JP4052389B2

JP4052389B2 - 複数の発光成分の発光量測定法およびその発光測定装置

Info

Publication number: JP4052389B2
Application number: JP2003162987A
Authority: JP
Inventors: 英文秋山; 克裕近江谷; 敏照榎本; 隆司堀; 英博久保田
Original assignee: Atto Corp
Current assignee: Atto Corp
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2023-05-02
Also published as: JP2004333457A

Description

【０００１】
【発明に属する技術分野】
本発明は複数の発光成分が混在する試料において、高効率で精度良く発光成分を分離定量する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子発現（遺伝子からタンパク質に転写翻訳される過程）をモニターするためのツールとして、発光タンパク質遺伝子が用いられている。通常は、ホタルの発光タンパク質であるルシフェラーゼの遺伝子が用いられることからルシフェラーゼアッセイ法と呼ばれている。
【０００３】
特定の遺伝子発現をモニターする場合、その遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置きかえると、置きかえる前のタンパク質翻訳量に相当するルシフェラーゼが翻訳合成される。ここで合成されたルシフェラーゼに基質を加えるとルシフェラーゼの濃度に依存した発光が測定できるため、濃度の推定は容易に行える。しかし、この方法には細胞の状態と細胞数によって発光量が変化するという問題があり、細胞の状態と細胞数を考慮し発光量を補正することのできる内部標準が必要であるとされている。
【０００４】
補正が可能なものとしてはデュアルルシフェラーゼアッセイ法が紹介されている。これは、ホタルルシフェラーゼによる発光を測定した後に、内部標準としてのウミシイタケ（レニラ）のルシフェラーゼによる発光を測定するという手法である。この方法は、発光の至適条件が異なるために、同時測定ができずに操作が煩雑であり、一方のルシフェラーゼがもう一方の転写過程を阻害する可能性を否定できない問題点が残されていた。
【０００５】
一方、ホタルのルシフェラーゼから発光色の異なる変異体を見つける研究（ＣｏｎｔａｇＣ．ｅｔａｌ，Ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ６，４９５，３５５，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１７，２００２）や発光色の異なる鉄道虫由来のルシフェラーゼの研究も進められている（ＶｉｖｉａｎｉＶＲ，ＵｃｈｉｄａＡ，ＶｉｖｉａｎｉＷ，ＯｈｍｉｙａＹ，ＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００２，７６（５）５３８−４４：ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＡｌａ２４３（Ｇｌｙ２４７），Ａｒｇ２１５ａｎｄＴｈｒ２２６（Ａｓｎ２３０）ｏｎｔｈｅｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａａｎｄｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｒａｉｌｒｏａｄｗｏｒｍ，ｃｌｉｃｋｂｅｅｔｌｅａｎｄｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ）。これらは同じ基質を添加するだけで、異なった色に発光するので注目されている。しかし、これらの変異体も色を完全に区別して測定できるほどに発光波長がシフトしている訳ではない。このような背景から、発光色は異なっていても分離の難しいルシフェラーゼ量を簡単に測定する方法の開発が望まれていた。
【０００６】
また、タンパク質の機能を解析するための手法として、目的のアミノ酸配列をはさんで発光タンパク質と蛍光タンパク質を配した融合タンパク質の利用も進められている。この融合タンパク質は、通常は発光タンパク質による光エネルギーを蛍光タンパク質が吸収し、蛍光タンパク質が発光する。ところが、目的のアミノ酸配列からなる部分が切断を含む大きな構造変化を受けると、蛍光タンパク質はエネルギーを吸収できなくなり、構造変化を受けた量に応じて発光タンパク質による発光が強くなる。この場合も、２色の発光の増減を定量的に測定することのできる実用的な装置開発が望まれていた。
【０００７】
２色が同時に発光する測定対象に対してそれぞれの光量を求める場合、従来は、お互いの光によって影響を受けない波長を測定波長としなければならず、そのために透過波長帯域が１０ｎｍ前後と狭く透過率が４０％程度のフィルターを２枚利用していた。しかし、一般的な発光は、発光の中心波長に対して２００ｎｍほどの広がりを持っていて、従来法では発光色を精度良く分離することはできないことが多かった。また、分離できる成分であっても、互いに影響を受けない波長で測定すると、光量が著しく低下するために、実用的な感度が得られないという致命的な問題があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、明瞭に区別しにくい微弱な複数の発光成分を高効率で分離する方法および装置を開発し、生命現象の解明に利用しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するためには、透過波長域が広く高透過率の色分離用のフィルターの利用が必要であるが、それらは色を分離する機能が十分に備わっていない。そこで、これらのフィルターを用いて色成分を分離定量するための行列計算式を考案した。
【００１０】
この方法によるとｉ色の発光成分を分離するにはｉ−１枚のフィルターで足りる。まず、発光成分毎にそれらのフィルターの透過率を測定する。次に、フィルターを通さず、すなわちフィルターなしで総発光量を測定し、続いて、特定のフィルターを透過する発光量を測定する。それらの結果から、個々の成分の発光量が、行列式を用いて計算できることを示し、装置を組み立て、実際に測定可能であることを確認した。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
最初に図１に示したような２色の発光成分Ｙ、Ｒを１枚のフィルターで個々に測定する方法を示す。
【００１２】
まず、発光成分Ｙについて、フィルターを使用しないときとフィルターを使用したときの光電子増倍管などの検出器のシグナル値から透過率Ｔｙを求める。同様に発光成分Ｒのフィルター透過率Ｔｒを求める。成分Ｙの発光による検出器のシグナル値をｙ、成分Ｒの発光による検出器のシグナル値をｒをとする実試料において、フィルターを使用しないときの検出器のシグナル値がＳ１、フィルターを使用したときの検出器のシグナル値がＳ２であるとする。
シグナル値はフィルターの透過率に比例することから、
Ｓ１＝ｙ＋ｒ
Ｓ２＝（Ｔｙ×ｙ）＋（Ｔｒ×ｒ）
の関係式が得られる。これを行列式で表すと数１となる。
【００１３】
【数１】

これは数２に変形できるから成分ＹとＲの発光量は数３と計算できる。
【００１４】
【数２】

【００１５】
【数３】

【００１６】
上記の考え方を発展させると、ｉ色の発光成分が混在する試料において、フィルターなしのときの総発光量と、ｉ−１枚のフィルターをそれぞれ透過させたときの発光量と、各発光成分毎の既知のフィルター透過率とから、４式が得られる。ここでＳ１はフィルターなしのときの総発光量、Ｓ２は１枚目フィルターを透過させたときの発光量、Ｓ３は２枚目フィルターを透過させたときの発光量、Ｓｉはｉ−１枚目フィルターを透過させたときの発光量である。Ｔ（ｉ−１）ｉはｉ−１枚目のフィルターの発光成分ｉの既知の透過率である。又、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１ｉ、Ｔ２１、Ｔ２２、Ｔ２３、Ｔ２ｉはそれぞれ２文字目がフィルター、３文字目が発光成分を表すことから、例えばＴ２１は発光成分１の２枚目のフィルター透過率を表すことになる。尚、ｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘｉは各発光成分の発光量である。
【００１７】
【数４】

【００１８】
これを行列式では数５と表すことができ、この方程式を解くことで、個々の成分の発光量を求めることができる。
【００１９】
【数５】

【００２０】
次に、この方法を実現するための発光測定装置を図２に示す。試料台２に設置された多成分が同時に発光する実試料１からの光はレンズ３で平行光にされ、フィルター４に導入される。フィルター固定台５は円板状で、フィルターの無いホールとフィルターが固定できるホールとの環状配列から成り、使用するフィルターはモーター６を回転させて選択できる。ここで使用するフィルターは、一般に市販されている長波長透過フィルター、または長波長カットフィルターを用いることができる。これらのフィルターの透過率は８０％を越えるものが多く使いやすい。また、５０％透過波長または５０％カット波長は厳密に設定する必要がなく、実試料において予想される発光量の少ない成分をより効率良く透過するフィルターを選択するのが良い。
【００２１】
フィルター４を透過した光はレンズ７で検出器８に集光される。この検出器のシグナルを電気的に取り出し数値化し、コンピュータ９に転送する。このコンピュータは発光成分毎にフィルターの透過率を入力すると、シグナル値から各発光成分の光量を計算する機能を有している。また、光子数に換算する係数も入力、保持できる。検出器は微弱な発光測定に適した光電子増倍管やＣＣＤが好ましいが、これに限定されることはない。また、ＣＣＤを使う場合でも画像にしないのであれば、平行光にする必要は無い。従って、レンズは１枚でも良く、フィルター部５の設置場所もこれに限定されることは無い。
【００２２】
この装置を用いると、以下の順序に従って色分離を行うことができる。最初に色分離用のフィルターを選択し、発光成分毎に透過率を測定し、それをコンピュータに入力しておく。次に、フィルターのないホールを通過させた総発光量を測定し、続いて、特定のフィルターを固定したホールを透過させた発光量を測定する。それらの結果から、個々の成分の発光量を上記の行列式を用いて計算する。ここで、あらかじめ検出器のシグナルを光子数に変換するための係数を求めておくと、個々の成分の発光量は光子数として表示できる。
【００２３】
この装置では、フィルターを切り換えてから測定するために、フィルターの枚数が増えるに従って測定に時間差が生じる。これを回避するには、検出器毎に特定のフィルターを取り付けた複数の検出器による同時計測が考えられる。この場合は、発光の測定効率を同じにする配置は無く、同種の検出器であっても、波長で量子効率が異なることから、複雑な補正が必要である。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明実施についての具体例を列挙しさらに詳細に説明する。
【００２５】
色分離が正しく行われるか、大腸菌で発現させた一定量の緑色発光鉄道虫のルシフェラーゼに対して赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼおよび青色発光ウミホタルルシフェラーゼの混合比率を変化させ、期待する結果が得られるか確認を行った。
【００２６】
緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼおよび赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼの発現大腸菌を個別に培養したもの１００ｍＬを集菌し、緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁し、緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼ溶液と赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼ溶液を得た。ウミボタルルシフェラーゼは天然精製品（市販品：アトー株式会社）を用いた。鉄道虫ルシフェラーゼの発光基質はピッカジーン発光基質液（市販品：東洋ビーネット）を、ウミボタルルシフェラーゼの発光基質はウミボタルルシフェリン（市販品：アトー株式会社）を用いた。赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼ、緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼ、ウミボタルルシフェラーゼ溶液は緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）でそれぞれ２００倍、１００倍、１０００倍に希釈した。これらの５０μＬに、水で５０００倍に希釈したウミボタルルシフェリンとピッカジーン発光基質液を１：１の比率で混合した基質混合液５０μＬを加え発光させた。
【００２７】
これらの発光スペクトルは、微弱発光スペクトル測定装置（市販品：アトー株式会社）を用いて測定した（図３）。続いて、この発光スペクトルを見て、色分離に適していると思われるＹ５２（５０％透過波長５２０ｎｍ）とＲ６０（５０％透過波長６００ｎｍ）の長波長透過フィルターを選択した。その透過特性を図４に示した。
【００２８】
色分離操作には、フィルターを切り替えて発光量を測定するため、それぞれの発光反応が安定している必要がある。図５に基質添加後の発光量の変化を示した。この結果より、３種類のルシフェラーゼ発光の経時変化が少なく、色識別計測に適している時間はルシフェラーゼ液に基質液を混合後、８分〜１０分であると判明した。
【００２９】
そこで８分後にフィルターなしの状態の発光量を３０秒測定し、続けてＹ５２、Ｒ６０を透過する発光量を求め、その結果から上記３種類の発光タンパク質による発光の透過率を計算し表１の結果を得た。
【００３０】
【表１】

【００３１】
緑色発光鉄道虫のルシフェラーゼを一定量の５０μＬとし、ウミボタルルシフェラーゼと赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼの添加量を変え全量を１００μＬとした溶液を調製し、これに上記基質混合液５０μＬを加え、８分経過後、フィルターなしの状態の発光量を３０秒測定し、続けてＹ５２、Ｒ６０を透過する発光量を測定した。その結果を表２に示した。
【００３２】
【表２】

【００３３】
表１の結果と表２の結果から、上記の方法で計算した各成分の発光量を表３に示した。
【００３４】
【表３】

【００３５】
また、縦軸に各成分の発光値の最大を１００としたときの相対値に対して、横軸にウミボタルルシフェラーゼの添加量と赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼの添加量をプロットしたものを図６に示した。この結果は、発光色の異なる成分が混合したものでも、成分毎の発光量を容易に求めることができることを示している。このように成分が分離できれば、この発光量を光子数に変換することが始めて可能になる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、複数の発光遺伝子を用いることによって、遺伝子の発現状況をより高精度に測定するための方法、および色分離機能を有する発光測定装置を提供する。この発光測定装置を用いると、必要とされる発光基質が同じであっても、発光色が変化する発光タンパク質遺伝子を有効に活用できるようになり、２種類以上の遺伝子発現の同時モニターが可能になる。さらに、発光タンパク質と蛍光タンパク質を配した融合タンパク質を利用すると、発光色の変化を測定することで、タンパク質の機能を調べられるため、生命現象の解明を進めることができる。また、２種類の発光成分の分離測定を例に述べれば、正確に測定したい光成分を効率良く透過する１枚のフィルターを利用するだけで、発光量の多い成分に隠れた微弱な発光成分の測定が可能になる。同様に、発光成分Ａに隠れた成分ＢおよびＣの分離測定には、成分ＢおよびＣを効率良く透過するフィルターと成分Ｃを効率良く透過するフィルターを利用すればよい。このように、ｉ−１枚のフィルターでｉ色を実用的に分離することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２色の発光成分Ｙ、Ｒのスペクトルと分離用フィルターの概念図である。
【図２】発光成分分離測定装置の略図である。
【図３】ウミボタルルシフェラーゼ、緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼおよび赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼの発光スペクトルを示したものである。
【図４】発光成分分離用フィルターの波長透過特性を示したものである。
【図５】ウミボタルルシフェラーゼ、緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼおよび赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼの基質添加後の発光強度変化を見たものである。
【図６】緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼ一定量下で、ウミボタルルシフェラーゼと赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼの混合比を変えた３成分発光試料の成分分離結果を示したものである。
【符号の説明】
１：実試料、２：試料台、３：レンズ、４：フィルター、５：フィルター固定台、６：モーター、７：レンズ、８：検出器、９：コンピュータ

Claims

明瞭に区別しにくいｉ色の発光成分が混在する試料の各発光成分の発光量をｉ−１枚のフィルターを利用して測定する方法において、フィルターなしの総発光量と、ｉ−１枚のフィルターをそれぞれ透過させたときの発光量と、各発光成分毎の既知の上記フィルター透過率とから、行列式によって各発光成分の発光量を求めることを特長とする発光量測定方法。
ｉ色の発光成分を含む試料を設置する試料台と、該試料の発光量を測定する検出器と、上記試料台と上記検出器との間に設置される固定台にして、フィルターのないホールとｉ−１枚のフィルターが固定されたホールとが環状に配列された固定台と、上記フィルターのないホールを通過したときの上記検出器からのシグナル値と、上記ｉ−１枚のフィルターを固定したホールをそれぞれ透過したときの上記検出器からのシグナル値とが転送されるコンピュータとから構成され、該コンピュータに入力された発光成分毎のフィルター透過率と上記シグナル値とから請求項１に記載の方法によりｉ色の発光成分の発光量を測定することを特長とする装置。
請求項２に記載の装置であって発光成分の発光量を光子数で規定することを特長とする装置。