JP3947721B2

JP3947721B2 - A culture of koji mold containing a physiologically active substance and a method for producing the same

Info

Publication number: JP3947721B2
Application number: JP2003092911A
Authority: JP
Inventors: 智栄美今田; 康彰高森; 光秀榊原; 俊男米山
Original assignee: IWATA CHEMICAL CO., LTD.
Current assignee: IWATA CHEMICAL CO., LTD.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2023-03-28
Also published as: JP2004298027A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレステロール低下作用性物質であるモナコリンＫを多く含む紅麹菌培養物及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
紅麹は、穀類などの澱粉質物にモナスカス属の菌株を繁殖させた麹であり、赤い色素を生産する特徴を有している。沖縄の特産品である豆腐ようをはじめ、中国および台湾において紅酒、紅乳腐等の醸造食品の原料として、食品の製造および加工において、ならびに天然色素の製造において広く利用されている。
【０００３】
古くから紅麹は消化を促進し、血行を良くする漢方生薬として利用されてきた。この紅麹のある種の菌がコレステロール低下物質であるモナコリンＫを生産することが発見され（特公昭５９−２５５９９号公報（特許文献１））、紅麹自体にもコレステロール低下作用があることが分かってきた（特公昭６０−４４９１４号公報（特許文献２））。この作用を高めるため、紅麹のモナコリン含量向上について検討がなされている（特開２０００−１０６８３４号公報（特許文献３）、特開２０００−１０６８３５号公報（特許文献４））。これらの方法は、伝統的な固体培養におけるものである。安価かつ大量培養が可能な液体培養においては、モナコリンＫ含量向上についてあまり知見が得られていない。また、他の大豆由来物質、米ぬか、ふすまのような固体培地の原料として通常使用されている原料を固体培地中に添加することと比較して、おからを液体培養の培地原料として使用することにより、モナコリンＫ生産量が著しく増加することは見出されていなかった。
【０００４】
おからは、従来より、豆腐および豆乳を製造する際の副産物として煮物などの食用に用いられたり、飼料として用いられたりしていたが、多くは産業廃棄物として処理されているのが現状である。しかしながら、近年、食物繊維、イソフラボン、およびサポニンのような、おからの栄養的価値が注目され始めており、おからに何らかの付加価値を与えることは、産業廃棄物の再利用および資源化の観点からも有意義なことである。
【０００５】
紅麹菌の培養とおからとを組み合わせたものについては、醗酵飼料の製法（特開昭６２−１４３６４６号公報（特許文献５））およびアルコール類製造に伴う高濃度蒸留廃液の処理方法（特開２００１−２３２３８９号公報（特許文献６））が見られる。前者は、紅麹のもつ腐敗抑制作用を利用して、おからのような、廃棄処分されるかまたは利用価値が極めて低いタンパク質原料または澱粉質原料の腐敗を防止すると共に、適度に消化分解することを目的としたものである。後者は、アルコール類製造に伴う高濃度蒸留液の処理のために紅麹菌を利用した際に発生する菌体を有効利用するための一手段として、おからに植菌して紅麹を製造することを目的としたものである。したがって、特許文献５および特許文献６に開示の紅麹菌の培養とおからとの組み合わせはともに、食用に供するものではなく、なおかつ紅麹のもつ生理活性能をおからによって高め、健康増進に寄与することを目的としたものではない。
【０００６】
特開２００２−２８８号公報（特許文献７）には、イソフラボン配糖体を含む原料である大豆、大豆胚軸、または大豆を加工したものに紅麹菌を接種して製麹することにより、イソフラボンアグリコンを製造する方法が開示される。特許文献７では、イソフラボン配糖体を含む原料である大豆または大豆胚軸に紅麹菌を接種することにより、このイソフラボン配糖体がイソフラボンアグリコンに分解され得ることが記載される。
【０００７】
しかし、いずれの先行技術文献においても、他の大豆由来物質、米ぬか、ふすまのような固体培地の原料として通常使用されている原料を固体培地中に添加することと比較して、おからを液体培養の培地原料として使用することにより、おからまたは紅麹菌に起因する生理活性物質の生産を向上させること、特にモナコリンＫ生産量が著しく増加することは見出されていない。
【０００８】
【特許文献１】
特公昭５９−２５５９９号公報
【０００９】
【特許文献２】
特公昭６０−４４９１４号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開２０００−１０６８３４号公報
【００１１】
【特許文献４】
特開２０００−１０６８３５号公報
【００１２】
【特許文献５】
特開昭６２−１４３６４６号公報
【００１３】
【特許文献６】
特開昭６２−１４３６４６号公報
【００１４】
【特許文献７】
特開２００２−２８８号公報
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、モナコリンＫのような生理活性物質を著しく多く産生できる紅麹菌培養物およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、おからに由来する生理活性物質を含む紅麹菌培養物を提供することを目的とする。本発明はさらに、および高濃度のモナコリンＫを生産可能な新規なバシペトスポラ株を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、紅麹菌を培養する培地としてこれまで主として用いられてきた米のような穀類に代えて、おからを液体培地に分散させて紅麹菌を培養することにより、紅麹菌が生理活性物質モナコリンＫを著しく産生できたことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
従って、本発明の１つの局面において、モナコリンＫ含有組成物の製造方法であって、おからを分散させた液体培地で紅麹菌を培養する工程を包含する、方法が提供される。
【００１８】
１つの実施形態において、上記紅麹菌は、ベニコウジカビ科（Ｍｏｎａｓｃａｃｅａｅ）に属する菌株である。
【００１９】
さらなる実施形態において、上記紅麹菌は、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）またはバシペトスポラ属（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）に属する菌株である。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、上記紅麹菌は、モナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）（ＩＦＯ４５２０）、モナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）（ＩＦＯ４４８０）、モナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）（ＩＦＯ４５３７）、およびバシペトスポラ（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）２４０４（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１９１０９号）からなる群から選択される菌株である。
【００２１】
１つの実施形態において、上記液体培地は、約１重量％を超える濃度のおからを含む。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の方法は、上記紅麹菌を除去する工程をさらに包含する。
【００２３】
本発明の別の局面において、上記の方法により製造されたモナコリンＫ含有組成物もまた提供される。
【００２４】
本発明のさらなる別の局面において、高濃度のモナコリンＫを生産可能なバシペトスポラ属（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）２４０４株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１９１０９号）もまた提供される。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いることができる紅麹菌としては、ベニコウジカビ科（Ｍｏｎａｓｃａｃｅａｅ）に属し、好ましくは、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）およびバシペトスポラ属（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）に属し、モナコリンＫの生産能があればいずれの菌株であってもよい。このような菌株としては、例えばモナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）（ＩＦＯ４５２０株、ＩＦＯ４４８０株、ＩＦＯ４５３７株）、モナスカス・プビゲレス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｕｂｉｇｅｒｕｓ）（ＯＵＴ２０１５株）、モナスカス・パキシー（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐａｘｉｉ）（ＩＦＯ８２０１株）、モナスカス・ルーベル（Ｍｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ）（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−４８２２号、ＩＦＯ９２０３株、ＡＴＣＣ１３６９２株、ＡＴＣＣ１５６７０株、ＡＴＣＣ１６２４０株、ＡＴＣＣ１６３６６株、ＡＴＣＣ１６３８４株）、モナスカス・ビトレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｖｉｔｒｅｕｓ）（ＩＦＯ７５３７株、ＩＦＯ４５３２株）、モナスカス・パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ１６３８５株、ＡＴＣＣ１６３８６株、ＡＴＣＣ１６４３６株）、モナスカス・ルブロパンクタタス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｒｏｐｕｎｃｔａｔｕｓ）（ＡＴＣＣ１６３６８株）、およびモナスカス属ＡＴＣＣ１６３７０、１６４３３、１６４３４、１６６６６、１６７７２、１６７７３、１６７７５株などが挙げられ、これらの株は公知のものである。これらの変異株もまた使用され得る。ここで、ＩＦＯは財団法人発酵研究所の保存株であることを示し、ＯＵＴは大阪大学大学院工学研究科応用生物工学専攻の保存株であることを示す。ＡＴＣＣは、アメリカンタイプカルチャーコレクションへの寄託により指定された番号である。これらの菌株は、上記施設より、制限されることなく容易に入手可能である。
【００２６】
本発明者が豆腐ようより新たに単離した、赤色色素を生産するカビに、ＵＶ変異処理を施して得られた、高濃度のモナコリンＫを生産可能なバシペトスポラ属（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）２４０４株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１９１０９号；平成１４年１１月２１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより受託証が発行された）もまた、本発明に用いることができる。本菌株は、エヌシーアイエムビー・ジャパン社において、２８ＳｒＤＮＡ−５００塩基配列解析及び形態学的観察により、完全世代名モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）の分生子世代であるバシペトスポラ属（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）と同定された。本菌株の寒天培地上の形態は、通常は白色もしくは淡赤色である。本菌株は、顕微鏡下で短少な連鎖状の分生子を有する。本菌株の分類学上の位置は、子嚢菌である。上述したように、本菌株は、子嚢菌亜門ベニコウジカビ科（Ｍｏｎａｓｃａｃｅａｅ）に属するモナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）の分生子世代であるＢａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａｓｐ．に属する。この菌株は、分生子嚢の形成が確認されず、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属の閉子嚢核の形成能が欠損した株であると推定される。本菌株の最適生育条件は、ｐＨ５．６±０．２、２５℃である。本菌株の生育の範囲は、ｐＨ４〜８、２０〜３０℃である。なお、本菌株は、１２１℃で１５分間殺菌したＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ（Ｂａｃｔｏ）２１３４００培地（組成は、１リットル当り、Ｐｏｔａｔｏｅｓ澱粉（ｉｎｆｕｉｏｎｆｒｏｍ）２００ｇ、ＢａｃｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅ２０．０ｇ、ＢａｃｔｏＡｇａｒ１５．０ｇ）でｐＨ５．６±０．２にて２５℃、７日間培養する条件下で生存していた。本菌株は、好気性である。本菌株は、下記の実施例に示されるように、モナコリンＫを含有することが従来知られていたモナスカス属の菌株に比較して、より多くのモナコリンＫを生産する。
【００２７】
本発明において「おから」とは、大豆を摩砕し加熱した後、豆乳を絞りとった残り（絞りカス）である。おからは、大豆から豆腐および豆乳を製造する際の副産物として得られ得る。大豆を加工する際に生じ得、これまで廃棄物として処理されてきたおからを利用することもまた可能である。おからには、大豆の皮、胚芽部分のような繊維質、大豆由来のタンパク質および脂質、ならびに大豆の皮および胚芽部分に含まれる微量成分が含まれ得る。本発明の製造方法においては、当然ながら水分を多量に含んだおからだけではなく、保存性の点を考慮し、おからを加熱乾燥、減圧乾燥及び凍結乾燥等、通常考え得る手段で予め乾燥したものを用いてもよい。おからは、タンパク質、食物繊維、ミネラル(カルシウム、カリウム、マグネシウム、鉄、銅、ナトリウムを含む）、およびビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＣを含む）を含み、生理活性物質としてイソフラボン、サポニンなどを含む。
【００２８】
本発明の方法においては、紅麹菌は、おからを分散させた液体培地を使用して培養される。液体培地中のおからの含有量は、液体培地中に菌体がうまく分散するのに適切な量であることが望まれる。好ましくは、液体培地は、約１重量％を超える濃度のおからを含む。例えば、１０５℃で３時間乾燥させた乾燥おからの場合、液体培地中の含有量は、液体培地１リットル当たり１０ｇを超えることが望ましい。
【００２９】
本発明の方法において使用される培地中のおから以外の成分は、一般的に紅麹菌の培養に用いられ得るものであれば、特に限定されない。このような成分としては、紅麹菌が資化できる炭素源、窒素源および無機塩；有機性の微量栄養素；発育促進物質などが挙げられる。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、マンノース、ラクトース、デンプン、糖蜜、ホエー、グリセリン、ソルビトールなどが用いられ得る。窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機塩、および尿素が用いられ得る。紅麹菌の生育を促進するために、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーン・スティープ・リカー、カゼイン分解物、アミノ酸などの有機窒素源が、培地成分として添加され得る。リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛などの化合物もまた、培地に添加され得る。これらの成分の含有量は、紅麹菌を培養するのに通常用いられ得る量であり、このような含有量は、当業者によって適宜決定される。
【００３１】
本発明の方法において用いられる培養は、懸濁培養が好ましく、通常当業者によって行われ得る旋回、振盪、通気などの処理が施され得る。通常、深部通気撹拌培養の方法が用いられ得る。好気的条件であることが望ましい。培養または培地滅菌中で消泡を必要とする場合には消泡剤（例えば、シリコーンオイル、界面活性剤）を使用してもよい。本実施例では回転型培養装置が用いられているが、これに限定されない。本発明の方法では、工業的規模で培養に使用されるいかなる装置もまた使用され得る。培養に用いられる装置は市販により入手可能である。
【００３２】
本発明における紅麹菌の培養は、ｐＨ４付近から８付近までの中性ないしは酸性の培地の液性において実施可能である。より好ましくは、ｐＨは、４．０〜５．５であり、さらに好ましくは、ｐＨは、４．５〜５．０である。培養温度は、１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃に保つのが望ましい。培養日数は、上記のような条件下で、通常、２日〜１５日間、好ましくは、５日〜８日間である。
【００３３】
上述のようにして培養した紅麹菌培養物は、モナコリンＫの含量が著しく高い。ここで、「紅麹菌培養物」とは、おからを分散させた培養液に培養紅麹菌が懸濁した溶液を指す。従って、本明細書中では、このような紅麹菌培養物がモナコリンＫを多く含むため、本明細書においては「モナコリンＫ含有組成物」とも称する。モナコリンＫは、ヒドロキシアシド型とラクトン型との２種類がある。モナコリンＫは、中性物質で、中性、酸性の水には溶けないが、通常のアルカリ処理により酸性物質に変換し、水に転溶する。上述のような培養により得られる紅麹菌培養物においては、培養された紅麹菌が産生したモナコリンＫの大半が、培養液中に流出して存在し得る。
【００３４】
上記紅麹菌培養物はまた、失活物、乾燥物、乾燥粉砕物、濃縮物、濃縮液乾燥物、抽出エキス、抽出エキス濃縮物、抽出エキス粉末などに加工して用いられ得る。上記紅麹菌培養物は、菌体および酵素を失活させて失活物とし得る。上記紅麹菌培養物を、常法（例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥など）により乾燥させ、所望であれば粉砕して乾燥物または乾燥粉末とすることができる。また、上記紅麹菌培養物またはその乾燥物もしくは乾燥粉末を、常法により溶媒（例えば、含水アルコール）を用いて抽出し、所望により濃縮および／または乾燥して濃縮エキスまたは粉末状のエキスとすることもできる。このように紅麹菌培養物を加工して得られるいかなる製品（以下、「加工物」とも称する）もまた「モナコリンＫ含有組成物」の定義内に含まれる。
【００３５】
本発明により得られる紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）は、紅麹の利用法として公知のすべての用途に利用できる。例えば、醸造食品の原料としての使用が可能である。日本における清酒、焼酎、泡盛、味醂、甘酒、白酒、食酢、醤油、味噌の製造；なす、大根、白菜、かぶなどの野菜類の漬物の製造；いか、かつおなどの魚介類の塩類および漬物類の製造；および中国、台湾、香港などの他のアジア諸国の伝統食品である白酒（こうりやん酒など）、黄酒（紹興酒、紅露酒など）、豆腐乳、獣肉の漬物類、ソーセージなどの製造などに使用され得る。また、発酵法などによるアルコールの製造においても使用され得る。
【００３６】
本発明により得られる紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）はまた、医薬の分野においても、本来の紅麹の効果を期待された用途において使用できる。例えば、本発明の紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）は、紅麹によって奏される効果である血中コレステロール値を低下させる効果のために利用される。本発明の紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）は、消化促進および血行改善を目的とする漢方生薬として利用できる。また、本発明の紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）は、血中コレステロール低下作用を利用して、抗脂血症薬、抗動脈硬化薬などのような医薬組成物に含有されてもよい。
【００３７】
上記紅麹菌培養物およびその加工物（モナコリンＫ含有組成物）は、以下の実施例に記載されるように、おからに由来する生理活性物質を含む。このような生理活性物質としては、イソフラボン、サポニンなどが挙げられる。本紅麹菌培養物において生成されるイソフラボンは、ヒトによってより吸収されやすいアグリコンの形態であり得る。イソフラボンは、女性ホルモンの一種であるエストロゲンと構造が似ており、代替ホルモンとして作用し得るため、細胞の癌化抑制、癌細胞の増殖緩和、骨粗しょう症の緩和、更年期障害の抑制のために使用され得る。サポニンは、肝機能改善、免疫強化、血圧降下、血中コレステロールの低下の作用を有することが知られている。
【００３８】
本発明においてはまた、上記培養によって得られた紅麹菌培養物から紅麹菌体を取り除いた紅麹菌培養液もまた有用である。紅麹菌体の除去のためには、濾過、遠心分離などの当該分野で周知の方法が使用され得る。上述したように、紅麹菌を除いた紅麹菌培養液においてもモナコリンＫが存在する。従って、このような紅麹菌培養液もまた「モナコリンＫ含有組成物」の定義内に含まれる。この紅麹菌培養液は濃縮されて、モナコリンＫを含有する濃縮液を生成し得る。さらに、この濃縮液が乾燥されて、乾燥粉末とすることもできる。従って、「モナコリンＫ含有組成物」には、紅麹菌培養物から紅麹菌体を取り除いた紅麹菌培養液、この紅麹菌培養液を濃縮して生成したモナコリンＫ含有濃縮液、およびこの紅麹菌培養液から乾燥によって生成した乾燥粉末もまた包含され得る。上記紅麹菌培養液およびその加工物（その濃縮液および乾燥粉末を含む）は、モナコリンＫが有する活性を利用する組成物中に含ませることができる。モナコリンＫは血中のコレステロール値を低下させる作用を有するので、上記紅麹菌培養液およびその加工物（その濃縮液および乾燥粉末を含む）は、例えば、抗脂血症薬、抗動脈硬化薬などのような医薬組成物に含有され得る。
【００３９】
このような医薬組成物は、経口的に、カプセル剤、錠剤などの形態で投与することができる。このような医薬組成物は、製薬の分野で周知の様式で作製される。このような処方物は、好ましくは、カプセル化され、そして固体投薬形態で適切なキャリアと共に処方される。適切なキャリア、賦形剤、および希釈剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアレート、水、鉱油などが挙げられる。処方物は、滑沢剤、湿潤剤、乳化および懸濁剤、保存剤、甘味剤、または矯味矯臭剤をさらに含み得る。組成物は、当該分野で周知の手順を用いることによって、患者に投与された後の活性成分の迅速な、持続性の、または遅延した放出を提供するように処方され得る。処方物はまた、タンパク質分解性分解を減少させ、そして吸収を促進する物質（例えば、界面活性剤など）を含み得る。
【００４０】
キャリアはまた、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、滅菌度、安定性、溶解速度、または処方物の臭いを調節または維持するための他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位投薬量もしくは多回用量形態のいずれかの非経口投与のために、投薬を処方するために通常そして慣用的に用いられる物質である。用量投与は、投薬処方物の薬物動態学的パラメータおよび使用される投与経路に依存して繰り返され得る。
【００４１】
特定の用量は、投与される個体のおおよその体重もしくは体表面積、または占められる身体空間の容積に従って算出される。用量はまた、選択される特定の投与経路に依存して算出され得る。処置の適切な投薬量を決定するために必要な算出のさらなる改善は、当業者によって慣用的に行われる。正確な投薬量は、標準的な用量応答研究に関連して決定される。実際に投与される組成物の量が、関連する状況（処置されるべき状態、投与されるべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重篤度、ならびに選択される投与経路を含む）を考慮して、実施者によって決定されることが理解される。
【００４２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００４３】
【実施例】
（実施例１）
グリセリン７０ｇ、予め１０５℃で３時間乾燥されたおから３０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン８ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硝酸ナトリウム２ｇをイオン交換水に溶かし１Ｌとし、その１００ｍｌづつ５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で３０分間殺菌を行い培地とした。対照として、乾燥おからの代わりに、脱脂大豆粉３０ｇを添加したもの、米ぬか３０ｇを添加したもの、赤ふすま３０ｇを添加したもの、及びふすま３０ｇを添加したものについてもまた、同様の方法で行った。次いで、予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したモナスカスピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株の菌体１白金耳分を培地に接種し、ロータリーシェーカー上、回転数毎分２００回転、培養温度２５℃で６日間培養を行った。培養開始のｐＨは、４．５〜５．５であった。培養終了後、自然濾過によって菌体を取り除き、得られた濾液に０．１５規定の水酸化ナトリウムを等量加えて加水分解した。得られたモナコリンＫのヒドロキシアシド体を高速液体クロマトグラフィーにて分析、定量した。なお分析方法については、文献（薬剤学，５８（４），１９４−２０２（１９９８））の方法に準拠した。
【００４４】
高速液体クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである：
カラム：資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＣＣ_１８
キャリアー液：０．０５モルリン酸／アセトニトリル＝４０／６０
温度：４０℃
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２３８ｎｍ
【００４５】
【表１】

結果を表１に示す。この表１より、乾燥おからを添加した液体培地で培養した場合、他の場合（脱脂大豆粉、米ぬか、あかふすま、およびふすま添加）に比較して、紅麹菌は、モナコリンＫを著しく産生した。
【００４６】
（実施例２）
グリセリン７０ｇ、予め１０５℃で３時間乾燥されたおから３０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン８ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硝酸ナトリウム２ｇをイオン交換水に溶かし１Ｌとし、その１００ｍｌづつ５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で３０分間殺菌を行い培地とした。なお対照として、乾燥おからの替わりに脱脂大豆粉３０ｇ添加したものについて同様の方法で行った。次いで、予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したモナスカスピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株、同ＩＦＯ４４８０株、同ＩＦＯ４５３７株、及びバシペトスポラ（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）属２４０４株の各菌体１白金耳分をそれぞれの培地に接種し、ロータリーシェーカー上、回転数毎分２００回転、培養温度２５℃で６日間培養を行った培養開始のｐＨは、４．５〜５．５であった。培養終了後、実施例１と同様の方法で分離、分析した。
【００４７】
【表２】

結果を表２に示す。この表２より、いずれの菌株も、乾燥おからを添加した液体培地で培養した場合、脱脂大豆粉に比較して、モナコリンＫを多く産生した。
【００４８】
（実施例３）
グリセリン２０ｇ、予め１０５℃で３時間乾燥されたおから２０ｇ、グルコース３０ｇ、ミーストＰ１Ｇ５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硝酸ナトリウム２ｇをイオン交換水に溶かし１Ｌとし、ｐＨを硝酸又は水酸化ナトリウムにて、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０に調整した。その１００ｍｌづつ５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で３０分間殺菌を行い培地とした。次いで、予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したモナスカスピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株をそれぞれの培地に接種し、ロータリーシェーカー上、回転数毎分２００回転、培養温度２５℃で８日間培養を行った。培養終了後、実施例１と同様の方法で分離、分析した。
【００４９】
【表３】

結果を表３に示す。この表３より、殺菌前ｐＨが４．０から８．０のいずれの場合においても、モナコリンＫが良好に産生されたことが分かった。ｐＨ４．０から５．５の酸性の場合にはより良好であった。
【００５０】
（実施例４）
グリセリン２０ｇ、グルコース３０ｇ、ミーストＰ１Ｇ５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硝酸ナトリウム２ｇをイオン交換水に溶かし１Ｌとした。その１００ｍｌづつ５００ｍｌ容三角フラスコに分注した後、予め１０５℃で３時間乾燥されたおから５ｇ、１０ｇ、２０ｇ又は３０ｇを添加し、１２１℃で３０分間殺菌を行い培地とした。次いで、予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したモナスカスピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株をそれぞれの培地に接種し、ロータリーシェーカー上、回転数毎分２００回転、培養温度２５℃で８日間培養を行った。培養開始のｐＨは、４．５〜５．５であった。培養終了後、実施例１と同様の方法で分離、分析した。この結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】

培養の結果、おから添加量１０ｇ／Ｌ以下では菌体がうまく分散しないため生育できず、モナコリンＫも生産されなかった。
【００５２】
（実施例５）
モナスカスピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株を実施例１と同様の方法で振とう培養したものを、１５Ｌ中にグリセリン１５０ｇ、予め１０５℃で３時間乾燥されたおから３００ｇ、含水グルコース４９５ｇ、ミーストＰ１Ｇ７５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１５ｇ、硝酸ナトリウム３０ｇを仕込んだ３０Ｌ容のジャーファーメンターに５％の割合で植菌し、通気量７．５Ｌ／分、撹拌２００ｒ．ｐ．ｍ．、温度２５℃にて１６２時間培養した。培養開始のｐＨは、４．５〜５．５であった。培養終了後、遠心分離し培養濾液を得た。この培養濾液のモナコリンＫ含量（ヒドロキシアシド体として）は９０．９ｐｐｍであった。この培養濾液をロータリーエバポレーターにて７．５倍に濃縮し、この濃縮液に賦形剤としてデキストリン（塩水港精糖株式会社製）を等量加えた後スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥した。この乾燥品のモナコリンＫ含量（ヒドロキシアシド体として）は２７７ｍｇ／１００ｇであった。
【００５３】
（比較例１）
おからを固体培養の培地原料と使用した場合について、モナコリンＫの生産能力があるかどうか試みた。簡潔には、水分量６４〜７７％に調整し、１２１℃で２０分間煮沸滅菌したおからを固形培地として用いた。この固形培地に、実施例１と同様に予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したモナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＩＦＯ４５２０株の菌体１白金耳分を接種した。これを２５〜３０℃で９日間培養した。培養終了後、培養した紅麹菌を１０倍量の６０％エタノールを加え、攪拌しながら３０分間抽出した。この抽出液を高速液体クロマトグラフィーにかけ、モナコリンＫ含量を測定した。ところが固体培養においては、胞子の形成が確認され赤色色素の生産は認められたが、モナコリンＫは全く生産されなかった。
【００５４】
（実施例６）
本実施例では、おからを分散させた液体培地で培養した紅麹菌培養物が、おからに由来する成分を含有するか否かを調べた。
【００５５】
予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したバシペトスポラ（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）属２４０４株の菌体を、実施例１に記載の同じ組成のおからを含む培地において、実施例１と同様にして培養した。得られた紅麹菌培養物を、以下の成分に関して分析した：リン脂質（ステアロ・オレオ・レシチンとして）、および、ダイジン、ダイゼイン、ゲニスチン、およびゲニステインのようなイソフラボン化合物の含量。リン脂質の定量は、基準油脂分析試験法（日本油化学会編）に準じて試験した。イソフラボン化合物に関しては常法に従って、ダイジンを液体クロマトグラフ−質量分析法を用いて、ダイゼイン、ゲニスチン、およびゲニステインを高速液体クロマトグラフ法を用いて測定した。その結果、紅麹菌培養物より、リン脂質（ステアロ・オレオ・レシチンとして）１３ｍｇ／１００ｇ、ダイゼイン１２ｍｇ／１００ｇ、およびゲニステイン１０ｍｇ／１００ｇが検出された。ダイジンおよびゲニスチンは、０．５ｍｇ／１００ｇの検出限界においては検出されなかった。従って、これらの結果から、紅麹菌培養物は、ダイジンおよびゲニスチンのようなイソフラボン配糖体よりもむしろ、ダイゼインおよびゲニステインのようなイソフラボンアグリコンを多く含むことが分かった。
【００５６】
（実施例７）
本実施例においてもまた、おからを分散させた液体培地で培養した紅麹菌培養物が、おからに由来する成分を含有するか否かを調べた。
【００５７】
予めＰＤＡ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したバシペトスポラ（Ｂａｓｉｐｅｔｏｓｐｏｒａ）属２４０４株の菌体を、実施例１に記載の同じ組成のおからを含む培地において、実施例１と同様にして培養した。培養物約５ｇを量りとり、水１０ｍｌを添加して振り混ぜた。次いで、これにメタノール１００ｍｌを添加し、加熱還流抽出を行った。冷却後濾過（Ｎｏ２．［東洋濾紙株式会社］）し、濾液を濃縮乾固した。得られた残留物に水１０ｍｌ、１０％塩化第二鉄溶液１ｍｌおよび水飽和ブタノール５０ｍｌを添加して振とうした。ブタノール層を分取し、これを水で洗浄し、次いで濃縮乾固した。得られた残留物をメタノール１０ｍｌに溶解し、これを試料溶液とした。この試料溶液を２０μｌについて以下の条件で薄層クロマトグラフィーを行った。対照として、サポニン（大豆製）［和光純薬工業株式会社］を用いた：
薄層板：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ_２５４ＨＰＴＬＣ（１．０５６４２［Ｅ．Ｍｅｒｃｋ］）
展開溶媒：クロロホルム、メタノールおよび水の混液（６：４：１）
検出方法：１０％硫酸を噴霧後、１２０℃で５分間加熱。
【００５８】
この結果を図１に示す。図１中、右側のレーンに紅麹菌培養物の結果を示し、左側のレーンはコントロールレーン（大豆サポニン）である。試料溶液中において、コントロールレーンと同様に、サポニンに特有な発色（硫酸により赤紫色を呈する）を示すスポットが認められた。この結果は、おからを分散させた液体培地で培養した紅麹菌培養物がサポニンを含有することを示す。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、モナコリンＫのような生理活性物質を著しく多く産生できる紅麹菌培養物およびその製造方法、ならびにモナコリンＫを含有する組成物、おからに由来する生理活性物質を含む紅麹菌培養物、および高濃度のモナコリンＫを生産可能な新規なバシペトスポラ株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】紅麹菌培養物がサポニンを含むか否かを調べた薄層クロマトグラフィーの結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a culture of red yeast that contains a large amount of monacolin K, which is a cholesterol-lowering substance, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Sockeye salmon is a persimmon made by breeding Monascus strains on starchy substances such as cereals, and has the characteristic of producing red pigment. It is widely used as a raw material for brewed foods such as Tofuyo, which is a special product of Okinawa, and in Hong Kong and China, in the production and processing of foods, and in the production of natural pigments.
[0003]
Since ancient times, red yeast rice has been used as a herbal medicine that promotes digestion and improves blood circulation. It was discovered that a certain fungus of this red potato produces monacolin K, which is a cholesterol-lowering substance (Japanese Patent Publication No. 59-25599 (Patent Document 1)). (Japanese Patent Publication No. 60-44914 (Patent Document 2)). In order to enhance this effect, studies have been made on improving the monacholine content of red yeast rice (JP 2000-106834 (Patent Document 3), JP 2000-106835 (Patent Document 4)). These methods are in traditional solid culture. In liquid culture that is inexpensive and capable of large-scale culture, little knowledge has been obtained about improving the content of monacolin K. In addition, using okara as a raw material for liquid culture compared to adding other raw materials normally used as raw materials for solid media such as rice bran and bran to solid media. Has not been found to significantly increase monacholine K production.
[0004]
Okara has traditionally been used as a by-product in the production of tofu and soymilk, such as simmered foods and feed, but it is currently treated as industrial waste. is there. However, in recent years, the nutritional value of okara such as dietary fiber, isoflavone, and saponin has begun to attract attention, and adding some added value to okara is from the viewpoint of recycling and recycling industrial waste Is also meaningful.
[0005]
For a combination of culture of red koji mold and okara, a method for producing a fermented feed (Japanese Patent Laid-Open No. 62-143646 (Patent Document 5)) and a method for treating a high-concentration distillation waste solution accompanying the production of alcohols (Japanese Patent Laid-Open No. 2001) -232389 (patent document 6)). The former uses the anti-corrosion action of red yeast rice to prevent the decay of protein materials or starchy materials that are discarded or have extremely low utility value, such as okara, and are appropriately digested and decomposed. It is for the purpose. The latter is a method for effectively using the cells produced when using red koji molds for the treatment of high-concentration distillates associated with alcohol production, and producing koji mold by inoculating okara. It is for the purpose. Therefore, the combination of the culture of red koji mold and okara disclosed in Patent Document 5 and Patent Document 6 is not provided for edible use, and also enhances the physiological activity ability of koji mushrooms by contributing to health promotion. It is not intended to be.
[0006]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-288 (Patent Document 7) discloses isoflavones by inoculating soybeans, soybean hypocotyls, or processed soybeans containing isoflavone glycosides with koji molds and making koji. A method for producing an aglycon is disclosed. In Patent Document 7, it is described that the isoflavone glycoside can be decomposed into an isoflavone aglycone by inoculating soybean or soybean hypocotyl, which is a raw material containing the isoflavone glycoside, with red yeast.
[0007]
However, in any of the prior art documents, okara is liquid compared to the addition of raw materials normally used as raw materials for solid media, such as other soybean-derived substances, rice bran, and bran. It has not been found that by using it as a culture medium material for cultivation, the production of physiologically active substances caused by okara or koji mold is improved, and in particular, the production amount of monacolin K is remarkably increased.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No.59-25599
[0009]
[Patent Document 2]
Japanese Examined Patent Publication No. 60-44914
[0010]
[Patent Document 3]
JP 2000-106834 A
[0011]
[Patent Document 4]
JP 2000-106835 A
[0012]
[Patent Document 5]
Japanese Patent Laid-Open No. 62-143646
[0013]
[Patent Document 6]
Japanese Patent Laid-Open No. 62-143646
[0014]
[Patent Document 7]
Japanese Patent Laid-Open No. 2002-288
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a red yeast koji culture capable of producing a significantly large amount of a physiologically active substance such as monacolin K and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a red koji mold culture containing a physiologically active substance derived from okara. Another object of the present invention is to provide a novel Basipetospora strain capable of producing a high concentration of monacolin K.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors replaced the cereals such as rice, which has been mainly used as a medium for cultivating red koji molds, by cultivating red koji molds by dispersing okara in a liquid medium. It was found that the active substance monacolin K could be remarkably produced and the present invention was completed.
[0017]
Accordingly, in one aspect of the present invention, there is provided a method for producing a monacolin K-containing composition, comprising the step of cultivating red koji mold in a liquid medium in which okara is dispersed.
[0018]
In one embodiment, the red koji mold is a strain belonging to the family Monascaceae.
[0019]
In a further embodiment, the Monascus is a strain belonging to the genus Monascus or Basipetospora.
[0020]
In yet a further embodiment, the red yeast is Monascus pilosus (IFO 4520), Monascus pilosus (IFO 4480), Monascus pilosus (IFO 4537) and pos Bato p. It is a strain selected from the group consisting of (Patent Organism Depositary Accession No. FERM-P-19109).
[0021]
In one embodiment, the liquid medium includes a fortified concentration of greater than about 1% by weight.
[0022]
In one embodiment, the method of the present invention further includes the step of removing the aforementioned koji mold.
[0023]
In another aspect of the present invention, a monacolin K-containing composition produced by the above method is also provided.
[0024]
In still another aspect of the present invention, Basipetospora strain 2404 (patent biological deposit center accession number FERM-P-19109) capable of producing a high concentration of monacolin K is also provided.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As the red koji mold that can be used in the present invention, it belongs to the family Monascaceae, and preferably belongs to the genus Monascus and the genus Basipetospora, and any strain that has the ability to produce monacholine K can be used. There may be. Examples of such strains include Monascus pilosus (IFO4520 strain, IFO4480 strain, IFO4537 strain), Monascus pubigerus (OUT2015 strain), Monascus paxii (Monascus paxi8 strain) Monascus rubber (patent biological deposit center deposit number FERM-P-4822, IFO9203 strain, ATCC13692 strain, ATCC15670 strain, ATCC16240 strain, ATCC16366 strain, ATCC16384 strain), Monascus vitreus strain (Monascus vitro37 strain) , IFO4532), Monascus Purpleus (Mo nascuspurpureus) (ATCC16385 strain, ATCC16386 strain, ATCC16436 strain), Monascus rubropuncutatus (ATCC16368 strain), and Monascus genus ATCC16370, 16433, 16634, 16773, 167716, 7577, etc. These strains are known. These mutant strains can also be used. Here, IFO indicates that it is a conserved strain of the Fermentation Institute, and OUT indicates that it is a conserved strain of the Graduate School of Engineering, Osaka University. The ATCC is a number designated by the deposit to the American Type Culture Collection. These strains can be easily obtained from the above facilities without limitation.
[0026]
Basipetospora 2404 strain (patented organism) capable of producing a high concentration of monacolin K obtained by subjecting mold newly produced from tofu to a red pigment-producing fungus to UV mutation Deposit Center Deposit Number FERM-P-19109; Deposit Certificate issued by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Deposit Center on November 21, 2002) can also be used in the present invention. This strain was identified as a conidia generation of the complete generation name Monascus by the basic genera Monascus by analyzing the nucleotide sequence of 28S rDNA-500 and morphological observation at NCB Japan. The form of the strain on the agar medium is usually white or light red. This strain has short chained conidia under a microscope. The taxonomic position of this strain is Ascomycetes. As described above, the present strain is identified as Basipetosporia sp., Which is a conidial generation of the genus Monascus belonging to the family Ascomycota Monascaceae. Belonging to. This strain is presumed to be a strain in which the formation of conidial sac is not confirmed, and the ability to form a closed sac nucleus of the Monascus genus is deficient. The optimum growth conditions for this strain are pH 5.6 ± 0.2 and 25 ° C. The range of growth of this strain is pH 4-8, 20-30 ° C. In addition, this strain is Potato Dextrose Agar (Bacto) 213400 medium sterilized at 121 ° C. for 15 minutes (composition is 200 g of Potatoes starch (infection from), 20.0 g of Bacto Dextrose, 15.0 g of Bacto Agar). It survived under conditions of culturing at 25 ° C. for 7 days at pH 5.6 ± 0.2. This strain is aerobic. As shown in the examples below, this strain produces more monacolin K compared to the strain of the genus Monascus, which was conventionally known to contain monacolin K.
[0027]
In the present invention, “okara” is a residue (squeezed residue) obtained by squeezing soy milk after grinding and heating soybeans. Okara can be obtained as a by-product in producing tofu and soy milk from soybeans. It is also possible to make use of okara, which can occur when processing soy and has been treated as waste. Okara may contain soybean skin, fibers such as germ parts, soy-derived proteins and lipids, and trace components contained in soybean skin and germ parts. In the production method of the present invention, naturally, not only okara containing a large amount of moisture, but also in consideration of storage stability, okara is dried in advance by means that can be considered normally, such as heat drying, vacuum drying and freeze drying. You may use what you did. Okara contains protein, dietary fiber, minerals (including calcium, potassium, magnesium, iron, copper, sodium), and vitamins (including vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, niacin, vitamin C) and bioactivity Substances include isoflavones and saponins.
[0028]
In the method of the present invention, the koji mold is cultured using a liquid medium in which okara is dispersed. It is desirable that the amount of okara contained in the liquid medium is an appropriate amount for the cells to be well dispersed in the liquid medium. Preferably, the liquid culture medium comprises okara at a concentration greater than about 1% by weight. For example, in the case of dried okara dried at 105 ° C. for 3 hours, the content in the liquid medium is desirably more than 10 g per liter of the liquid medium.
[0029]
Ingredients other than okara in the medium used in the method of the present invention are not particularly limited as long as they can generally be used for cultivation of red yeast. Examples of such components include carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts that can be assimilated by red yeast, organic micronutrients, growth promoting substances, and the like.
[0030]
As the carbon source, glucose, sucrose, fructose, mannose, lactose, starch, molasses, whey, glycerin, sorbitol and the like can be used. As the nitrogen source, inorganic salts such as ammonium salts and nitrates, and urea can be used. In order to promote the growth of red koji mold, organic nitrogen sources such as yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, casein degradation product and amino acid can be added as a medium component. Compounds such as phosphoric acid, potassium, sodium, magnesium, manganese, zinc can also be added to the medium. The content of these components is an amount that can be normally used for cultivating red koji mold, and such content is appropriately determined by those skilled in the art.
[0031]
The culture used in the method of the present invention is preferably a suspension culture, and can be subjected to treatments such as swirling, shaking, and aeration that can be usually performed by those skilled in the art. Usually, the method of deep aeration stirring culture can be used. Aerobic conditions are desirable. If defoaming is required during culture or medium sterilization, an antifoaming agent (eg, silicone oil, surfactant) may be used. In this embodiment, a rotary culture apparatus is used, but the present invention is not limited to this. Any apparatus used for culturing on an industrial scale can also be used in the method of the invention. The apparatus used for culture is commercially available.
[0032]
The culture of the koji mold in the present invention can be carried out in a neutral or acidic medium from pH 4 to pH 8. More preferably, the pH is 4.0 to 5.5, and still more preferably the pH is 4.5 to 5.0. The culture temperature is desirably maintained at 15 ° C to 35 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C. The culture days are usually 2 to 15 days, preferably 5 to 8 days, under the conditions as described above.
[0033]
The Monascus fungus culture cultured as described above has a significantly high content of monacolin K. Here, the “monas bacterium culture” refers to a solution in which cultured gonococcus is suspended in a culture solution in which okara is dispersed. Therefore, in the present specification, such a Monascus fungus culture contains a large amount of monacolin K, and is also referred to as a “monacolin K-containing composition” in the present specification. Monacolin K has two types, a hydroxyacid type and a lactone type. Monacholine K is a neutral substance that does not dissolve in neutral or acidic water, but is converted into an acidic substance by ordinary alkali treatment and dissolved in water. In the Monascus fungus culture obtained by culturing as described above, most of the monacolin K produced by the cultured Monascus fungus can flow out into the culture solution.
[0034]
The above-mentioned koji mold culture can also be used after being processed into a deactivated product, dried product, dried pulverized product, concentrate, dried concentrate, extract extract, extract extract concentrate, extract extract powder and the like. The above-mentioned red koji mold culture can be inactivated by inactivating the cells and enzymes. The above culture of koji mold can be dried by a conventional method (for example, spray drying, freeze drying, etc.) and, if desired, pulverized to obtain a dried product or a dried powder. Further, the above koji mold culture or a dried or dried powder thereof is extracted using a solvent (for example, hydrous alcohol) by a conventional method, and concentrated and / or dried as desired to obtain a concentrated extract or a powdery extract. You can also. Any product thus obtained by processing the koji mold culture (hereinafter also referred to as “processed product”) is also included in the definition of “monacolin K-containing composition”.
[0035]
The koji mold culture obtained by the present invention and the processed product thereof (monacolin K-containing composition) can be used for all uses known as a method for using koji. For example, it can be used as a raw material for brewed foods. Production of sake, shochu, awamori, miso, amazake, white sake, vinegar, soy sauce, miso in Japan; production of pickles of vegetables such as eggplant, radish, Chinese cabbage, turnip; salt and pickles of seafood such as squid and bonito And other traditional foods from other Asian countries such as China, Taiwan, Hong Kong, white liquor (such as Koryan sake), yellow liquor (such as Shaoxing liquor, red dew liquor), tofu milk, pickled meats, sausages, etc. Can be used. It can also be used in the production of alcohol by fermentation or the like.
[0036]
The red yeast koji culture obtained by the present invention and the processed product thereof (monacolin K-containing composition) can also be used in the field of medicine where the effect of the original red koji is expected. For example, the koji mold culture of the present invention and the processed product thereof (monacolin K-containing composition) are used for the effect of lowering blood cholesterol level, which is an effect exhibited by koji. The koji mold culture and the processed product thereof (monacolin K-containing composition) of the present invention can be used as a herbal medicine for the purpose of promoting digestion and improving blood circulation. Further, the red yeast koji culture and the processed product thereof (monacolin K-containing composition) of the present invention can be used as a pharmaceutical composition such as an antilipidemic agent or an anti-atherosclerotic agent by utilizing the blood cholesterol lowering action. It may be contained.
[0037]
The above described red koji mold culture product and processed product thereof (monacolin K-containing composition) contain a physiologically active substance derived from okara as described in the following examples. Examples of such physiologically active substances include isoflavones and saponins. The isoflavones produced in the present red koji mold culture can be in the form of aglycone that is more readily absorbed by humans. Isoflavone is similar in structure to estrogen, a female hormone, and can act as an alternative hormone, so it can suppress canceration of cells, reduce proliferation of cancer cells, alleviate osteoporosis, and suppress climacteric disorder Can be used. Saponins are known to have effects of improving liver function, enhancing immunity, lowering blood pressure, and lowering blood cholesterol.
[0038]
In the present invention, a red koji mold culture solution obtained by removing red koji molds from the koji mold culture obtained by the above culture is also useful. For the removal of red yeast cells, methods well known in the art such as filtration and centrifugation can be used. As described above, monacholine K is also present in the culture solution of the koji mold excluding koji mold. Accordingly, such a koji mold culture solution is also included in the definition of “monacolin K-containing composition”. This red koji mold culture can be concentrated to produce a concentrate containing monacolin K. Furthermore, this concentrated liquid can be dried to form a dry powder. Therefore, the “monacolin K-containing composition” includes a red yeast strain culture solution obtained by removing red yeast cells from a red yeast strain culture, a monacolin K-containing concentrate formed by concentrating the red yeast strain culture solution, and the red yeast strain culture. A dry powder produced by drying from a liquid may also be included. The above-mentioned koji mold culture solution and processed product thereof (including the concentrated solution and dry powder thereof) can be contained in a composition utilizing the activity of monacolin K. Since Monacolin K has an action of lowering the cholesterol level in blood, the culture solution of the koji mold and its processed product (including its concentrated solution and dry powder) are, for example, antilipidemic agents, antiatherosclerotic agents, etc. Can be contained in a pharmaceutical composition such as
[0039]
Such a pharmaceutical composition can be administered orally in the form of capsules, tablets and the like. Such pharmaceutical compositions are made in a manner well known in the pharmaceutical art. Such formulations are preferably encapsulated and formulated with a suitable carrier in a solid dosage form. Some examples of suitable carriers, excipients, and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, Examples include cellulose, gelatin, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate and propylhydroxybenzoate, talc, magnesium, stearate, water, mineral oil, and the like. The formulations can further include lubricants, wetting agents, emulsifying and suspending agents, preserving agents, sweetening agents or flavoring agents. The composition can be formulated to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a patient by using procedures well known in the art. The formulation may also include substances that reduce proteolytic degradation and promote absorption, such as surfactants.
[0040]
The carrier also contains pH, osmolarity, viscosity, clarity, color, sterility, stability, dissolution rate, or other pharmaceutically acceptable excipients to adjust or maintain the odor of the formulation. May be included. Such excipients are substances commonly and routinely used to formulate dosages for parenteral administration in either unit dosage or multiple dose form. Dosage administration can be repeated depending on the pharmacokinetic parameters of the dosage formulation and the route of administration used.
[0041]
The specific dose is calculated according to the approximate body weight or body surface area of the administered individual, or the volume of body space occupied. The dose can also be calculated depending on the particular route of administration chosen. Further improvements in calculations necessary to determine the appropriate dosage for treatment are routinely performed by those skilled in the art. The exact dosage will be determined in the context of standard dose response studies. The amount of composition actually administered depends on the relevant circumstances (condition to be treated, choice of composition to be administered, individual patient age, weight and response, severity of patient symptoms, and It is understood that it will be determined by the practitioner in consideration of (including the route of administration chosen).
[0042]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to this. Materials, reagents, etc. used in the examples are available from commercial sources unless specified otherwise.
[0043]
【Example】
Example 1
Dissolve 70 g of glycerin, 30 g of okara 30 g previously dried at 105 ° C., 30 g of glucose, 8 g of peptone, 1 g of magnesium sulfate heptahydrate and 2 g of sodium nitrate in ion-exchanged water to make 1 L, and add 100 ml of each to a 500 ml Erlenmeyer flask. The solution was dispensed and sterilized at 121 ° C. for 30 minutes to obtain a medium. As a control, instead of dried okara, 30 g of defatted soybean flour, 30 g of rice bran, 30 g of red bran, and 30 g of bran were used in the same manner. It was. Subsequently, the platinum ear portion of Monascus pilosus strain IFO4520 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days was inoculated into the medium, and the rotation temperature was 200 rpm on the rotary shaker. Culturing was performed at 25 ° C. for 6 days. The pH at the start of the culture was 4.5 to 5.5. After completion of the culture, the cells were removed by natural filtration, and the obtained filtrate was hydrolyzed by adding an equal amount of 0.15 normal sodium hydroxide. The obtained hydroxyacid body of monacolin K was analyzed and quantified by high performance liquid chromatography. In addition, about the analysis method, it conformed to the method of literature (Pharmacology, 58 (4), 194-202 (1998)).
[0044]
The conditions for high performance liquid chromatography are as follows:
Column: CAPCELL PAC C manufactured by Shiseido₁₈
Carrier liquid: 0.05 mol phosphoric acid / acetonitrile = 40/60
Temperature: 40 ° C
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV238 nm
[0045]
[Table 1]

The results are shown in Table 1. According to Table 1, when cultured in a liquid medium supplemented with dried okara, red yeast was significantly more prone to produce monacolin K than in other cases (addition of defatted soy flour, rice bran, red bran, and bran). .
[0046]
(Example 2)
Dissolve 70 g of glycerin, 30 g of okara 30 g previously dried at 105 ° C., 30 g of glucose, 8 g of peptone, 1 g of magnesium sulfate heptahydrate and 2 g of sodium nitrate in ion-exchanged water to make 1 L, and add 100 ml of each to a 500 ml Erlenmeyer flask. The solution was dispensed and sterilized at 121 ° C. for 30 minutes to obtain a medium. In addition, it carried out by the same method about what added 30g of defatted soybean flour instead of dry okara as a control. Next, 1 platinum loop of each cell of Monascus pilosus IFO 4520, IFO 4480, IFO 4537, and Basipetospora 2404 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days. Each culture medium was inoculated and cultured on a rotary shaker at 200 rpm for 6 days at a culture temperature of 25 ° C. The pH at the start of the culture was 4.5 to 5.5. After completion of the culture, separation and analysis were performed in the same manner as in Example 1.
[0047]
[Table 2]

The results are shown in Table 2. From Table 2, all the strains produced more monacolin K when compared to defatted soybean flour when cultured in a liquid medium supplemented with dried okara.
[0048]
(Example 3)
Dissolve 20 g of glycerin, 20 g of okara previously dried at 105 ° C. for 3 hours, 30 g of glucose, 5 g of mist P1G, 1 g of magnesium sulfate heptahydrate and 2 g of sodium nitrate in ion-exchanged water to make 1 L, and adjust the pH to nitric acid or sodium hydroxide Adjusted to 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, or 8.0. Each 100 ml was dispensed into 500 ml Erlenmeyer flasks and sterilized at 121 ° C. for 30 minutes to obtain a medium. Next, Monascus pilosus strain IFO4520 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days is inoculated into each medium, and is rotated on a rotary shaker at 200 rpm for 8 days at a culture temperature of 25 ° C. Culture was performed. After completion of the culture, separation and analysis were performed in the same manner as in Example 1.
[0049]
[Table 3]

The results are shown in Table 3. From Table 3, it was found that monacolin K was produced satisfactorily when the pH before sterilization was 4.0 to 8.0. It was better when the pH was from 4.0 to 5.5.
[0050]
(Example 4)
20 g of glycerin, 30 g of glucose, 5 g of mist P1G, 1 g of magnesium sulfate heptahydrate and 2 g of sodium nitrate were dissolved in ion-exchanged water to make 1 L. After dispensing 100 ml each into a 500 ml Erlenmeyer flask, okara 5 g, 10 g, 20 g or 30 g previously dried at 105 ° C. for 3 hours was added and sterilized at 121 ° C. for 30 minutes to obtain a medium. Next, Monascus pilosus strain IFO4520 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days is inoculated into each medium, and is rotated on a rotary shaker at 200 rpm for 8 days at a culture temperature of 25 ° C. Culture was performed. The pH at the start of the culture was 4.5 to 5.5. After completion of the culture, separation and analysis were performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 4.
[0051]
[Table 4]

As a result of the cultivation, when the added amount of okara was 10 g / L or less, the cells did not disperse well, so that they could not grow, and monacholine K was not produced.
[0052]
(Example 5)
Monascus pilosus IFO4520 strain cultured by shaking in the same manner as in Example 1, 150 g glycerin in 15 L, 300 g oat dried in advance at 105 ° C. for 3 hours, 495 g hydrous glucose, 75 g mist P1G Inoculated at a rate of 5% into a 30 L jar fermenter charged with 15 g of magnesium sulfate heptahydrate and 30 g of sodium nitrate, aeration rate 7.5 L / min, stirring 200 r. p. m. The culture was performed at a temperature of 25 ° C for 162 hours. The pH at the start of the culture was 4.5 to 5.5. After completion of the culture, the mixture was centrifuged to obtain a culture filtrate. The culture filtrate had a monacolin K content (as a hydroxyacid) of 90.9 ppm. The culture filtrate was concentrated 7.5 times with a rotary evaporator, and an equal amount of dextrin (manufactured by Shimizu Minato Sugar Co., Ltd.) as an excipient was added to the concentrated solution, followed by spray drying using a spray dryer. The dried product had a monacolin K content (as a hydroxy acid) of 277 mg / 100 g.
[0053]
(Comparative Example 1)
When okara was used as a medium material for solid culture, an attempt was made to determine whether it has the ability to produce monacolin K. Briefly, okara that was adjusted to a moisture content of 64 to 77% and boiled and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes was used as a solid medium. In the same manner as in Example 1, this solid medium was inoculated with 1 platinum loop of Monascus pilosus strain IFO4520 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days. This was cultured at 25-30 ° C. for 9 days. After completion of the culture, the cultured red koji mold was added with 10 times the amount of 60% ethanol, and extracted for 30 minutes with stirring. The extract was subjected to high performance liquid chromatography to measure the monacolin K content. However, in solid culture, spore formation was confirmed and red pigment production was observed, but no monacolin K was produced.
[0054]
(Example 6)
In this example, it was examined whether or not a red koji mold culture cultured in a liquid medium in which okara was dispersed contains components derived from okara.
[0055]
Bacterial cells of genus Basipetospora 2404 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days are cultured in the same manner as in Example 1 in the medium containing the same composition as described in Example 1. did. The resulting koji mold culture was analyzed for the following components: phospholipid (as stearo-oleo lecithin) and content of isoflavone compounds such as daidzin, daidzein, genistin, and genistein. Phospholipids were quantified in accordance with the standard oil analysis method (edited by the Japan Oil Chemists' Society). Regarding isoflavone compounds, daidin was measured by liquid chromatography-mass spectrometry and daidzein, genistin, and genistein were measured by high-performance liquid chromatography according to conventional methods. As a result, 13 mg / 100 g of phospholipid (as stearo-oleo-lecithin), 12 mg / 100 g of daidzein, and 10 mg / 100 g of genistein were detected from the culture of red yeast. Daidine and genistin were not detected at the detection limit of 0.5 mg / 100 g. Therefore, these results indicate that the yeast strain cultures are rich in isoflavone aglycones such as daidzein and genistein rather than isoflavone glycosides such as daidzin and genistin.
[0056]
(Example 7)
Also in the present example, it was examined whether or not a red koji mold culture cultured in a liquid medium in which okara was dispersed contains components derived from okara.
[0057]
Bacterial cells of genus Basipetospora 2404 previously cultured in a PDA slant medium at 25 ° C. for 3 to 7 days are cultured in the same manner as in Example 1 in the medium containing the same composition as described in Example 1. did. About 5 g of the culture was weighed, and 10 ml of water was added and shaken. Next, 100 ml of methanol was added thereto, and extraction under heating was performed. After cooling, the mixture was filtered (No. 2. [Toyo Roshi Kaisha, Ltd.]), and the filtrate was concentrated to dryness. To the obtained residue, 10 ml of water, 1 ml of 10% ferric chloride solution and 50 ml of water-saturated butanol were added and shaken. The butanol layer was separated and washed with water and then concentrated to dryness. The obtained residue was dissolved in 10 ml of methanol and used as a sample solution. 20 μl of this sample solution was subjected to thin layer chromatography under the following conditions. As a control, saponin (soybean) [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] was used:
Thin layer board: Kieselgel 60F₂₅₄ HPTLC (1.05642 [E. Merck])
Developing solvent: Chloroform, methanol and water mixture (6: 4: 1)
Detection method: Heated at 120 ° C. for 5 minutes after spraying with 10% sulfuric acid.
[0058]
The result is shown in FIG. In FIG. 1, the right lane shows the results of the Monascus fungus culture, and the left lane is the control lane (soybean saponin). In the sample solution, a spot exhibiting a color development peculiar to saponin (presenting reddish purple due to sulfuric acid) was observed as in the control lane. This result shows that a red yeast koji culture cultured in a liquid medium in which okara is dispersed contains saponin.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention, a koji mold culture capable of producing a significantly large amount of a physiologically active substance such as monacolin K, a method for producing the same, a composition containing monacolin K, a koji mold culture containing a physiologically active substance derived from okara, And a novel Basipetospora strain capable of producing high concentrations of Monacolin K.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the results of thin-layer chromatography for examining whether or not a red koji mold culture contains saponin.

Claims

A method for producing a monacolin K-containing composition, comprising a step of cultivating red koji molds in a liquid medium in which okara is dispersed.

The method according to claim 1, wherein the Monascus is a strain belonging to the family Monascaceae.

The method according to claim 3, wherein the Monascus is a strain belonging to the genus Monascus or Basipetospora.

Monascus pilosus (IFO 4520), Monascus pilosus (IFO 4480), Monascus pilosus (IFO 4537), and Bacipetosporas et al. 5. The method according to claim 4, wherein the method is selected from the group consisting of number FERM-P-19109).

The liquid medium, containing okara of concentrations greater than 1% by weight The process of claim 1.

The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising the step of removing the koji mold.

Basipetospora 2404 strain (patent biological deposit center accession number FERM-P-19109) capable of producing a high concentration of monacolin K.