JP4121330B2 - 水難溶性ポリフェノールを含む機能性素材 - Google Patents
水難溶性ポリフェノールを含む機能性素材 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリフェノールを含有する植物抽出物に対してポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分を含む機能性素材、すなわち水難溶性ポリフェノールを含む機能性素材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでに、ポリフェノールを含有する植物抽出物が、抗菌性、消臭性、抗酸化活性などの機能を有していることが知られている。また、ポリフェノールを含有する植物抽出物は、植物素材として製造が容易であり、かつ安全性が高いことから、繊維、プラスチック、塗料、ゴム、木材、紙などの多くの製品に添加され、その機能性を活かした商品開発がなされている。
【０００３】
しかし、植物抽出物に含まれるポリフェノールのほとんどが水溶性であることから、その加工法や耐久性などに問題があった。例えば、度重なる洗浄により有効成分であるポリフェノールが溶出し、結果として製品の機能性が経時的に低下するという難点があった。また、製造工程において、ポリフェノールを含む混合物が吸湿性であることから、合成樹脂などの有機反応を主体とする工程に用いるには不都合があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記問題点を解決すべく、本発明は、水に対して難溶な機能性ポリフェノール含有素材を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、以下に記載の手段を採用する。
（１） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗菌剤。
（２） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む消臭剤。
（３） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗ウイルス剤。
（４） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗菌剤を製造する方法。
（５） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む消臭剤を製造する方法。
（６） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗ウイルス剤を製造する方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の機能性素材は、ポリフェノールを含有する植物抽出物に対してポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分を含むものである。
【０００７】
本発明で使用されるポリフェノールを含有する植物抽出物は、ポリフェノールを含有する植物からポリフェノールを含むように抽出された物であれば特に限定されないが、ポリフェノールのなかでもとりわけカテキン類を多く含有する植物からの抽出物が好ましい。ここで、カテキン類とは、３−オキシフラバン誘導体もしくはこれらの混合物をいう。カテキン類として、例えば、(−)−エピカテキン(ＥＣ)、(−)−エピガロカテキン(ＥＧＣ)、(−)−エピカテキンガレート(ＥＣＧ)、(−)−エピガロカテキンガレート(ＥＧＣＧ)、さらにその異性体である(±)−カテキン(Ｃ)、(−)−ガロカテキン(ＧＣ)、(−)−カテキンガレート(ＣＧ)、(−)−ガロカテキンガレート(ＧＣＧ)、これらカテキン類の酸化２量体であるテアフラビン類、もしくはこれらの混合物が挙げられる。
【０００８】
カテキン類を多量に含有する植物としては、アカネ科（例えば、アセンヤク（阿仙薬；Uncaria gambir Roxburch））、ツバキ科（例えば、茶（Camellia sinensis））、マメ科（例えば、Acacia catechin Willdenow）の植物等が挙げられるが、なかでも入手しやすさ、加工しやすさ、安価であることから茶植物が好ましい。抽出に使用する植物の部位としては、任意の部位でよいが、例えば、葉、茎、木部、樹皮、実、種子、根を用いることができる。好ましくは、茶植物の葉（茎、芽を含む）を用いる。また、茶の種類としては、緑茶、釜炒り緑茶、ほうじ茶などの不発酵茶、ウーロン茶、包種茶などの半発酵茶、紅茶などの発酵茶、これらの混合物が挙げられる。
【０００９】
抽出の仕方は、ポリフェノールが抽出される手法であれば特に限定されない。例えば、日本国特許第2703241号、特開平2-311474号、日本国特許第3052172号、日本国特許第3052174号に記載される方法を使用することができる。好ましくは、水（冷水および熱水を含む）、メタノール、エタノールなどの抽出溶媒を用いて、植物に対して抽出操作を行うことにより、ポリフェノールを含有する植物抽出物を得ることができる。
【００１０】
より簡便には、ポリフェノール含量が９０重量％以上の茶抽出物、商品名テアフラン９０Ｓ（株式会社伊藤園製）、またはポリフェノール含量が３０重量％以上の茶抽出物、商品名テアフラン３０Ａ（株式会社伊藤園製）を使用することができる。好ましくは、ポリフェノール含量が少なくとも３０重量％以上の茶抽出物を用いる。このように、ポリフェノール成分の含量が高い抽出物は、粗抽出物を使用したときより重合反応にかかる時間が短いという利点を有する。
【００１１】
本発明においてポリフェノールを重合させる反応は、フェノール樹脂を作成する際の反応と同様にして行うことができる。すなわち、ポリフェノール分子が縮合重合反応により高分子となり、水に難溶なポリフェノールが形成される反応である。より具体的に、縮合重合反応は、ポリフェノールのもつフェノール核に、酸触媒下でアルデヒドが付加し、別のポリフェノールと縮合反応を起こす。この反応において、フェノール性水酸基は反応に関与せず保持されている。この反応で形成される水に難溶なポリフェノールは、以下、重合化ポリフェノール、水難溶性ポリフェノールともいう。
【００１２】
縮合重合反応に使用するアルデヒドの種類は限定されないが、好ましくは鎖式アルデヒド、例として、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、１−プロパナールを用いることができる。なかでも反応性や簡便性の観点からホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、短鎖アルデヒドが好ましい。ここでアルデヒドの使用量は、特に限定されないが、その添加量や濃度の違いによって、有機溶媒への溶解度が異なる不溶化物（重合化ポリフェノールを含む）を得ることができるため、適宜設定することが好ましい。
【００１３】
例えば、原料として用いる植物抽出物に含有されるポリフェノールの量に対して、モル比で０．５〜過剰量に相当する量のホルムアルデヒドを使用することができる。ここで「植物抽出物に含有されるポリフェノールの量（モル）」は、主成分の没食子酸エピガロカテキンの分子量を用いて換算した値をいう。以下ポリフェノールの量とは、このようにして求めた値をいう。
【００１４】
後述の調製例１のように、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノールの量（約３ミリモル）に対して過剰量（調製例１では約４０倍以上）使用した場合、あらゆる有機溶媒および水に対して難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。また、後述の調製例２のように、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノールの量（約３ミリモル）に対してモル比で０．５倍程度使用した場合、極性の高い有機溶媒（アセトンやメタノールなど）には溶解するが、水に難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。このように、アルデヒドの添加量を変えることで、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分の溶解度を任意に調整することができる。
【００１５】
あるいは、水不溶性画分の溶解度は、重合反応溶媒中のポリフェノールの濃度によっても調整することができる。重合反応溶媒中のポリフェノール濃度は、特に限定されないが、反応効率や後処理の簡便さから、１〜４０重量％が望ましい。
【００１６】
例えば、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノール量（約１．５ミリモル）に対してモル比で１倍程度使用する場合、ポリフェノール濃度が５重量％のとき、全ての溶媒に対して不溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分が得ることができる。一方、ポリフェノール濃度が２重量％のとき、極性の高い有機溶媒（アセトンやメタノールなど）には溶解するが、水に難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。
【００１７】
このように、ホルムアルデヒドの使用量および/またはポリフェノールの濃度を調整することにより、所望の溶解度を有する重合化ポリフェノールをつくることが可能である。このことを、本発明者らは本発明において新たに見出した。
【００１８】
また、ポリフェノール分子の縮合重合反応に使用される酸触媒については、その種類は特に限定されないが、例えば、塩酸や蓚酸を使用することができる。本反応では触媒としての使用であるため濃酸を使用する必要はない。例えば酸触媒として、１％希塩酸溶液を使用することができる。
【００１９】
ポリフェノールを重合し高分子化させる反応は、例えば下記のように行うことができる。まず、ポリフェノールを含有する植物抽出物（例えばテアフラン９０Ｓ）を溶媒（例えば水）に常温にて溶解し、溶液中のポリフェノール濃度を所定の濃度（例えば１〜６０重量％）にする。その後、この溶液に、酸（例えば塩酸）を最終濃度１％程度になるように添加するか、もしくはこの溶液を、酸１％程度の希釈溶液に溶解する。その後、適量（例えばポリフェノールの量に対してモル比で０．５〜過剰量）のアルデヒド化合物（好ましくはホルムアルデヒド）を添加し、常温もしくは加温しながら攪拌し、不溶物を分取する。得られた不溶物を蒸留水で洗浄し、水不溶性画分を得る。
【００２０】
ここで、ポリフェノールを含有する植物抽出物、酸、およびアルデヒド化合物を添加する順序やこれら添加物の濃度、加熱の有無は、特に限定されず、植物抽出物に含まれるポリフェノールの反応性に応じて適宜設定する。
【００２１】
得られた水不溶性画分には、重合し高分子化した水難溶性のポリフェノールが含有される。このように本発明において、水不溶性画分に含まれるポリフェノールは、該条件下では水に不溶であるが、条件が変われば水に溶解する可能性があるという意味において水難溶性という。
【００２２】
本発明の好ましい機能性素材の一例として、ポリフェノールを含有する茶植物の葉抽出物（テアフラン９０Ｓ）に対して、下記のとおりポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分が挙げられる。すなわち、ポリフェノールを重合させる反応は、茶植物の葉抽出物（テアフラン９０Ｓ）を溶媒（水）に常温にて溶解し、溶液中のポリフェノール濃度を４０重量％にし、次いで、この溶液に酸（塩酸）を最終濃度１％になるように添加し、その後、茶抽出物に含まれるポリフェノールの量に対してモル比で０．５倍のホルムアルデヒドを添加し、常温もしくは加温しながら攪拌する反応をいう。
【００２３】
このようにして得られた好ましい機能性素材は、メタノール、エタノール、アセトンには溶解するが、水、ヘキサンに難溶な性質を有する。この好ましい機能性素材を、レーヨンなどの繊維に練り込ませ、その機能性を付与することができる。より詳細には、例えば、得られた機能性素材を、マイクロカプセルなどの担体に担持させ、ビスコースに練り込み紡糸することで、機能性素材を保持した抗菌性のレーヨン繊維をつくることができる。
【００２４】
本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分は、原料のポリフェノールを含有する植物抽出物と同等もしくはそれ以上に、抗菌性、消臭性、抗酸化活性、抗ウイルス活性を維持していた。そのため、得られた水不溶性画分は、当該性質を利用した機能性素材として、繊維（天然、合成、半合成も含む）、プラスチック、金属、セラミックス、塗料、油脂、ゴム、木材、紙などの製品に添加することができる。
【００２５】
本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分の抗菌性は、任意の細菌、真菌に対して効果を有し、下記の実施例では、代表的なグラム陽性菌、グラム陰性菌に対して効果を有することが実証されている。また、本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分の抗ウイルス活性は、任意のウイルスに対して効果を有し、下記の実施例では、インフルエンザウイルスに対して効果を有することが実証されている。
【００２６】
【実施例】
（調製例１）
ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）２ｇを、ホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）１０ｍＬに溶解させた。次に１％塩酸４０ｍＬを添加し、約３０分加熱した。その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加えて攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた沈渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を1.95ｇ得た。得られた水不溶性画分は、クロロホルム、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、二硫化炭素、エーテル、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどあらゆる有機溶媒に不溶であった。
【００２７】
（調製例２）
ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）１ｇを、水５０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）200μＬを添加し、攪拌した後、濃塩酸１滴を加え、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、吸引濾過により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）を0.58ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。また、水では酸性条件では不溶であるが、アルカリ性条件では、化合物の一部が分解し、色調に変化を来たした。
【００２８】
（調製例３）
ポリフェノール含量３０重量％以上の茶抽出物（テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）株式会社伊藤園製）４５０ｇを、１％塩酸１１２５ｍＬに溶解させた。加熱し、次にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）２９８ｍＬを添加した。その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加えて攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた沈渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｃ）を３８９.４４ｇ得た。得られた水不溶性画分は、クロロホルム、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、二硫化炭素、エーテル、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどあらゆる有機溶媒に不溶であった。
【００２９】
（調製例４）
ポリフェノール含量３０重量％以上の茶抽出物（テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）株式会社伊藤園製）２ｇを、１％塩酸４０ｍＬに溶解させ、ホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）４００μＬを加え８５℃以上に加熱し攪拌した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）を０．８ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。また、水では酸性条件では不溶であるが、アルカリ性条件では、化合物の一部が分解し、色調に変化を来たした。
【００３０】
（調製例５）
ポリフェノール含量６０重量％以上の茶抽出物（テアフランＷ（ＴＦＷ）株式会社伊藤園製）５０ｇを、１％塩酸１３５ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）５ｍＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、吸引濾過により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）を４３．８７ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００３１】
（実施例１：抗菌活性測定１）
測定試料として、茶抽出物ＴＦ９０Ｓ、茶抽出物ＴＦ３０Ａ、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）、茶抽出物ＴＦＷ、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）を用いた。各試料を１ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１ｍＬに溶解させた。これら試験液を濾過滅菌した後、滅菌したペーパーディスク（φ８ｍｍ）上に７０μＬ（濃度１ｍｇ/ｍＬ）吸着させた。
【００３２】
一方、直径９ｃｍのペトリ皿に感性ディスク平板培地（10ｍＬ）を作成し、これに共試菌（Staphylococcus aureus、またはEscherichia coli）を懸濁した半流動性寒天培地（感性ディスク培地）４ｍＬを重層した。
【００３３】
この培地に、上述のペーパーディスクを置き、３５±１℃で２４時間培養し、その後５℃で２日間保存した。結果は、阻止帯の有無によって判定した（ｎ＝３）。ペーパーディスクの直径８ｍｍを含む阻止帯の直径（ｍｍ）を、下記表１に示す。３サンプルの結果をＩ〜IIIとして示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
その結果、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦ９０Ｓが１１．３ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂが１２．３ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦ９０Ｓが１３．０ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂが１３．７ｍｍであった。
【００３６】
また、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦ３０Ａが１０．５ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｄが１１．３ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦ３０Ａが１３．２ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｄが１３．２ｍｍであった。
【００３７】
また、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦＷが１１．２ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｅが１１．８ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦＷが１３．７ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｅが１２．５ｍｍであった。
【００３８】
以上の結果より、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂ、ＰＰｉ−Ｄ、ＰＰｉ−Ｅは、それぞれの原料である茶抽出物と同等かそれ以上の抗菌活性を示した。
【００３９】
（実施例２：抗菌活性測定２）
調製例１で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）をポリスチレンへ練り込み加工し、その抗菌活性を測定した。
【００４０】
まず、ポリスチレン１ｋｇに対し、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を５５ｇ添加混合し、２００℃にて加温溶解させた。その後、ペレット状から板状に再加工し、フィルム密着法により抗菌活性を測定した。
【００４１】
ここで使用したフィルム密着法は、抗菌製品技術協議会により発行されている試験法（1998年改訂版）に基づくものである。なお、ここで使用したフィルム密着法は、現在制定されている日本工業規格（ＪＩＳ）に基づくフィルム密着法と、接種用菌液の調製に使用するＮＢ培地（普通ブイヨン培地）の希釈率が「１/１００ＮＢ」であった点においてのみ異なる。
【００４２】
コントロールとして、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を添加せずポリスチレンのみのものを使用した。
【００４３】
その結果を以下に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
以上の結果より、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）は、コントロールのポリスチレンのみに対して抗菌活性を有していることが示された。
【００４６】
（実施例３：消臭性測定）
テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）、テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）、調製例２で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、および調製例４で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）を測定試料として用いて、その消臭性を測定した。
【００４７】
各試料を１０ｍｇ秤量し、３リットルのアンモニアガスとともにテドラーバッグに入れ、２時間後のヘッドスペースの残存アンモニアガス濃度をガス検知管で測定した。
【００４８】
消臭率(％)＝(Ｃ0−Ｃ1)/Ｃ0×１００
Ｃ0：０時間のアンモニアガス濃度、Ｃ1：２時間後のアンモニアガス濃度
【００４９】
その結果を図１に示す。水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）および（ＰＰｉ−Ｂ）は、それぞれの原料であるテアフラン３０Ａ、同９０Ｓに対して消臭力は上昇していた。これは、反応により重合が進み、高分子化したことによりＮＨ3を捕捉し易くなったためと考えられる。
【００５０】
（実施例４：ＮＭＲ測定）
(１)測定試料の調製
測定試料として、▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分、▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分、▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分を用いた。
【００５１】
各測定試料は以下に記載のとおり調製した。
【００５２】
▲１▼(＋)−カテキンは、EXTRASYNTHESE製のものを使用した。
【００５３】
▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。(＋)−カテキン(EXTRASYNTHESE製)１ｇを水８０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）１４０μＬを添加し、攪拌した後、濃塩酸１滴を加え更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．４５ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５４】
▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。(＋)−カテキン(EXTRASYNTHESE製)１ｇを１％塩酸２０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液に２０％ 13Ｃラベル化ホルムアルデヒド（Aldrich Chem. Co.製）２６７μＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を２回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．７５ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５５】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）は、上記調製例２に従って調製した。
【００５６】
▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）１ｇを１％塩酸２０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液に２０％ 13Ｃラベル化ホルムアルデヒド（Aldrich Chem. Co.製）１９４μＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を２回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．７８ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５７】
(２)測定方法および測定結果
▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲは、Jeol JNM-EX270（270MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図２および図３に示す。
【００５８】
▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-EX270（270MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-LA500（500MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分、▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図４、図５および図６に示す。
【００５９】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-LA500（500MHz）、溶媒：重メタノールを使用し測定した。▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図７および図８に示す。
【００６０】
化学シフトは、測定溶媒を内部標準物質とし、ｐｐｍであらわした。
【００６１】
▲１▼(＋)−カテキン（図２）と、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分（図３）の1Ｈ−ＮＭＲを比較すると、3.5−3.9ｐｐｍに新たなブロードピークが検出された。また、これら試料▲１▼および▲２▼の13Ｃ−ＮＭＲ（図４と図５）より、18ｐｐｍ付近に新たにピークが検出された。これらのピークは、何れも不溶化反応によりできたピークである。
【００６２】
▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分（図５）と▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分（図６）の13Ｃ−ＮＭＲを比較すると、18ｐｐｍ付近のピークが大きく検出された。このピークはホルムアルデヒドに由来する。
【００６３】
以上の結果より、本反応では、ポリフェノールの持つフェノール核にホルムアルデヒドが付加してメチレン架橋を形成し、別のポリフェノールと縮合重合を起こしていると考えられる。
【００６４】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ、図７）と▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分（図８）の13Ｃ−ＮＭＲを比較すると、(＋)−カテキンの場合と同様に、18ｐｐｍ付近のピークが大きく検出された。
【００６５】
以上の結果より、茶抽出物ＴＦ９０Ｓは、(＋)カテキンと同様に、ホルムアルデヒド由来のメチレン架橋を形成し、ポリフェノールが縮合重合していると推察される。
【００６６】
（実施例５：質量分析）
茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（LCQ、ThermoQuest社製）、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ApexII 70e、Bruker Daltonics社製）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）を使用して測定した。
【００６７】
ＥＳＩ−ＩＴＭＳは、加熱キャピラリー温度：２１０℃、溶媒：５０％メタノール、キャピラリー電圧：１４Ｖ、シースガス流量：１０Ｌ/分、導入法：シリンジポンプ（流速：５μＬ/分）で測定した。
【００６８】
ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳは、ドライガス温度：１３０℃、溶媒：５０％メタノール（0.１％酢酸含有）、導入法：シリンジポンプ（流速２μＬ/分）で測定した。
【００６９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、リニアモード、加速電圧：２０ｋＶ、マトリクス：インドールアクリル酸で測定した。
【００７０】
ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（図９）、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（図１０）より、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）とエピカテキンガレート（ＥＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；８９７[Ｍ＋Ｈ]+）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；９１３[Ｍ＋Ｈ]+）、及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；９２９[Ｍ＋Ｈ]+）と予測される分子量を得た。
【００７１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（図１１および図１２）より、最大７重合度までの分子種が検出された。
【００７２】
（実施例６：細胞毒性試験）
テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）、テアフランＷ（ＴＦＷ）、ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ、調製例２参照）、およびＴＦＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ、調製例５参照）を被験材料として用いて、その細胞毒性について試験した。
【００７３】
(１)使用細胞
川崎市衛生研究所においてインフルエンザウイルスの分離・培養に使用しているＭＤＣＫ細胞（イヌ腎由来）を用いた。
【００７４】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、細胞維持用に１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEMを用いた。
【００７５】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）を用いて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、０．５ｍｇ/ｍＬ、０．１ｍｇ/ｍＬおよび０．０５ｍｇ/ｍＬの各濃度に、細胞維持用培養液で希釈し、被験材料液とした。
【００７６】
(４)細胞毒性試験法
９６穴培養プレートにＭＤＣＫ細胞を１００μＬ播種し、細胞がコンフルエントになった状態（３〜４日後）で、細胞維持用培養液を用いて１回洗浄後、被験材料液を１００μＬずつ接種し、１週間培養した。被験材料液は各濃度別に４ウェル接種し、４８時間後、７２時間後に観察した。細胞毒性は細胞の変性を目視で確認し、判定した。
【００７７】
(５)結果
４８時間後および７２時間後の結果について表３に示す。この結果から細胞毒性については、同程度といえる。
【００７８】
【表３】
【００７９】
４８時間後に観察したところ、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）、テアフラン９０Ｓ、テアフランＷのすべてにおいて、１０ｍｇ/ｍＬから０．５ｍｇ/ｍＬまでのウェルで、細胞の変性が認められた。７２時間後の観察でも同様に０．５ｍｇ/ｍＬ以上の濃度で細胞毒性が認められた。０．１ｍｇ/ｍＬと０．０５ｍｇ/ｍＬの濃度では細胞の変化は全くみられなかった。なお、細胞については７日間観察を継続したが、０．１ｍｇ/ｍＬと０．０５ｍｇ/ｍＬの濃度のウェルはすべて細胞の変性は認められなかった。
【００８０】
（実施例７：インフルエンザウイルス抑制試験１）
インフルエンザウイルス抑制試験１においては、インフルエンザウイルスと被験材料とを混合した後に細胞に接種する。
【００８１】
(１)使用細胞
実施例６の細胞毒性試験と同じＭＤＣＫ細胞を使用した。試験開始時に細胞がコンフルエントになるよう９６穴プレートで培養した。
【００８２】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、インフルエンザウイルス培養用培地は、Eagle’s MEMにアセチルトリプシンを３μｇ/ｍＬになるように加えた。
【００８３】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）をＰＢＳにて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、５００μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、５μｇ/ｍＬおよび１μｇ/ｍＬに希釈し、被験材料液とした。また、インフルエンザウイルスは増殖後ＴＣＩＤ50を測定し、−８０℃凍結保存したものを試験直前に溶解した。８００ＴＣＩＤ50/ｍＬに調節したものをインフルエンザウイルス溶液として使用した。
【００８４】
(４)インフルエンザウイルス抑制試験法
１０ｍｇ/ｍＬから１μｇ/ｍＬに調整した被験材料液を、各濃度につき４ウェル使用し、滅菌Ｖ底プレートに２５μＬ入れたものを２プレート作成した。直後に８００ＴＣＩＤ50/ｍＬ（２００ＴＣＩＤ50/２５μＬ）のインフルエンザウイルス溶液を等量（２５μＬ）加え、プレートミキサーで３０秒間攪拌した。３７℃で３０分と６０分反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に接種した。３０分吸着後、カテキン・インフルエンザウイルス反応液を吸引し、維持培地（１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEM）を加え、３４℃のＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、判定を行った。
【００８５】
(５)結果
結果を表４に示す。
【００８６】
【表４】
【００８７】
３０分反応させたプレートでは、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフラン９０Ｓが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、およびテアフランＷが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、ＣＰＥ（細胞変性効果：Cytopathogenic Effect）は認められず、１００％インフルエンザウイルスの増殖が抑制された。
【００８８】
また、６０分反応させたプレートでは、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフラン９０Ｓが５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）が１０μｇ/ｍＬ以上の場合、およびテアフランＷが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、１００％の増殖抑制が認められた。
【００８９】
（実施例８：インフルエンザウイルス抑制試験２）
インフルエンザウイルス抑制試験２においては、インフルエンザウイルス感染細胞に被験材料を添加する。
【００９０】
(１)使用細胞
実施例６の細胞毒性試験と同じＭＤＣＫ細胞を使用した。試験開始時に細胞がコンフルエントになるよう９６穴プレートで培養した。
【００９１】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、インフルエンザウイルス培養用培地は、Eagle’s MEMにアセチルトリプシンを３μｇ/ｍＬになるように加えた。
【００９２】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）をＰＢＳにて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、５００μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、５μｇ/ｍＬおよび１μｇ/ｍＬに希釈し、被験材料液とした。また、インフルエンザウイルスは増殖後ＴＣＩＤ50を測定し、−８０℃凍結保存したものを試験直前に溶解した。４００ＴＣＩＤ50/ｍＬに調節したものをインフルエンザウイルス溶液として使用した。
【００９３】
(４)インフルエンザウイルス抑制試験法
ＭＤＣＫ細胞を培養した９６穴プレート２枚をＰＢＳ１００μＬで１回洗浄後、すべてのウェルに上記インフルエンザウイルス溶液を５０μＬ接種し、３０分３４℃で吸着させた。インフルエンザウイルス溶液吸引後、ＰＢＳで１回洗浄後、１０ｍｇ/ｍＬから１μｇ/ｍＬに調整した被験材料液を、各濃度につき４ウェル添加し、３７℃で３０分と６０分反応させた。反応後、維持培地（１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEM）を加え、３４℃のＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、判定を行った。
【００９４】
(５)結果
結果を表５に示す。
【００９５】
【表５】
【００９６】
３０分および６０分反応させたプレートのすべてのウェルでＣＰＥが認められ、インフルエンザウイルスの増殖抑制はみられなかった。
【００９７】
(６)考察
以上、実施例７および８において、水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））について、インフルエンザウイルス抑制効果を検討した。インフルエンザウイルス感染細胞に水難溶性カテキンを添加した実験（実施例８）では、抑制効果はみられなかったが、インフルエンザウイルスと水難溶性カテキンを混合した後に細胞に接種した実験（実施例７）では、インフルエンザウイルス抑制効果がみられた。
【００９８】
今回の実験における条件での１００％増殖抑制濃度は、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）で５０μｇ/ｍＬ、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）で１０μｇ/ｍＬ（６０分）、５０μｇ/ｍＬ（３０分）であった。このように長時間反応させた方がＣＰＥの抑制が強く認められた。また、コントロールに用いたテアフラン９０ＳおよびテアフランＷと比較すると、インフルエンザウイルス増殖抑制効果は、やや強い結果が得られた。
【００９９】
実施例６において、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）の細胞毒性は、０．５ｍｇ/ｍＬまでみられ、コントロールに使用したテアフラン９０ＳおよびテアフランＷと同様の値であり、インフルエンザウイルス抑制濃度の１０〜５０倍であった。また、２５μＬの使用量で換算すると、４０〜２００倍となり、１００％増殖抑制濃度での使用においても、細胞毒性の影響はないものと考えられる。
【０１００】
以上のことから、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制する効果があり、その性質上様々な用途の商品に応用可能であると考えられる。
【０１０１】
【発明の効果】
以上説明したように、水難溶性ポリフェノールを含む本発明の機能性素材は、該素材が維持している有用な性質（抗菌性、消臭性、抗酸化活性、抗ウイルス活性など）により、繊維、プラスチック、紙などの製品に有用な性質を付与することができる。しかも、本発明の機能性素材は、製法が容易で、安価に製造することができる。また、本発明の機能性素材は、該素材が含む水難溶性ポリフェノールが、洗浄などの操作により溶出しにくいという性質を獲得し、長期使用に耐え得るという効果を有する。更に、本発明の機能性素材は、該素材が含む水難溶性ポリフェノールのおかげで、合成樹脂等への加工が容易であるという利点を有する。その上、本発明の機能性素材は、植物由来であるため天然素材としてのイメージの良さを有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 消臭性測定の結果を示す図。
【図２】 (＋)−カテキンの1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図３】 (＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図４】 (＋)−カテキンの13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図５】 (＋)−カテキンの水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図６】 (＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図７】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図８】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図９】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（LCQ、ThermoQuest社製）で測定した結果を示す図。
【図１０】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ApexII 70e、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
【図１１】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
【図１２】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリフェノールを含有する植物抽出物に対してポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分を含む機能性素材、すなわち水難溶性ポリフェノールを含む機能性素材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでに、ポリフェノールを含有する植物抽出物が、抗菌性、消臭性、抗酸化活性などの機能を有していることが知られている。また、ポリフェノールを含有する植物抽出物は、植物素材として製造が容易であり、かつ安全性が高いことから、繊維、プラスチック、塗料、ゴム、木材、紙などの多くの製品に添加され、その機能性を活かした商品開発がなされている。
【０００３】
しかし、植物抽出物に含まれるポリフェノールのほとんどが水溶性であることから、その加工法や耐久性などに問題があった。例えば、度重なる洗浄により有効成分であるポリフェノールが溶出し、結果として製品の機能性が経時的に低下するという難点があった。また、製造工程において、ポリフェノールを含む混合物が吸湿性であることから、合成樹脂などの有機反応を主体とする工程に用いるには不都合があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記問題点を解決すべく、本発明は、水に対して難溶な機能性ポリフェノール含有素材を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、以下に記載の手段を採用する。
（１） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗菌剤。
（２） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む消臭剤。
（３） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗ウイルス剤。
（４） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗菌剤を製造する方法。
（５） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む消臭剤を製造する方法。
（６） ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗ウイルス剤を製造する方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の機能性素材は、ポリフェノールを含有する植物抽出物に対してポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分を含むものである。
【０００７】
本発明で使用されるポリフェノールを含有する植物抽出物は、ポリフェノールを含有する植物からポリフェノールを含むように抽出された物であれば特に限定されないが、ポリフェノールのなかでもとりわけカテキン類を多く含有する植物からの抽出物が好ましい。ここで、カテキン類とは、３−オキシフラバン誘導体もしくはこれらの混合物をいう。カテキン類として、例えば、(−)−エピカテキン(ＥＣ)、(−)−エピガロカテキン(ＥＧＣ)、(−)−エピカテキンガレート(ＥＣＧ)、(−)−エピガロカテキンガレート(ＥＧＣＧ)、さらにその異性体である(±)−カテキン(Ｃ)、(−)−ガロカテキン(ＧＣ)、(−)−カテキンガレート(ＣＧ)、(−)−ガロカテキンガレート(ＧＣＧ)、これらカテキン類の酸化２量体であるテアフラビン類、もしくはこれらの混合物が挙げられる。
【０００８】
カテキン類を多量に含有する植物としては、アカネ科（例えば、アセンヤク（阿仙薬；Uncaria gambir Roxburch））、ツバキ科（例えば、茶（Camellia sinensis））、マメ科（例えば、Acacia catechin Willdenow）の植物等が挙げられるが、なかでも入手しやすさ、加工しやすさ、安価であることから茶植物が好ましい。抽出に使用する植物の部位としては、任意の部位でよいが、例えば、葉、茎、木部、樹皮、実、種子、根を用いることができる。好ましくは、茶植物の葉（茎、芽を含む）を用いる。また、茶の種類としては、緑茶、釜炒り緑茶、ほうじ茶などの不発酵茶、ウーロン茶、包種茶などの半発酵茶、紅茶などの発酵茶、これらの混合物が挙げられる。
【０００９】
抽出の仕方は、ポリフェノールが抽出される手法であれば特に限定されない。例えば、日本国特許第2703241号、特開平2-311474号、日本国特許第3052172号、日本国特許第3052174号に記載される方法を使用することができる。好ましくは、水（冷水および熱水を含む）、メタノール、エタノールなどの抽出溶媒を用いて、植物に対して抽出操作を行うことにより、ポリフェノールを含有する植物抽出物を得ることができる。
【００１０】
より簡便には、ポリフェノール含量が９０重量％以上の茶抽出物、商品名テアフラン９０Ｓ（株式会社伊藤園製）、またはポリフェノール含量が３０重量％以上の茶抽出物、商品名テアフラン３０Ａ（株式会社伊藤園製）を使用することができる。好ましくは、ポリフェノール含量が少なくとも３０重量％以上の茶抽出物を用いる。このように、ポリフェノール成分の含量が高い抽出物は、粗抽出物を使用したときより重合反応にかかる時間が短いという利点を有する。
【００１１】
本発明においてポリフェノールを重合させる反応は、フェノール樹脂を作成する際の反応と同様にして行うことができる。すなわち、ポリフェノール分子が縮合重合反応により高分子となり、水に難溶なポリフェノールが形成される反応である。より具体的に、縮合重合反応は、ポリフェノールのもつフェノール核に、酸触媒下でアルデヒドが付加し、別のポリフェノールと縮合反応を起こす。この反応において、フェノール性水酸基は反応に関与せず保持されている。この反応で形成される水に難溶なポリフェノールは、以下、重合化ポリフェノール、水難溶性ポリフェノールともいう。
【００１２】
縮合重合反応に使用するアルデヒドの種類は限定されないが、好ましくは鎖式アルデヒド、例として、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、１−プロパナールを用いることができる。なかでも反応性や簡便性の観点からホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、短鎖アルデヒドが好ましい。ここでアルデヒドの使用量は、特に限定されないが、その添加量や濃度の違いによって、有機溶媒への溶解度が異なる不溶化物（重合化ポリフェノールを含む）を得ることができるため、適宜設定することが好ましい。
【００１３】
例えば、原料として用いる植物抽出物に含有されるポリフェノールの量に対して、モル比で０．５〜過剰量に相当する量のホルムアルデヒドを使用することができる。ここで「植物抽出物に含有されるポリフェノールの量（モル）」は、主成分の没食子酸エピガロカテキンの分子量を用いて換算した値をいう。以下ポリフェノールの量とは、このようにして求めた値をいう。
【００１４】
後述の調製例１のように、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノールの量（約３ミリモル）に対して過剰量（調製例１では約４０倍以上）使用した場合、あらゆる有機溶媒および水に対して難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。また、後述の調製例２のように、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノールの量（約３ミリモル）に対してモル比で０．５倍程度使用した場合、極性の高い有機溶媒（アセトンやメタノールなど）には溶解するが、水に難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。このように、アルデヒドの添加量を変えることで、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分の溶解度を任意に調整することができる。
【００１５】
あるいは、水不溶性画分の溶解度は、重合反応溶媒中のポリフェノールの濃度によっても調整することができる。重合反応溶媒中のポリフェノール濃度は、特に限定されないが、反応効率や後処理の簡便さから、１〜４０重量％が望ましい。
【００１６】
例えば、ホルムアルデヒドを、原料のポリフェノール量（約１．５ミリモル）に対してモル比で１倍程度使用する場合、ポリフェノール濃度が５重量％のとき、全ての溶媒に対して不溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分が得ることができる。一方、ポリフェノール濃度が２重量％のとき、極性の高い有機溶媒（アセトンやメタノールなど）には溶解するが、水に難溶な重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を得ることができる。
【００１７】
このように、ホルムアルデヒドの使用量および/またはポリフェノールの濃度を調整することにより、所望の溶解度を有する重合化ポリフェノールをつくることが可能である。このことを、本発明者らは本発明において新たに見出した。
【００１８】
また、ポリフェノール分子の縮合重合反応に使用される酸触媒については、その種類は特に限定されないが、例えば、塩酸や蓚酸を使用することができる。本反応では触媒としての使用であるため濃酸を使用する必要はない。例えば酸触媒として、１％希塩酸溶液を使用することができる。
【００１９】
ポリフェノールを重合し高分子化させる反応は、例えば下記のように行うことができる。まず、ポリフェノールを含有する植物抽出物（例えばテアフラン９０Ｓ）を溶媒（例えば水）に常温にて溶解し、溶液中のポリフェノール濃度を所定の濃度（例えば１〜６０重量％）にする。その後、この溶液に、酸（例えば塩酸）を最終濃度１％程度になるように添加するか、もしくはこの溶液を、酸１％程度の希釈溶液に溶解する。その後、適量（例えばポリフェノールの量に対してモル比で０．５〜過剰量）のアルデヒド化合物（好ましくはホルムアルデヒド）を添加し、常温もしくは加温しながら攪拌し、不溶物を分取する。得られた不溶物を蒸留水で洗浄し、水不溶性画分を得る。
【００２０】
ここで、ポリフェノールを含有する植物抽出物、酸、およびアルデヒド化合物を添加する順序やこれら添加物の濃度、加熱の有無は、特に限定されず、植物抽出物に含まれるポリフェノールの反応性に応じて適宜設定する。
【００２１】
得られた水不溶性画分には、重合し高分子化した水難溶性のポリフェノールが含有される。このように本発明において、水不溶性画分に含まれるポリフェノールは、該条件下では水に不溶であるが、条件が変われば水に溶解する可能性があるという意味において水難溶性という。
【００２２】
本発明の好ましい機能性素材の一例として、ポリフェノールを含有する茶植物の葉抽出物（テアフラン９０Ｓ）に対して、下記のとおりポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる反応液の水不溶性画分が挙げられる。すなわち、ポリフェノールを重合させる反応は、茶植物の葉抽出物（テアフラン９０Ｓ）を溶媒（水）に常温にて溶解し、溶液中のポリフェノール濃度を４０重量％にし、次いで、この溶液に酸（塩酸）を最終濃度１％になるように添加し、その後、茶抽出物に含まれるポリフェノールの量に対してモル比で０．５倍のホルムアルデヒドを添加し、常温もしくは加温しながら攪拌する反応をいう。
【００２３】
このようにして得られた好ましい機能性素材は、メタノール、エタノール、アセトンには溶解するが、水、ヘキサンに難溶な性質を有する。この好ましい機能性素材を、レーヨンなどの繊維に練り込ませ、その機能性を付与することができる。より詳細には、例えば、得られた機能性素材を、マイクロカプセルなどの担体に担持させ、ビスコースに練り込み紡糸することで、機能性素材を保持した抗菌性のレーヨン繊維をつくることができる。
【００２４】
本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分は、原料のポリフェノールを含有する植物抽出物と同等もしくはそれ以上に、抗菌性、消臭性、抗酸化活性、抗ウイルス活性を維持していた。そのため、得られた水不溶性画分は、当該性質を利用した機能性素材として、繊維（天然、合成、半合成も含む）、プラスチック、金属、セラミックス、塗料、油脂、ゴム、木材、紙などの製品に添加することができる。
【００２５】
本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分の抗菌性は、任意の細菌、真菌に対して効果を有し、下記の実施例では、代表的なグラム陽性菌、グラム陰性菌に対して効果を有することが実証されている。また、本発明の水難溶性ポリフェノールを含有する水不溶性画分の抗ウイルス活性は、任意のウイルスに対して効果を有し、下記の実施例では、インフルエンザウイルスに対して効果を有することが実証されている。
【００２６】
【実施例】
（調製例１）
ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）２ｇを、ホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）１０ｍＬに溶解させた。次に１％塩酸４０ｍＬを添加し、約３０分加熱した。その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加えて攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた沈渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を1.95ｇ得た。得られた水不溶性画分は、クロロホルム、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、二硫化炭素、エーテル、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどあらゆる有機溶媒に不溶であった。
【００２７】
（調製例２）
ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）１ｇを、水５０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）200μＬを添加し、攪拌した後、濃塩酸１滴を加え、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、吸引濾過により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）を0.58ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。また、水では酸性条件では不溶であるが、アルカリ性条件では、化合物の一部が分解し、色調に変化を来たした。
【００２８】
（調製例３）
ポリフェノール含量３０重量％以上の茶抽出物（テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）株式会社伊藤園製）４５０ｇを、１％塩酸１１２５ｍＬに溶解させた。加熱し、次にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）２９８ｍＬを添加した。その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加えて攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた沈渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｃ）を３８９.４４ｇ得た。得られた水不溶性画分は、クロロホルム、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、二硫化炭素、エーテル、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどあらゆる有機溶媒に不溶であった。
【００２９】
（調製例４）
ポリフェノール含量３０重量％以上の茶抽出物（テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）株式会社伊藤園製）２ｇを、１％塩酸４０ｍＬに溶解させ、ホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）４００μＬを加え８５℃以上に加熱し攪拌した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）を０．８ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。また、水では酸性条件では不溶であるが、アルカリ性条件では、化合物の一部が分解し、色調に変化を来たした。
【００３０】
（調製例５）
ポリフェノール含量６０重量％以上の茶抽出物（テアフランＷ（ＴＦＷ）株式会社伊藤園製）５０ｇを、１％塩酸１３５ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）５ｍＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、吸引濾過により残渣を分取した。残渣を蒸留水で洗浄した後、残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）を４３．８７ｇ得た。得られた水不溶性画分は、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００３１】
（実施例１：抗菌活性測定１）
測定試料として、茶抽出物ＴＦ９０Ｓ、茶抽出物ＴＦ３０Ａ、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）、茶抽出物ＴＦＷ、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）を用いた。各試料を１ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１ｍＬに溶解させた。これら試験液を濾過滅菌した後、滅菌したペーパーディスク（φ８ｍｍ）上に７０μＬ（濃度１ｍｇ/ｍＬ）吸着させた。
【００３２】
一方、直径９ｃｍのペトリ皿に感性ディスク平板培地（10ｍＬ）を作成し、これに共試菌（Staphylococcus aureus、またはEscherichia coli）を懸濁した半流動性寒天培地（感性ディスク培地）４ｍＬを重層した。
【００３３】
この培地に、上述のペーパーディスクを置き、３５±１℃で２４時間培養し、その後５℃で２日間保存した。結果は、阻止帯の有無によって判定した（ｎ＝３）。ペーパーディスクの直径８ｍｍを含む阻止帯の直径（ｍｍ）を、下記表１に示す。３サンプルの結果をＩ〜IIIとして示す。
【００３４】
【表１】
その結果、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦ９０Ｓが１１．３ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂが１２．３ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦ９０Ｓが１３．０ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂが１３．７ｍｍであった。
【００３６】
また、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦ３０Ａが１０．５ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｄが１１．３ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦ３０Ａが１３．２ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｄが１３．２ｍｍであった。
【００３７】
また、阻止帯の直径平均は、S.aureusに対しては、茶抽出物ＴＦＷが１１．２ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｅが１１．８ｍｍであった。E.coliに対しては、茶抽出物ＴＦＷが１３．７ｍｍ、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｅが１２．５ｍｍであった。
【００３８】
以上の結果より、水不溶性画分ＰＰｉ−Ｂ、ＰＰｉ−Ｄ、ＰＰｉ−Ｅは、それぞれの原料である茶抽出物と同等かそれ以上の抗菌活性を示した。
【００３９】
（実施例２：抗菌活性測定２）
調製例１で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）をポリスチレンへ練り込み加工し、その抗菌活性を測定した。
【００４０】
まず、ポリスチレン１ｋｇに対し、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を５５ｇ添加混合し、２００℃にて加温溶解させた。その後、ペレット状から板状に再加工し、フィルム密着法により抗菌活性を測定した。
【００４１】
ここで使用したフィルム密着法は、抗菌製品技術協議会により発行されている試験法（1998年改訂版）に基づくものである。なお、ここで使用したフィルム密着法は、現在制定されている日本工業規格（ＪＩＳ）に基づくフィルム密着法と、接種用菌液の調製に使用するＮＢ培地（普通ブイヨン培地）の希釈率が「１/１００ＮＢ」であった点においてのみ異なる。
【００４２】
コントロールとして、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）を添加せずポリスチレンのみのものを使用した。
【００４３】
その結果を以下に示す。
【００４４】
【表２】
以上の結果より、水不溶性画分（ＰＰｉ−Ａ）は、コントロールのポリスチレンのみに対して抗菌活性を有していることが示された。
【００４６】
（実施例３：消臭性測定）
テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）、テアフラン３０Ａ（ＴＦ３０Ａ）、調製例２で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、および調製例４で作成した水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）を測定試料として用いて、その消臭性を測定した。
【００４７】
各試料を１０ｍｇ秤量し、３リットルのアンモニアガスとともにテドラーバッグに入れ、２時間後のヘッドスペースの残存アンモニアガス濃度をガス検知管で測定した。
【００４８】
消臭率(％)＝(Ｃ0−Ｃ1)/Ｃ0×１００
Ｃ0：０時間のアンモニアガス濃度、Ｃ1：２時間後のアンモニアガス濃度
【００４９】
その結果を図１に示す。水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｄ）および（ＰＰｉ−Ｂ）は、それぞれの原料であるテアフラン３０Ａ、同９０Ｓに対して消臭力は上昇していた。これは、反応により重合が進み、高分子化したことによりＮＨ3を捕捉し易くなったためと考えられる。
【００５０】
（実施例４：ＮＭＲ測定）
(１)測定試料の調製
測定試料として、▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分、▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分、▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分を用いた。
【００５１】
各測定試料は以下に記載のとおり調製した。
【００５２】
▲１▼(＋)−カテキンは、EXTRASYNTHESE製のものを使用した。
【００５３】
▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。(＋)−カテキン(EXTRASYNTHESE製)１ｇを水８０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液にホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）１４０μＬを添加し、攪拌した後、濃塩酸１滴を加え更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を３回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．４５ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５４】
▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。(＋)−カテキン(EXTRASYNTHESE製)１ｇを１％塩酸２０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液に２０％ 13Ｃラベル化ホルムアルデヒド（Aldrich Chem. Co.製）２６７μＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を２回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．７５ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５５】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）は、上記調製例２に従って調製した。
【００５６】
▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分は、以下に記載のとおり調製した。ポリフェノール含量９０重量％以上の茶抽出物（テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）株式会社伊藤園製）１ｇを１％塩酸２０ｍＬに溶解させ、８５℃以上に加熱した。この溶液に２０％ 13Ｃラベル化ホルムアルデヒド（Aldrich Chem. Co.製）１９４μＬを添加し、攪拌した後、更に加熱した。沈殿物の生成を確認した後、その溶液を室温まで冷却し、ポリエチレン製の遠沈管に移し、７００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、沈渣に蒸留水を加え攪拌し、さらに遠心分離を行った。この操作を２回繰り返して、沈渣を洗浄した。得られた残渣を濾紙上に移し、温風（約５０℃）で乾燥させた。これにより、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を０．７８ｇ得た。得られた水不溶性画分はメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに対して可溶であった。
【００５７】
(２)測定方法および測定結果
▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲは、Jeol JNM-EX270（270MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図２および図３に示す。
【００５８】
▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-EX270（270MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-LA500（500MHz）、溶媒：重アセトンを使用し測定した。▲１▼(＋)−カテキン、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分、▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図４、図５および図６に示す。
【００５９】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲは、Jeol JNM-LA500（500MHz）、溶媒：重メタノールを使用し測定した。▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を、それぞれ図７および図８に示す。
【００６０】
化学シフトは、測定溶媒を内部標準物質とし、ｐｐｍであらわした。
【００６１】
▲１▼(＋)−カテキン（図２）と、▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分（図３）の1Ｈ−ＮＭＲを比較すると、3.5−3.9ｐｐｍに新たなブロードピークが検出された。また、これら試料▲１▼および▲２▼の13Ｃ−ＮＭＲ（図４と図５）より、18ｐｐｍ付近に新たにピークが検出された。これらのピークは、何れも不溶化反応によりできたピークである。
【００６２】
▲２▼(＋)−カテキンの水不溶性画分（図５）と▲３▼(＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分（図６）の13Ｃ−ＮＭＲを比較すると、18ｐｐｍ付近のピークが大きく検出された。このピークはホルムアルデヒドに由来する。
【００６３】
以上の結果より、本反応では、ポリフェノールの持つフェノール核にホルムアルデヒドが付加してメチレン架橋を形成し、別のポリフェノールと縮合重合を起こしていると考えられる。
【００６４】
▲４▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ、図７）と▲５▼茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分（図８）の13Ｃ−ＮＭＲを比較すると、(＋)−カテキンの場合と同様に、18ｐｐｍ付近のピークが大きく検出された。
【００６５】
以上の結果より、茶抽出物ＴＦ９０Ｓは、(＋)カテキンと同様に、ホルムアルデヒド由来のメチレン架橋を形成し、ポリフェノールが縮合重合していると推察される。
【００６６】
（実施例５：質量分析）
茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（LCQ、ThermoQuest社製）、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ApexII 70e、Bruker Daltonics社製）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）を使用して測定した。
【００６７】
ＥＳＩ−ＩＴＭＳは、加熱キャピラリー温度：２１０℃、溶媒：５０％メタノール、キャピラリー電圧：１４Ｖ、シースガス流量：１０Ｌ/分、導入法：シリンジポンプ（流速：５μＬ/分）で測定した。
【００６８】
ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳは、ドライガス温度：１３０℃、溶媒：５０％メタノール（0.１％酢酸含有）、導入法：シリンジポンプ（流速２μＬ/分）で測定した。
【００６９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、リニアモード、加速電圧：２０ｋＶ、マトリクス：インドールアクリル酸で測定した。
【００７０】
ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（図９）、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（図１０）より、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）とエピカテキンガレート（ＥＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；８９７[Ｍ＋Ｈ]+）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；９１３[Ｍ＋Ｈ]+）、及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）との重合体（ｍ/ｚ；９２９[Ｍ＋Ｈ]+）と予測される分子量を得た。
【００７１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（図１１および図１２）より、最大７重合度までの分子種が検出された。
【００７２】
（実施例６：細胞毒性試験）
テアフラン９０Ｓ（ＴＦ９０Ｓ）、テアフランＷ（ＴＦＷ）、ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ、調製例２参照）、およびＴＦＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ、調製例５参照）を被験材料として用いて、その細胞毒性について試験した。
【００７３】
(１)使用細胞
川崎市衛生研究所においてインフルエンザウイルスの分離・培養に使用しているＭＤＣＫ細胞（イヌ腎由来）を用いた。
【００７４】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、細胞維持用に１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEMを用いた。
【００７５】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）を用いて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、０．５ｍｇ/ｍＬ、０．１ｍｇ/ｍＬおよび０．０５ｍｇ/ｍＬの各濃度に、細胞維持用培養液で希釈し、被験材料液とした。
【００７６】
(４)細胞毒性試験法
９６穴培養プレートにＭＤＣＫ細胞を１００μＬ播種し、細胞がコンフルエントになった状態（３〜４日後）で、細胞維持用培養液を用いて１回洗浄後、被験材料液を１００μＬずつ接種し、１週間培養した。被験材料液は各濃度別に４ウェル接種し、４８時間後、７２時間後に観察した。細胞毒性は細胞の変性を目視で確認し、判定した。
【００７７】
(５)結果
４８時間後および７２時間後の結果について表３に示す。この結果から細胞毒性については、同程度といえる。
【００７８】
【表３】
４８時間後に観察したところ、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）、テアフラン９０Ｓ、テアフランＷのすべてにおいて、１０ｍｇ/ｍＬから０．５ｍｇ/ｍＬまでのウェルで、細胞の変性が認められた。７２時間後の観察でも同様に０．５ｍｇ/ｍＬ以上の濃度で細胞毒性が認められた。０．１ｍｇ/ｍＬと０．０５ｍｇ/ｍＬの濃度では細胞の変化は全くみられなかった。なお、細胞については７日間観察を継続したが、０．１ｍｇ/ｍＬと０．０５ｍｇ/ｍＬの濃度のウェルはすべて細胞の変性は認められなかった。
【００８０】
（実施例７：インフルエンザウイルス抑制試験１）
インフルエンザウイルス抑制試験１においては、インフルエンザウイルスと被験材料とを混合した後に細胞に接種する。
【００８１】
(１)使用細胞
実施例６の細胞毒性試験と同じＭＤＣＫ細胞を使用した。試験開始時に細胞がコンフルエントになるよう９６穴プレートで培養した。
【００８２】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、インフルエンザウイルス培養用培地は、Eagle’s MEMにアセチルトリプシンを３μｇ/ｍＬになるように加えた。
【００８３】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）をＰＢＳにて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、５００μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、５μｇ/ｍＬおよび１μｇ/ｍＬに希釈し、被験材料液とした。また、インフルエンザウイルスは増殖後ＴＣＩＤ50を測定し、−８０℃凍結保存したものを試験直前に溶解した。８００ＴＣＩＤ50/ｍＬに調節したものをインフルエンザウイルス溶液として使用した。
【００８４】
(４)インフルエンザウイルス抑制試験法
１０ｍｇ/ｍＬから１μｇ/ｍＬに調整した被験材料液を、各濃度につき４ウェル使用し、滅菌Ｖ底プレートに２５μＬ入れたものを２プレート作成した。直後に８００ＴＣＩＤ50/ｍＬ（２００ＴＣＩＤ50/２５μＬ）のインフルエンザウイルス溶液を等量（２５μＬ）加え、プレートミキサーで３０秒間攪拌した。３７℃で３０分と６０分反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に接種した。３０分吸着後、カテキン・インフルエンザウイルス反応液を吸引し、維持培地（１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEM）を加え、３４℃のＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、判定を行った。
【００８５】
(５)結果
結果を表４に示す。
【００８６】
【表４】
３０分反応させたプレートでは、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフラン９０Ｓが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、およびテアフランＷが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、ＣＰＥ（細胞変性効果：Cytopathogenic Effect）は認められず、１００％インフルエンザウイルスの増殖が抑制された。
【００８８】
また、６０分反応させたプレートでは、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）が５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフラン９０Ｓが５０μｇ/ｍＬ以上の場合、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）が１０μｇ/ｍＬ以上の場合、およびテアフランＷが１００μｇ/ｍＬ以上の場合、１００％の増殖抑制が認められた。
【００８９】
（実施例８：インフルエンザウイルス抑制試験２）
インフルエンザウイルス抑制試験２においては、インフルエンザウイルス感染細胞に被験材料を添加する。
【００９０】
(１)使用細胞
実施例６の細胞毒性試験と同じＭＤＣＫ細胞を使用した。試験開始時に細胞がコンフルエントになるよう９６穴プレートで培養した。
【００９１】
(２)試験用培養液
細胞増殖用に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたEagle’s MEMを用い、インフルエンザウイルス培養用培地は、Eagle’s MEMにアセチルトリプシンを３μｇ/ｍＬになるように加えた。
【００９２】
(３)被験材料の調製
水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）とテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））、コントロール（テアフラン９０ＳとテアフランＷ）を、それぞれ１００ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ １．０ｍＬに溶解した。この検体液（１００ｍｇ/ｍＬ）をＰＢＳにて、１０ｍｇ/ｍＬ、５ｍｇ/ｍＬ、１ｍｇ/ｍＬ、５００μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、５μｇ/ｍＬおよび１μｇ/ｍＬに希釈し、被験材料液とした。また、インフルエンザウイルスは増殖後ＴＣＩＤ50を測定し、−８０℃凍結保存したものを試験直前に溶解した。４００ＴＣＩＤ50/ｍＬに調節したものをインフルエンザウイルス溶液として使用した。
【００９３】
(４)インフルエンザウイルス抑制試験法
ＭＤＣＫ細胞を培養した９６穴プレート２枚をＰＢＳ１００μＬで１回洗浄後、すべてのウェルに上記インフルエンザウイルス溶液を５０μＬ接種し、３０分３４℃で吸着させた。インフルエンザウイルス溶液吸引後、ＰＢＳで１回洗浄後、１０ｍｇ/ｍＬから１μｇ/ｍＬに調整した被験材料液を、各濃度につき４ウェル添加し、３７℃で３０分と６０分反応させた。反応後、維持培地（１％ＦＣＳを加えたEagle’s MEM）を加え、３４℃のＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、判定を行った。
【００９４】
(５)結果
結果を表５に示す。
【００９５】
【表５】
３０分および６０分反応させたプレートのすべてのウェルでＣＰＥが認められ、インフルエンザウイルスの増殖抑制はみられなかった。
【００９７】
(６)考察
以上、実施例７および８において、水難溶性カテキン（テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ））について、インフルエンザウイルス抑制効果を検討した。インフルエンザウイルス感染細胞に水難溶性カテキンを添加した実験（実施例８）では、抑制効果はみられなかったが、インフルエンザウイルスと水難溶性カテキンを混合した後に細胞に接種した実験（実施例７）では、インフルエンザウイルス抑制効果がみられた。
【００９８】
今回の実験における条件での１００％増殖抑制濃度は、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）で５０μｇ/ｍＬ、テアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）で１０μｇ/ｍＬ（６０分）、５０μｇ/ｍＬ（３０分）であった。このように長時間反応させた方がＣＰＥの抑制が強く認められた。また、コントロールに用いたテアフラン９０ＳおよびテアフランＷと比較すると、インフルエンザウイルス増殖抑制効果は、やや強い結果が得られた。
【００９９】
実施例６において、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）の細胞毒性は、０．５ｍｇ/ｍＬまでみられ、コントロールに使用したテアフラン９０ＳおよびテアフランＷと同様の値であり、インフルエンザウイルス抑制濃度の１０〜５０倍であった。また、２５μＬの使用量で換算すると、４０〜２００倍となり、１００％増殖抑制濃度での使用においても、細胞毒性の影響はないものと考えられる。
【０１００】
以上のことから、テアフラン９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）およびテアフランＷの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｅ）は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制する効果があり、その性質上様々な用途の商品に応用可能であると考えられる。
【０１０１】
【発明の効果】
以上説明したように、水難溶性ポリフェノールを含む本発明の機能性素材は、該素材が維持している有用な性質（抗菌性、消臭性、抗酸化活性、抗ウイルス活性など）により、繊維、プラスチック、紙などの製品に有用な性質を付与することができる。しかも、本発明の機能性素材は、製法が容易で、安価に製造することができる。また、本発明の機能性素材は、該素材が含む水難溶性ポリフェノールが、洗浄などの操作により溶出しにくいという性質を獲得し、長期使用に耐え得るという効果を有する。更に、本発明の機能性素材は、該素材が含む水難溶性ポリフェノールのおかげで、合成樹脂等への加工が容易であるという利点を有する。その上、本発明の機能性素材は、植物由来であるため天然素材としてのイメージの良さを有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 消臭性測定の結果を示す図。
【図２】 (＋)−カテキンの1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図３】 (＋)−カテキンの水不溶性画分の1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図４】 (＋)−カテキンの13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図５】 (＋)−カテキンの水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図６】 (＋)−カテキンの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図７】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図８】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの13Ｃラベル化水不溶性画分の13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を示す図。
【図９】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（LCQ、ThermoQuest社製）で測定した結果を示す図。
【図１０】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＥＳＩ ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ApexII 70e、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
【図１１】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
【図１２】 茶抽出物ＴＦ９０Ｓの水不溶性画分（ＰＰｉ−Ｂ）の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ReflexII、Bruker Daltonics社製）で測定した結果を示す図。
Claims (6)
- ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗菌剤。
- ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む消臭剤。
- ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行うことにより得られる、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を含む抗ウイルス剤。
- ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗菌剤を製造する方法。 - ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む消臭剤を製造する方法。 - ポリフェノールを含有する茶植物の抽出物を得る工程と、
前記植物抽出物に対して、アルデヒド類を用いてポリフェノールを重合させる反応を行う工程と、
前記反応により得られた、重合化ポリフェノールを含む水不溶性画分を回収する工程と
を具備する、水難溶性ポリフェノールを含む抗ウイルス剤を製造する方法。
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