モデルが、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭi対溶出容量の依存性を表すのに不正確である場合、固有粘度法則を表すパラメータの精度は、対応した不正確さを蒙るであろう。
【０１９９】
この不正確さの原因は検出器雑音のためでない。むしろ、それは、ｌｏｇ［］i及びｌｏｇＭi対スライス溶出容量を表すため用いられたモデル曲線の形式における誤差から生じている。これらのモデルがカラムに対する分子量較正曲線並びに重合体の固有特性を説明しなければならないということに注目することは価値がある。
【０２００】
本発明の次の実施形態は、データ分析領域の全体にわたり同時に２つの関係を解決することにより固有粘度法則のパラメータを決定する方へ指向している。この方法において、ＩＶ法則は、スライス・データから直接決定され、追加の補助的モデルの仮定を必要としない。
【０２０１】
解決されるべき２つの関係は、次のとおりである。
１．被測定比粘度の比粘度予測値との最小２乗比較であって、それは固有粘度モデル法則と濃度のスライス測定値との積である。最小２乗比較は、次のとおりである。
【０２０２】
【数４１】
ここで、χ2は、各スライスに対して計算された差の２乗の和である。この式において、固有粘度法則は分子量の対数の関数であり、固有粘度の形式は次のとおりである。
【０２０４】
【数４２】
ＭＷ較正がここでは分からないので、この式の最小は、追加の情報なしに見つけることができない。この追加の情報は、解決されるべき第２の関係により与えられ、それは次のものである。
【０２０６】
２．各スライスｉに対する、流体力学容量、固有粘度及び分子量間の基本的関係。
【０２０７】
【数４３】
式（３４） Ｈi≡Ｍi［η］i
再び、固有粘度法則は式（３３）により表される。
【０２０８】
式（３４）を用いて、式（３３）におけるＭiの依存性、即ちサンプルのＩＶＬを排除する。従って、ＩＶＬの明示的形式が与えられる場合、本発明の重要な部分は、ＩＶＬを再度表すことを含み、それにより［］iは、パラメータＰ１，…，ＰＭ及び流体力学容量Ｈiのみに依存する。
【０２０９】
この代数的置換は、以下の線形ＩＶＬのケースにおいて明示的に証明されるであろう。式（９）及び式（１０）において表されるような、より複雑なＩＶＬのケースにおいて、単純な代数的置換は、［］iをＨiの関数として閉じた形式で決定するのに十分でない。式（３３）、Ｐ１，…，ＰＭ及びＨiに対する値が与えられる場合、式（３４）は、数値的方法を用いて解けて、［］iに対する値を与えることができる。これらの数値的方法（根決定による式の解法）は、本明細書に援用されているＳ．Ａ．Ｔｅｕｋｏｌｓｋｙ、Ｗ．Ｔ．Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ及びＢ．Ｐ．Ｆｌａｎｎｅｒｙ（Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）著「Ｃ、科学計算技術における数値レシピ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ，Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）」（第２版）（１９９２年、Ｗ．Ｈ．Ｐｒｅｓｓ発行）の３４７〜３９３頁に記載されている。
【０２１０】
従って、式（３２）は、ここで被測定量ｓｐ，ｉ、ｃi、Ｈi及びパラメータＰ１，…，ＰＭのみに明示的に依存する。式（３２）の最終公式においてｌｏｇＭを明示的に参照しない。また、従来技術とは対照的に、溶出容量を独立変数として参照してない。従って、ＩＶＬのパラメータは、被測定検出器応答に対する単一の適合により決定される。
【０２１１】
最小化後に、各スライスに対して［］ｉに対する適合された値が得られる。この値、及びＨi及びＭiに対する既知の値は、基本的関係、即ち
【０２１２】
【数４４】
Ｈi≡Ｍi［η］i
からの直接計算から決定される。それにより、サンプルのＭＷＤが得られる。再び、追加の適合が要求されない。
【０２１３】
図１１は、外挿に依拠する従来技術方法により決定されるＩＶ法則、及び本発明の例示的方法により決定されるＩＶ法則をプロットする。４つの曲線、即ち、スライスから決定されたＩＶ法則６０、本発明の例示的方法から決定されたＩＶ法則６２、従来技術の方法により決定されたＩＶ法則６４、及び図３における基準に対するサンプルのＭＷＤ ３５が重ねられている。
【０２１４】
光散乱のケースにおけるように、最小２乗問題は、ここで、雑音の多いデータの比の比又は対数を取ることを避けるため、定式化される。各項における雑音が同じ大きさであり、そのため重み付けされない最小２乗の使用は適切である。適合は、ピーク領域における基線を訂正されたデータの全てに対して実行されることができる。被測定値ｓｐ，ｉ及びｃiは、ゼロ近くであり、そしてこれらの応答をゼロの周りで揺らぐようにさせる雑音を含み得る。
【０２１５】
量2の定式化のための本発明において、ゼロ応答と一致する測定値の包含は、Ｋ及びαのようなＩＶＬを表すパラメータに関する制約を改善する。従って、本発明は、特にピークの端部において、測定誤差に対してかなり敏感でない。
【０２１６】
更に、２つの式を同時に適合させる利点は、ＩＶ法則及び分子量較正が全てのスライス・データに対する単一の適合から推定されることを意味する。複数の適合及び外挿の実行はもはや必要でない。従来技術において、追加の適合は、特別のカラム依存の適合タイプが仮定されねばならなかったので、系統的誤差の潜在的原因である。
【０２１７】
ＩＶ法則が線形であるケースにおいて、式（８）
【０２１８】
【数４５】
ｌｏｇ［η］＝ｌｏｇＫ＋αｌｏｇＭ
は、
【０２１９】
【数４６】
［η］＝ＫＭα
と再び表される。そこで、流体力学容量と分子量との関係は、
【０２２０】
【数４７】
Ｈ＝ＫＭα+1
である。
【０２２１】
従って、我々は、Ｍiを排除し、ＩＶＬを次のとおり表す。
【０２２２】
【数４８】
次いで、最小化されるべき式は次のとおりである。
【０２２４】
【数４９】
この最終の形式において、量2は、被測定スライス値ｓｐ，ｉ、Ｈi及びｃi、及びパラメータＫ及びαのみで表される。溶出容量に対する明示的参照はなされない。
【０２２６】
量2を最小化するＫ及びαの値が、ある適当な最小化アルゴリズムにより見つけられると仮定すると、各スライスの分子量は、次の関係
【０２２７】
【数５０】
Ｍi＝（Ｈi／Ｋ）1/(1+α)
から得られ、そしてスライスに対して［］iのためのモデル値が、式（３５）から得られる。
【０２２８】
例示的実施形態において、本発明は、式（８）、式（９）及び式（１０）に表される定式化を用いて実行され、それらの式は、対数の固有粘度法則に対する３つの適合タイプを定義する。分子量の対数の線形関数、長い連鎖分岐を表すジム−ストックメイヤー法則、及びより高次の多項式関数が存在する。
【０２２９】
図１２は、以下に詳細に説明されるような本発明の例示的実施形態により実行されるステップを図示する。第１の検出器から得られるデータ１００（例えば、濃度検出器からのスライス・データ）は、サンプル特性を表すパラメータ化されたモデル曲線１０３と組み合わされて、モデル曲線を構成する（ステップ１０４）。データ１０２は、第２の検出器から得られる（例えば、分子量に感応する検出器からのスライス・データ）。最小２乗最小化アルゴリズムが、実行される（ステップ１０８）。最小２乗最小化アルゴリズムの詳細が以下に記載される。その結果は、最適化モデル曲線及びパラメータである（ステップ１１０）。
【０２３０】
図１３は、以下に詳細に説明されるようにＲＩ−ＬＳ検出からサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）を推定する、一実施形態のためのステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータは処理され、スライスの濃度を得る（ステップ１０５）。ｌｏｇＭ対溶出容量を表すパラメータ化されたモデル（式（１３））１０３ａは、濃度スライス１０５と共に用いられて、次の式によりスライスのレイリー比を表すモデル曲線を構成する（ステップ１０４ａ）。
【０２３１】
【数５１】
（ＬＳ検出器のような）分子量感応検出器１８ｂからの第２のデータが、スライスの中に処理され、そしてレイリー比が、各スライスに対して決定される（ステップ１１２）。最小２乗最小化アルゴリズムが、式（１８）又は式（１９）を用いて実行され（ステップ１０８）、図１０における曲線５２により示されるように、ｌｏｇＭ対溶出容量を表す最適化モデル曲線をもたらす。次いで、サンプルの分子量分布が生成される（図１３のステップ１２０）。
【０２３３】
図１４は、以下に詳細に説明される、サンプル固有粘度をＲＩ−Ｖ検出から推定する実施形態のためのステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータはスライスの濃度として処理される（ステップ１０５）。ｌｏｇ［］対溶出容量（式（２７））を表すパラメータ化されたモデル１０３ｂを濃度スライス１０５と共に用いて、スライスの比粘度を表すモデル曲線を次式によりステップ１０４ｂにおいて構成する。
【０２３４】
【数５２】
粘度検出器１８ｃからの第２のデータは、スライスに対する比粘度を用いて処理される（ステップ１１６）。最小２乗最小化が、式（２８）又は式（２９）を用いて実行される（ステップ１０８）。ｌｏｇ［］対溶出容量（式（２７））の最適化モデルが生成される（ステップ１１０ｂ）。
【０２３６】
図１５は、以下に詳細に説明される、本発明に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度及び分子量分布を同時に推定する別の実施形態に従って実行されるステップを図示する。データは、（ＲＩ検出器のような）濃度感応検出器１８ａから得られる。そのデータは、スライスの濃度として処理される（ステップ１０５）。ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭ（ＩＶＬ）を表すパラメータ化されたモデル１０３ｃ、式（３３）をスライスの濃度と共に用いて、初期モデル曲線を構成する（ステップ１０４ｃ）。また、モデル曲線を構成するため、汎用較正曲線から得られたスライスの流体力学容量が用いられる（ステップ１１９）。ステップ１０４ｃで生成された初期モデル曲線は、スライス・データの固有粘度を表す制約を含む。
【０２３７】
粘度検出器１８ｃからの第２のデータが処理され、スライスに対する比粘度を得る（ステップ１１６）。最小２乗最小化（ステップ１０８）が、構成された初期モデル曲線１０４ｃ、及びスライス・データの比粘度１１６に関して実行される（式（３２））。ｌｏｇ［］対ｌｏｇＭを表すモデル曲線が、生成される（ステップ１１０ｃ）（式（３３））。この曲線１１０ｃから、ｌｏｇＭ対溶出容量を表すモデル曲線が、
【０２３８】
【数５３】
式（３９） ｌｏｇＭi＝ｌｏｇＨi−ｌｏｇ［η］i
に従って生成され（ステップ１１０ａ）、次いでサンプルの分子量分布が生成される（ステップ１２０）。最後に、また曲線１１０ｃから、ｌｏｇ［］対溶出容量のモデル曲線が生成される（ステップ１１０ｂ）。
【０２３９】
図１６は、図１２から図１５の最小２乗最小化ステップをより詳細に図示する。（濃度検出器１８ａからのスライス・データから生成された）初期モデル曲線１０４は、式（１８）、（１９）、（２８）、（２９）、（３０）、（３２）及び（３６）を含む複数の式を用いて量2を計算ことにより、検出器１８ｂからのスライス・データ１０２と比較される。前述したように、モデル・パラメータは、調整され（ステップ１２６）、そして量2は、再び、その量2が最小化されるまで計算される（ステップ１２４）。この点で、最適化モデル曲線及び最適化モデル・パラメータが決定される（ステップ１１０）。
【０２４０】
ＲＩ検出器、Ｖ検出器及びＬＳ検出器の特定の例が本明細書において記載されたが、他のモデルのような、及び／又は他の製造業者からの他の検出器を実施できることが認められるであろう。
【０２４１】
本発明は、その例示的実施形態に関して示されかつ説明されたが、種々の他の変形、省略、及び追加がその形式及び細部において本発明の趣旨及び範囲から離れることなくなし得るであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明を含むシステムにより分析されるべきデータを与えるゲル透過クロマトグラフィー・システムの全体図である。
【図２】 図２は、本発明に従った、データを分析する例示的コンピュータ・システムである。
【図３】 図３は、質量がカラム上に注入された場合のサンプルのシミュレートされたＭＷＤであってｄｍ／ｄ（ｌｏｇＭ）を与えるため正規化されたＭＷＤのグラフ、即ちＭＷの単位対数間隔当たりの質量のグラフである。
【図４】 図４は、３つの固有粘度法則のプロットを示すグラフである。
【図５】 図５は、サンプル分子量較正曲線である。
【図６】 図６は、サンプル濃度対溶出容量を示すグラフである。
【図７】 図７は、図６に示される濃度プロフィールに対する計器応答に基づく検出器プロフィールを図示する。
【図８】 図８は、検出器雑音を含む、図７の検出器応答を図示する。
【図９】 図９は、スライス・データ対溶出容量から得られた分子量較正曲線を図示する。
【図１０】 図１０は、例示的実施形態から得られた分子量較正を従来技術の方法と比較して図示する。
【図１１】 図１１は、例示的実施形態に従ったＲＩ−Ｖ検出から決定されたサンプルのＩＶ法則を従来技術の方法と比較して示す。
【図１２】 図１２は、本発明の一実施形態に従って実行されるステップの全体図である。
【図１３】 図１３は、図１２の実施形態に従ったＲＩ−ＬＳ検出からサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）を推定するため実行されるステップの全体図である。
【図１４】 図１４は、図１２の実施形態に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度対溶出容量を推定するため実行されるステップの全体図である。
【図１５】 図１５は、本発明に従ったＲＩ−Ｖ検出からサンプルの固有粘度法則及び分子量分布を推定するための別の実施形態に従って実行されるステップの全体図である。
【図１６】 図１６は、図１２から図１５に示される実施形態により利用される最小２乗適合ステップの全体図である。
Claims (12)
- ゲル透過クロマトグラフィー装置を用いて処理されたサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）をコンピュータ・システム上で決定する方法において、
前記サンプルを検出する濃度感応検出器から第１のデータを取得するステップと、
サンプル特性を表すパラメータ化された初期モデル曲線を得るステップと、
前記第１のデータ及び前記パラメータ化された初期モデル曲線から初期モデル曲線を構成するステップと、
前記サンプルを検出する分子量感応検出器から第２のデータを取得するステップと、
前記パラメータ化された初期モデル曲線及び前記第２のデータから、パラメータ化された最適化モデル曲線及び最適化パラメータを決定して、前記クロマトグラフィー装置に分子量較正を与えるステップと、
前記クロマトグラフィー装置を用いて前記サンプルの濃度プロフィールを取得し、かつ前記分子量較正及び前記濃度プロフィールを用いて、前記ＭＷＤを決定するステップと
を備える方法。 - 前記分子量感応検出器が光散乱（ＬＳ）検出器を含む請求項１記載の方法。
- ゲル透過クロマトグラフィーにより処理されたサンプルの固有粘度対溶出容量をコンピュータ・システム上で決定する方法において、
前記サンプルを検出する第１の検出器から第１のデータを取得するステップと、
固有粘度の対数対溶出容量を表すパラメータ化された初期モデル曲線を得るステップと、
前記第１のデータ及び前記パラメータ化された初期モデル曲線から比粘度の初期モデル曲線を構成するステップと、
前記サンプルを検出する分子量感応検出器から第２のデータを取得するステップと、
前記パラメータ化された初期モデル曲線及び前記第２のデータから、固有粘度の対数対溶出容量の最適化モデル曲線であるパラメータ化された最適化モデル曲線及び最適化パラメータを決定するステップと
を備える方法。 - 前記分子量感応検出器が粘度計（Ｖ）検出器を含む請求項３記載の方法。
- ゲル透過クロマトグラフィーにより処理されたサンプルの分子量分布（ＭＷＤ）及び固有粘度法則（ＩＶＬ）をコンピュータ・システム上で同時に決定する方法において、
前記サンプルを検出する濃度感応検出器から第１のデータを取得するステップと、
固有粘度の対数対分子量の対数を表すパラメータ化された初期モデル曲線を得るステップと、
汎用較正曲線からスライスの流体力学容量を得るステップと、
前記第１のデータ、前記パラメータ化された初期モデル曲線及び前記スライスの流体力学容量から比粘度の初期モデル曲線を構成するステップと、
前記サンプルを検出する分子量感応検出器から第２のデータを取得するステップと、
前記パラメータ化された初期モデル曲線及び前記第２のデータから、固有粘度の対数対分子量の対数のパラメータ化された最適化モデル曲線及び最適化パラメータを決定するステップと、
前記パラメータ化された最適化モデル曲線及び最適化パラメータからＩＶＬを決定するステップと、
固有粘度の対数対分子量の対数の最適化モデル曲線としてＩＶＬを決定するステップと、
前記ＩＶＬから得られた分子量較正情報を得るステップと、
前記分子量較正情報から前記ＭＷＤを決定するステップと
を備える方法。 - 前記初期モデル曲線が、前記サンプルのレイリー比対溶出容量を表す請求項１記載の方法。
- 前記パラメータ化された初期モデル曲線を得る前記ステップは、前記分子量較正を溶出容量の関数として表す曲線を得るステップを含む請求項１記載の方法。
- 前記パラメータ化された最適化モデル曲線及び最適化パラメータを決定する前記ステップは、前記初期モデル曲線及び前記第２のデータに関して最小２乗最小化適合を実行するステップを備える請求項１記載の方法。
- 前記濃度プロフィールが、前記濃度感応検出器を用いて得られる請求項１記載の方法。
- 固有粘度の対数対溶出容量の前記最適化モデル曲線を決定する前記ステップは、前記初期モデル曲線及び前記第２のデータに関して最小２乗最小化適合を実行するステップを含む請求項３記載の方法。
- 固有粘度の対数対分子量の対数の前記最適化モデル曲線としてＩＶＬを決定する前記ステップは、最小２乗を実行するステップを含む請求項５記載の方法。
- 前記濃度感応検出器が粘度計（Ｖ）検出器を含む請求項５記載の方法。
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