JP4077481B2

JP4077481B2 - ダイオキシンを認識する組換抗体および該抗体をコードする遺伝子

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Publication number: JP4077481B2
Application number: JP2005504305A
Authority: JP
Inventors: 一之澤田石; 桂一日向野; 千和片岡
Original assignee: Kyoto Electronics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Kyoto Electronics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2024-03-26
Also published as: US7381798B2; EP1616885A4; JPWO2004087764A1; US20060269977A1; WO2004087764A1; EP1616885B1; EP1616885A1

Description

本発明は、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン（２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ）に結合活性を有する新規な組換抗体、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を導入したベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該組換抗体の製造方法、該組換抗体を用いる２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの免疫学的捕獲法ならびに測定法に関する。

内分泌撹乱物質による環境汚染が問題となり、その汚染状況の把握やヒトの健康への影響などの調査が進められている。これら内分泌撹乱物質によるヒトや環境への影響が明らかになるに従い、日本のみならず世界各国においても重大な社会的関心事となっている。なかでもダイオキシン類については、ヒトや生態系および環境への持続的な影響が懸念されおり、汚染状況の把握や、ヒトや生態系での暴露状況の調査、摂取ルートの解明、さらには汚染箇所のダイオキシン量のモニタリングや汚染除去方法への対応が急務となっている。ダイオキシン類は、有機塩素化合物の使用、生産、燃焼などの過程で生成することから発生源が多岐に渡るとともに、土壌、水質、大気、食品、海産物などにおいて広範な汚染が確認されている。従って、膨大な生体試料や環境試料などの試料中のダイオキシン濃度を測定し、対策を講じる必要から、ダイオキシン類の簡便かつ迅速な測定方法の確立が望まれている。
ダイオキシン類には、７５種類のポリクロロジベンゾダイオキシン（ＰＣＤＤ）および１３５種類のポリクロロジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）からなる多数の構造異性体が存在する。最も毒性が高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾパラダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）の毒性を１としたときの各ダイオキシン異性体の相対毒性が毒性等価指数として示されており、ダイオキシン類の分析においては毒性の高い７種類のＰＣＤＤおよび１０種類のＰＣＤＦが測定対象物質とされている。また、内分泌撹乱物質の１つとして以前から問題とされていたポリクロロビフェニール（ＰＣＢ）のうち１２種類の共平面（ｃｏ−ｐｌａｎａｒ）ＰＣＢもダイオキシン類として測定されるようになった。
ダイオキシン類の測定は、従来、高分解能ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）分析により行われていた。しかし、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ法は、試料中の妨害物質を除去するために多段階のクリーンアップ操作を必要とし、分析機器が高額であり、かつ測定者の習熟を要するため、特定の分析機関においてのみ測定が可能であった。ダイオキシン類の分析方法、特にＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ法においては、毒性の高い１７種類のダイオキシン異性体の含有量を個々に定量し、次いで各異性体の実測値に毒性等価指数を乗じた値の総和を、２，３，７，８−ＴＣＤＤ相当量である毒性等量（ＴＥＱ）に換算し、この換算値をダイオキシン分析値として用いている。従って、データ解析を含め被検体の分析に多大な時間を要する。これらの理由から、ダイオキシン類のより簡便で安価かつ高感度な測定方法の開発が強く望まれている。
また、特定の指標物質を測定することにより、より簡便にダイオキシン量（ＴＥＱ）を把握しようという考え方が根強く存在している。前駆体であるクロロベンゼンを測定する方法もこの１つである。近年、ダイオキシン異性体の１つである２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ量が、ダイオキシン類の総ＴＥＱと非常に高い相関性を有することが明らかになってきた（高菅ら、第１１回環境化学討論会講演要旨集、１３６頁、２００２年）。土壌、底質、大気、水質、排ガス、飛灰などの環境試料、母乳、血液などの生体試料、ならびに、海産物、食品などの広範な試料においても、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦは、全ダイオキシンの主要構成成分でありその含有量はダイオキシン類の総ＴＥＱとＲ＝０．９６〜０．９９の高い相関を示す。従って、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦは、ダイオキシン量を把握するための指標物質として注目されている。
一方、抗体を利用してダイオキシン類を定量する試みも行われている。
例えば、特開２００２−３４０８８２号公報には、ダイオキシン類の捕集ユニット、抽出ユニット、分離精製ユニット、および抗体を用いてダイオキシン類を測定する測定ユニットの４つのユニットから構成されるダイオキシン類の測定装置および測定方法が記載されている。
また、特開２００２−２２８６６０号公報には、２，３，７，８−ＴＣＤＤに高親和性のモノクローナル抗体を作製し、これを用いてヒト血液や母乳などの生体試料中のダイオキシン類を検出する方法が記載されている。
さらに、特開２００２−１１９２７９号公報には、ダイオキシン類である複数の異性体に対して交差反応性を有する数種の抗体を用い、ダイオキシン類の存在量を推定する方法が記載されている。
しかし、これらの文献には、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識するモノクローナル抗体、ならびに、該モノクローナル抗体をコードする遺伝子配列、該遺伝子配列に基づく組換抗体および該組換抗体を用いる２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの測定方法については記載されていない。
また、これら文献の方法は、試料中に含まれるダイオキシン類のＴＥＱを把握するには至らないという欠点を有する。

（発明が解決しようとする技術的課題）
本発明者らは、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ法で測定される１７種類のダイオキシン類の主要構成成分であり、かつ、その含有量がダイオキシン類の総ＴＥＱと高い相関性を有する指標異性体である２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを、免疫学的手法により、迅速、簡便、高感度に捕獲および測定する方法を確立しようとした。
（その解決方法）
本発明者らは、上記課題を解決するために、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体を抗原として用いて、通常の細胞融合法により、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識するモノクローナル抗体を産生する２株のハイブリドーマ、即ち、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０を産生するハイブリドーマＤｘ３８６０ｒ１およびモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０を産生するハイブリドーマＤｘ３１５０ｒ１を得た。
また、本発明者らは、これらのハイブリドーマ中に含まれるｍＲＮＡを単離および精製し、このｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡを合成した。次いで、このｃＤＮＡの中から、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域ならびにモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを選択するため、抗体遺伝子特有の配列を利用してＰＣＲを行い、目的の抗体遺伝子を特異的に増幅させた。これら選択されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、それらがコードするアミノ酸配列を推定した。
その結果、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡは、それぞれ配列番号１および２で示され、一方、モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡは、それぞれ配列番号３および４で示されることがわかった。
また、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および６で示され、一方、モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および８で示されることがわかった。
さらに、本発明者らは、上記抗体の可変領域中の超可変領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列およびその位置を特定した。超可変領域のアミノ酸配列を以下の表１〜４に示す。

モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖およびＬ鎖可変領域中の超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と共に、それぞれ図１および図２に示す。また、モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖およびＬ鎖可変領域中の超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と共に、それぞれ図３および図４に示す。
図１において、アミノ酸配列の２６〜３３位がＣＤＲ１を、５１〜５７位がＣＤＲ２を、９６〜１０３位がＣＤＲ３を示す。
図２において、アミノ酸配列の２６〜３４位がＣＤＲ１を、５２〜５４位がＣＤＲ２を、９１〜９８位がＣＤＲ３を示す。
図３において、アミノ酸配列の２６〜３４位がＣＤＲ１を、５２〜５８位がＣＤＲ２を、９７〜１０７位がＣＤＲ３を示す。
図４において、アミノ酸配列の２６〜３４位がＣＤＲ１を、５２〜５４位がＣＤＲ２を、９１〜９９位がＣＤＲ３を示す。
また、本発明者らは、上記抗体の可変領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに組込み、該ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞において組換抗体を発現させた。さらに、本発明者らは、該組換抗体を用いて、試料中の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを定量しうることを確かめた。また、本発明者らは、上記抗体の可変領域をコードするＤＮＡに変異を導入し、この変異導入ＤＮＡを用いて上記のように組換抗体を発現させ、該組換抗体を用いて、試料中の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを定量しうることを確かめた。
即ち、本発明は、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン（２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ）に結合活性を有する組換抗体であって、
（１）２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識するモノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域を構成し、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）該モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＬ鎖可変領域を構成し、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（３）２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識するモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域を構成し、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（４）該モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＬ鎖可変領域を構成し、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（５）上記（１）〜（４）のポリペプチドのアミノ酸配列に９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦに結合活性を有するポリペプチド；ならびに
（６）上記（１）〜（５）のポリペプチドのフラグメントであり、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦに結合活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む組換抗体を提供するものである。
また、本発明は、上記の組換抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むクローニングまたは発現ベクター、該ベクターで形質転換した形質転換体、該形質転換体を用いて該組換抗体を製造する方法、ならびに、該組換抗体を用いて２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを免疫学的に捕獲および測定する方法を提供するものである。
（従来技術より有効な効果）
本発明の組換抗体を用いて、ダイオキシン類、特に２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを、免疫学的手法により、迅速、簡便、高感度に捕獲および測定することができる。

図１は、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域のＤＮＡ配列、アミノ酸配列および超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を示す。
図２は、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＬ鎖可変領域のＤＮＡ配列、アミノ酸配列および超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を示す。
図３は、モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域のＤＮＡ配列、アミノ酸配列および超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を示す。
図４は、モノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＬ鎖可変領域のＤＮＡ配列、アミノ酸配列および超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を示す。
図５は、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３８６０ＨＬの構成を示す。
図６は、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３８６０ＬＨの構成を示す。
図７は、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３１５０ＨＬの構成を示す。
図８は、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３１５０ＬＨの構成を示す。
図９は、抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦｓｃＦｖを用いた間接競合イムノアッセイにより、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを測定した結果を示すグラフである。
図１０は、Ｈ鎖可変領域ポリペプチド画分と抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ活性の関係を示すグラフである。
図１１は、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＶ_Ｈ鎖変異体のアミノ酸配列を示す。
図１２は、変異導入Ｄｘ３８６０ｓｃＦｖ提示ファージにより、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを測定した結果を示すグラフである。
図１３は、変異導入Ｄｘ３８６０ｓｃＦｖ提示ファージの抗体価を比較するグラフである。
図１４は、変異導入Ｄｘ３８６０ｓｃＦｖ提示ファージのＤＭＳＯ存在下での反応性を比較するグラフである。

本発明で言う「抗体」には、生体内に存在する天然型抗体の他に、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖の可変領域またはその組合せにより形成される、少なくとも１つの抗原結合部位を有するポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドには、例えば、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域のみを含むポリペプチド、１組のＨ鎖フラグメントとＬ鎖からなるＦａｂフラグメント、２組のＨ鎖フラグメントとＬ鎖からなるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域がリンカーにより１本に結合された一本鎖組換抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。
ｓｃＦｖには、例えば、Ｎ末端側から「（Ｈ鎖可変領域）−（リンカー）−（Ｌ鎖可変領域）」の順序で結合されたポリペプチド、ならびに、「（Ｌ鎖可変領域）−（リンカー）−（Ｈ鎖可変領域）」の順序で結合されたポリペプチドが含まれる。リンカーは、ｓｃＦｖが抗原に結合する際に、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域が効率良く折り畳まれるように、これらの領域の間に配置させるものである。このリンカーは、通常、５〜１５個のアミノ酸から構成されており、例えば、−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−を例として挙げることができる。本発明において使用するリンカーは、上記目的を達成できる限り、アミノ酸の数および種類に制限はない。
また、本発明の組換抗体においては、Ｈ鎖可変領域またはＬ鎖可変領域のＮ末端側およびＣ末端側に、さらに適当なアミノ酸配列が付加されていてもよい。例えば、以下の実施例において示すように、「（Ｈ鎖可変領域）−（リンカー）−（Ｌ鎖可変領域）」ポリペプチドの場合には、Ｈ鎖可変領域のＮ末端側に分泌シグナル領域を、Ｌ鎖可変領域のＣ末端側にエピトープタグ配列を付加することができる。また、「（Ｌ鎖可変領域）−（リンカー）−（Ｈ鎖可変領域）」ポリペプチドの場合には、Ｌ鎖可変領域のＮ末端側に分泌シグナル領域を、Ｈ鎖可変領域のＣ末端側にエピトープタグ配列を付加することができる。
本発明の組換抗体には、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖の可変領域またはその組合せにより形成される少なくとも１つの抗原結合部位を有するポリペプチドの他に、これらポリペプチドと実質的に同じ機能を有する変異ポリペプチドが含まれる。本発明で言う「実質的に同じ機能」とは、抗原に対する結合力が実質的に同じであることを意味する。即ち、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列を有する本発明の抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域は、抗原との結合力が実質的に同じである限り、１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加変異を含むことができる。このような本発明の変異ポリペプチドは、配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列に対して、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。また、この変異は、図１〜４に示される抗体可変領域中の超可変領域（ＣＤＲ１〜３）以外のフレームワークに存在するのが好ましい。
また、本発明の組換抗体には、配列番号５〜８で示されるポリペプチドのフラグメントであって、元のポリペプチドと実質的に同じ機能を有するフラグメント、ならびに、これらフラグメントの組合せにより形成されるポリペプチドが含まれる。これらのフラグメントは、図１〜４に示される超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つ全てを含有する。
本発明の組換抗体は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを発現ベクターに組込み、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を適当な培地中で培養して該組換抗体を発現させることにより製造することができる。
所望のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列番号１〜４（または図１〜４）に示されるｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列に基づいて、合成により調製することができる。別法によれば、所望のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、次のようにして得ることもできる。即ち、本発明者らは、以下の実施例において示すように、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３８６０のＬ鎖可変領域を、この順序で含むフラグメント（図５を参照）を組込んだ発現ベクターを作製し、このベクターを大腸菌Ｂに導入し、この大腸菌Ｂ（ｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬ）を特許生物寄託センターに寄託した。さらに、本発明者らは、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３１５０のＬ鎖可変領域を、この順序で含むフラグメント（図７を参照）を組込んだ発現ベクターを作製し、このベクターを大腸菌Ｋ−１２に導入し、この大腸菌Ｋ−１２（ｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３１５０ＨＬ）を特許生物寄託センターに寄託した。所望のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、これらの発現ベクターから適当な制限酵素を用いて切出し、所望によりＤＮＡ配列中に変異を加えることにより得ることができる。また、ＤＮＡフラグメントの連結のために、常法によりフラグメントの末端を修飾することができる。
得られたＤＮＡフラグメントの発現ベクターへの組込みは、市販の発現ベクター［例えば、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）など］の所定のフラグメント挿入部位に合致させるように、ＤＮＡフラグメントの末端を加工し、末端加工されたＤＮＡフラグメントを発現ベクターに挿入することによって行うことができる。
このようにして得た発現ベクターを、適当な宿主細胞、特に大腸菌［例えば、大腸菌Ｂ株、Ｋ−１２株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株など］に導入し、挿入したＤＮＡフラグメントの発現に適した培地で宿主細胞を培養することにより、所望の組換抗体を発現させることができる。発現された組換抗体を、常法により宿主細胞またはその培養液から回収することができる。回収した組換抗体は、例えばクロマトグラフィー法によって精製することができる。
この方法により、所望の組換抗体を、血清を必要とする培地で動物細胞を培養することにより得られるモノクローナル抗体より安価に、かつ大量に製造することができる。
得られた組換抗体を用いて試料中の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを免疫学的に、迅速に捕獲することができる。このような捕獲法としては、イムノクロマトグラフィーや免疫沈降による２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの分離、精製および濃縮方法が含まれる。また、このような２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの捕獲作用を利用することにより、該組換抗体を用いて生体中に摂取されたダイオキシン類のうち主要物質である２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを迅速に捕獲し、除去することも可能である。
また、得られた組換抗体を用いて試料中の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを免疫学的に迅速かつ高感度に測定することができる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）などが含まれる。
また、免疫学的測定法は非競合法と競合法に大別される。本発明の組換抗体は競合法に用いるのが好ましい。この競合法には、間接競合法と直接競合法が含まれる。間接競合法においては、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体を固定化し、試料中の遊離２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦと固定化抗原との間で、組換抗体との反応を競合させる。直接競合法においては、組換抗体を固定化し、試料中の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの存在量に応じ、該組換抗体に結合する標識２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体の量を測定する。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ抗体産生ハイブリドーマの調製
２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、次のようにして調製した。即ち、初めに２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦにアルキル鎖を導入し、その末端を活性エステル体とした。次いで、これを、常法に従い、キャリアータンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に導入し、免疫用コンジュゲートを調製した。
この免疫用コンジュゲートを、アジュバントＲＡＳＲ−７００（Ｒｉｂｉ社）中に十分に乳化させ、この乳化液２００μｌをＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌）の腹腔内に投与して、マウスを免疫感作した。２週間毎に追加免疫を行い、追加免疫より約１週間の経過後に尾静脈より採血し、血中抗体価を競合ＥＩＡ法により測定した。
２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦに対する高い抗体産生が確認されたマウスを選択し、尾静脈内に免疫用コンジュゲートを投与して、最終免疫を行った。最終免疫より３〜４日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ）と脾臓細胞を細胞数が１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）にて細胞融合を行った。１０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエル培養プレートに分注（１〜２．５×１０^５／ウエル）し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。
培養開始より７〜１０日後、ハイブリドーマの増殖が見られたウエルの培養上清を一部採取し、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体−ＢＳＡコンジュゲートを固相化したマイクロタイタープレートに添加した。室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、プレートにペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）抗体（ＫＰＬ社）を加えて室温で１時間反応させた後、同様にプレートを洗浄した。基質溶液（ＴＭＢ基質、ＫＰＬ社）を加えてプレート上のペルオキシダーゼ活性を測定し、培養上清中の抗体価を求めた。高い抗体価を示すウエルのうち、固相化２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体−ＢＳＡコンジュゲートに対する抗体価が、２０％ＤＭＳＯに溶解した２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦによって大きく阻害されるウエルを選抜し、該ウエル中のハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。クローニングにより単離された細胞を培養することによって、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識する２種類のモノクローナル抗体産生クローンを樹立した。
即ち、このようにして、モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０を産生するハイブリドーマＤｘ３８６０ｒ１およびモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０を産生するハイブリドーマＤｘ３１５０ｒ１を得た。
ｍＲＮＡの単離および精製
抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ抗体産生ハイブリドーマＤｘ３８６０ｒ１およびＤｘ３１５０ｒ１を、５％ＣＯ_２通気条件下、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。対数増殖期にある約２．８〜５．０ｘ１０^７個の細胞から、ＡＧＰＣ法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，ｐ．１５６−１５９（１９８７）］によって全ＲＮＡを抽出した。次いで、オリゴｄＴがラテックスビーズに結合したＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（宝酒造）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
ｃＤＮＡの合成
ＭｏｕｓｅｓｃＦｖＭｏｄｕｌｅ／ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｈａｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＳｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）に含まれるＰｒｉｍｅｄｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘを用いて、上記のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＭｏｕｓｅＩｇ−ＰｒｉｍｅｒＳｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＣＲを行った。Ｄｘ３８６０Ｈ鎖にはＭｕＩｇＶＨ５’−ＡとＭｕＩｇＶＨ３’−２のプライマーセットを、Ｄｘ３１５０Ｈ鎖にはＭｕＩｇＶＨ５’−ＤとＭｕＩｇＶＨ３’−２のプライマーセットを用いた。また、Ｄｘ３８６０Ｌ鎖およびＤｘ３１５０Ｌ鎖の両方には、ＭｕＩｇλＶ_Ｌ５’−ＡとＭｕＩｇλＶ_Ｌ３’−１のプライマーセットを用いた。用いたプライマーを以下の表５に示す。ＰＣＲ反応は次のように行った。即ち、Ｄｘ３８６０Ｈ鎖とＤｘ３１５０Ｌ鎖については、９４℃×１分間、５０℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを３０サイクル行い、Ｄｘ３１５０Ｈ鎖については、９４℃×１分間、６０℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを３０サイクル行い、Ｄｘ３８６０Ｌ鎖については、９４℃×１分間、６０℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを５サイクル行い、その後さらに、９４℃×１分間、５０℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを３０サイクル行った。

ｃＤＮＡのサブクローニング
上記のＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキットであるｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙに挿入した後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。コンピテントセルとして、ＸＬ１−ＢｌｕｅＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を使用した。
塩基配列の決定とアミノ酸配列の解析
ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙにサブクローニングした抗体遺伝子ｃＤＮＡクローンについて、Ｔ７プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ：配列番号２６）を用いて、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によるシークエンス反応を行った。次いで、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて配列を解析した。その結果、Ｄｘ３８６０抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびその推定アミノ酸配列（配列番号１および２）ならびにＤｘ３１５０抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびその推定アミノ酸配列（配列番号３および４）を得た。塩基配列の解析ならびにアミノ酸配列の推定および解析には、解析ソフトＤＮＡｓｉｓ（日立ソフトエンジニアリング）を使用した。
また、配列番号１〜４の配列中に含まれる超可変領域は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）の分類に従って特定した。このデータベースは、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２７，ｐ．２０９−２１２（１９９９）］、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２８，ｐ．２１９−２２１（２０００）］、および、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２９，ｐ．２０７−２０９（２００１）］の論文を参照して作成されている。特定した超可変領域（ＣＤＲ１〜３）の位置を、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と共に、図１〜４に示す。
発現ベクターｐＥＴ２２Δの作製
市販ベクターであるｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の制限酵素サイトＸｂａＩ−ＮｃｏＩ間の配列を、市販ベクターであるｐＥＴ−３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の制限酵素サイトＸｂａＩ−ＮｃｏＩ間の配列に置換して、Ｔ７／ｌａｃプロモーター、ヒスチジンタグおよびＴ７ターミネーターを有する発現ベクターｐＥＴ２２Δを作製した。この発現ベクターｐＥＴ２２Δを、制限酵素ＮｃｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）とＮｏｔＩ（東洋紡社）で切断し、その末端をＣａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡社）により脱リン酸化処理した。０．７％アガロースゲル電気泳動により、切断したｐＥＴ２２Δのバンドを分離し、ゲルを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎＵｐ−（東洋紡社）を用いてＤＮＡをゲルより抽出した。このＮｃｏＩ−ＮｏｔＩサイトに、以下のようにｓｃＦｖフラグメントを組込み、これをｓｃＦｖ発現ベクターとした。
ｃＤＮＡからのｓｃＦｖフラグメントの作製
クローニングした抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡを、リンカー配列をコードするＤＮＡにより連結し、これを発現ベクターに組込むために、制限酵素配列を含むプライマーを用いて、Ｈ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。Ｄｘ３１５０Ｈ鎖は、ＢａｍＨＩサイトの配列をＧＧＡＴＣＣからＧＧＡＴＴＣに変更し、かつ、ＢａｍＨＩサイトの前後の配列を含むようにプライマーを設計し、Ｈ鎖ＤＮＡを５’側と３’側の２つに分け増幅した。リンカーＤＮＡは、ｆｉｌｌ−ｉｎによりＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡを連結するために、これらの配列の一部を含むプライマーによりＰＣＲで増幅した。これによって、一本鎖抗体のアミノ末端側がＨ鎖となるものには、Ｈ鎖センスＤＮＡ３’端側の配列をリンカーＤＮＡの５’端側に、Ｌ鎖センスＤＮＡ５’端側の配列をリンカーＤＮＡの３’端側に付加した。また、一本鎖抗体のアミノ末端側がＬ鎖となるものには、Ｌ鎖センスＤＮＡ３’端側の配列をリンカーＤＮＡの５’端側に、Ｈ鎖センスＤＮＡ５’端側の配列をリンカーＤＮＡの３’端側に付加した。Ｈ鎖、Ｌ鎖およびリンカーＤＮＡの増幅に用いたプライマーの組合せを表６および表７に示す。

ＰＣＲ増幅を、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて、次のように行った。即ち、９４℃×１分間、５８℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを５サイクル行い、さらに９４℃×１分間、４８℃×１分間、７２℃×１分間の反応サイクルを２０サイクル行った。ＰＣＲ増幅の後、各ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ＧｅｌＣｌｅａｎＵｐ−（東洋紡社）を用いてＤＮＡをゲルから抽出した。次いで、抽出したＨ鎖、Ｌ鎖およびリンカーＤＮＡの３種類のＤＮＡを混合し、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて９４℃×１．５分、６５℃×３分の反応サイクルを２０サイクル行うか、あるいは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて９５℃×１．５分、６５℃×６分の反応サイクルを２０サイクル行うことにより、Ｈ鎖、Ｌ鎖およびリンカーＤＮＡを連結した。
このように連結したｓｃＦｖフラグメントを、それがコードするアミノ酸配列と共に、図５〜８（配列番号５６〜５９；アミノ酸配列のみは配列番号６０〜６３）に示した。
図５（配列番号５６）は、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３８６０のＬ鎖可変領域を、この順序で含むｓｃＦｖフラグメント（Ｄｘ３８６０ＨＬ）を示すものであり、そのアミノ酸配列の１〜１１４位はＨ鎖可変領域を、１１５〜１２９位はリンカーを、１３０〜２３９位はＬ鎖可変領域を示す。
図６（配列番号５７）は、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３８６０のＬ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３８６０のＨ鎖可変領域を、この順序で含むｓｃＦｖフラグメント（Ｄｘ３８６０ＬＨ）を示すものであり、そのアミノ酸配列の１〜１１０位はＬ鎖可変領域を、１１２〜１２６位はリンカーを、１２７〜２４０位はＨ鎖可変領域を示す。
図７（配列番号５８）は、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３１５０のＬ鎖可変領域を、この順序で含むｓｃＦｖフラグメント（Ｄｘ３１５０ＨＬ）を示すものであり、そのアミノ酸配列の１〜１１８位はＨ鎖可変領域を、１１９〜１３３位はリンカーを、１３４〜２４３位はＬ鎖可変領域を示す。
図８（配列番号５９）は、Ｎ末端側からモノクローナル抗体Ｄｘ３１５０のＬ鎖可変領域、リンカー、Ｄｘ３１５０のＨ鎖可変領域を、この順序で含むｓｃＦｖフラグメント（Ｄｘ３１５０ＬＨ）を示すものであり、そのアミノ酸配列の１〜１１０位はＬ鎖可変領域を、１１２〜１２６位はリンカーを、１２７〜２４４位はＨ鎖可変領域を示す。
さらに、得られたｓｃＦｖフラグメントを増幅するために、反応溶液にｓｃＦｖの両端（ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ）に対応するプライマーを加えてＰＣＲを行った。Ｄｘ３８６０については、９４℃×１分、６７℃×１分、７２℃×２分の反応サイクルを５サイクル行い、さらに９４℃×１分、６０℃×１分、７２℃×２分の反応サイクルを２０サイクル行った。Ｄｘ３１５０については、９５℃×１分、６２℃×１分、７５℃×４分の反応サイクルを５サイクル行い、さらに９５℃×１分、５５℃×１分、７５℃×４分の反応サイクルを２０サイクル行った。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、ｓｃＦｖのＤＮＡフラグメント（７３０〜７４０ｂｐ）を含むゲルを切り出し、ＤＮＡフラグメントをゲルから抽出した。次いで、このＤＮＡフラグメントの末端を、制限酵素ＮｃｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）およびＮｏｔＩ（東洋紡社）により処理し、再度ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒにより精製した。
ｓｃＦｖＤＮＡフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ２２ΔのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入し、この発現ベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。ライゲーションにはＤＮＡＬｉｇｅｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（宝酒造社）を用い、コンピテントセルとしてＸＬ１−ＢｌｕｅＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を使用した。サブクローニングしたクローンについて、ｓｃＦｖ部分の配列を解析し、正しい配列を有するクローンを選択してｓｃＦｖの発現に用いた。このようにして、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３８６０ＨＬを含む発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬならびにｓｃＦｖフラグメントＤｘ３１５０ＨＬを含む発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３１５０ＨＬを得た。
発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬは、大腸菌Ｂに導入し、大腸菌Ｂ（ｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬ）として、また、発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３１５０ＨＬは、大腸菌Ｋ−１２に導入し、大腸菌Ｋ−１２（ｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３１５０ＨＬ）として、平成１５年２月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８３０５およびＦＥＲＭＢＰ−８３０６を取得した。
大腸菌での発現
ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３８６０ＨＬが組込まれた発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬで形質転換した大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、ＬＢ培地３００ｍｌ中、ＯＤ６００が約０．５になるまで３７℃で培養した。次いで、培養温度を２５℃に下げて培養を続けた。ＯＤ６００が約１．０になった時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を終濃度が１ｍＭになるように添加し、終夜培養して、ｓｃＦｖの発現を誘導した。遠心により菌体約１ｇを回収した後、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ＭＮａＣｌ中に懸濁し、リゾチーム（終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度１％）を加えて溶菌した。遠心（１５，０００ｘｇ、２０分間）により沈殿を回収し、沈殿を１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液で２回洗浄し、ｓｃＦｖを含む沈殿を約１００ｍｇ得た。
ｓｃＦｖの再構成
封入体として得られたｓｃＦｖを、２５ｍＭＰＢ、３５０ｍＭＮａＣｌ、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の緩衝液中に加え、４℃で終夜静置して溶解した。遠心（１０，０００ｘｇ、１５分間）により残渣を除去した後、上記の緩衝液にて平衡化したニッケルキレートカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に適用した。カラム容積の約５〜１０倍量の緩衝液にてカラムを十分に洗浄した後、２０％グリセロールおよび４００ｍＭアルギニンを含む上記緩衝液に交換した。６Ｍから０Ｍまでのグアニジン・ＨＣｌのグラジエントを用いて、キレートカラム上に結合したｓｃＦｖを再構成させた。２５ｍＭＰＢ、３５０ｍＭＮａＣｌ、２０％グリセロール、５０ｍＭイミダゾールの溶液（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後、イミダゾール濃度を３００ｍＭに上げてｓｃＦｖを溶出させた。
抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦｓｃＦｖを用いた間接競合イムノアッセイによる２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦの測定
マイクロタイタープレートに２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体−ＢＳＡコンジュゲート（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）でマイクロタイタープレートの各ウエルを洗浄し、ブロックエース（雪印社）を加え、室温で２時間静置してブロッキングを行った。マイクロタイタープレートを洗浄後、各濃度に調製した２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ（２０％ＤＭＳＯ溶液）２５μｌと抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦｓｃＦｖの溶液２５μｌを添加し、室温で０．５〜１時間反応させた。再度マイクロタイタープレートを洗浄した後、２０００倍希釈した抗ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）を加え室温で１時間反応させた。次いで、３０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）抗体（ＫＰＬ社）５０μｌを添加し、室温で１時間反応させた。マイクロタイタープレートの各ウエルを十分に洗浄して未反応液を除去した後、基質溶液（ＴＭＢ基質、ＫＰＬ社）を加え、室温で１５分間静置した。５０μｌの１ＭＨ_３ＰＯ_４を添加して反応を停止させ、プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）によりＯＤ４５０（対照：ＯＤ６００）を測定した。この結果を図９にグラフで示す。このグラフから、抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦｓｃＦｖにより、高感度に２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを測定できることが明らかである。
Ｈ鎖可変領域ポリペプチドの２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ結合活性の確認
発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０ＨＬのＬ鎖可変領域を含む制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ間の配列を除去して作製した発現ベクターｐＥＴ２２Δ−Ｄｘ３８６０Ｈを用いて大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。この形質転換体を用いて、ｓｃＦｖと同様に、Ｈ鎖可変領域ポリペプチド（配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）の発現を行った。
封入体として得られたＨ鎖可変領域ポリペプチドを、上記と同様に、ニッケルキレートカラム上で再構成した後、イミダゾールを用いて単離および精製した。キレートカラムより溶出された画分について、吸光度（２８０ｎｍ）を測定してタンパク質濃度を求め、さらに、ＥＩＡ法により固相化した２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ−ＢＳＡコンジュゲートへの反応性を検討した。この結果、図１０に示すように、Ｈ鎖可変領域ポリペプチド画分に抗２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ活性を認め、Ｈ鎖可変領域ポリペプチドが２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦに結合活性を有することを確認した。
Ｈ鎖への変異導入と変異体の２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ結合活性の確認
モノクローナル抗体Ｄｘ３８６０の遺伝子配列をもとに、変異導入抗体遺伝子ライブラリーの作製を行った。抗体のＨ鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）の遺伝子を鋳型とし、５’側および３’側の配列に制限酵素サイトを付加したプライマーを設定し、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅＰＣＲにより変異を導入した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅＰＣＲは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが増幅中にしばしば読み間違えを起こす性質を利用し、さらに塩化マンガンの添加によりＰＣＲの際の読み間違いを意図的に誘発し、ランダムな変異を導入する方法である。このＰＣＲ産物を、制限酵素による末端の処理と精製の後、その制限酵素サイトを利用して単鎖抗体発現ファージミドのＨ鎖遺伝子と置き換え、これを用いて大腸菌ＴＧ１を形質転換した。
形質転換した大腸菌の培養液１０ｍｌに、アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように、また、Ｍ１３ＫＯ７ファージを終濃度４×１０^９ｐｆｕ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃で１時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２×ＹＴ培地１０ｍｌに再懸濁し、３７℃で終夜培養して培地中に単鎖抗体提示ファージを産生させた。培養液を遠心分離し、大腸菌菌体を除いた培養上清１０ｍｌに対し、２．５ＭＮａＣｌ含有２０％ポリエチレングリコール溶液２ｍｌを加え、混和した。氷上で１時間静置した後、冷却下、遠心分離（１００００ｇ×２０分間）した。上清を完全に除去した後、得られた沈殿を１０倍希釈ブロックエース（雪印社）１ｍｌに溶解させ、単鎖抗体提示ファージ溶液とした。
調製した単鎖抗体提示ファージから、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体、２，３，７，８−ＴＣＤＦ誘導体、およびクロロベンゼン誘導体に対する反応性の高いクローンを濃縮するため、バイオパニングを行った。調製したファージ溶液を、まずブロッキング剤のみを固相化したマイクロタイタープレート中でプレインキュベート（１００μｌ／ウエル、室温、１時間）することにより、非特異的結合を排除した。次いで、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ誘導体、２，３，７，８−ＴＣＤＦ誘導体、およびクロロベンゼン誘導体の各ＢＳＡコンジュゲートを固相化してブロックエースでブロッキングしたマイクロタイタープレートに移し（１００μｌ／ウエル）、８％ＤＭＳＯ存在下に室温で１時間反応させた。反応終了後、プレートの各ウエルに８％ＤＭＳＯおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）３００μｌを添加し、ピペッティングし、５分間静置した後、洗浄緩衝液を廃棄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、洗浄液を完全に除去し、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）１００μｌ／ウエルを加え、１０分間静置した。ピペッティングを行って、固相化抗原から遊離した単鎖抗体提示ファージを回収し、直ちにトリス溶液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。
２×ＹＴ培地２．５ｍｌ中で培養した大腸菌ＴＧ１（ＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．３）の培養液に、バイオパニングにより回収したファージ溶液を混和し、３７℃で１時間培養してファージを再感染させた。次に、アンピシリン（終濃度１００μｇ／ｍｌ）およびグルコース（終濃度２％）を含む培養液に、終濃度４×１０^９ｐｆｕ／ｍｌとなるようＭ１３ＫＯ７ファージを添加し、さらに３７℃で１時間培養を行った。遠心分離により菌体を回収した後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２×ＹＴ培地１０ｍｌに再度懸濁し、３７℃で終夜培養した。これにより、単鎖抗体提示ファージを増幅し、培地中に産生させた（ファージレスキュー）。増幅したファージを、再びポリエチレングリコール沈殿により回収した。バイオパニングによる濃縮と再感染およびファージレスキューによる増幅を、３〜５回繰り返した。
十分濃縮されたと考えられるファージクローンを、大腸菌ＴＧ１に感染させ、寒天平板培地にプレーティングし、３０℃で終夜培養して単一コロニー化した。スクリーニング条件ごとにＴＧ１の単一コロニーから６クローンずつを無作為に選び、常法によりファージミドを調製し、これを鋳型としてＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によるシークエンス反応を行った。ジェネティックアナライザＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により塩基配列を解析し、４種類のＶ_Ｈ鎖変異導入体（Ｄｘ３８６０ＨＬ−Ｍ＃５、Ｄｘ３８６０ＬＨ−Ｍ＃１、Ｄｘ３８６０ＬＨ−Ｍ＃２、Ｄｘ３８６０ＬＨ−Ｍ＃３）を得た。これらＶ_Ｈ鎖変異体のアミノ酸配列を、図１１および配列番号６４〜６７に示した。Ｄｘ３８６０野生型Ｖ_Ｈ（ＷＴ）と比較したところ、１〜２個のアミノ酸の変異が見られた。また、変異導入箇所はＣＤＲ部位に特定されず、フレームワークにも認められた。
いずれの変異体も間接競合イムノアッセイにより２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識することを確認した（図１２）。また、抗体価やＤＭＳＯ中での反応性には差が見られ、抗体価およびＤＭＳＯ中での安定性はいずれも、変異体の方が野生型を上回る結果を示した（図１３および図１４）。さらに、この傾向は形質転換した大腸菌［ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）］にて発現させた各ｓｃＦｖにおいても保持されていた。

産業上の利用の可能性

本発明により提供されるＤＮＡを用いて宿主細胞内で発現させることにより、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを認識する組換抗体を大量に製造することができる。このように製造された組換抗体は、親モノクローナル抗体より安価であり、それを用いて２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦを免疫学的に捕獲することができ、免疫測定に応用することができる。また、変異を導入したＤＮＡを用いることにより、さらに有利な特性を有する組換抗体、例えば、２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦへの親和性が向上した組換抗体や安定性が改善された組換抗体などを製造することができ、生体成分である天然の抗体タンパク質が有する問題点の克服も可能となる。

Claims

２,３,４,７,８-ペンタクロロジベンゾフラン(２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦ)に結合活性を有する組換抗体であって、ｓｃＦｖフラグメントＤｘ３８６０ＨＬ、ならびに、変異体Ｄｘ３８６０ＨＬ - Ｍ＃５、Ｄｘ３８６０ＬＨ - Ｍ＃１、Ｄｘ３８６０ＬＨ - Ｍ＃２およびＤｘ３８６０ＬＨ - Ｍ＃３からなる群から選択される組換抗体。
請求項１に記載の組換抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
請求項２に記載のＤＮＡを含むクローニングまたは発現ベクター。
請求項３に記載のクローニングまたは発現ベクターで形質転換した形質転換体。
請求項１に記載の組換抗体の製造方法であって、請求項４に記載の発現ベクターで形質転換した形質転換体を適当な培地中で培養し、該形質転換体または培地から組換抗体を回収することを含んでなる方法。
２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦを免疫学的に捕獲する方法であって、請求項１に記載の組換抗体を使用することを特徴とする方法。
２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦを免疫学的に測定する方法であって、請求項１に記載の組換抗体を使用することを特徴とする方法。