JP4103929B2 - 殺細胞剤 - Google Patents
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Description
本発明は、超音波の照射を受け、該照射により細胞毒となる、癌細胞等の殺対象となる細胞を殺傷することができる殺細胞剤に関するものである。この殺細胞剤は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための超音波癌治療促進剤として利用可能である。
近年、癌治療において、治療効果と患者のQOL(生活の質)の両方の向上を図るために、非侵襲で効率的に患部を治療することができる音響化学療法が提案されている。これは、超音波の照射により、投与した薬剤(超音波併用剤)の抗腫瘍活性化を行い、腫瘍の治療を行なうというものである。超音波治療用併用剤として、フラーレンを用いる方法が知られている(例えば、特許文献1(特開2002-241307号公報)および特許文献2(国際公開第2002/66061号パンフレット)参照)。また、超音波治療用併用剤として、色素を用いる方法も知られている(特許文献3(特開2001-253836号公報)、特許文献4(国際公開第98/1131号パンフレット)、および特許文献5(特開2003-226654号公報)を参照)。このような方法にあっては、光によりラジカル種を発生する有機物またはフラーレンを超音波の効果により励起させることによって、治療が行われる。
機物を分解させる技術も提案されている(例えば、特許文献9(特開2003−2640
6号公報)および特許文献10(特開2005−7392号公報)参照)。
チタンテトライソプロポキシド3.6gとイソプロパノール3.6gを混合し、氷冷下で60mlの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で30分間攪拌した。攪拌後、12N硝酸を1ml滴下して80℃で8時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、0.45μmのフィルターで濾過し、脱塩カラム(PD10、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社)を用いて溶液交換して固形成分1%のアナターゼ型酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量100mlのバイアル瓶に入れ、200kHzで30分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前と後での平均分散粒経は、それぞれ、36.4nm、20.2nmであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分20%の酸化チタンゾル(アナターゼ型)を調製した。
チタンテトライソプロポキシド3.6gとイソプロパノール3.6gを混合し、氷冷下で60mlの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で30分間攪拌した。攪拌後、12N硝酸1mlを滴下して80℃で8時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、0.45μmのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム(PD-10、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製)を用いて溶液交換して固形成分1%の酸性酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量100mlのバイアル瓶に入れ、200kHzで30分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経は、それぞれ、36.4nm、20.2nmであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分20%の酸化チタンゾルを調製した。
チタンテトライソプロポキシド3.6gとイソプロパノール3.6gを混合し、氷冷下で60mlの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で30分間攪拌した。攪拌後、12N硝酸1mlを滴下して80℃で8時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、0.45μmのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム(PD-10、アマシャム・バイオサイエンス社製)を用いて溶液交換して固形成分1%の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを100ml容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器MIDSONIC200(カイジョー社製)を用いて200kHzで30分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経は、12Nの硝酸で1000倍に希釈した後、ゼータサイザーナノZS(シスメックス社製)を用いて、石英測定セルに分散液0.1mlを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、25℃にて動的光散乱法により測定した。その結果、分散粒径は20.2nmであった。この酸化チタンゾルを蒸発皿を用いて、50℃下で溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分20%の酸性酸化チタンゾルを調整した。
HPLC:AKTA purifier、アマシャム・バイオサイエンス社製
カラム:HiPrep 16/60 Sephacryl S-300HR、アマシャム・バイオサイエンス社製
移動相:リン酸塩緩衝溶液(pH7.4)
流速:0.3ml/min
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2/PAA粒子(例1で作製されたもの)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)
CdSe粒子(Quantum Dot社製、Qdot655プロテインA標識、中性分散体、分散粒径:8nm)
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例1で示した動的光散乱法により得られたものである。
SiO2粒子(シーアイ化成製、Siミズ10WT%-G360、中性分散体、分散粒径:105nm)
Au粒子(ICN Biomedicals,Inc製、ProteinA 20nm、Gold conjugate、中性分散体、分散粒径:40nm)
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例1で示した動的光散乱法により得られたものである。
半導体粒子として、例1で作製されたTiO2粒子(TiO2/PAA)を用いて、超音波照射による細胞殺傷濃度依存性試験を行なった。酸化チタン粒子をPBS緩衝溶液(pH6.8)で調整し、1×104cells/mlのJurkat細胞を含む、10%血清入りRPMI1640培地(Invitrogen社)に1/10量添加して終濃度で、0.001%、0.01%、0.05%、および0.1%となるように、試験溶液を調整した。この試験溶液に、超音波照射装置(オージー技研(株)製、ULTRASONIC APPARATUS ES-2:1MHz)により、0.5W/cm2で50%duty cycle運転で1分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行ない、半導体粒子濃度の依存性を検討した。その結果は、図2に示される通りであった。酸化チタン粒子を添加した全ての溶液濃度において細胞の生存率が低下していることが確認された。特に、終濃度0.05%溶液において細胞の生存率が低下していることから、細胞殺傷効果の高い終濃度は0.05%であることが分かった。
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)、
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)
TiO2/PAA(例1により作成したもの)
TiO2/PEG(例3により作成したもの)
2mlのマイクロチューブ中で、PBS緩衝液:850μl、還元系発色試薬WST-1(同仁化学製):50μl、0.1%酸化チタン粒子:100μlの組成の溶液を調製した。酸化チタン粒子としては、TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)を用いた。
水、PBS緩衝液(pH 7.4)、および10%血清を含むRPMI1640培地のそれぞれに以下の粒子を最終濃度 が0.01% になるように分散して、サンプルを得た。
例1により作成したTiO2/PAA粒子
例3により作成したTiO2/PEG粒子
酸化チタン(A)(STS240、石原産業製、中性分散体、分散粒径:52nm)
酸化チタン(B)(TKS-203、テイカ製、アナターゼ型酸化チタン、中性分散体、分散粒径:120nm)
SnO2粒子(シーアイ化成製、SNW15WT%-G02、中性分散体、分散粒径:39nm)
ZnO粒子(シーアイ化成製、Znミズ15WT%-G01、中性分散体、分散粒径:67nm)
各分散液について測定された平均分散粒子径を表1に示す。表1に示されるように、中性分散体として市販されている酸化チタン(A)や酸化チタン(B)と比較して、本例で作成した TiO2/PAAおよびTiO2/PEGは平均分散粒子径の変化が少なく、それ故、優れた安定性を有することが分かる。
まず、TiO2/PAA粒子(例1で作製されたもの 中性分散体、分散粒径:45.5nm)をPBS緩衝溶液(pH6.8)に分散させ、この溶液を、1×104cells/mlのJurkat細胞を含む、10%血清入りRPMI1640培地(Invitrogen社)に1/10量添加して、TiO2/PAA粒子の終濃度0.01%および0.001%となるように試験溶液を調整した。
まず、以下の半導体粒子を用意した。
TiO2粒子(A)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-240、中性分散体、分散粒径:52nm)
TiO2粒子(D)(石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、STS-230、中性分散体、分散粒径:15nm)
TiO2粒子(C)(P25粒子;日本エアロジル製をPBS緩衝溶液(pH6.8)で分散させたもの、分散粒径:500nm)
まず、TiO2/PAA粒子(例1で作製されたもの 中性分散体、分散粒径:45.5nm)、TiO2/PEI粒子(例2で作製されたもの 中性分散体、分散粒径:67.7nm)、およびTiO2/PEG粒子(例3で作製されたもの 中性分散体、分散粒径:45.4nm)をPBS緩衝溶液(pH6.8)に分散させて、各種分散液を得た。これらの分散液を、1×104cells/mlのJurkat細胞を含む、10%血清入りRPMI1640培地(Invitrogen社)に1/10量添加して、TiO2系複合体粒子の終濃度が0.1、0.01、および0.001質量%となるように試料液を調整した。また、対照実験として、PBS緩衝液のみを同様に添加して対照試料液を調整した。調整後、CO2インキュベーターにて37℃で24時間培養し、CellTiterGro Kit(バイオラッド社製)により生細胞数を測定した。対照試料液の生存率を100%として各試験液を比較した結果を図10に示す。図10に示される通り、0.1〜0.001質量%の全試料液において、高い細胞生存率、すなわち高い安全性を示した。
TiO2/PAA粒子(例1で作製されたもの)、TiO2/PEI粒子(例2で作製されたもの)およびTiO2/PEG粒子(例3で作製されたもの)を、PBS緩衝溶液(pH6.8)に分散させ、この溶液を、1×104cells/mlのJurkat細胞を含む、10%血清入りRPMI1640培地(Invitrogen社)に1/10量添加して、終濃度0.05%となるように試験溶液を調整した。
まず、TiO2/PAA粒子(例1で作製されたもの、中性分散体、分散粒径:45.5nm)をPBS緩衝溶液(pH6.8)に分散させ、この溶液を、5×104cells/mlのJurkat細胞を含む、10%血清入りRPMI1640培地(Invitrogen社)に1/10量添加して、TiO2/PAA粒子の終濃度0.05%となるように試験溶液を3ml調整した。
ヌードマウス (Balb/c、雄、3週齢)にヒト膀胱癌由来株化細胞(T−24)を皮下接種し、腫瘍を形成させ、約0.63mm3程度の腫瘍を形成させた。例1で作製されたTiO2/PAAをPBS緩衝液にて0.5%に希釈し、腫瘍に100μl局所注射した。投与より24時間後に、時間1分 出力1W パルス50%で1MHzの超音波を超音波照射装置(オージー技研(株)製、ULTRASONIC APPARATUS ES-2:1MHz; プローブ径 10mm)を用いて照射した。照射は、水溶性高分子ゲルを皮膚に塗布し、その上にプローブ(超音波照射部)を密着させた後に行った。マウス数は1群あたり6匹とし、PBSのみ投与又は無処置動物を対照群とした。超音波照射後、各個体の腫瘍体積を測定し、各個体の超音波照射施工日(0日)におけるTiO2/PAA投与前の腫瘍体積を1とした時の各測定時点の腫瘍体積(相対腫瘍増殖率)を求めた。
TiO2/PAA粒子の代わりにTiO2粒子(P25粒子;日本エアロジル製をPBS緩衝溶液(pH6.8)で分散させたもの、分散粒径:500nm)を用いたこと以外は、例17と同様の条件で抗腫瘍効果試験を行った。超音波照射後、各個体の腫瘍体積を測定し、各個体の超音波照射施工日(0日)におけるTiO2粒子投与前の腫瘍体積を1とした時の各測定時点の腫瘍体積(相対腫瘍増殖率)を求めた。その結果、TiO2粒子を投与して超音波照射を行った群、超音波照射を行わなかった群、およびTiO2粒子を投与しなかった群の各群間において、相対腫瘍増殖率の経時変化に有意な差は見られなかった。
ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体(平均分子量;33659−日本油脂製)1gに水5mlを添加して加水分解した。こうして得られた溶液と1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(同仁化学製)を、超純水を用いてそれぞれ濃度が50mg/mlおよび50mMとなるように混合しながら調整した。調整した溶液に4−アミノサリチル酸(分子量Mn=153.14:MP Biomedicals,Inc.)を濃度100mMになるよう混合して4mlの溶液を得た。この溶液を室温にて72時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ/ポア CE 透析用チューブ(分画分子量=3500、Spectrum Laboratories,Inc.)に移して超純水4lに対して室温にて24時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に4mlのジメチルホルムアミド(DMF:和光純薬工業)を添加して混合し、4−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。
Claims (16)
- 20〜200nmの粒子径を有し、TiO2、SnO2、およびZnOからなる群から選択される少なくとも一種の半導体粒子を含んでなり、細胞毒となるように400kHz〜20MHzの超音波が照射されることを特徴とする、殺細胞剤。
- 体内に投与され、前記超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、請求項1に記載の殺細胞剤。
- 殺対象が、癌細胞である、請求項1または2に記載の殺細胞剤。
- 前記細胞毒が、前記超音波照射により前記半導体粒子が発生するラジカル種により生じる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 前記半導体粒子が、TiO2である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 前記半導体粒子が、該粒子表面でポリマーおよび/または生体由来高分子と結合されてなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 前記ポリマーが、アニオン性ポリマーである、請求項6に記載の殺細胞剤。
- 前記ポリマーが、カチオン性ポリマーである、請求項6に記載の殺細胞剤。
- 前記ポリマーが、ノニオン性の親水性基を有するポリマーである、請求項6に記載の殺細胞剤。
- 前記半導体粒子が、溶媒に分散されてなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 前記溶媒が、中性の液性を有する、請求項10に記載の殺細胞剤。
- 前記溶媒が、生理食塩水である、請求項10または11に記載の殺細胞剤。
- 前記半導体粒子が、0.001〜1質量%含有される、請求項10〜12のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 前記半導体粒子が、凍結乾燥された粉末形態を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 静脈による投与経路により体内に投与される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
- 皮下による投与経路により体内に投与される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
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