JP3996635B2

JP3996635B2 - 重症筋無力症処置用合成ペプチド

Info

Publication number: JP3996635B2
Application number: JP50250294A
Authority: JP
Inventors: セラ，マイクル; モーゼス，エドナ
Original assignee: イエダ・リサーチ・アンド・デベロツプメント・カンパニー・リミテツド
Priority date: 1992-06-18
Filing date: 1993-06-18
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2022-10-24
Also published as: IL122445A0; JPH07508521A; EP0646016A4; ATE183652T1; AU4642993A; WO1994000148A1; CA2138258C; DE69326145D1; EP0646016A1; EP0646016B1; IL106065A; AU678372B2; DE69326145T2; GR3031371T3; IL122445A; CA2138258A1; ES2139667T3; DK0646016T3; IL106065A0

Description

発明の分野
本発明は，重症筋無力症（ＭＧ）患者の処置に有用な合成ペプチドに関し，さらに詳しくは，これらのペプチド自体，重合型または巨大分子担体に結合した型からなる医薬組成物に関する．
背景技術の説明
自己免疫疾患は自己抗原に対して向けられる免疫応答によって特徴づけられる．これらの応答は，自己反応性Ｔリンパ球の持続的活性化によって維持される．Ｔリンパ球は，異種および／または自己抗原を，抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の自己主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子産物として認識して，特異的に活性化される．
重症筋無力症（ＭＧ）は自己免疫疾患であり，その症状は，神経筋接合部の後シナプス膜のアセチルコリン受容体（ＡＣhＲ）に対する抗体仲介自己免疫攻撃によって生じる．この抗体の攻撃はアセチルコリン受容体の喪失を起こし，正常な神経筋伝達は危機に瀕し，主として脳神経によって刺激される筋肉の偶発的な筋脱力，および易疲労性を生じる．
Ｔリンパ球が自己反応性過程に中心的役割を果たしているとは考えられるが，Ｔ細胞がその調節的役割に影響してＭＧの誘発および様々な臨床的表出を導くことになる特定の免疫調節機構は殆ど理解されておらず，筋無力症患者の処置には特異的な治療法はない．現在，処置はコリンエステラーゼ阻害剤たとえばピリドスチグミンおよびネオスチグミン，胸腺切除術，コルチコステロイド，ならびに免疫抑制剤および血漿交換療法によって行われている．
ＭＧは，ＡＣhＲの決定基に特異的な抗体によって仲介される，十分に確定された自己免疫疾患である．ヒトＭＨＣの特異的遺伝子，ＨＬＡ系がこの疾患に有意に関連することが明らかにされた．ＭＧ患者におけるある種の組織適合性抗原（ＨＬＡ-Ｂ８，ＤＲ３）の高い頻度はＴ細胞のレベルで表現される免疫調節の欠陥を示唆するものである．
以前の研究で，本発明者らは，ヒトＡＣhＲα-サブユニットの配列を示す２つのペプチド（ｐ１９５-２１２およびｐ２５７-２６９）が健康対照者に比較して，ＭＧ患者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を有意に刺激することを見出したのである［Brocke,S.ら(1988),J.Clin.Invest.82:1894-1900］．さらに，ＭＧ患者のＨＬＡ-ＤＲタイプとこれらのペプチドに対する応答の間の相関が明らかにされた．すなわち，ＨＬＡ-ＤＲ３を発現したすべての患者がｐ２５７-２６９に応答し，ＨＬＡ-ＤＲ５を発現した患者の８３％はｐ１９５-２１２に応答した．
近交系マウス株を用いたこの研究の延長から，ヒトＡＣhＲα-サブユニットの配列ｐ１９５-２１２およびｐ２５９-２７１に対して高，中等度および低リスポンダー株が同定されるに至った．さらに，デンキナマズ由来のＡＣhＲで免疫したＳＪＬおよびＢＡＬＢ/ｃマウスからのリンパ節細胞は免疫に用いた抗原に対するよりも，それぞれｐ１９５-２１２およびｐ２５９-２７１にむしろ良好に応答して増殖した［Brocke,S.ら(1990),Immunol.69:495］．これらの結果は，ペプチドｐ１９５-２１２およびｐ２５９-２７１が免疫学的に優性なマウスＴ細胞エピトープであることを示している．
合成免疫原性ペプチド，ｐ１５９-２１２およびｐ２５９-２７１に特異的な，ＣＨ３.ＳＷ起源の長期Ｔ細胞系およびクローンが本発明者らの実験室で確立され，Brock,S.らによって

に報告された．この報告は参考として本明細書に導入する．これらの細胞系およびクローンを用いて筋無力症エピトープのＴ細胞認識過程の特徴を明らかにすることが可能である．この方法を用い，ｐ１５９-２１２に特異的なＴ細胞系およびクローンは低（ＣＨ３.ＳＷ）および高（ＳＪＬ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から確立され，ｐ２５９-２７１に特異的なＴ細胞系およびクローンは低（ＣＨ３.ＳＷ）および高（ＢＡＬＢ/ｃ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から開発された．
欧州特許公報第432,691号には，無傷の生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ），クラスＩおよびIIの遺伝子産物に対するＴ-細胞エピトープであるペプチドの直接結合を測定するアッセイが記載されている．このアッセイは，標識ペプチドをＡＰＣとインキュベートし，ペプチドの標識に用いたリガンドと反応するプローブの添加により結合の程度をモニターするものである．このアッセイは自己免疫疾患および他の免疫学的疾患に適している．このアッセイにより，ｐ１５９-２１２は数種の異なるマウス株からの生存ＡＰＣ上のＭＨＣクラスII分子に直接結合することが示された．この観察されたペプチドの結合能は異なるマウス株の潜在的増殖能と相関を示し，関連抗-Ｉ-Ａ抗体によって阻害された．さらに，ペプチドｐ１５９-２１２および／またはｐ２５９-２７１に増殖によって応答するＭＧ患者および健康対照者からのＡＰＣは，ビオチンで標識した同一ペプチドにも結合することが明らかにされた．ＭＨＣ産物への直接結合およびＴ細胞に対する刺激能によって，ペプチドがスクリーニングできることは，疾患の病因におけるＭＧ-関連エピトープの役割を説明するものかもしれない．
自己免疫疾患に関連するペプチド抗原の一続きの配列中のアミノ酸置換によって得られるペプチド類縁体は，ＭＨＣ遺伝子産物には結合するが特異的ヘルパーＴ細胞は刺激しないペプチドに到達する可能性が示唆されてきた．このようなペプチドはインビトロおよびインビボにおいてＴ細胞の反応性を競合的に阻害し，したがって，相当する自己免疫疾患の処置に使用できる可能性がある［Sakai,K.ら(1989),PNAS 86:9740;Urban,J,L,ら(1989),Cell 59:257;欧州特許公報第432,691号およびPCT公報WO92/04049］．しかしながら，これらの引例のいずれにも，病原ペプチドと効果的に競合し，したがって，一般的に自己免疫疾患とくに重症筋無力症の防止または処置に有用なペプチド類縁体を得るために，置換できる病原ペプチドのアミノ酸およびどのようなアミノ酸が適当な置換体として有効かに関しては何の情報もガイドラインも与えられてはいないのである．
発明の要約
本発明の目的は，ヒトＡＣhＲサブユニットの配列を表す筋無力症病原Ｔ細胞エピトープの類縁体であり，重症筋無力症の特異的処置のために設計された合成ペプチドを提供することにある．
これらの合成ペプチドはＭＨＣクラスII遺伝子産物に結合するが，ＭＧ関連自己免疫応答に関与するＴ細胞は活性化しない．
したがって，本発明は，ペプチドｐ１９５-２１２の配列（配列番号：１）：

およびペプチドｐ２５９-２７１の配列（配列番号：２）：

から選ばれるヒトアセチルコリン受容体α-サブユニットの配列に相当する筋無力症病原ペプチドに対する，重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害することができる合成ペプチドであって，少なくとも９個のアミノ酸残基を有し，ペプチドｐ１５９-２１２およびｐ２５９-２７１とは１個または２個以上のアミノ酸の置換によって異なる合成ペプチド，それらのペプチドのポリマーおよびそれらの巨大分子担体との接合体に関する．
本発明はさらに，本発明のペプチド自体，その重合型または巨大分子担体への結合型の投与による重症筋無力症の処置のための医薬組成物およびその処置方法に関する．
【図面の簡単な説明】
図１は，様々な用量の筋無力症病原性ペプチドｐ２５９-２７１，ならびにその類縁体ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７に対する，Ｔ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１の増殖性応答を示すグラフである．
図２は，様々な用量の阻害性ペプチド，ｐ３０５，ｐ３０６，ｐ３０７およびｐ１９５-２１２による，Ｔ細胞系，ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１のｐ２５９-２７１特異的増殖性応答の阻害を示すグラフである．
図３は，様々な用量のペプチド（抗原＝Ａｇ）ｐ２５９-２７１，ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７による，Ｔ細胞系，ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１のヘルパー活性の特異性を示すグラフである．
図４は，様々な用量のペプチドｐ２５９-２７１単独または類縁体ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７それぞれとの配合による，Ｔ細胞系，ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１のヘルパー活性の阻害を示すグラフである．
図５は，様々な用量のｐ２５９-２７１，ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７に対する，ｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖性応答を示すグラフである．
図６は，様々な用量のｐ２５９-２７１単独または類縁体ｐ３０６との配合に対する，ｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖性応答の阻害を示すグラフである．
図７は，ｐ１９５-２１２と類縁体ｐ４５５の混合物の２つの異なる用量による，Ｔ細胞系，ＴＣＳＪＬ１９５-２１２のｐ１９５-２１２特異的増殖性応答の阻害を示すグラフである．
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は，高い親和性で適当なＭＨＣクラスII分子に結合するがＴ細胞の更なる活性化は導かない，筋無力症病原性ペプチドｐ２５９-２７１（配列番号１：）およびｐ１９５-２１２（配列番号：２）の類縁体に関する．このような類縁体の例は，この機能を同様に達成するペプチドをさらに同定するために本技術分野の通常の技術を有する誰にでも実施できる操作として提供される．本発明は，母体のペプチドｐ１５９-２１２およびｐ２５９-２７１をベースに様々な位置にアミノ酸置換を有するペプチドの設計および合成に基づくものである．適当な置換によって，重症筋無力症の経過において筋無力症病原エピトープの活動に対するアンタゴニストである類縁体を同定できる．適当なＭＨＣクラスII分子に高い親和性で結合するがＴ細胞の更なる活性化は招来しない類縁体は，Ｔ細胞の活性化を起こし続いて重症筋無力症の原因となる抗体の産生を生じるため同一のＭＨＣクラスII分子に結合する筈の筋無力症病原性ペプチドと競合することになる．Ｔ細胞の増殖を起こさせる筋無力症病原性ペプチドと競合することによって，重症筋無力症の有害な作用は緩和される．
筋無力症病原性エピトープｐ２５９-２７１およびｐ１９５-２１２のＴ細胞エピトープとしての機能に最も重要な部分は，配列番号：１のアミノ酸残基２００-２０８および配列番号：２の２６２-２６６である．したがって，改変はこれらのコア領域に行うのが好ましい．これらのコア領域の外側のアミノ酸残基は適当なＭＨＣクラスII分子への結合機能にはそれほど重要ではなく，したがってこれらのアミノ酸残基の改変がＴ細胞の更なる活性化を防止することは期待されない．したがって，これらの領域を改変させる必要はないが，非コア領域のアミノ酸残基に置換を行う場合には，それらな置換の累積効果に関して本明細書に説明するガイドラインを満たすように選択されなければならない．
アミノ酸は，容量，疎水性-親水性パターンおよび電荷によって分類される．容量に関しては，本技術分野の通常の技術を有する者には明らかなように，大容量のアミノ酸としてはＴrp，Ｔyr，Ｐhe，Ａrg，Ｌys，Ｉle，Ｌeu，ＭetおよびＨisが，小容量のアミノ酸としてＧly，Ａla，Ｓer，Ａsp，ＴhrおよびＰroがあり，他はその中間に位置する．
疎水性-親水性パターンに関しては，アミノ酸Ｇly，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，Ｐro，ＭetおよびＴrpが疎水性であり，一方，残りのアミノ酸はすべて親水性であることはよく知られている．親水性アミノ酸中，Ｓer，Ｔhr，ＧlnおよびＴyrは電荷をもたず，一方Ａrg，Ｌys，ＨisおよびＡsnは陽電荷をＡspおよびＧluは陰電荷を有する．
その相当する筋無力症病原性ペプチド配列番号：１および配列番号：２に対する重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する可能性について試験するペプチドの選択に際して重要な点は，非置換筋無力症病原性ペプチドの相当する部分の容量，疎水性-親水性パターンおよび電荷は，累積的に，実質的に変化しないことである．すなわち，疎水性残基の親水性残基による置換，またはその逆は，全体的効果が相当する非置換筋無力症病原性ペプチドの容量，疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に変化しない限り可能である．上に指摘したように，これらの置換は，配列番号：１のアミノ酸残基２００-２０８および配列番号：２の２６２-２６６の重要なエピトープコア領域に行われることが好ましい．
本発明の合成類縁体は少なくとも９アミノ酸長，好ましくは９〜１２アミノ酸長を有することが好ましい．それぞれの類縁体は好ましくは，コア領域内に１〜３個の置換を有する．
本発明の好ましい実施態様においては，１個または２個以上の置換が，コア領域における疎水性アミノ酸残基を非置換ペプチドの容量を累積的に実質的に変化させないように選択された他の疎水性アミノ酸残基で置換するように選ばれる．
たとえば，ｐ２００-２０８においては，疎水性アミノ酸は２０１Ｉle，２０５Ｐhe，２０６Ｖalおよび２０７Ｍetである．これらのそれぞれが，好ましい実施態様においては，他の任意の疎水性残基によって置換される．すなわち，たとえば２０７ＭetはＧ1y，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，ＰroまたはＴrpで置換できる．Ａlaによる置換がとくに良好な結果を与えることが確立されている．同様に，ｐ２６２-２６６では，２６２Ｌeu，２６４Ｉleおよび２６５Ｐroがすべて疎水性である．したがって，これらの１〜３個が，容量に対する累積的効果が実質的でない限り，他の疎水性残基で置換できる．すなわち，たとえば２６５Ｐroは，Ｇly，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，ＭetまたはＴrpによって置換できる．２６５ＰroのＰheによる置換はとくに良好な結果を与えることが見出されている．
第二の実施態様においては，親水性非荷電残基が荷電または非荷電親水性残基によって置換される．ｐ２００-２０８ペプチドにおける親水性非荷電残基には２０２Ｔhr，２０３Ｔyrおよび２０８Ｇlnが包含される．ｐ２６２-２６６ペプチドでは，２６６Ｓerが非荷電親水性残基である．すなわち，たとえば，２０８Ｇlnは，Ｓer，Ｔhr，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，Ａsn，ＡspまたはＧluのいずれかに変換することが可能で，また２６６Ｓerは，Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，Ａsn，ＡspまたはＧluのいずれかに変換することが可能である．この場合も，変換は，すべての変換の累積的効果が，非置換筋無力症病原性ペプチド相当する部分の容量，疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させないように選択されなければならない．この実施態様内での変化の特定の例としては，２０８ＧlnのＡsnまたはＡspによる置換，および２６６ＳerのＬysまたはＡspによる置換を挙げることができる．
本発明の他の実施態様においては，荷電親水性残基が荷電（同一または逆の電荷）または非荷電親水性残基によって置換される．ｐ２００-２０８ペプチドにおいては，２００Ａspは陰性荷電親水性残基であり，２０４Ｈisは陽性荷電親水性残基である．ｐ２６２-２６６においては，２６２Ｇluは陰性に荷電した親水性残基である．したがって，たとえば２００Ａspは，Ｓer，Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，ＡsnまたはＧluで置換することが可能で，２６２ＧluはＳer，Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，ＡsnまたはＡspで置換することが可能である．特定の例としては，２００ＡspのＬys（逆の電荷），または２６２ＧluのＳer（荷電対非荷電）による置換を挙げることができる．この場合も，どのような置換が行われても，非置換筋無力症病原性ペプチドの相当する部分の容量，疎水性-親水性パターンおよび電荷が，累積的に実質的に変化させないように選択されなければならない．
最後に，さらに別の実施態様では，疎水性残基を親水性残基で置換すること，またはその逆も，累積効果がガイドライン内にある限り可能である．このような置換の例としては，２０４ＨisのＧlyによる置換または２０３ＴyrのＰheによる置換または２６２ＧluのＡlaによる置換がある．
ペプチド化学の技術分野における通常の熟練者には，厳密な理論的考察により，９アミノ酸程度の短い与えられたペプチドの電荷，疎水性-親水性パターンおよび容量に対する累積効果が何かは容易に認識できるものである．すなわち，適当なＭＨＣクラスII分子との結合でネイティブな筋無力症病原性ペプチドと競合する機能は有するがＴ細胞の更なる活性化は招来しない本発明の類縁体を同定するためには，どのような置換を試行すべきかを決定するのには，面倒な実験は必要ではない．
ネイティブなペプチドへの置換に用いられるアミノ酸には，ノルロイシン，ヒドロキシプロリン，ヒドロキシルセリン，γ-カルボキシグルタミン酸のような修飾されたペプチドも包含されることを理解すべきである．
本明細書に示したガイドラインに個別には従う１〜３個の置換で本発明の類縁体を提供できる一部の特定の置換の組合わせには，２００，Ａsp→Ｌys；２０３，Ｔyr→Ｐhe；２０４，Ｈis→Ｇly；２０４，Ｔyr→Ｐhe；２０７，Ｍet→Ｎleu；２０７，Ｍet→Ａla；２０８，Ｇln→Ａsp；２０８，Ｇlu→Ａsn；２６２，Ｇlu→Ａsp；２６２，Ｇlu→Ｌys；２６２，Ｇlu→Ｓer；２６２，Ｇlu→Ａla；２６５，Ｐro→Ｌeu；２６５，Ｐro→Ｐhe；２６６，Ｓer→Ｌys；および２６６，Ｓer→Ａspが包含される．
主としてＴ細胞受容体相互作用に関与する親水性アミノ酸の置換は，Ｔ細胞の活性化の遮断に効果的であろうことが期待される．疎水性残基の置換は類縁体とＭＨＣの複合体の高い安定性に寄与するものと思われる．
筋無力症病原性ペプチドの他の修飾も本発明によって意図されるものであることを理解すべきである．すなわち，本発明のペプチドにはＴ細胞の増殖性応答および自己免疫疾患の防止または阻害への利用を可能にするそのペプチドの機能の少なくとも一部を維持するそれらの「化学的誘導体」を包含する意図である．
本発明のペプチドの「化学的誘導体」は，通常はそのペプチドの部分ではない付加的な化学的残基を含有する．共有結合によるペプチドの修飾は本発明の範囲内に包含される．このような修飾は，ペプチドの標的アミノ酸残基を，選ばれた側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化物質と反応させることによって，分子内に導入できる．このような化学的誘導体およびそれらの製造方法は本技術分野においてよく知られている．
本発明のペプチドの塩も本発明の範囲に包含される．本明細書において用いられる「塩」の語は，ペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する．カルボキシル基の塩は本技術分野で知られた方法によって形成され，無機塩たとえばナトリウム，カルシウム，アンモニウム，鉄または亜鉛の塩等，および有機塩基との塩たとえばトリエタノールアミン，アルギニンもしくはリジン，ピペリジン，プロカイン等のアミンとで形成される塩が包含される．酸付加塩には，たとえば塩酸または硫酸のような鉱酸との塩，およびたとえば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩が包含される．このような化学的誘導体は好ましくは，安定性，溶解性等に関連してペプチドの医薬的性質を改変させるために用いられる．
本発明の類縁体が製造されたならば，相当する筋無力症病原ペプチドに対するＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力は，本技術分野の通常の熟練者によれば，複雑な実験によらず，たとえば本明細書に記載の試験を用いて容易に決定することができる．容易に実施できる一つの試験は，元のペプチドに対するある種のＴ細胞系およびクローンの増殖性応答をインビトロで阻害する置換ペプチドの能力についての試験である．Ｔ細胞系およびクローンは，配列番号：１または配列番号：２の筋無力症病原エピトープに特異的に産生されたものである．所望の活性を有する類縁体を選択するために実施できる他の試験としては，Ｔ細胞系およびクローンが母体ペプチドの存在下にペプチド特異的Ｂ細胞の活性化を促す能力を阻害する置換ペプチドの能力を試験するものである．置換ペプチドはまた，ビオチン化後，関連株の抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII産物に直接結合して母体の筋無力症病原エピトープの結合を阻害する能力を試験することもできる．
これらのインビトロ試験の１つまたは２つ以上で陽性の試験結果を示す置換ペプチドはインビボ活性の合理的期待を提供するものである．しかしながら，インビボ試験も煩雑な実験を要しないで実施できる．このようなインビボ動物試験の一つは，ナイーブなマウスを筋無力症病原ペプチドで免疫し，このマウスに類縁体を様々な経路および用量スケジュールで共投与する方法がある．ついで，リンパ節細胞を，筋無力症病原ペプチドに対するそれらの増殖性潜在能力について分析することができる．さらに，これらのマウスの血清中の抗-ＡＣhＲ抗体の力価を測定し，類縁体のインビボヘルパー細胞活性に対する効果を記録することができる．これらのインビボアッセイの利点は，疾患の誘導に対する類縁体の効果の検定を目的とするものではないが，比較的短時間ですべての類縁体のインビボスクリーニングを可能にすることである．
治療活性の最終的な証明として，この種の活性をモデルマウスによりインビボで直接測定することができる．筋無力症病原性Ｔ細胞エピトープに特異的な一部のＴ細胞系およびクローンは，マウスにＭＧ類似の自己免疫性表出を誘導できることが以前明らかにされている［Yaffe,D.ら(1977),Nature 270:725-727;およびInestrosa,N.C.ら(1983),Exp.Cell.Res.147:393-405］．したがって，ナイーブなマウスにこのようなクローンを注射し，自己免疫応答を防止または緩解するために，選ばれた置換ペプチドで処置することができる．ペプチドはマウスに，様々な経路，様々な投与量および様々なタイムスケジュールで注射することができる．分布容量，抗原提示細胞への取り込みおよびクリアランスを含めた類縁体の薬動力学的パラメーターを測定するためには，類縁体のビオチン化誘導体を用いることができる．各種体液中における類縁体の溶解分画の濃度はアビジンをコーティングしたプレートおよび特異的抗-ペプチド抗体を用いＥＬＩＳＡにより測定できる．細胞結合類縁体は蛍光色素接合アビジンまたはストレプトアビジンを用いＦＡＣＳにより測定できる．さらに，Ｔ細胞クローンによってマウスに誘発した自己免疫応答および疾患の表出に対するペプチドの効果を決定するために，処置マウスを周期的に検査することができる．
したがって，本明細書の実施例に使用可能であることを示した好ましい実施態様に加えて，本技術分野の通常の熟練者には，本明細書に示したガイドラインに沿って，複雑な実験を行うことなく，同様に使用可能な別の類縁体を決定できることは明白である．
与えられた置換ペプチドの与えられた重症筋無力症患者に対する期待される治療効果を検定するためにも，比較的単純なインビボ試験を行うことができる．適当なＭＨＣクラスII分子に高い親和性で結合するがＴ細胞の更なる活性化は招来せず，したがってＭＧ患者に治療効果を有すると思われるペプチドを製造することの最終目標の評価には，ペプチドをビオチン化したのち，重症筋無力症患者の末梢血リンパ球中の抗原提示細胞上のＨＬＡクラスII産物への直接結合能および母体の筋無力症病原エピトープの結合阻止能を検定することができる．それらの特異性を確証するため，このようなアッセイにおいては，健康対照ドナーおよび対照ペプチドが使用される．
本発明の治療剤の好ましい形態は多重エピトープの単一ペプチドの形態である．すなわち，好ましい実施態様においては，２つの筋無力症病原ペプチドのそれぞれの類縁体を互いに共有結合で，たとえばアラニン残基の短い連鎖またはカテプシンによる蛋白分解候補部位によって連結する．このような部位に関しては，米国特許第5,126,249号および欧州特許第495,049号が参考になる．これは，２つの所望の類縁体中に好ましい形態の部位特異的蛋白分解を誘導する．別法として，本発明の同種または異種の多数の置換ペプチドから，たとえば，適当な重合剤たとえば０．１％グルタールアルデヒド［Audibertら(1981),Nature 289:593］を用いるペプチドの重合によって，ペプチドポリマーを形成させることもできる．このポリマーは５〜２０ペプチド残基を含有することが好ましい．このようなペプチドポリマーはまた，ペプチドを架橋することにより，または多重のペプチドを巨大分子担体に結合させることによっても形成させることができる．さらに，製剤は単純に本発明の異なるペプチドの混合物とすることもできる．
適当な巨大分子担体は，たとえば，破傷風トキソイドのような蛋白質であり，アミノ酸の直鎖状または分岐状コポリマーは，Ｌ-アラニン，Ｌ-グルタミン酸およびＬ-リジンの直鎖状コポリマーならびにＬ-チロシン，Ｌ-グルタミン酸，Ｌ-アラニンおよびＬ-リジンの分岐状コポリマー，(Ｔ，Ｇ)-Ａ-Ｌ，または多重鎖ポリ-ＤＬ-アラニン［M.Selaら(1955),J.Am.Chem.Soc.77:6175］である．担体との接合体は，たとえば最初にペプチドを水溶性カルボジイミドたとえば1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩とカップリングさせ，ついでMuller,G.M.ら(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:569の記載に従い，巨大分子との接合を行うことによって得られる．各接合体中のカップリングしたペプチドの含量はアミノ酸分析により，担体単独の組成と比較して決定することができる．
本発明の好ましい実施態様によれば，１または２種以上の活性ペプチドを適当な巨大分子担体に結合させるか，またはグルタールアルデヒドの存在下に重合させることができる．
ペプチド，それらのポリマーまたはそれらの適当な巨大分子担体との接合体は，それらの生物学的利用性が保証され，処置に適当に作成された形態で患者に投与される．２個以上のペプチド類縁体に有意な阻害活性が見出された場合には，これらの類縁体はペプチドの混合物を含有する製剤として患者に投与することもできる．個々の患者が両方の病原性ＭＧ関連ペプチド，すなわちｐ１９５-２１２およびｐ２５９-２７１に応答する場合は，最終的な処置には，適当な形態で両ペプチドの適当な阻害類縁体を含有させることになる．
本発明はさらに，本発明の合成ペプチド，適当な巨大分子担体とそれらの接合体またはそれらのポリマー少なくとも１種と，所望により医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を包含する．
投与経路には，経口，静脈内，皮下，動脈内，筋肉内，吸入，腹腔内，経鼻，莢膜内，経皮，または経腸経路を含めた他の既知経路が包含される．
本発明の組成物の投与に際しての用量範囲は，所望の効果が生じる，たとえばインビトロにおけるＴ細胞の増殖性によって測定される筋無力症病原ペプチドに対する免疫応答が実質的に防止または阻害され，さらに疾患が有意に処置されるのに十分な用量である．この用量は，有害な副作用，たとえば望ましくない交叉反応，全身的な免疫抑制，アナフィラキシー反応等を起こすほど大量であってはならない．
免疫関連疾患の処置に使用するのに際しての本発明のペプチドの有効用量は，約１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である．投与量は患者の年齢，性別，健康状態および体重，現在の処置の種類，それがある場合にはその頻度，ならびに所望の効果の程度に依存する．
ヒトＡＣhＲの配列の合成類縁体はＭＧ患者の特異的抗原応答を，他の免疫応答を障害することなく阻害または抑制することを目的とする．このアプローチは，ＭＧに現在承認されている処置が，非特異的でしかも多くの有害な副作用のある免疫抑制剤の投与であることからきわめて重要である．
次に，本発明を以下の非限定的実施例によって例示する．
実施例
例１．ペプチドの製造
合成ペプチドｐ１９５-２１２およびｐ２５９-２７１ならびにそれらの類縁体ｐ４５５(２０７,Ｍet→Ａla)，(２００,Ａsp→Ｌys)，(２０３,Ｔyr→Ｐhe)，(２０４,Ｈis→Ｇly)，(２０８,Ｇln→Ａsp)，ｐ３０５(２６６,Ｓer→Ａsp)，ｐ３０６(２６２,Ｇlu→Ｌys)，ｐ３０７(２６２,Ｇlu→Ａsp)，(２６２,Ｇlu→Ｓer)，および(２６２,Ｇlu→Ａla)が、ペプチドシンセサイザーで，市販されている側鎖保護アミノ酸を用い，メリーフィールド固相法［Merrifieldら(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149］によって合成される．アミノ酸は各工程において少なくとも９９％の効率で付加される．無水ＨＦによって保護基が除去され，ペプチドが樹脂から分離される．
ペプチドは酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルで抽出し，ＨＰＬＣによって精製する．ペプチドの純度はＨＰＬＣおよびアミノ酸分析によって確認される．
上述のペプチドはそれぞれ１個の置換をもつのみであるが，２もしくは３個の置換を有し，本明細書に示したガイドラインの目標を維持する他のペプチドも同様にして合成できる．
例２．ペプチドｐ２５９-２７１に対するＴ細胞クローンのインビトロ増殖応答の阻害
ｐ２５９-２７１に特異的なＴ細胞系およびクローンは，Brockeら（1990a,前出）によって記載された方法に従って高レスポンダーＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞から開発し，ＴＣＢＡＬＢ／ｃ２５９-２７１と命名された［Mozes,E.ら(1991),"Abstraot,15th International Congress of Biochemistry,Jerusalem,20頁］．
Ｔ細胞クローンの増殖性応答は最終的に１６時間の培養のためのインキュベーション後における細胞への³Ｈ-チミジンの取り込みを測定して評価した．Ｔ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１の細胞（１０⁴細胞/ウエル）を，抗原提示細胞としてのＢＡＬＢ/ｃマウスからの照射した（３,０００ラド）同遺伝子系脾臓細胞（０.５×１０⁵細胞/ウエル）の存在下，各種濃度（１，５，１０，２０μｇ/ウエル）のペプチドｐ１９５-２１２，ｐ２５９-２７１，ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７を添加してインキュベートした．培養は２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸ナトリウム，非必須アミノ酸，１００Ｕ/ｍｌのペニシリン，１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシン，０.２５μｇ/ｍｌのフンギゾン，５×１０^-5Ｍの２-メルカプトエタノール，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（補強培地）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地０.２ｍｌ中にセットした．アイソトープを導入して１６時間後に，細胞をろ紙上に収穫し，放射能を測定した．結果を図１に示す（３回の測定値の平均ＣＰＭ±ＳＤで表す）．ペプチドｐ３０５およびｐ３０７は，試験したすべての用量でＴ細胞系の増殖性応答の低下を誘発した（ｐ２５９-２７１で得られた応答のそれぞれ１２％および３４．３％まで）が，ｐ３０６はＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１細胞系の増殖を刺激しなかった．ペプチドｐ１９５-２１２が，ペプチドｐ２５９-２７１に特異的なＴ細胞の増殖の競合的阻害を示すことは，ｐ１９５-２１２がｐ２５９-２７１と同じＭＨＣ-決定基に向けられていることから，驚くべきことではない．Brockeら(1990a,前出)はｐ１９５-２１２がＴＣＳＷ２５９-２７１Ｔ細胞系の増殖性応答を阻害し，ｐ２５９-２７１がＴＣＳＷ１９５-２１２系の特異的増殖性応答を阻害することを報告している．
増殖性応答の阻害は，インビトロ増殖培養液中への試験する置換ペプチドの添加用量を増大させていって（２５，５０，７５，１００μｇ/ウエル）実施した．Ｔ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１の細胞（１０⁴細胞/ウエル）を，照射した同遺伝子系脾臓細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル）の存在下，ｐ２５９-２７１（１μｇ/ウエル），および様々な用量の阻害ペプチドｐ３０５，ｐ３０６，ｐ３０７およびｐ１９５-２１２を添加して４８時間インキュベートした．ついで，³Ｈ-チミジン（５Ｃi/ミリモルを０.５μＣi）を加え，１６時間後にプレートをろ紙上に収穫した．結果はｐ２５９-２７１特異的増殖応答の阻害％として表す．図２に示すように，ｐ３０６はｐ２５９-２７１に対するＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１系の増殖性応答を９３％まで阻害した．
例３．インビトロ抗体産生アッセイ
合成ペプチドｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７を，抗体産生アッセイにおいて，ペプチド特異的Ｂ細胞と協力してＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１Ｔ細胞系を刺激する能力について試験した．前もって２０μｇのｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスの脾臓から精製したＢ細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル）を正常同遺伝子系脾臓細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル），様々な用量のｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７（０.００１，０.０１，０.１，１および５μｇ/ウエル）ならびにＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１系の細胞（１０⁴細胞/ウエル）とともに，９６-ウエルマイクロタイタープレート中で培養した．３日間インキュベートしたのち，培地（７.５％ＦＣＳを補充した補強ＲＰＭＩ）を抗原を含まない新鮮な培地に交換し，４日後に上清を収穫して，特異的抗-ｐ２５９-２７１抗体の存在について試験した（固相ＲＩＡによる）．結果は３回の測定値の平均ＣＰＭ±ＳＤとして表す．
図３から明らかなように，ｐ３０５の存在下には低い抗体力価が得られたが，ｐ３０７によって刺激されたヘルパー活性は，母体のペプチドの存在下に得られた活性と同じ有効性を示した．これに対し，ｐ３０６を培養液に添加した場合には，抗体の活性は検出できなかった．
Ｔ細胞ヘルパー活性の阻害は，インビトロ培養混合物中への試験する置換ペプチドの添加用量を増大させていって実施した．前もって，２０μｇのｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスの脾臓から精製したＢ細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル）を，正常同遺伝子系脾臓細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル），様々な用量のｐ２５９-２７１単独（０.００１，０.０１，０.１，１および５μｇ/ウエル）またはｐ３０５，ｐ３０６またはｐ３０７（各２０μｇ）とともに，ならびにＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１系の細胞（１０⁴細胞/ウエル）を加えて，９６-ウエルマイクロタイタープレート中で培養した．３日間インキュベートしたのち，上記と同様に培地を新鮮な培地に交換し，４日後に上清を収穫して，特異的抗-ｐ２５９-２７１抗体の存在について試験した（固相ＲＩＡによる）．結果は３回の測定値の平均ＣＰＭ±ＳＤとして表す．図４に示すように，ｐ２５９-２７１特異的抗体の産生はｐ３０６の存在下に８０％まで阻害された．
例４．ｐ２５９-２７１による免疫後のマウスリンパ節細胞の抗原特異的増殖性応答
ペプチドｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７が，より異種性のＴ細胞集団すなわちリンパ節の増殖性応答を刺激または阻害するかどうかを明らかにするために，以下の実験を行った．
ペプチドｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７を，ｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスリンパ節細胞の増殖を刺激する能力について，母体のペプチドｐ２５９-２７１と比較して調べた．ｐ２５９-２７１Ｔで免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスから得られたリンパ節細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル）を１％正常マウス血清を含有する補強培地中，様々な濃度のペプチド（１０，２０，５０，および１００μｇ/ウエル）の存在下に９６時間インキュベートした．ついで³Ｈ-チミジン（５Ｃi/ミリモルを０.５μＣi）を加え，１６時間後にプレートをろ紙上に収穫した．結果は，３回の測定値の平均ＣＰＭとして表す．図５に示すように，ｐ３０５およびｐ３０７はその細胞の低い増殖性応答を誘発した（ｐ２５９-２７１の使用によって得られた値のそれぞれ５３.２％および３２.３％まで）が，ｐ３０６はリンパ節細胞の増殖を刺激しなかった．
ｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖性応答をの阻害は，インキュベーション混合物中に病原性ペプチドｐ２５９-２７１と同じ時間にペプチド類縁体ｐ３０６を添加して行った．ｐ２５９-２７１で免疫したＢＡＬＢ/ｃマウスから得られたリンパ節細胞（０.５×１０⁶細胞/ウエル）を，様々な濃度のｐ２５９-２７１（１，５，１０，および２０μｇ/ウエル）および１００μｇ/ウエルのｐ３０６の存在下に９６時間インキュベートした．ついで，³Ｈ-チミジン（５Ci/ミリモルを０.５μCi）を加え，１６時間後にプレートをろ紙上に収穫した．結果は，３回の測定値の平均ＣＰＭとして表す．図６に示すようにＰ３０６はｐ２５９-２７１に対するリンパ節細胞の増殖性応答を６４.７％まで阻害した．
例５．ペプチドｐ１９５-２１２に対するＴ細胞クローンのインビトロ増殖性応答の阻害
ｐ１９５-２１２に特異的なＴ細胞系およびクローンは，Brockeら（1990a,前出）によって記載された方法によって高（ＳＪＬ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から確立され，ＴＣＳＪＬ１９５-２１２系と命名された［Mozes,E.ら(1991),前出］．
Ｔ細胞クローンの増殖性応答は例２のプロトコールと同様にして評価し，図２に示す結果を得た．
ｐ１９５-２１２ペプチド類縁体ｐ４５５はＴＣＳＪＬ１９５-２１２系細胞の増殖を刺激しなかった．しかも，図７に示すようにｐ４５５はｐ１５９-２１２に対するＴＣＳＪＬ１９５-２１２系の増殖性応答を９９％以上阻害した．これは極めて実質的な阻害を示すものである．
例６．重症筋無力症の病原ペプチドに対するヒトＴ細胞の増殖の阻害
病原性ペプチドｐ２５９-２７１およびその類縁体ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７，ならびにｐ１９５-２１２およびその類縁体ｐ４５５の，ヒトＴ細胞の増殖性応答に対する作用を評価した．
重症筋無力症患者および適当な対照ドナーの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（２×１０⁵細胞/ウエル）を，１０％自己血清を含有する補強培地０.２ｍｌ中，様々な用量のペプチドｐ１９５-２１２および類縁体ｐ４５５の存在下に，マイクロタイタープレートで９６時間インキュベートし，ついで³Ｈ-チミジン０.５μCiにより一夜パルスして評価した．細胞を収穫し，放射能を測定した．増殖応答の阻害は，インキュベーション混合物中に病原性ペプチドｐ１９５-２１２と同じ時間に様々な用量のｐ４５５を添加して行った．結果は（ＳＩ）刺激係数（２および３欄），％阻害率（４欄）として表１に示す．
ＭＧ患者のＰＢＬを，ｐ１９５-２１２およびペプチド類縁体ｐ４５５の存在下におけるそれらの増殖能について試験した．さらにＰＢＬのｐ１９５-２１２特異的増殖応答に対する類縁体ｐ４５５の阻害能を試験した．これらの試験における３例のＭＧ患者の応答を表１にまとめる．この表から明らかなように，患者Ｅ.Ｋ.，Ｃ.Ｇ.およびＭ.Ｒ.からのＰＢＬはｐ１９５-２１２に応答して増殖した（それぞれＳＩ＝６.３，４.３および３.６）が，この類縁体に対する増殖性応答は，試験したすべての濃度（１０，２５，５０，１００μＭ，２０，５０，１００，２００μｇ/ウエルに相当）で検出されなかった．さらにこの類縁体は，インヒビター：スティミュレーター比（Ｉ：Ｓ）１：１で３例すべての患者からのＰＢＬの増殖性応答を７７〜１００％まで阻害した．

ＭＧ患者のＰＢＬをｐ２５９-２７１ならびにその類縁体ｐ３０５，ｐ３０６およびｐ３０７の存在下におけるそれらの増殖能について上述のように試験した．さらにＰＢＬのｐ２５９-２７１特異的増殖応答に対する様々な用量の類縁体の阻害能を試験した．これらの試験における３例のＭＧ患者の応答を表２にまとめる．この表から明らかなように，患者Ｉ.Ｔ.，Ｅ.Ｋ.およびＣ.Ｇ.からのＰＢＬはｐ２５９-２７１に応答して増殖した（それぞれ，ＳＩ＝４.１，３.７および２.７）．しかも，各患者について少なくとも１種の類縁体がＰＢＬのｐ２５９-２７１誘導増殖性応答を阻害することができた．

例７．マウスにおける実験的ＭＧの誘発および処置
ナイーブな同遺伝子型マウスに，ＴＣＳＪＬｐ１９５-２１２およびＴＣＢＡＬＢ/ｃ２５９-２７１またはそれらに由来するクローン系の活性化ペプチド特異的Ｔ細胞（５〜１０×１０⁶細胞）を接種する（ＰＢＳ中静脈内，１４回）．自己免疫応答は，血清学的（たとえば抗マウスＡＣhＲ抗体），組織学的および電気生理学的パラメーターによって測定する．
接種されたマウスには，それらの血清の，Ｃ₂系細胞，分化によってＡＣhＲを発現するマウス筋肉細胞系を染色する能力［Yaffe,D. & Saxel,0.(1977),前出；およびInestrosa,N.C.ら(1983),前出］によって明らかなように，自己免疫応答が誘発された．さらに，接種されたＢＡＬＢ/ｃマウスの筋電図には，対照群には観察されなかった複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の典型的な無力性低下が認められた．
誘発される実験的ＭＧの防止または治癒のために，ペプチド類縁体をａ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種前；ｂ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種と同時；ｃ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種後，ただし自己免疫応答の出現前；ｄ）実験的ＭＧの出現後に投与する．自己免疫応答の重篤度の低下はペプチドによる処置の適合性を指示する．
本明細書に引用したすべての参考文献は，雑誌論文もしくは要約，公開されたもしくは対応する米国もしくは外国の特許出願，発行された米国もしくは外国特許，または他のすべての引例を含め，引用した引例に掲載されたすべてのデータ，表，図および本文を含むすべてを参考として本明細書に導入する．さらに，本明細書に引用された参考文献中に引用された参考文献の全内容をすべて参考として本明細書に導入する．
既知方法工程，慣用方法工程，既知方法または慣用方法に関する言及はいかなる意味においても，本発明の様態，説明または実施態様が関連技術中に開示，教示または示唆されていることを自認するものではない．
特定の実施態様についての以上の説明により本発明の一般的性質は完全に明らかにされているので，本技術分野の熟練者の知識（本明細書に引用した参考文献の内容も含めて）を適用することにより，複雑な実験を要しないで，また本発明の一般的概念から逸脱することなく，このような特定の実施態様の改変および／または各種応用の適用は容易である．したがって，このような適用および改変は本明細書に提供された教示およびガイドラインに基づき，開示された実施態様の均等物の意味および範囲に包含されるものである．本明細書における表現および術語は説明の目的で用いられるものであって，限定を目的とするものではないことを理解すべきであり，本明細書の術語および表現は，本明細書に提示された教示およびガイドラインを参照し，熟練した技術者が，本技術分野における通常の熟練者の知識と合せて解釈すべきである．
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１８
配列の型：アミノ酸
鎖の長さ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列

配列番号：２
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の長さ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列

Claims

配列番号１：

の式で示されるペプチドｐ１９５-２１２及び配列番号２：

の式で示されるペプチドｐ２５９-２７１からなる群より選ばれるヒトアセチルコリン受容体α-サブユニットの部分配列に相当する、筋無力症病原ペプチドに対する重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害することができる応答阻害ペプチドであり、
該応答阻害ペプチドは、配列番号１及び２の該アミノ酸残基とは配列番号１及び２の該アミノ酸残基中の１個のアミノ酸置換によって異なり、該アミノ酸置換は、
配列番号１のアミノ酸残基１９５-２１２の２０７Metがアミノ酸Alaによって置換される；
配列番号２のアミノ酸残基２５９-２７１の２６６Serがアミノ酸Aspによって置換される；
配列番号２のアミノ酸残基２５９-２７１の２６２Gluがアミノ酸Lysによって置換される；
又は、
配列番号２のアミノ酸残基２５９-２７１の２６２Gluがアミノ酸Aspによって置換される、
アミノ酸置換より選択される上記応答阻害ペプチド。
請求項１に記載の応答阻害ペプチドの有効量と医薬的に許容される賦形剤からなる、重症筋無力症の処置用医薬組成物。