JP3967319B2 - ポリヌクレオチド配列のインビトロ組換えのためのウォークスルー技術 - Google Patents
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Description
・経時的変異誘発PCR(Moore, J.C.およびArnold, F.H. 1996. Chem.Eng.Sci. 51:5091-5102)、
・コンビナトリアルカセット変異誘発(Reidhaar-Olson, J.F.およびSauer, R.T. 1988. Science 241:53-57)、
「DNAシャッフリング(shuffiling)」(Stemmer, W.P.C. 1994a. Nature, 370:389-391; Stemmer, W.P.C. 1994b.Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91:10747-10751)
・ランダムプライミング組換え(Shao, Zhixin, H.Zhao, Lori GiverおよびFrances H.Arnold. 1998. Nucleic Acids Res. 26(2):681-683)、
・ねじれ型-伸長(StEP). H.Zhaoら、1998, Nature Biotechnol. 16(3):258-2661)、
・人工組換え(Shao, Zhixin. 1998. Protein Science 8 (Suppl.2):55; Volkov, Alexander,Zhixin ShaoおよびFrances H.Arnold. 1999 Nucleic Acids Res. 27(18)e18:i-vi)
がこれらの問題に首尾よく適用されている。
1)種々の二本鎖テンプレートポリヌクレオチドからのランダムな二本鎖フラグメントの作製、該種々のテンプレートポリヌクレオチドは、好ましくは同一のエリアおよび非相同エリアを含む
2)ランダムフラグメントの再構築
3)クローニング
4)発現および
5)スクリーニング。
a)少なくとも1つのプライマー、核酸合成活性を有する酵素、および核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物ならびにテンプレートポリヌクレオチドを含有する反応混合物の存在下で行われる核酸合成により核酸フラグメントラダーを作製する工程、
b)鎖終結分子を除去するか、または鎖終結分子を非終結分子に変化させる工程、
c)核酸合成活性を有する熱安定性酵素の存在下で、これらのフラグメントを互いにまたはテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、
i)核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物の存在下で、または
ii)鎖終結分子を含まない核酸鎖伸長分子の反応混合物の存在下で
のいずれかで核酸合成を行うことによるポリヌクレオチドの再構築
を含み、ただしi)の場合、工程b)およびc)を続いて繰り返す、ポリヌクレオチド配列の形成方法である。
(a)鎖ターミネーター(terminator)の存在下でのフラグメント合成、
(b)組み込まれた鎖ターミネーターを除去すること、および
(c)工程(b)由来のフラグメントを再構築すること
の3つの主要な異なるレベルで最適化されうる。
この工程は、通常のポリヌクレオチド配列決定反応になぜか類似し、それゆえ、種々の標的を配列決定するのに適切な種々の条件がこの工程に適用されうる。
この工程は首尾よいウォークスルー組換えのための第2の鍵工程である。各々の新たに作製されたフラグメントの末端ヌクレオチド、または取り込まれたターミネーターは、各々のかかるフラグメントがさらなるフラグメント再構築に必要な遊離3’-OH基を得るように除去されなければならない。
フラグメントの再構築はPCR様反応であり、DNA変性、アニーリングおよびDNA合成のサイクルを含む。アニーリングの間、ssDNA-フラグメントはホモログ領域でハイブリダイズする。ssDNAのオーバーラップする末端は、ポリメラーゼにより伸長される。この場合、種々のポリヌクレオチド由来のssDNAランダムフラグメントは、ハイブリダイズし、遺伝子シャッフリングが起こる。遺伝子シャッフリングは、ホモログ(homologues)であるが同一でない配列間の組換えを意味する。用語「同一」は、2つの核酸配列が同一の配列または相同性配列を有することを意味する。従って、「同一の領域」は、核酸フラグメントまたはポリヌクレオチドの領域またはエリアが別のポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントに同一または相補的であることを意味する。用語「ホモログ」は、1つの一本鎖(ss)核酸配列が相補的ss核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量ならびに後述されるような温度および塩濃度等のハイブリダイゼーション条件を含む多数の因子に依存しうる。
1. 適切な制限エンドヌクレアーゼを有する目的のDNAおよび目的の精製DNAフラグメントを、Roche High Pure PCR Prep Kit(Roche Diagnostics GmbH, Germany))を用いてゲル電気泳動により精製した。1つの例として、Bucillus subtilis BMTU3420 サルコシンオキシダーゼ遺伝子を組換えプラスミドpBMTU5823から1.2kb長PstI-Nsilフラグメントとして切断した。
1. PCRによるSarcOD遺伝子の再構築のために、5μlの精製したウォークスルーDNAフラグメント、20μlの2×PCRプレミックス(5倍希釈のクローン化Pfuバッファー、0.5mMの各dNTP、0.1U/μlのクローン化Pfuポリメラーゼ(Stratagene La Jolla CA))および15μlのH2Oを氷上で混合した。
この最初のPCRの正しく再構築した産物を、テンプレートDNAの末端に相補的なPCRプライマーを含む第2のPCR反応においてさらに増幅した。
。
1. Bs SarcOD遺伝子のPCR産物をPstIおよびNsiI制限酵素を用いて消化し、pBMTU5823(Pst/Nsi)にクローン化した。
野生型SarcOD遺伝子のこの技術の1ラウンドのみの適用後、2つのHind IIIおよびPvu II耐性変異体が酵素的に活性であることが見出された。
ヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼ遺伝子の組換え
1. 方法の説明
ウォークスルー組換えは、2つ以上のDNA配列をそれらの相同性に基づいて組換えるために使用される方法である。さらなる点変異もまた、組換え工程の間に導入されうる。この方法は、主に5つの工程:
フラグメント合成
テンプレート除去
ターミネーター除去
再構築
増幅
からなる。
フラグメント合成はDNA合成反応から生じ、伸長はジデオキシヌクレオチドの取り込みにより終結される。組換えのために選択される標的DNA配列は、この反応におけるテンプレートとして役に立つ。プライマーの数は、標的DNA配列の長さおよび得られるフラグメントの長さに依存して選択されるべきである。フラグメントの長さはまた、反応条件により調節されうる。さらに、「サイクル配列決定反応」は、そのより高い産物収率および簡単な使用のために好ましい。
再構築工程の妨害を避けるために、フラグメント合成後、テンプレートDNAを完全に除去する必要がある。この目的のために、いくつかの方法が使用されうる。本発明者らは、U-DNAおよびウラシル-DNAグルコシラーゼの使用を選択した。ウラシル-DNAグリコシラーゼを使用して、デオキシウリジレートが取り込まれている部位(U-DNA)でウラシル塩基を除去することができる。得られる非塩基性(abasic部位は、続いてアルカリ処理、高温または特異的エンドヌクレアーゼにより加水分解されうる。本発明者らのアプローチでは、単純な温度処置で十分である。U-DNAは、dTTPの変わりにdUTPを使用するPCR反応により調製されうる。U-DNAはフラグメント合成に対するテンプレートとして役に立った後、全ての反応がウラシル-DNAグリコシラーゼ処理および温度処理に供される。別の対照PCRを使用して完全なU-DNA除去を確認しうる。
再構築反応のために、フラグメントは3’-OH末端を有する必要がある。本発明者らのフラグメントはジオキシヌクレオチドで終結されるので、このフラグメントは3’-OH末端を保有しない。これらのターミネーターは、数個のヌクレアーゼまたはDNAポリメラーゼの3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性により除去され、3’-OH末端を生じうる。本発明者らは、この工程のために熱安定性エキソヌクレアーゼIIIおよびTaqポリメラーゼを使用することによりターミネーター除去と再構築とを合わせる。エキソヌクレアーゼIIIは、その3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性(dsDNAでのみの酵素活性、およびしたがってDNAアニーリング後のみの酵素活性)によりターミネーターを切断し、Taqポリメラーゼは、その5’-3’-ポリメラーゼ活性によりフラグメントを伸長する。
再構築は、プライマー無しのPCR様反応であり、フラグメントはそれぞれ互いにその相同性に基づいてアニールし、伸長する。変性の全サイクルを通して、アニーリングおよび伸長フラグメントが、オリジナルDNA配列の長さまで増殖または再構築する。
再構築したDNAの増殖は、配列クローニングおよび解析工程に十分な材料を提供するために、配列隣接プライマーを用いるPCRにおいて生じる。
2.1 U-DNAの調製
dUTP含有DNAテンプレートを、マニュアル(「ウラシル-DNAグルコシラーゼ」Roche # 1 444 646)に従って2.5mM MgCl2、600μM dUTP、および3つの他のヌクレオチドdATP、dCTPおよびdGTPをそれぞれ200μMで用いるPCRにより作製する。アルカリホスファターゼを組換えるために使用される典型的な反応混合物およびサイクル条件を以下に示す。
テンプレートDNA(プラスミド) 40ng
プライマーAPhpaF 20pmol
プライマーAPxbaR 20pmol
10×Taqプッファー(Puffer) 10μl
Taq DNAポリメラーゼ 0.5U
Mg2Cl2 2.5mM
dATP,dCTP,dGTP(Roche # 1 969 064) 各0.2mM
dUTP(Roche # 1 420 470) 0.6mM
H2O 100μlまで
いくつかの改変を有するサイクル配列決定反応(標準およびサイクル配列決定のための「DIG Taq DNA配列決定キット」Roche # 1449443)を用いてフラグメントを合成する。12個の反応混合物を、全6個のプライマーおよび2個のU-DNAテンプレートに対してセットする。2つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用されるサイクル条件での典型的な反応混合物を以下に示す。
U-DNA 175ng
プライマー(1μM) 1pmol
プッファー 3μl
Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl) 0.6μl
終結混合物ddATP/dGTP 2.5μl
終結混合物ddCTP/dGTP 2.5μl
終結混合物ddGTP/dGTP 2.5μl
終結混合物ddTTP/dGTP 2.5μl
H2O 30μlまで
この工程は、各フラグメント合成混合物への1μlのウラシル-DNAグリコシラーゼ(1U/μl;Roche, # 1775375)の添加、およびU-塩基の切断のための37℃で4時間のインキュベーション、続く非塩基性部位の加水分解および酵素の活性化のための95℃で2分間のインキュベーションにより達成される。別のPCRが、テンプレートU-DNAの完全な除去を制御するために使用されうる。
重大な再構築工程において適量の精製DNAを使用することが重要である。DNAフラグメントは、Microcon(Microcon50;Millipore # 42415)を用いることにより切断生成物から精製され、H2O中に残っている。2つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用される典型的な混合物およびサイクル条件を以下に示す。
精製フラグメント xμl(適量)
dNTP(Roche # 1 969 064) 各0.4mM
Expand High Fidelity10×バッファー(Roche # 1 759 175) 5μl
Taq/Exo IIIミックス 1U
H2O 50μlまで
増幅PCRは、2つの配列隣接プライマー(AphpaFおよびApxbaR)を用いる標準的PCRである。以下は、2つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用されるサイクル条件での典型的な混合物である。
プライマーAPhpaF 10pmol
プライマーAPxbaR 10pmol
10×Taqプッファー(+Mg; Roche # 1 271 318) 5μl
Taq DNAポリメラーゼ(Roche # 1 418 432) 2.5U
dATP,dCTP,dGTP,dTTP(Roche # 1 969 064) 各0.2mM
H2O 50μlまで
増幅産物を、調製用ゲル電気泳動(1%アガロース/TAE)およびゲル抽出(「QIAquickゲル抽出キット」Quiagen # 28076)により精製し、供給者のマニュアルに従ってベクターpCR(登録商標)-XL-TOPO(登録商標)(Invitrogen # K475020)にクローン化し、ベクターと共に送達した大腸菌TOP 10細胞に発現させる。
9個の組換えクローンを、1つの配列決定用プライマーを用いる配列決定により解析した。結果を表1に要約する。これらのクローンの8個は、配列決定領域内(445〜645bp)に1つ以上の組換え事象を示す。1つのバリアントは、上記領域内に4つのクロスオーバーを含む。全体の変異率は、約0.25%である。再構築産物は、ベクターに2つの異なる配向でライゲートされ得、1つのプライマーのみを用いるこれらのクローンの配列決定は、N-末端の配列およびC-末端の領域のコーディングの両方を与えた。
図3は、親ciapおよびhpap遺伝子のN-末端配列アラインメントおよびそれらの組換えバリアント(AP01、AP03、AP05、AP06、AP11およびAP15)を示す。
Claims (7)
- a)少なくとも1つのプライマー、核酸合成活性を有する酵素、および核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物、ならびにテンプレートポリヌクレオチドを含有する反応混合物の存在下で行われる核酸合成により核酸フラグメントラダーを作製する工程、
b)該鎖終結分子を除去する工程、
c)熱安定性酵素の存在下、核酸鎖終結分子を含まない核酸鎖伸長分子を含む反応混合物中で、工程b)で得られたフラグメントを互いに、またはテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、アニーリングし、これらを伸長することによるポリヌクレオチド配列の再構築工程、ならびに
d)工程a)〜c)を繰り返すか、または工程c)のみを繰り返す工程
を含むポリヌクレオチド配列の形成方法。 - 工程a)および/またはc)のテンプレートポリヌクレオチドが、種々のテンプレートポリヌクレオチドからなる混合物である請求項1記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
- 核酸鎖終結分子がddNTP であり、核酸伸長分子がdNTPである請求項1または2記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
- 請求項1〜3いずれか記載の工程を含み、さらに
e)ベクターへの工程d)で得られたポリヌクレオチド配列のクローニング工程、
f)コードされる変異体ポリペプチドの発現工程、および
g)変異体ポリペプチドをコードするベクターのスクリーニング工程または選択工程
を含む、変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。 - 再構築産物の増幅工程をさらに含む、請求項4記載の工程を含む変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。
- 生体分子の最適化のための請求項1〜5いずれか記載の方法の使用。
- 酵素の最適化のための請求項1〜5いずれか記載の方法の使用。
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