JP4018122B2 - Pd−1欠損マウスおよびその用途 - Google Patents
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Description
しかしながら、他の系統のマウスでPD−1を欠損させた場合については、その遺伝背景の違いがPD−1を欠損に対してどのような影響を及ぼすか全く知られていない。
1.PD−1受容体を欠損したBALB/c系マウス、
2.前項1に記載のマウスを用いることを特徴とする自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
3.自己抗体を産生することによる自己免疫疾患に対する前項2記載のスクリーニング方法、
4.免疫疾患が、拡張型心筋症である前項2記載のスクリーニング方法、
5.前項1記載のマウスが特異的に産生するIgG自己反応性抗体、
6.前項5記載のIgG自己反応性抗体に特異的に反応し、心臓で特異的に産生される約33kDa(33kDa±5kDa)の蛋白、
7.前項6記載の蛋白を用いることを特徴とする拡張型心筋症の診断方法、
8.前項7記載の蛋白をコードする遺伝子を検出することを特徴とする拡張型心筋症の(遺伝子)診断方法に関する。
PD−1を欠損したBALB/c系マウス(PD−1(−/−)と表記する。)は、生後5週齢目から死亡し始め、30週齢までには、その2/3が死亡する。正常なBALB/cマウス(PD−1(+/+)と表記する。)には、その様な兆候は見られない。また、PD−1を欠失したC57BL/6(B6−PD−1(−/−)と表記する。)には、ループス様腎炎および関節炎の発症は見られたが、初期段階の死亡は見られなかった。
IgG1サブクラスの自己免疫抗体を産生し、この抗体が心臓で特異的に産生される約33kDaの蛋白に結合して集積するため、自己免疫疾患型の拡張型心筋症を引き起こしたものと考えられる。
この様に、拡張型心筋症の原因が、心筋を標的とした内因性の調節障害による自己免疫疾患であるという可能性、すなわちこれまで証明されていない可能性が示唆された。
PD−1受容体を欠損した本発明のBALB/c系マウスは、
(1)PD−1を欠損したC57BL/6(B6)系マウスを少なくとも10世代以上、BALB/c系マウスに戻し交配するか、または、
(2)BALB/c系マウスの胚芽基幹(ES)細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製することができる。
本発明のBALB/c系PD−1欠損マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のBALB/c系PD−1欠損マウスは、拡張型心筋症を発症して死亡する。本PD−1欠損マウスに薬剤を投与した後、生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本PD−1欠損マウスが産生する自己抗体量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
加齢により拡張型心筋症を発症した本PD−1欠損マウスは、その血液中に心臓特異的IgG抗体が確認され、その心臓にはIgG抗体が沈着していることが確認される。本IgG抗体は、心臓に発現される分子量約33kDaの蛋白を特異的に認識する。本PD−1欠損マウスでもまだ拡張型心筋症を発症していないマウスでは、このIgG抗体の産生は確認できるが、量的には十倍以上低い程度であった。
BALB/c系マウスの胚芽基幹(ES)細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製したC57BL/6系PD−1欠損マウスを、BALB/c系マウスに10世代戻し交配し、表記BALB/c系PD−1欠損マウスを得た。得られたマウスは、無菌の施設で飼育した。
実施例1で得たBALB/c系PD−1欠損(PD−1(−/−))マウスを飼育すると、図1中、黒丸に示すように生後5週齢から死亡し始めた。30週齢までには2/3が死亡した。それに対し、PD−1の欠損のない正常BALB/c系(PD−1(+/+))マウス(図1中白抜きの四角)では死亡例が認められなかった。B6PD−1欠損(PD−1(+/−))マウスの飼育の結果と共にまとめて図1に示す。
PD−1(−/−)マウスは、死の数日前に眼球の突出を示し、剖検の結果、すべて異常に心臓が肥大していた。また、肝腫脹を示し、このことは死因が鬱血性心不全であったことを示唆していた。
死亡したBALB/c系PD−1欠損マウスの組織学的な検討を行なった。PD−1(−/−)マウスの右心室壁は正常マウスより薄く、両心室は直径がおよそ2倍に肥大していた。
瘢痕形成を伴った細胞充実性で、間質性の線維症を含む散発的な線維性の反応があったが、肉眼では心室壁は正常に見えた。電子顕微鏡による検観では、心室壁全体に乱れて崩壊した筋フィラメントと不規則な形状のミトコンドリアを伴う心筋細胞の変性が散在していた。大多数のマウスの心房では、様々な大きさの、多くは巨大な、鬱血によると思われる血栓が認められた。
生存状態で心機能評価のために、PD−1(−/−)マウスおよび正常(PD−1(+/+))について経胸壁超音波心臓図検査を行った。結果を図2(A)(LVDd:左心室拡張期寸法)、(B)(LVDS:左心室収縮期末期寸法)および(C)(心室分画短縮率%)に示す。PD−1(−/−)マウスの心室腔は、特に右心室で大きく肥大し、その壁の厚さはPD−1(+/+)マウスのそれに比べて顕著に減少していた。左心室と心室中隔の動きはPD−1(−/−)マウスでは拡張期(LVDd)及び収縮期(LVDS)共に低下し(Mモード)、収縮機能の指標である、心室分画短縮は、71.9%(PD−1(+/+))から14.9%(PD−1(−/−))へと大きく低下した。
この事実は、PD−1(−/−)マウスの心臓のポンプ機能が、肥大により冒されていることを示し、拡張型心筋症という診断を裏付けた。
BALB/c−Rag−2(−/−)背景でのPD−1(−/−)マウスは完全に健康だったので、BALB/cPD−1(−/−)マウスにおける心疾患の発生は、免疫応答性の細胞の機能によるものと考えられたため、心臓に特異的な免疫反応の徴候を探した。
免疫蛍光法による解析の結果、PD−1(−/−)マウスの心臓では心筋細胞を取り囲んで、IgGの線状の沈着がC3補体と共に見られ、PD−1(+/+)マウスの心臓ではそのようなIgGの沈着は検出されなかった。
心臓壁全体にIgGの沈着はびまん性に認められた。IgGの線状の染色パターンは、組織特異的な自己抗体の結合であることを意味していた。他の臓器では、IgGの沈着はほとんど検出されなかった。沈着したIgGのアイソタイプはほとんどIgG1であった。
心臓に対する特異的な自己免疫反応を確認するため、心臓組織に対する自己抗体の存在の可能性を検討するためにBALB/c(n=4)、心臓の肥大したBALB/c−PD−1(+/−)(n=9)、発症していないBALB/c−PD−1(−/−)(n=6)、B6(n=2)、およびB6−PD−1(−/−)(n=5)の各マウスの血清を用いて、正常な心臓抽出物に対するIgG自己抗体を調べた。
病気のPD−1(−/−)マウスの血清はすべて300倍希釈で、ほとんどは1000倍希釈でも33kDaのタンパク質に対する自己抗体を示したが、PD−1(+/+)マウスの血清は30倍希釈でもそのような自己抗体を示さなかった。
しかし、前者は濃度を高くすれば反応を示した。従って、33kDaのタンパク質に対する高い力価のIgG自己抗体の存在は、拡張型心筋症の臨床的な徴候と完全に相関した。33kDaのタンパク質は、BALB/cPD−1(−/−)由来の同じ血清によっては、肝臓、腎臓又は骨格筋のようなその他の組織で検出されなかったので、33kDaの自己抗原は、心臓組織特異的であると思われた。
正常な心臓抽出物に対して、同じPD−1(−/−)マウスの血清と共に溶離物の免疫反応性を調べるために、プロテインGビーズによって、組織抽出物を免疫沈降し、正常BALB/c及び病気に冒されたPD−1(−/−)マウスの心臓に沈着したIgGを酸性抽出によって回収し、直接その反応性を検討した。図6に示すように、PD−1(−/−)マウスからの溶離物には野生型BALB/cマウスに比べてはるかに大量のIgGが含まれていた。溶離したIgGは、病気のPD−1(−/−)マウスの血清によって検出されたものと明らかに同一の特異的な33kDaタンパク質と反応した。この結果は、病気のマウスでは、循環している自己抗体が心臓組織に特異的に結合することを示していた。
外見上正常な5週令のPD−1(−/−)マウスの脾細胞を3匹のBALB/c−Rag−2(−/−)マウスに静脈を介し、移入した(2000万個/マウス)。単回注射した30週後、1匹のマウスが眼球突出を示した。剖検では典型的な拡張型心筋症であった。このマウスの血清による免疫ブロットでは、1000倍希釈で心臓の33kDa蛋白に対するIgG自己抗体の存在が示された。
実施例1で得たPD−1(−/−)マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のBALB/c系PD−1欠損マウスは拡張型心筋症を発症して死亡する。本PD−1欠損マウスに候補化合物を投与し、その効果を生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本PD−1(−/−)マウスが産生する自己抗体は心臓で特異的に産生される約33kDaの蛋白を用いたELISA法によって測定が可能である。従って、その自己抗体の産生量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
BALB/c−PD−1(−/−)マウスをBALB/c−Rag−2(−/−)マウスに戻し、交配し、BALB/c−PD−1(−/−)−Rag−2(−/−)マウス30匹を作出した。
これらのマウスは、45日間の観察期間中生存し、剖検によっても心疾患の症状は見られなかった。
Claims (6)
- PD−1欠損C57BL/6系マウスを、BALB/c系マウスに10世代、11世代または12世代戻し交配して、PD−1遺伝子をホモ欠損させることにより得られることを特徴とするBALB/c系マウス。
- 戻し交配が10世代である請求項1に記載のBALB/c系マウス。
- 拡張型心筋症の表現型を示す請求項1または2に記載のBALB/c系マウス。
- 拡張型心筋症治療剤のスクリーニングに用いるための請求項1〜3のいずれかに記載のBALB/c系マウス。
- PD−1欠損C57BL/6系マウスを、BALB/c系マウスに10世代、11世代または12世代戻し交配することを特徴とする、PD−1遺伝子がホモ欠損したBALB/c系マウスの作製方法。
- 戻し交配が10世代である請求項5に記載の作製方法。
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