JP3964060B2 - アポトーシス抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、アポトーシス抑制剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、中枢神経型プロスタサイクリン受容体に特異的なリガンドとして知られているイソカルバサイクリン誘導体を有効成分とし、神経細胞等のアポトーシスに対して優れた抑制作用を有する新規なアポトーシス抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス (apoptosis)は遺伝的にプログラムされた細胞死の一種であり、形態学的には以下のプロセス、すなわち核の凝縮；細胞縮小；空胞化・細胞表面の平滑化；細胞間間隔の拡大；周囲からの細胞の遊離；細胞の断片化（アポトーシス小体）；マクロファージ等による貪食のプロセスを経て起こる。また生化学的には、エンドヌクレアーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単位が 180〜200 塩基長のＤＮＡに断片化することも知られている（Immunology Today 7:115-119, 1986；Science 245:301-305, 1989 ）。
【０００３】
現在では、このアポトーシスは発生・分化、正常組織や細胞のターン・オーバーなどの生理的な機構に加え、脳梗塞後等の虚血性神経細胞死、癌腫の退縮、放射線や抗癌剤の作用、ＡＩＤＳ等のウイルス感染によるリンパ球の減少、炎症などの疾患にも関与することが明らかにされ、これを調整する薬剤（すなわち、アポトーシス抑制剤、アポトーシス誘導剤）の開発は、脳神経系や癌、老化など幅広い分野において新しい作用機序に基づく薬剤を生み出すものと期待されている。
【０００４】
アポトーシスを誘導する物質、要因としては、グルココルチコイド、グルタミン酸等の神経伝達物質の毒性、放射線照射、ＮＫ細胞、キラー細胞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはリンフォトキシン（ＬＴ）等のサイトカイン類等が報告されている。また、蛋白合成阻害剤であるシクロヘキシミド（Cycloheximide)またはＲＮＡ合成阻害剤であるアクチノマイシンＤ（Actinomycin D ）が、ヒト白血病細胞HL-60 に対してアポトーシスを誘導することも報告されている。さらに、最近では、免疫細胞のアポトーシスに関与する細胞膜分子であるＦａｓ抗原に対する抗Ｆａｓモノクローナル抗体が調製され、抗Ｆａｓ抗体の医薬への応用については種々の研究がなされている。
【０００５】
一方、アポトーシスを抑制する因子としては、インターロイキン１変換酵素の阻害物質、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等が報告されている。また、bcl-2 関連遺伝子産物も、アポトーシスを抑制し、細胞の延命機能を有することが知られている。ただし、これらのアポトーシス抑制因子は全て生体由来のペプチドあるいはタンパク質であって、化学合成等の工業的手段によって得られるアポトーシス抑制物質は従来知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者等は、脳機能の生理的作用を詳細に検討する過程で、中枢神経型プロスタサイクリン受容体の特異的リガンドとして働く各種のイソカルバサイクリン誘導体を発明し、既に特許出願している [特願平7-51589 号（特開平8-245498号公報）、特願平8-243122号（特開平10-87608号公報）、特願平8-260957号（特開平10-101610 号公報、特願平9-160320号] 。そして、これらの物質の生理活性をさらに検討した結果、そのうちの幾つかが顕著なアポトーシス抑制効果を示すことを見出した。
【０００７】
従って、この出願の発明は、発明者等による以上のとおりの知見をさらに発展させ、化学合成によって大量かつ安価に製造することのできる新規なアポトーシス抑制剤を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する第１の発明として、次式（１）
【０００９】
【化５】
【００１０】
（式中Ｒ1 は炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｒ2 は水素原子または保護基を示す）
で表される１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤を提供する。
この第１発明のアポトーシス抑制剤においては、上記１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体が、次式（２）
【００１１】
【化６】
【００１２】
で表される１５Ｒ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンまたはそのメチルエステルであることを好ましい態様としている。
さらにこの出願は、第２の発明として、次式（３）
【００１３】
【化７】
【００１４】
（式中Ｒ1 は炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｒ2 は水素原子または保護基を示す）
で表される１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤を提供する。
この第２発明においては、上記１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体が、次式（４）
【００１５】
【化８】
【００１６】
で表される１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンまたはそのメチルエステルであることを好ましい態様としている。
なお、上記式（１）および（３）において、Ｒ2 を構成する保護基とは、製剤上許容される塩、エステル等を意味し、例えば、メチルエステル、エチルエステル等を構成するアルキル基が示される。
【００１７】
以下、これらの発明について、その実施形態をさらに詳しく説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この出願の第１発明のアポトーシス抑制剤の有効成分である１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体は、例えば１５Ｒ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリン（以下、１５Ｒ−ＴＩＣと記載することがある）またはそのメチルエステルであり、この出願の発明者等による先願発明（特開平8-245498号公報）に記載された方法に従って作成することができる。
【００１９】
また、第２発明の有効成分である１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体は、例えば１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリン（以下、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣと記載することがある）またはそのメチルエステルであり、同じくこの出願の発明者等による特許出願（特願平9-160320号）に記載の方法によって製造することができる。
【００２０】
この発明のアポトーシス抑制剤は、これらのイソカルバサイクリン誘導体のいずれかを実質的な含有成分として製剤化することができるが、下記の参考例２にも示したように、中枢神経に作用させる場合には、脳への移行効率を考慮して、それらのメチルエステル等を含有成分としてして製剤化するのが好ましい。このメチルエステル等は脳内で１５Ｒ−ＴＩＣまたはＤｅｏｘｙ−ＴＩＣ等のイソカルバサイクリン誘導体に変換し、神経細胞アポトーシスに対して抑制効果を発揮する。また、体細胞のアポトーシス抑制を目的とする場合には、１５Ｒ−ＴＩＣまたはＤｅｏｘｙ−ＴＩＣ等のイソカルバサイクリン誘導体を有効成分として製剤化することができる。そして、この発明のアポトーシス抑制剤は、これらの有効成分の他に、公知のアポトーシス抑制性物質を含有していてもよい。
【００２１】
この発明のアポトーシス抑制剤は、一般的な医薬製剤の形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与することができる。
この発明のアポトーシス誘導剤は、イソカルバサイクリン誘導体を有効成分として５μM 以上の濃度で含有させ、その他の成分とともに製剤化することができる。その他の成分としては、医薬製造分野で通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤の希釈剤、賦形剤等を例示することができる。また、剤形としては、各種の形態が治療目的に応じて選択可能であり、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等を例示することができる。
【００２２】
例えば、注射剤を調製する場合は、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を含有させることも可能であり、また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合することもできる。
【００２３】
前記各形態の医薬製剤には、さらに必要に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有させることもできる。
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１
高酸素培養により誘導される海馬ニューロン・アポトーシスに対する１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣの効果を試験した。
（１）被検試料
・イソカルバサイクリン：帝人株式会社からの供与純品を使用した。
【００２５】
・１５Ｓ−ＴＩＣ：特開平8-245498号公報の実施例２で作成した１５Ｓ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルを用い、同公報実施例３の方法に準じて作成した。
・１５Ｒ−ＴＩＣ：特開平8-245498号公報の実施例３と同一の方法により作成した。
【００２６】
・Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣ：下記参考例１に記載の方法により作成した。
・ｂＦＧＦ：市販品を使用した。
（２）方法
妊娠２０日のウイスター系ラットから無菌的に摘出した胎仔の脳から海馬領域を切り出し、この海馬領域をＤＬ−システイン（0.2mg/ml）、ウシ血清アルブミン（0.2mg/ml）、グルコース（5mg/ml）、ＤＮＡseＩ（0.01% ）およびパパイン（9 unit/ml ）を含むＰＢＳ（Ca,Mg-free）で３０分間震盪培養することにより海馬ニューロンを分散した。次いで、各ニューロンを、ＤＭＥ／Ｆ−１２培地（5 ％ウマ血清および5 ％ウシ胎児血清含有）を満たした２４ well plate （ポリエチレンイニンコーティング済み）に、5 x 105 cells/cm2 の割合で蒔き、5 ％炭酸ガス培養器（9 ％酸素）にて２日間培養した。その後、培養液を血清除去ＤＭＥ／Ｆ−１２培地（5 μg/mlトランスフェリン、5 μg/mlインスリンおよび5 nMプロゲステロン含有）に換え、各被検試料を培地に加え、３０分後に50％酸素中に移した。４８時間５０％酸素中で培養した後、細胞の生存率を測定した。また、９％酸素中で培養した細胞の培地にも同様に各被検試料を添加し、生存率を測定した。
【００２７】
細胞生存率は、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後、抗ＭＡＰ２抗体で染色し、ＤＡＢで発色させ、その200 倍顕微鏡写真からＭＡＰ２陽性細胞を計測して算出した。
（３）結果
図１は、ｂＦＧＦの添加量を50 ng/mlとし、その他の被検試料の添加量を5 μＭとした場合の、９％または50％酸素培養における海馬ニューロンの生存率である。９％酸素培養で、試料無添加の条件をコントロールとした。イソカルバサイクリンおよび１５Ｓ−ＴＩＣを添加した場合には、コントロール条件と同様、海馬ニューロンは高濃度酸素により誘導されるアポトーシスによってその生存率を大幅に減少させた。これに対して、この発明に係る１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣを添加した場合には、公知のアポトーシス抑制物質であるｂＦＧＦと同等もしくはそれ以上の割合で細胞生存率の向上が観察された。
【００２８】
図２は、海馬ニューロンのアポトーシスに対する各被検試料の濃度依存効果である。なお、この図２では、９％酸素培養における細胞生存率を 100％とし、各被検試料の添加による生存率を平均値±S.D.（ｎ−４）で表示している。この図２から明らかなように、イソカルバサイクリンおよび１５Ｓ−ＴＩＣは試験した濃度範囲で効果を示さなかったが、１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣは添加量依存的にアポトーシス抑制効果を示し、3000 nＭ濃度ではコントロールと同等の抑制効果が観察された。なお、50％抑制濃度（ＩＣ50）は、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣは30 nＭであり、１５Ｒ−ＴＩＣは300nＭであった。
【００２９】
以上の結果から、この発明のアポトーシス抑制剤の有効成分である１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣは、生体細胞、とりわけ神経系細胞のアポトーシスに対して優れた抑制効果を有することが確認された。
実施例２
海馬ＣＡ１錐体神経細胞（pyramidal neuron）の虚血誘発性アポトーシスに対する１５Ｒ−ＴＩＣの効果をスナネズミ（mongolian gerbils ）を用いた
in vivo 実験系において試験した。
【００３０】
１５Ｒ−ＴＩＣが in vivo神経細胞死を抑制するか否かを調べるため、浸透圧ミニポンプを用い、３分間の一過性前脳虚血処置を施したスナネズミの左側脳室に７日間（一過性虚血の２日前から５日後まで）に渡って１５Ｒ−ＴＩＣ溶液を連続的に注入した。ＣＡ１錐体神経細胞の生存数は、ニッスル染色した脳切片中の10μm 以上の細胞体を有する神経細胞を数えることによって決定した。
【００３１】
その結果、１５Ｒ−ＴＩＣの脳内投与は、前脳虚血によって誘発されるＣＡ１錐体神経細胞の減少を抑制することが確認された。すなわち、１５Ｒ−ＴＩＣを投与したスナネズミの神経細胞数（20μm 厚切片中984 ± 299個、ｎ＝４）は、虚血処置を施していないコントロールの神経細胞数（1061±220 個、ｎ＝４）と同等であった。一方、溶媒を注入したスナネズミのＣＡ１錐体神経細胞数（142 ±28個、ｎ＝４）は、コントロール個体または１５Ｒ−ＴＩＣ注入個体に比して有意に減少していた。また、溶媒を注入したスナネズミの錐体神経細胞は徐々に変性し、核が縮小し、そして、全体が破壊細胞となる。
【００３２】
これらの結果は、実施例１および２で示したin vitroの作用と同様に、１５Ｒ−ＴＩＣがin vivo でも神経細胞の生存促進因子として有効に作用することを示している。
参考例１
特願平9-160320号の実施例１の記載に従い、下記の化学反応式に沿って、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣを以下のとおりに作成した。
【００３３】
【化９】
【００３４】
＜１＞アルデヒド化合物(12)の合成
１０ｍｌ容量の skulenkチューブに、（トリフェニルホスホラニリデン）アセトアルデヒド（21.8mg, 71.6μmol ）のベンゼン（1.5ml ）溶液を入れ、次いで前記アルデヒド化合物(11)（23.0mg, 65.3μmol ）のベンゼン（1.5ml ）溶液を加え、２０時間還流させた。反応混合物を冷却後、溶媒を除去し、残渣を、ヘキサンおよびエチルアセテートの２：１並びに１：１混合物を用いてＳｉＯ2 クロマトグラフィー精製し、アルデヒド化合物(12)を得た（14.8mg, 61％）。
【００３５】
TLC Rf 0.55（１：１ヘキサン／エチルアセテート）であった。
＜２＞炭酸エステル化合物(13)の合成
10ml容量の丸底フラスコに、前記アルデヒド化合物(12)（7.6mg, 20.2 μmol ）のメタノール（1.0ml ）溶液を入れ、次いで、ＣｅＣｌ7 Ｈ2 Ｏ（10mg, 27μmol ）とＮａＢＨ4 （2mg, 53 μmol ）を添加し、５分間撹拌した。
【００３６】
その後、反応混合物にエチルアセテートと水を添加した。エチルアセテートを溶媒として用い、３度抽出を行った。有機相を一緒にして、ＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧下に濃縮した。
得られた粗生成物を、10ml容量の丸底フラスコに入れ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （2.0ml ）に溶解させた。この溶液にＤＭＡＰ（37.0mg, 0.303mmol ）およびクロルギ酸メチルエステル（0.015ml, 0.194mmol）を添加し、４時間撹拌した。その後、ＮａＨＣＯ3 水溶液を加え、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＮａ2 ＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。ヘキサンとエチルアセテートの４：１混合物を用いてＳｉＯ2 によるクロマトグラフィー精製し、前記の炭酸エステル化合物(13)（8.0mg, 91 ％）を得た。TLC Rf 0,42（２：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜３＞付加体化合物(15)の合成
20ml容量の skulenkチューブに、トリス（ジベンジリデンアセトン）−ジパラジウム（Ｏ）−クロロホルム付加物（2.1mg, 2.0μmol ）と１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（1.6mg, 4.0μmol ）のＴＨＦ（1.0ml ）溶液を入れた。この溶液に、前記の炭酸エステル化合物(13)（8.0mg, 18.3 μmol ）およびジスルホン（7.6mg, 19.7 μmol ）のＴＨＦ（1.0ml ）溶液を加え、１５時間撹拌した。
【００３７】
反応混合物を、ＮＨ4 Ｃｌ水溶液に注ぎ、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。ヘキサンとエチルアセテートの２：１、１：１並びに１：２混合物を用いてＳｉＯ2 クロマトグラフィーにより精製し、目的とする付加体化合物(15)を得た（９．６ｍｇ、７０％）。TLC Rf 0.27（１：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜４＞化合物(16)；１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルの合成
10ml容量の丸底フラスコに、Ｍｇ（10mg, 0.4mmol ）を入れ、次いで、前記の付加体化合物(15)（7.5mg, 10.0 μmol ）のメタノール（1.5ml ）溶液を加えて３時間撹拌した。
【００３８】
反応混合物にＨＣｌ（１Ｎ）水溶液を加え、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。
得られた粗生成物を10ml容量の丸底フラスコに入れ、酢酸と水との９：１混合物（2.0ml ）に溶解させた。４０時間撹拌した後に、エチルアセテートを添加し、ＮａＨＣＯ3 水溶液により洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ4 により乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。次いで、３：１のヘキサンとエチルアセテート混合物を用い、ＳｉＯ2 クロマトグラフィー精製して、目的とする化合物(16)の１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルを得た（2.2mg, 58 ％）。TLC Rf 0.6 （１：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜５＞１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンの合成
10ml容量のテストチューブに、前記化合物(16)（1.0mg, 2.6μmol ）のメタノール（0.5ml ）溶液を入れ、ＮａＯＨ水溶液（３Ｎ，0.2ml ）を加え、室温で１２時間撹拌した。ＮａＨＳＯ4 を添加した後にエチルアセテートと水を加えた。ｐＨは３とした。
【００３９】
有機相を分離し、水性相をエチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にし、ＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧下に濃縮した。ＣＨ2 Ｃｌ2 とメタノールとの１０：１混合物を用いてＳｉＯ2 （0.5g）クロマトグラフィー精製し、目的とする１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンを得た（0.9mg, 94 ％）。TLC Rf 0.39（９：１ＣＨ2 Ｃｌ2 ／メタノール）。
参考例２
イソカルバサイクリン誘導体の脳への移行をポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）法により試験した。
（１）被検試料
・11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（ＲＴＡ）：
下記参考例の方法に従って作成した１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルの１６−ｍ−トリル基のメチル基炭素を11Ｃで標識した標識化合物。
【００４０】
・11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（ＲＴＣ）：
下記参考例の方法に従って作成した１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルのメチルエステル基のメチル基炭素を11Ｃで標識した標識化合物。
（２）方法
成獣アカゲザル（体重約８kg）に、上記被検試料のトレーサー量（0.2 μg/kg以下）を静注し、静注後から６０分後までの脳内における被検試料の挙動をＰＥＴ装置を用いて画像化した。この画像からＲＯＩ（region of interest：関心領域）値を計測し、以下の式に従って取り込み量を算出した。
【数１】
（３）結果
図３（Ａ）には各標識化合物の脳全体での取り込み量を示し、図３（Ｂ）には視床における取り込み量を示した。ＲＴＡおよびＲＴＣは同程度に血液−脳関門を通過したが（図４Ａ、Ｂ）、ＲＴＡはＲＴＣよりもずっと多く脳内に保持されていた。このことは、脱エステル化11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣが脳内で保持されることを示しており、換言すれば、ＲＴＡが１５Ｒ−ＴＩＣのプロドラッグとして機能する可能性が示唆された。
【００４１】
これらの結果からも明らかなように、全身投与された１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルは、効率よく脳内に移行することが確認された。そして、この標識化合物は投与後６０分間以上も脳内に止まることから、１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（１５Ｒ−ＴＩＣの前駆体）は脳内で１５Ｒ−ＴＩＣに変換してプロスタサイクリン受容体に結合し、そのアポトーシス抑制作用を脳内で発揮することが示唆された。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、化学合成によって簡便かつ安価に製造可能な化合物を有効成分とする新規なアポトーシス抑制剤が提供される。この薬剤の有効成分であるイソカルバサイクリン誘導体は、血液脳関門を通過して中枢神経系に作用することがＰＥＴ研究等により明らかにされているため、特に、神経細胞のアポトーシスを原因とする各種疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】海馬ニューロンのアポトーシスに対する抑制効果を示したグラフ図である。
【図２】海馬ニューロンのアポトーシスに対する各種化合物の抑制効果と濃度との関係を示したグラフ図である。
【図３】（Ａ）（Ｂ）は、各々、標識したイソカルバサイクリン誘導体の脳全体および視床における取り込み量を経時的にプロットしたグラフ図である。
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、アポトーシス抑制剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、中枢神経型プロスタサイクリン受容体に特異的なリガンドとして知られているイソカルバサイクリン誘導体を有効成分とし、神経細胞等のアポトーシスに対して優れた抑制作用を有する新規なアポトーシス抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス (apoptosis)は遺伝的にプログラムされた細胞死の一種であり、形態学的には以下のプロセス、すなわち核の凝縮；細胞縮小；空胞化・細胞表面の平滑化；細胞間間隔の拡大；周囲からの細胞の遊離；細胞の断片化（アポトーシス小体）；マクロファージ等による貪食のプロセスを経て起こる。また生化学的には、エンドヌクレアーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単位が 180〜200 塩基長のＤＮＡに断片化することも知られている（Immunology Today 7:115-119, 1986；Science 245:301-305, 1989 ）。
【０００３】
現在では、このアポトーシスは発生・分化、正常組織や細胞のターン・オーバーなどの生理的な機構に加え、脳梗塞後等の虚血性神経細胞死、癌腫の退縮、放射線や抗癌剤の作用、ＡＩＤＳ等のウイルス感染によるリンパ球の減少、炎症などの疾患にも関与することが明らかにされ、これを調整する薬剤（すなわち、アポトーシス抑制剤、アポトーシス誘導剤）の開発は、脳神経系や癌、老化など幅広い分野において新しい作用機序に基づく薬剤を生み出すものと期待されている。
【０００４】
アポトーシスを誘導する物質、要因としては、グルココルチコイド、グルタミン酸等の神経伝達物質の毒性、放射線照射、ＮＫ細胞、キラー細胞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはリンフォトキシン（ＬＴ）等のサイトカイン類等が報告されている。また、蛋白合成阻害剤であるシクロヘキシミド（Cycloheximide)またはＲＮＡ合成阻害剤であるアクチノマイシンＤ（Actinomycin D ）が、ヒト白血病細胞HL-60 に対してアポトーシスを誘導することも報告されている。さらに、最近では、免疫細胞のアポトーシスに関与する細胞膜分子であるＦａｓ抗原に対する抗Ｆａｓモノクローナル抗体が調製され、抗Ｆａｓ抗体の医薬への応用については種々の研究がなされている。
【０００５】
一方、アポトーシスを抑制する因子としては、インターロイキン１変換酵素の阻害物質、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等が報告されている。また、bcl-2 関連遺伝子産物も、アポトーシスを抑制し、細胞の延命機能を有することが知られている。ただし、これらのアポトーシス抑制因子は全て生体由来のペプチドあるいはタンパク質であって、化学合成等の工業的手段によって得られるアポトーシス抑制物質は従来知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者等は、脳機能の生理的作用を詳細に検討する過程で、中枢神経型プロスタサイクリン受容体の特異的リガンドとして働く各種のイソカルバサイクリン誘導体を発明し、既に特許出願している [特願平7-51589 号（特開平8-245498号公報）、特願平8-243122号（特開平10-87608号公報）、特願平8-260957号（特開平10-101610 号公報、特願平9-160320号] 。そして、これらの物質の生理活性をさらに検討した結果、そのうちの幾つかが顕著なアポトーシス抑制効果を示すことを見出した。
【０００７】
従って、この出願の発明は、発明者等による以上のとおりの知見をさらに発展させ、化学合成によって大量かつ安価に製造することのできる新規なアポトーシス抑制剤を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する第１の発明として、次式（１）
【０００９】
【化５】
（式中Ｒ1 は炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｒ2 は水素原子または保護基を示す）
で表される１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤を提供する。
この第１発明のアポトーシス抑制剤においては、上記１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体が、次式（２）
【００１１】
【化６】
で表される１５Ｒ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンまたはそのメチルエステルであることを好ましい態様としている。
さらにこの出願は、第２の発明として、次式（３）
【００１３】
【化７】
（式中Ｒ1 は炭素数１〜６の炭化水素鎖を示し、Ｒ2 は水素原子または保護基を示す）
で表される１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤を提供する。
この第２発明においては、上記１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体が、次式（４）
【００１５】
【化８】
で表される１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンまたはそのメチルエステルであることを好ましい態様としている。
なお、上記式（１）および（３）において、Ｒ2 を構成する保護基とは、製剤上許容される塩、エステル等を意味し、例えば、メチルエステル、エチルエステル等を構成するアルキル基が示される。
【００１７】
以下、これらの発明について、その実施形態をさらに詳しく説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この出願の第１発明のアポトーシス抑制剤の有効成分である１５Ｒ−イソカルバサイクリン誘導体は、例えば１５Ｒ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリン（以下、１５Ｒ−ＴＩＣと記載することがある）またはそのメチルエステルであり、この出願の発明者等による先願発明（特開平8-245498号公報）に記載された方法に従って作成することができる。
【００１９】
また、第２発明の有効成分である１５−デオキシ−イソカルバサイクリン誘導体は、例えば１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリン（以下、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣと記載することがある）またはそのメチルエステルであり、同じくこの出願の発明者等による特許出願（特願平9-160320号）に記載の方法によって製造することができる。
【００２０】
この発明のアポトーシス抑制剤は、これらのイソカルバサイクリン誘導体のいずれかを実質的な含有成分として製剤化することができるが、下記の参考例２にも示したように、中枢神経に作用させる場合には、脳への移行効率を考慮して、それらのメチルエステル等を含有成分としてして製剤化するのが好ましい。このメチルエステル等は脳内で１５Ｒ−ＴＩＣまたはＤｅｏｘｙ−ＴＩＣ等のイソカルバサイクリン誘導体に変換し、神経細胞アポトーシスに対して抑制効果を発揮する。また、体細胞のアポトーシス抑制を目的とする場合には、１５Ｒ−ＴＩＣまたはＤｅｏｘｙ−ＴＩＣ等のイソカルバサイクリン誘導体を有効成分として製剤化することができる。そして、この発明のアポトーシス抑制剤は、これらの有効成分の他に、公知のアポトーシス抑制性物質を含有していてもよい。
【００２１】
この発明のアポトーシス抑制剤は、一般的な医薬製剤の形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与することができる。
この発明のアポトーシス誘導剤は、イソカルバサイクリン誘導体を有効成分として５μM 以上の濃度で含有させ、その他の成分とともに製剤化することができる。その他の成分としては、医薬製造分野で通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤の希釈剤、賦形剤等を例示することができる。また、剤形としては、各種の形態が治療目的に応じて選択可能であり、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等を例示することができる。
【００２２】
例えば、注射剤を調製する場合は、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を含有させることも可能であり、また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合することもできる。
【００２３】
前記各形態の医薬製剤には、さらに必要に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有させることもできる。
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１
高酸素培養により誘導される海馬ニューロン・アポトーシスに対する１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣの効果を試験した。
（１）被検試料
・イソカルバサイクリン：帝人株式会社からの供与純品を使用した。
【００２５】
・１５Ｓ−ＴＩＣ：特開平8-245498号公報の実施例２で作成した１５Ｓ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルを用い、同公報実施例３の方法に準じて作成した。
・１５Ｒ−ＴＩＣ：特開平8-245498号公報の実施例３と同一の方法により作成した。
【００２６】
・Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣ：下記参考例１に記載の方法により作成した。
・ｂＦＧＦ：市販品を使用した。
（２）方法
妊娠２０日のウイスター系ラットから無菌的に摘出した胎仔の脳から海馬領域を切り出し、この海馬領域をＤＬ−システイン（0.2mg/ml）、ウシ血清アルブミン（0.2mg/ml）、グルコース（5mg/ml）、ＤＮＡseＩ（0.01% ）およびパパイン（9 unit/ml ）を含むＰＢＳ（Ca,Mg-free）で３０分間震盪培養することにより海馬ニューロンを分散した。次いで、各ニューロンを、ＤＭＥ／Ｆ−１２培地（5 ％ウマ血清および5 ％ウシ胎児血清含有）を満たした２４ well plate （ポリエチレンイニンコーティング済み）に、5 x 105 cells/cm2 の割合で蒔き、5 ％炭酸ガス培養器（9 ％酸素）にて２日間培養した。その後、培養液を血清除去ＤＭＥ／Ｆ−１２培地（5 μg/mlトランスフェリン、5 μg/mlインスリンおよび5 nMプロゲステロン含有）に換え、各被検試料を培地に加え、３０分後に50％酸素中に移した。４８時間５０％酸素中で培養した後、細胞の生存率を測定した。また、９％酸素中で培養した細胞の培地にも同様に各被検試料を添加し、生存率を測定した。
【００２７】
細胞生存率は、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後、抗ＭＡＰ２抗体で染色し、ＤＡＢで発色させ、その200 倍顕微鏡写真からＭＡＰ２陽性細胞を計測して算出した。
（３）結果
図１は、ｂＦＧＦの添加量を50 ng/mlとし、その他の被検試料の添加量を5 μＭとした場合の、９％または50％酸素培養における海馬ニューロンの生存率である。９％酸素培養で、試料無添加の条件をコントロールとした。イソカルバサイクリンおよび１５Ｓ−ＴＩＣを添加した場合には、コントロール条件と同様、海馬ニューロンは高濃度酸素により誘導されるアポトーシスによってその生存率を大幅に減少させた。これに対して、この発明に係る１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣを添加した場合には、公知のアポトーシス抑制物質であるｂＦＧＦと同等もしくはそれ以上の割合で細胞生存率の向上が観察された。
【００２８】
図２は、海馬ニューロンのアポトーシスに対する各被検試料の濃度依存効果である。なお、この図２では、９％酸素培養における細胞生存率を 100％とし、各被検試料の添加による生存率を平均値±S.D.（ｎ−４）で表示している。この図２から明らかなように、イソカルバサイクリンおよび１５Ｓ−ＴＩＣは試験した濃度範囲で効果を示さなかったが、１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣは添加量依存的にアポトーシス抑制効果を示し、3000 nＭ濃度ではコントロールと同等の抑制効果が観察された。なお、50％抑制濃度（ＩＣ50）は、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣは30 nＭであり、１５Ｒ−ＴＩＣは300nＭであった。
【００２９】
以上の結果から、この発明のアポトーシス抑制剤の有効成分である１５Ｒ−ＴＩＣおよびＤｅｏｘｙ−ＴＩＣは、生体細胞、とりわけ神経系細胞のアポトーシスに対して優れた抑制効果を有することが確認された。
実施例２
海馬ＣＡ１錐体神経細胞（pyramidal neuron）の虚血誘発性アポトーシスに対する１５Ｒ−ＴＩＣの効果をスナネズミ（mongolian gerbils ）を用いた
in vivo 実験系において試験した。
【００３０】
１５Ｒ−ＴＩＣが in vivo神経細胞死を抑制するか否かを調べるため、浸透圧ミニポンプを用い、３分間の一過性前脳虚血処置を施したスナネズミの左側脳室に７日間（一過性虚血の２日前から５日後まで）に渡って１５Ｒ−ＴＩＣ溶液を連続的に注入した。ＣＡ１錐体神経細胞の生存数は、ニッスル染色した脳切片中の10μm 以上の細胞体を有する神経細胞を数えることによって決定した。
【００３１】
その結果、１５Ｒ−ＴＩＣの脳内投与は、前脳虚血によって誘発されるＣＡ１錐体神経細胞の減少を抑制することが確認された。すなわち、１５Ｒ−ＴＩＣを投与したスナネズミの神経細胞数（20μm 厚切片中984 ± 299個、ｎ＝４）は、虚血処置を施していないコントロールの神経細胞数（1061±220 個、ｎ＝４）と同等であった。一方、溶媒を注入したスナネズミのＣＡ１錐体神経細胞数（142 ±28個、ｎ＝４）は、コントロール個体または１５Ｒ−ＴＩＣ注入個体に比して有意に減少していた。また、溶媒を注入したスナネズミの錐体神経細胞は徐々に変性し、核が縮小し、そして、全体が破壊細胞となる。
【００３２】
これらの結果は、実施例１および２で示したin vitroの作用と同様に、１５Ｒ−ＴＩＣがin vivo でも神経細胞の生存促進因子として有効に作用することを示している。
参考例１
特願平9-160320号の実施例１の記載に従い、下記の化学反応式に沿って、Ｄｅｏｘｙ−ＴＩＣを以下のとおりに作成した。
【００３３】
【化９】
＜１＞アルデヒド化合物(12)の合成
１０ｍｌ容量の skulenkチューブに、（トリフェニルホスホラニリデン）アセトアルデヒド（21.8mg, 71.6μmol ）のベンゼン（1.5ml ）溶液を入れ、次いで前記アルデヒド化合物(11)（23.0mg, 65.3μmol ）のベンゼン（1.5ml ）溶液を加え、２０時間還流させた。反応混合物を冷却後、溶媒を除去し、残渣を、ヘキサンおよびエチルアセテートの２：１並びに１：１混合物を用いてＳｉＯ2 クロマトグラフィー精製し、アルデヒド化合物(12)を得た（14.8mg, 61％）。
【００３５】
TLC Rf 0.55（１：１ヘキサン／エチルアセテート）であった。
＜２＞炭酸エステル化合物(13)の合成
10ml容量の丸底フラスコに、前記アルデヒド化合物(12)（7.6mg, 20.2 μmol ）のメタノール（1.0ml ）溶液を入れ、次いで、ＣｅＣｌ7 Ｈ2 Ｏ（10mg, 27μmol ）とＮａＢＨ4 （2mg, 53 μmol ）を添加し、５分間撹拌した。
【００３６】
その後、反応混合物にエチルアセテートと水を添加した。エチルアセテートを溶媒として用い、３度抽出を行った。有機相を一緒にして、ＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧下に濃縮した。
得られた粗生成物を、10ml容量の丸底フラスコに入れ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （2.0ml ）に溶解させた。この溶液にＤＭＡＰ（37.0mg, 0.303mmol ）およびクロルギ酸メチルエステル（0.015ml, 0.194mmol）を添加し、４時間撹拌した。その後、ＮａＨＣＯ3 水溶液を加え、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＮａ2 ＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。ヘキサンとエチルアセテートの４：１混合物を用いてＳｉＯ2 によるクロマトグラフィー精製し、前記の炭酸エステル化合物(13)（8.0mg, 91 ％）を得た。TLC Rf 0,42（２：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜３＞付加体化合物(15)の合成
20ml容量の skulenkチューブに、トリス（ジベンジリデンアセトン）−ジパラジウム（Ｏ）−クロロホルム付加物（2.1mg, 2.0μmol ）と１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（1.6mg, 4.0μmol ）のＴＨＦ（1.0ml ）溶液を入れた。この溶液に、前記の炭酸エステル化合物(13)（8.0mg, 18.3 μmol ）およびジスルホン（7.6mg, 19.7 μmol ）のＴＨＦ（1.0ml ）溶液を加え、１５時間撹拌した。
【００３７】
反応混合物を、ＮＨ4 Ｃｌ水溶液に注ぎ、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。ヘキサンとエチルアセテートの２：１、１：１並びに１：２混合物を用いてＳｉＯ2 クロマトグラフィーにより精製し、目的とする付加体化合物(15)を得た（９．６ｍｇ、７０％）。TLC Rf 0.27（１：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜４＞化合物(16)；１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルの合成
10ml容量の丸底フラスコに、Ｍｇ（10mg, 0.4mmol ）を入れ、次いで、前記の付加体化合物(15)（7.5mg, 10.0 μmol ）のメタノール（1.5ml ）溶液を加えて３時間撹拌した。
【００３８】
反応混合物にＨＣｌ（１Ｎ）水溶液を加え、エチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にしてＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。
得られた粗生成物を10ml容量の丸底フラスコに入れ、酢酸と水との９：１混合物（2.0ml ）に溶解させた。４０時間撹拌した後に、エチルアセテートを添加し、ＮａＨＣＯ3 水溶液により洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ4 により乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。次いで、３：１のヘキサンとエチルアセテート混合物を用い、ＳｉＯ2 クロマトグラフィー精製して、目的とする化合物(16)の１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンメチルエステルを得た（2.2mg, 58 ％）。TLC Rf 0.6 （１：１ヘキサン／エチルアセテート）。
＜５＞１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンの合成
10ml容量のテストチューブに、前記化合物(16)（1.0mg, 2.6μmol ）のメタノール（0.5ml ）溶液を入れ、ＮａＯＨ水溶液（３Ｎ，0.2ml ）を加え、室温で１２時間撹拌した。ＮａＨＳＯ4 を添加した後にエチルアセテートと水を加えた。ｐＨは３とした。
【００３９】
有機相を分離し、水性相をエチルアセテートにより抽出した。有機相を一緒にし、ＭｇＳＯ4 により乾燥し、濾過し、減圧下に濃縮した。ＣＨ2 Ｃｌ2 とメタノールとの１０：１混合物を用いてＳｉＯ2 （0.5g）クロマトグラフィー精製し、目的とする１５−デオキシ−１６−ｍ−トリル−１７，１８，１９，２０−テトラノルイソカルバサイクリンを得た（0.9mg, 94 ％）。TLC Rf 0.39（９：１ＣＨ2 Ｃｌ2 ／メタノール）。
参考例２
イソカルバサイクリン誘導体の脳への移行をポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）法により試験した。
（１）被検試料
・11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（ＲＴＡ）：
下記参考例の方法に従って作成した１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルの１６−ｍ−トリル基のメチル基炭素を11Ｃで標識した標識化合物。
【００４０】
・11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（ＲＴＣ）：
下記参考例の方法に従って作成した１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルのメチルエステル基のメチル基炭素を11Ｃで標識した標識化合物。
（２）方法
成獣アカゲザル（体重約８kg）に、上記被検試料のトレーサー量（0.2 μg/kg以下）を静注し、静注後から６０分後までの脳内における被検試料の挙動をＰＥＴ装置を用いて画像化した。この画像からＲＯＩ（region of interest：関心領域）値を計測し、以下の式に従って取り込み量を算出した。
【数１】
図３（Ａ）には各標識化合物の脳全体での取り込み量を示し、図３（Ｂ）には視床における取り込み量を示した。ＲＴＡおよびＲＴＣは同程度に血液−脳関門を通過したが（図４Ａ、Ｂ）、ＲＴＡはＲＴＣよりもずっと多く脳内に保持されていた。このことは、脱エステル化11Ｃ標識１５Ｒ−ＴＩＣが脳内で保持されることを示しており、換言すれば、ＲＴＡが１５Ｒ−ＴＩＣのプロドラッグとして機能する可能性が示唆された。
【００４１】
これらの結果からも明らかなように、全身投与された１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステルは、効率よく脳内に移行することが確認された。そして、この標識化合物は投与後６０分間以上も脳内に止まることから、１５Ｒ−ＴＩＣ−メチルエステル（１５Ｒ−ＴＩＣの前駆体）は脳内で１５Ｒ−ＴＩＣに変換してプロスタサイクリン受容体に結合し、そのアポトーシス抑制作用を脳内で発揮することが示唆された。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、化学合成によって簡便かつ安価に製造可能な化合物を有効成分とする新規なアポトーシス抑制剤が提供される。この薬剤の有効成分であるイソカルバサイクリン誘導体は、血液脳関門を通過して中枢神経系に作用することがＰＥＴ研究等により明らかにされているため、特に、神経細胞のアポトーシスを原因とする各種疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】海馬ニューロンのアポトーシスに対する抑制効果を示したグラフ図である。
【図２】海馬ニューロンのアポトーシスに対する各種化合物の抑制効果と濃度との関係を示したグラフ図である。
【図３】（Ａ）（Ｂ）は、各々、標識したイソカルバサイクリン誘導体の脳全体および視床における取り込み量を経時的にプロットしたグラフ図である。
Claims (4)
- 神経細胞のアポトーシスに対して抑制作用を有する薬剤であって、
次式（２）
- 神経細胞のアポトーシスが、虚血性神経細胞アポトーシスである請求項１の神経細胞アポトーシス抑制剤。
- 神経細胞のアポトーシスに対して抑制作用を有する薬剤であって、
次式（４）
- 神経細胞のアポトーシスが、虚血性神経細胞アポトーシスである請求項３の神経細胞アポトーシス抑制剤。
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