JP3908119B2 - 有機金属錯体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機金属錯体に関し、特に核酸の結合および切断薬として有用な有機金属錯体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを切断し得る遷移金属錯体が、「ケミカルヌクレアーゼ」として広く知られている（Pyle & Barton (1990) Prog. Inorg. Chem. 38: 413、Sigman et al. (1987) Acc. Chem. Res. 26: 98、Stubbe & Kozarich (1987) Chem. Rev. 87: 1107等）。これらの錯体はＤＮＡに強く結合し、ついで種々の条件下でＤＮＡを切断する。例えば、遷移金属錯体は、アクリジンオレンジ（Lippard etal. (1984) J. Am. Chem. Soc. 106: 6102）、Ｘ線照射（Grokhovsky & Zubarev (1991) Nucl. Acids Res. 19: 257）、または光分解条件下（Rudnicki et al. (1991) Bioorg. Med. Chem. Lett. 1: 451、またはThorp et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 11673）等のＤＮＡ切断モチーフと連動してＤＮＡを切断することができる。
【０００３】
さらに、上記遷移金属錯体は、抗癌作用をも有している場合がある（Bruhn et al. (1987) Prog. Inorg. Chem. 38: 477、Sherman & Lippard (1987) Chem Rev. 87: 1153等）。例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン（すなわち、白金錯体）が、精巣および卵巣の癌の治療に日常的に使用されてきた（Christian (1992) Semin. Oncol. 19: 720、Barnard (1989) J. Plat. Met. Rev. 33: 162）。加えて、多くのシスプラチン誘導体が、副作用を低減し耐性を減少させた新規な抗癌剤として開発されてきた（Reedijk (1996) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 801、Hambley (1997) Coord. Chem. Rev. 166: 181）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な有機金属錯体および当該有機金属錯体の核酸の結合および切断薬としての用途を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸の結合および切断薬として有用な有機金属錯体に関する。
【０００６】
本発明の１つは、式
【０００７】
【化５】
【０００８】
（式中、ＭはＰｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、ＣｏまたはＣｕであり、Ｘは（Ａ1およびＡ2原子を含んで）アリール、ヘテロアリール、シクリル（cyclyl）またはヘテロシクリル（heterocyclyl）であり、Ｙはハロゲン、トシレート、メシレート、トリフレート、ピロホスフェート、またはカルボキシレートであり、Ａ1およびＡ2はそれぞれ独立してＮまたはＣであり、Ａ3またはＡ4はそれぞれ独立してＮ、ＳまたはＯであり、かつ、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4は一緒になって１つの正電荷を有しており（例えばＮ+ のように、電荷は４原子のうちの１つにより担われている）、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシル、アリールオキシル、ヘテロアリールオキシル、アルコキシルカルボニル、アリールオキシルカルボニルまたはヘテロアリールオキシルカルボニルである。）
で表される有機金属錯体である。
【０００９】
式（Ｉ）に含まれる有機金属錯体の一部は、ＭがＰｔであることを特徴とするものである。これらの錯体では、Ｘはピリジニルであり、Ａ1およびＡ2の１つはＮであり、Ｙはハロゲンであり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキルである。本発明の有機金属錯体の一例は、ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］である。
【００１０】
【化６】
【００１１】
上記のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクリル（cyclyl）、ヘテロシクリル（heterocyclyl）、アルコキシル、アリールオキシル、ヘテロアリールオキシル、アルコキシルカルボニル、アリールオキシルカルボニルまたはヘテロアリールオキシルカルボニルは、置換されたものおよび無置換のものを含む。ここで、アルキルとは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状の炭化水素基である。また、「置換された」とは、１つまたは複数の置換基（それらは同一であってもよいし異なっていてもよい）で水素原子が置換されていることをいう。このような置換基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル（heterocyclyl）等が挙げられ、アルキル、アルケニル、アルコキシル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリル（heterocyclyl）は、さらにＣ１〜Ｃ６のアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノ、シアノまたはニトロで置換されていてもよい。「アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環を含む炭化水素環系をいう。アリールとしては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル、ナフチル、ピレニル等が挙げられる。「ヘテロアリール」とは、Ｏ、ＮまたはＳのような少なくとも１つのヘテロ原子を含む少なくとも１つの芳香族環を有する炭化水素環系をいう。ヘテロアリールとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジニル、カルバゾリル、インドリル等が挙げられる。
【００１２】
式（Ｉ）の有機金属錯体の塩もまた、本発明の範囲に含まれるものである。そのような塩は、例えば、錯体上の正電荷の置換基（例えばスルホキシド）と陰イオンとにより形成することができる。このような陰イオンの例としては、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩等がある。同様に、正電荷置換基は陽イオンと塩を形成することができる。陽イオンは、特に限定されるものではないが、好適には、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウムイオン等が挙げられる。
【００１３】
本発明はまた、核酸の結合および切断方法である。当該方法は、核酸を上記有機金属錯体の１つまたは複数と接触させる工程を含むものである。核酸の切断は、核酸に結合した有機金属錯体のＵＶ照射によって達成することができる。ここで、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むプリン体であり、１本鎖、２本鎖または一部が１本鎖で一部が２本鎖であってもよい。具体的には、本発明の方法は、５〜８のｐＨ値を有する緩衝液中において行われ、前記切断は、３００ｎｍを超過する波長のＵＶ光を用いて行われる。
【００１４】
本発明のその他の特徴、目的および効果は、特許請求の範囲および発明の詳細な説明の記載から明らかになるであろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、有機金属錯体および核酸の結合および切断薬としてのその用途に関するものである。本発明の有機金属錯体は、ここに述べる合成方法を含む周知の方法により製造することができる。
【００１６】
有機金属錯体は、例えば、以下の方法により製造することができる。すなわち、メルカプトおよび酸化物で置換したへテロアリールをＫ2ＰｔＣｌ4溶液に添加する。添加は暗所で行う。次いで、Ｒ1、Ｒ2置換スルホキシドを当該溶液に添加し、所望の有機金属錯体を製造する。下記式は、本発明の有機金属錯体の合成工程を示すものである。
【００１７】
【化７】
【００１８】
本発明の有機金属錯体は、核酸の結合または切断薬として用いることができる。一般には、該有機金属錯体は、核酸のプリン体のヘテロアリール環に結合する。結合は、遷移金属と窒素等のヘテロ原子間の配位結合によるものである（錯体１を参照）。該有機金属錯体は、アデニンの６位のアミノと結合する。ＵＶ照射なしでは、質量分析により、結合から生じる核酸切断のシグナルが見られないことが示された。ＵＶ照射を行うと、分子内環化が起こり、核酸切断が誘導される。さらに、遷移金属錯体はまた、外部塩基（例えば、ピペリジン）の存在下で、グアニンを標的にする。錯体は、特にグアニンの２位のアミノと結合するばかりでなく、外部塩基の存在下でＵＶ照射のもと切断反応も生じさせる（後述する実施例を参照）。
【００１９】
切断された核酸産出物（切れ目の入った核酸）は、少なくとも１つの切れ目、すなわち、２つの隣接する塩基が共有結合していない部分、を有しており、それは、変性ポリアクリルアミドゲルを用いることにより検出することができる（Molecular Cloning, 2nd Ed. Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。ゲル電気泳動もまた、蛍光または放射性ラベルで標識した切れ目の入った核酸を、分離、検出することができる。
【００２０】
本発明の遷移金属錯体は、インビトロで核酸（例えばＤＮＡ）を結合および切断することができる。金属錯体と細胞ＤＮＡとの選択的相互作用により腫瘍細胞が死滅することが知られている（Ｒｅｅｄｉｊｋ （１９９２） Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １９８−２００： ８７３、Ｗｏｎｇ ＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ （１９９９） Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９９： ２３５１）。ゆえに、本発明は、有効量の少なくとも１つの本発明の前記遷移金属錯体および医薬的に許容される担体を含む腫瘍治療用医薬組成物をも提供するものである。本発明の範囲にはまた、腫瘍治療の必要な患者に有効量の前記錯体を投与する方法も含まれるものである。ここで、「有効量」とは、患者に治療効果を発現させるために必要な前記錯体の量をいう。
【００２１】
さらに、前記遷移金属錯体はまた、短い核酸フラグメントを生成するための核酸鋏として用いることができる。質量分析、マイクロアレイ等の種々の新技術は、分析または配列決定に、短い核酸フラグメントを利用している（例えば、Nordhoff (1996) Trends Anal. Chem. 15: 240、Ramsay (1998) Nat. Biotechnol. 16: 40、Marshall & Hodgson (1998) Nat. Biotechnol 16: 27等）。ゆえに、本発明の遷移金属錯体は、これらの新技術に対して有用である。前記錯体は、例えば、癌またはウイルス疾患の検査において、遺伝子チップに用いることができる。
【００２２】
以下の実施例は、単に例示と解釈されるべきものであって、いかなる場合においても本発明の開示を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本開示に基づいて容易に本発明を最大範囲まで利用することができる。ここに引用した文献は、その全範囲がここに引用されるものである。
【００２３】
【実施例】
有機プラチナ錯体ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η 2 −Ｃ 5 Ｈ 4 ＳＮ（Ｏ）］の合成
２−メルカプトピリジンＮ−オキシド・ナトリウムのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ）に、Ｋ2ＰｔＣＬ4（４１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の水溶液（１００ｍｌ）を暗所で１．０時間かけてゆっくり添加した。ついで、得られた溶液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１．０ｍｌ）を添加し、３日間撹拌した。得られた溶液の溶媒を減圧下除去して生成物を得た。生成物はシリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィー（溶離液はＣＨ2ＣＬ2１００％）を用いて精製し、黄色粉末のＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］（錯体１）を得た（４０８ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ、収率９４％）。
【００２４】
元素分析（ＰｔＣ7Ｈ10ＮＯ2Ｓ2）：
（計算値）Ｃ：１９．３４、Ｈ：２．３２、Ｎ：３．２２、
（分析値）Ｃ：１９．５６、Ｈ：２．１８、Ｎ：３．１０。
【００２５】
質量分析（ＦＡＢ、195Ｐｔ、37Ｃｌ）ｍ／ｚ：
４３６（Ｍ+）、３９９（Ｍ+−Ｃｌ）、３０５（Ｍ+−Ｌ）。
【００２６】
結晶構造：単位格子を２分子で構成、Ｃ14Ｈ20Ｃ12Ｎ2Ｏ4Ｓ4Ｐｔ2：
Ｍ＝８６９．６４、三斜昌系、空間群Ｐ１、格子定数：
ａ＝１０．２４９（３）Å、ｂ＝１０．９６３（５）Å、ｃ＝１１．０８３（３）Å、
α＝８２．７１（３）°、β＝７６．１８３（２１）°、γ＝７６．６４（３）°、
Ｖ＝１１７１．１（７）Ａ3、Ｚ＝２、Ｄｃ＝２．４６２ｇｃｍ-3、Ｔ＝２９８Ｋ、
λ＝０．７１０６９Å、μ（Ｍｏ／Ｋａ）＝１２．６３３６ｎｍ-1、
Ｅｎｒａｆ−ｎｏｎｉｕｓＣＡＤ４回折計：２０max＝４５．０°、
３２５９回復観測、１８６１観測（Ｒ＝０．０５７、ωＲ（Ｆ2）＝０．０５９）。
【００２７】
ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］の構造を単結晶Ｘ線回折分析により確認した。１−ヒドロキシピリジン−２−チオンは、Ｐｔ金属原子と等価の３つの電子（すなわち、１つの電子はチオレートの中心、２つの電子は酸素原子）が付与されていた。
【００２８】
１本鎖ＤＮＡ切断
種々のｐＨでの切断：
スーパーコイル環状φＸ１７４ＲＦＩＤＮＡ原液（５０μＭ／塩基対）、錯体１（５．０μＭ）、およびリン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ５．０、６．０、７．０および８．０）を含む反応混合物（１０ｍｌ）をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で予め保温した。ついで、室温で、反応混合物に３５０ｎｍのＵＶ光（３２−Ｗ）を２時間照射した。ゲルローディング緩衝液（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールおよび３０％グリセロール）を添加後、反応混合物を１％アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムにより染色した。ゲルを３１２ｎｍのＵＶ透照器で視覚化し、ＦＢ−ＰＤＣ−３４カメラで撮影した。スーパーコイル環状ＤＮＡおよび切断ＤＮＡがゲルから明瞭に観測された。結果は、反応混合物のｐＨが５．０、６．０または７．０のときは切断ＤＮＡのみが観測され、反応混合物のｐＨが８．０のときはスーパーコイル環状ＤＮＡと切断ＤＮＡの両方が観測されることを示した。
【００２９】
種々の錯体濃度での切断：
スーパーコイル環状φＸ１７４ＲＦＩＤＮＡ原液（５０μＭ／塩基対）、錯体１（０．０５０〜１００μＭ）、およびリン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ６．０）を含む反応混合物（１０ｍｌ）をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で事前保温した。ついで、室温で、反応混合物に３５０ｎｍのＵＶ光（３２−Ｗ）を２時間照射した。ゲルローディング緩衝液（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールおよび３０％グリセロール）を添加後、反応混合物を１％アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムにより染色した。ゲルを３１２ｎｍのＵＶ透照器で視覚化し、ＦＢ−ＰＤＣ−３４カメラで撮影した。スーパーコイル環状ＤＮＡ（Ｉ型）および切断ＤＮＡ（ＩＩ型）がゲルから明瞭に観測された。結果を表１にまとめた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
結果は、錯体１は、ｐＨ依存的（ｐＨ５．０〜８．０）にＤＮＡを切断し、酸性（ｐＨ５．０〜７．０）でその効果が強い。意外なことに、本有機金属錯体は、１．０μＭの濃度でさえ非常に強いＤＮＡ切断活性を示した。さらに、暗所では１本鎖ＤＮＡの切断は起こらなかった。
【００３２】
座位特異的ＤＮＡ切断
ｐＢＲ３２２ＤＮＡの５０１〜６６０フラグメントから１６０−ｂｐ ｄｓＤＮＡフラグメントを取得して、ポリメラーゼ連鎖反応により増殖し（Bailly & Waring (1995) J.Am. Chem. Soc. 117: 7311、Bailly et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 3784およびSayers & Waring (1993) Biochemistry 32: 9094）、γ−［32Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’−末端をラベルした。５’−末端ラベル32Ｐ−ＤＮＡ溶液、リン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ６．０）および錯体１（２０〜１００μＭ）を含む反応混合物をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で３０分間保温した。反応混合物に、室温、好気性環境下で２時間、３５０ｎｍのＵＶ光を照射した。０．３０ＮのＮａＣＮ（ｐＨ＝１１）を用い、３７℃で８時間処理することにより、ＤＮＡフラグメントに結合した有機金属錯体を除去した（Schwartz et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 3673、Zou et al. (1994) Biochemistry 33: 5404）。次いで、反応混合物をゲルローディング緩衝液または９５％エタノールで処理し、反応を停止させた。いくつかの試料はピペリジン処理を施してエタノールにより沈殿させ、ピペリジン水溶液（１．０Ｍ、６０μｌ）に９５℃で３０分間再懸濁させた。ついで、全ての試料に対し、連続して凍結乾燥、水処理（３０μｌ）、凍結乾燥、およびゲルローディング緩衝液（８０％ホルムアルデヒド、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび０．２５％キシレンシアノール）への再懸濁を施した。マクサム−ギルバートマーカーによる分析を、１０％ポリアクリルアミド／８．０Ｍウレアゲルを用いて行った。３００Ｖの電圧で６０分間、電圧を６００Ｖに上げてさらに８．０時間、電気泳動を行った。ゲルは、コダックＸ−Ｏｍａｔ Ａｒ・５フイルムを増感紙に用いて、−７０℃で２４時間露出することにより可視化した。ＤＮＡフラグメントの相対強度の定量を、マイクロテックスキャナおよびＮＩＨ１．６０イメージプログラムを用いて行った。
【００３３】
検出したＤＮＡフラグメントをオートラジオグラムでマクサム−ギルバートマーカーと比較し、コンピュータ分析プログラムにより定量化した。錯体１は、プリン残基では熱ピペリジン処理により（Armitage (1998) Chem. Rev. 98: 1171）、アデニン残基ではピペリジン処理なしで、ＤＮＡを切断することが結果より示された。
【００３４】
ＤＮＡ結合および切断メカニズム
二重らせんオリゴヌクレオチドｄ（ＡＴＡＴ）2を調製し、錯体１を含むリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０、１：１）に添加した。溶液を暗所で２時間静置した。ＬＣ−マスクロマトグラフィにおけるＥＳＩ（electron spray ionization）検出器の分析でシグナル６５０．１（Ｍ＋Ｈ+）の中間体が、５７％の収率で検出された。ついで、溶液に、３５０ｎｍのＵＶ光を、室温で２時間照射した。シグナル４５６．１（Ｍ＋Ｈ+）の産出物が検出された。結果より、錯体１は最初にアデニンのＣ−６アミノに結合し、中間体を生成することがわかった。ＤＭＳＯを除去し、錯体１のＮ−７窒素原子とプラチナ間の共有結合を形成することにより、オリゴヌクレオチド切断が生じ、分子内の環化が起こった。比較例は、切断反応がＵＶ照射により開始することを示した。
【００３５】
下記式は、当該反応を表したものである。
【００３６】
【化８】
【００３７】
比較として、２’−デオキシグアノシンおよび錯体１を含む反応を行った。錯体１は、グアニンのＣ−２アミノに結合してＰｔ−Ｎ共有結合を形成した。グアニンのＰｔとＮ−７窒素原子間の距離および幾何学的不整合により、分子内環化は起こらなかった。結果として、グアニン部位における切断は、外部塩基（例えば、ピペリジン）の補助を必要とすることがわかった。別の実験では、過剰の錯体１が２’−デオキシグアノシン溶液に添加され、ピペリジン処理された。ＬＣマスクロマトグラフィにおけるＥＳＩ検出器の分析でシグナル１０６３．９（Ｍ＋Ｈ+）の中間体が、４２％の収率で検出された。中間体は、暗所によらずに３５０ｎｍ−ＵＶ光を照射して、シグナル７９２．０（Ｍ＋Ｈ+）の環化生産物を、８０％の収率で生成することができた。下記式は、当該反応を表したものである。
【００３８】
【化９】
【００３９】
上記結果により、錯体１が、制御された条件下で良好なＤＮＡ結合剤または効果的な切断剤となり、またＵＶ光が開始剤として機能して、プリン残基における切断が誘発されることがわかった。
【００４０】
本明細書に開示した技術的特徴の全ては、様々に組み合わせて利用することができる。本明細書に開示したそれぞれの特徴は、同一の、等価の、同様の目的を達成する他の特徴に置き換えてもよい。したがって、開示したそれぞれの特徴は、別途明白に記述しない限り、包括的な等価のまたは同様の特徴の単に例示に過ぎないものである。
【００４１】
当業者は、上記記載から、本発明の本質的特徴を容易に達成することができ、その概念および範囲から外れることなく、本発明を種々変更し修正して、種々の用途や状態に適応させることができる。従って、他の実施形態もまた本出願の特許請求の範囲に含まれるものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機金属錯体に関し、特に核酸の結合および切断薬として有用な有機金属錯体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを切断し得る遷移金属錯体が、「ケミカルヌクレアーゼ」として広く知られている（Pyle & Barton (1990) Prog. Inorg. Chem. 38: 413、Sigman et al. (1987) Acc. Chem. Res. 26: 98、Stubbe & Kozarich (1987) Chem. Rev. 87: 1107等）。これらの錯体はＤＮＡに強く結合し、ついで種々の条件下でＤＮＡを切断する。例えば、遷移金属錯体は、アクリジンオレンジ（Lippard etal. (1984) J. Am. Chem. Soc. 106: 6102）、Ｘ線照射（Grokhovsky & Zubarev (1991) Nucl. Acids Res. 19: 257）、または光分解条件下（Rudnicki et al. (1991) Bioorg. Med. Chem. Lett. 1: 451、またはThorp et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 11673）等のＤＮＡ切断モチーフと連動してＤＮＡを切断することができる。
【０００３】
さらに、上記遷移金属錯体は、抗癌作用をも有している場合がある（Bruhn et al. (1987) Prog. Inorg. Chem. 38: 477、Sherman & Lippard (1987) Chem Rev. 87: 1153等）。例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン（すなわち、白金錯体）が、精巣および卵巣の癌の治療に日常的に使用されてきた（Christian (1992) Semin. Oncol. 19: 720、Barnard (1989) J. Plat. Met. Rev. 33: 162）。加えて、多くのシスプラチン誘導体が、副作用を低減し耐性を減少させた新規な抗癌剤として開発されてきた（Reedijk (1996) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 801、Hambley (1997) Coord. Chem. Rev. 166: 181）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な有機金属錯体および当該有機金属錯体の核酸の結合および切断薬としての用途を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸の結合および切断薬として有用な有機金属錯体に関する。
【０００６】
本発明の１つは、式
【０００７】
【化５】
（式中、ＭはＰｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、ＣｏまたはＣｕであり、Ｘは（Ａ1およびＡ2原子を含んで）アリール、ヘテロアリール、シクリル（cyclyl）またはヘテロシクリル（heterocyclyl）であり、Ｙはハロゲン、トシレート、メシレート、トリフレート、ピロホスフェート、またはカルボキシレートであり、Ａ1およびＡ2はそれぞれ独立してＮまたはＣであり、Ａ3またはＡ4はそれぞれ独立してＮ、ＳまたはＯであり、かつ、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4は一緒になって１つの正電荷を有しており（例えばＮ+ のように、電荷は４原子のうちの１つにより担われている）、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシル、アリールオキシル、ヘテロアリールオキシル、アルコキシルカルボニル、アリールオキシルカルボニルまたはヘテロアリールオキシルカルボニルである。）
で表される有機金属錯体である。
【０００９】
式（Ｉ）に含まれる有機金属錯体の一部は、ＭがＰｔであることを特徴とするものである。これらの錯体では、Ｘはピリジニルであり、Ａ1およびＡ2の１つはＮであり、Ｙはハロゲンであり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキルである。本発明の有機金属錯体の一例は、ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］である。
【００１０】
【化６】
上記のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクリル（cyclyl）、ヘテロシクリル（heterocyclyl）、アルコキシル、アリールオキシル、ヘテロアリールオキシル、アルコキシルカルボニル、アリールオキシルカルボニルまたはヘテロアリールオキシルカルボニルは、置換されたものおよび無置換のものを含む。ここで、アルキルとは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状の炭化水素基である。また、「置換された」とは、１つまたは複数の置換基（それらは同一であってもよいし異なっていてもよい）で水素原子が置換されていることをいう。このような置換基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル（heterocyclyl）等が挙げられ、アルキル、アルケニル、アルコキシル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリル（heterocyclyl）は、さらにＣ１〜Ｃ６のアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノ、シアノまたはニトロで置換されていてもよい。「アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環を含む炭化水素環系をいう。アリールとしては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル、ナフチル、ピレニル等が挙げられる。「ヘテロアリール」とは、Ｏ、ＮまたはＳのような少なくとも１つのヘテロ原子を含む少なくとも１つの芳香族環を有する炭化水素環系をいう。ヘテロアリールとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジニル、カルバゾリル、インドリル等が挙げられる。
【００１２】
式（Ｉ）の有機金属錯体の塩もまた、本発明の範囲に含まれるものである。そのような塩は、例えば、錯体上の正電荷の置換基（例えばスルホキシド）と陰イオンとにより形成することができる。このような陰イオンの例としては、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩等がある。同様に、正電荷置換基は陽イオンと塩を形成することができる。陽イオンは、特に限定されるものではないが、好適には、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウムイオン等が挙げられる。
【００１３】
本発明はまた、核酸の結合および切断方法である。当該方法は、核酸を上記有機金属錯体の１つまたは複数と接触させる工程を含むものである。核酸の切断は、核酸に結合した有機金属錯体のＵＶ照射によって達成することができる。ここで、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むプリン体であり、１本鎖、２本鎖または一部が１本鎖で一部が２本鎖であってもよい。具体的には、本発明の方法は、５〜８のｐＨ値を有する緩衝液中において行われ、前記切断は、３００ｎｍを超過する波長のＵＶ光を用いて行われる。
【００１４】
本発明のその他の特徴、目的および効果は、特許請求の範囲および発明の詳細な説明の記載から明らかになるであろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、有機金属錯体および核酸の結合および切断薬としてのその用途に関するものである。本発明の有機金属錯体は、ここに述べる合成方法を含む周知の方法により製造することができる。
【００１６】
有機金属錯体は、例えば、以下の方法により製造することができる。すなわち、メルカプトおよび酸化物で置換したへテロアリールをＫ2ＰｔＣｌ4溶液に添加する。添加は暗所で行う。次いで、Ｒ1、Ｒ2置換スルホキシドを当該溶液に添加し、所望の有機金属錯体を製造する。下記式は、本発明の有機金属錯体の合成工程を示すものである。
【００１７】
【化７】
本発明の有機金属錯体は、核酸の結合または切断薬として用いることができる。一般には、該有機金属錯体は、核酸のプリン体のヘテロアリール環に結合する。結合は、遷移金属と窒素等のヘテロ原子間の配位結合によるものである（錯体１を参照）。該有機金属錯体は、アデニンの６位のアミノと結合する。ＵＶ照射なしでは、質量分析により、結合から生じる核酸切断のシグナルが見られないことが示された。ＵＶ照射を行うと、分子内環化が起こり、核酸切断が誘導される。さらに、遷移金属錯体はまた、外部塩基（例えば、ピペリジン）の存在下で、グアニンを標的にする。錯体は、特にグアニンの２位のアミノと結合するばかりでなく、外部塩基の存在下でＵＶ照射のもと切断反応も生じさせる（後述する実施例を参照）。
【００１９】
切断された核酸産出物（切れ目の入った核酸）は、少なくとも１つの切れ目、すなわち、２つの隣接する塩基が共有結合していない部分、を有しており、それは、変性ポリアクリルアミドゲルを用いることにより検出することができる（Molecular Cloning, 2nd Ed. Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。ゲル電気泳動もまた、蛍光または放射性ラベルで標識した切れ目の入った核酸を、分離、検出することができる。
【００２０】
本発明の遷移金属錯体は、インビトロで核酸（例えばＤＮＡ）を結合および切断することができる。金属錯体と細胞ＤＮＡとの選択的相互作用により腫瘍細胞が死滅することが知られている（Ｒｅｅｄｉｊｋ （１９９２） Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １９８−２００： ８７３、Ｗｏｎｇ ＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ （１９９９） Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９９： ２３５１）。ゆえに、本発明は、有効量の少なくとも１つの本発明の前記遷移金属錯体および医薬的に許容される担体を含む腫瘍治療用医薬組成物をも提供するものである。本発明の範囲にはまた、腫瘍治療の必要な患者に有効量の前記錯体を投与する方法も含まれるものである。ここで、「有効量」とは、患者に治療効果を発現させるために必要な前記錯体の量をいう。
【００２１】
さらに、前記遷移金属錯体はまた、短い核酸フラグメントを生成するための核酸鋏として用いることができる。質量分析、マイクロアレイ等の種々の新技術は、分析または配列決定に、短い核酸フラグメントを利用している（例えば、Nordhoff (1996) Trends Anal. Chem. 15: 240、Ramsay (1998) Nat. Biotechnol. 16: 40、Marshall & Hodgson (1998) Nat. Biotechnol 16: 27等）。ゆえに、本発明の遷移金属錯体は、これらの新技術に対して有用である。前記錯体は、例えば、癌またはウイルス疾患の検査において、遺伝子チップに用いることができる。
【００２２】
以下の実施例は、単に例示と解釈されるべきものであって、いかなる場合においても本発明の開示を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本開示に基づいて容易に本発明を最大範囲まで利用することができる。ここに引用した文献は、その全範囲がここに引用されるものである。
【００２３】
【実施例】
有機プラチナ錯体ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η 2 −Ｃ 5 Ｈ 4 ＳＮ（Ｏ）］の合成
２−メルカプトピリジンＮ−オキシド・ナトリウムのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ）に、Ｋ2ＰｔＣＬ4（４１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の水溶液（１００ｍｌ）を暗所で１．０時間かけてゆっくり添加した。ついで、得られた溶液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１．０ｍｌ）を添加し、３日間撹拌した。得られた溶液の溶媒を減圧下除去して生成物を得た。生成物はシリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィー（溶離液はＣＨ2ＣＬ2１００％）を用いて精製し、黄色粉末のＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］（錯体１）を得た（４０８ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ、収率９４％）。
【００２４】
元素分析（ＰｔＣ7Ｈ10ＮＯ2Ｓ2）：
（計算値）Ｃ：１９．３４、Ｈ：２．３２、Ｎ：３．２２、
（分析値）Ｃ：１９．５６、Ｈ：２．１８、Ｎ：３．１０。
【００２５】
質量分析（ＦＡＢ、195Ｐｔ、37Ｃｌ）ｍ／ｚ：
４３６（Ｍ+）、３９９（Ｍ+−Ｃｌ）、３０５（Ｍ+−Ｌ）。
【００２６】
結晶構造：単位格子を２分子で構成、Ｃ14Ｈ20Ｃ12Ｎ2Ｏ4Ｓ4Ｐｔ2：
Ｍ＝８６９．６４、三斜昌系、空間群Ｐ１、格子定数：
ａ＝１０．２４９（３）Å、ｂ＝１０．９６３（５）Å、ｃ＝１１．０８３（３）Å、
α＝８２．７１（３）°、β＝７６．１８３（２１）°、γ＝７６．６４（３）°、
Ｖ＝１１７１．１（７）Ａ3、Ｚ＝２、Ｄｃ＝２．４６２ｇｃｍ-3、Ｔ＝２９８Ｋ、
λ＝０．７１０６９Å、μ（Ｍｏ／Ｋａ）＝１２．６３３６ｎｍ-1、
Ｅｎｒａｆ−ｎｏｎｉｕｓＣＡＤ４回折計：２０max＝４５．０°、
３２５９回復観測、１８６１観測（Ｒ＝０．０５７、ωＲ（Ｆ2）＝０．０５９）。
【００２７】
ＰｔＣｌ（ＤＭＳＯ）［η2−Ｃ5Ｈ4ＳＮ（Ｏ）］の構造を単結晶Ｘ線回折分析により確認した。１−ヒドロキシピリジン−２−チオンは、Ｐｔ金属原子と等価の３つの電子（すなわち、１つの電子はチオレートの中心、２つの電子は酸素原子）が付与されていた。
【００２８】
１本鎖ＤＮＡ切断
種々のｐＨでの切断：
スーパーコイル環状φＸ１７４ＲＦＩＤＮＡ原液（５０μＭ／塩基対）、錯体１（５．０μＭ）、およびリン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ５．０、６．０、７．０および８．０）を含む反応混合物（１０ｍｌ）をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で予め保温した。ついで、室温で、反応混合物に３５０ｎｍのＵＶ光（３２−Ｗ）を２時間照射した。ゲルローディング緩衝液（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールおよび３０％グリセロール）を添加後、反応混合物を１％アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムにより染色した。ゲルを３１２ｎｍのＵＶ透照器で視覚化し、ＦＢ−ＰＤＣ−３４カメラで撮影した。スーパーコイル環状ＤＮＡおよび切断ＤＮＡがゲルから明瞭に観測された。結果は、反応混合物のｐＨが５．０、６．０または７．０のときは切断ＤＮＡのみが観測され、反応混合物のｐＨが８．０のときはスーパーコイル環状ＤＮＡと切断ＤＮＡの両方が観測されることを示した。
【００２９】
種々の錯体濃度での切断：
スーパーコイル環状φＸ１７４ＲＦＩＤＮＡ原液（５０μＭ／塩基対）、錯体１（０．０５０〜１００μＭ）、およびリン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ６．０）を含む反応混合物（１０ｍｌ）をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で事前保温した。ついで、室温で、反応混合物に３５０ｎｍのＵＶ光（３２−Ｗ）を２時間照射した。ゲルローディング緩衝液（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールおよび３０％グリセロール）を添加後、反応混合物を１％アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムにより染色した。ゲルを３１２ｎｍのＵＶ透照器で視覚化し、ＦＢ−ＰＤＣ−３４カメラで撮影した。スーパーコイル環状ＤＮＡ（Ｉ型）および切断ＤＮＡ（ＩＩ型）がゲルから明瞭に観測された。結果を表１にまとめた。
【００３０】
【表１】
結果は、錯体１は、ｐＨ依存的（ｐＨ５．０〜８．０）にＤＮＡを切断し、酸性（ｐＨ５．０〜７．０）でその効果が強い。意外なことに、本有機金属錯体は、１．０μＭの濃度でさえ非常に強いＤＮＡ切断活性を示した。さらに、暗所では１本鎖ＤＮＡの切断は起こらなかった。
【００３２】
座位特異的ＤＮＡ切断
ｐＢＲ３２２ＤＮＡの５０１〜６６０フラグメントから１６０−ｂｐ ｄｓＤＮＡフラグメントを取得して、ポリメラーゼ連鎖反応により増殖し（Bailly & Waring (1995) J.Am. Chem. Soc. 117: 7311、Bailly et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 3784およびSayers & Waring (1993) Biochemistry 32: 9094）、γ−［32Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’−末端をラベルした。５’−末端ラベル32Ｐ−ＤＮＡ溶液、リン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ６．０）および錯体１（２０〜１００μＭ）を含む反応混合物をパイレックス（登録商標）バイアル中で３７℃で３０分間保温した。反応混合物に、室温、好気性環境下で２時間、３５０ｎｍのＵＶ光を照射した。０．３０ＮのＮａＣＮ（ｐＨ＝１１）を用い、３７℃で８時間処理することにより、ＤＮＡフラグメントに結合した有機金属錯体を除去した（Schwartz et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 3673、Zou et al. (1994) Biochemistry 33: 5404）。次いで、反応混合物をゲルローディング緩衝液または９５％エタノールで処理し、反応を停止させた。いくつかの試料はピペリジン処理を施してエタノールにより沈殿させ、ピペリジン水溶液（１．０Ｍ、６０μｌ）に９５℃で３０分間再懸濁させた。ついで、全ての試料に対し、連続して凍結乾燥、水処理（３０μｌ）、凍結乾燥、およびゲルローディング緩衝液（８０％ホルムアルデヒド、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび０．２５％キシレンシアノール）への再懸濁を施した。マクサム−ギルバートマーカーによる分析を、１０％ポリアクリルアミド／８．０Ｍウレアゲルを用いて行った。３００Ｖの電圧で６０分間、電圧を６００Ｖに上げてさらに８．０時間、電気泳動を行った。ゲルは、コダックＸ−Ｏｍａｔ Ａｒ・５フイルムを増感紙に用いて、−７０℃で２４時間露出することにより可視化した。ＤＮＡフラグメントの相対強度の定量を、マイクロテックスキャナおよびＮＩＨ１．６０イメージプログラムを用いて行った。
【００３３】
検出したＤＮＡフラグメントをオートラジオグラムでマクサム−ギルバートマーカーと比較し、コンピュータ分析プログラムにより定量化した。錯体１は、プリン残基では熱ピペリジン処理により（Armitage (1998) Chem. Rev. 98: 1171）、アデニン残基ではピペリジン処理なしで、ＤＮＡを切断することが結果より示された。
【００３４】
ＤＮＡ結合および切断メカニズム
二重らせんオリゴヌクレオチドｄ（ＡＴＡＴ）2を調製し、錯体１を含むリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０、１：１）に添加した。溶液を暗所で２時間静置した。ＬＣ−マスクロマトグラフィにおけるＥＳＩ（electron spray ionization）検出器の分析でシグナル６５０．１（Ｍ＋Ｈ+）の中間体が、５７％の収率で検出された。ついで、溶液に、３５０ｎｍのＵＶ光を、室温で２時間照射した。シグナル４５６．１（Ｍ＋Ｈ+）の産出物が検出された。結果より、錯体１は最初にアデニンのＣ−６アミノに結合し、中間体を生成することがわかった。ＤＭＳＯを除去し、錯体１のＮ−７窒素原子とプラチナ間の共有結合を形成することにより、オリゴヌクレオチド切断が生じ、分子内の環化が起こった。比較例は、切断反応がＵＶ照射により開始することを示した。
【００３５】
下記式は、当該反応を表したものである。
【００３６】
【化８】
比較として、２’−デオキシグアノシンおよび錯体１を含む反応を行った。錯体１は、グアニンのＣ−２アミノに結合してＰｔ−Ｎ共有結合を形成した。グアニンのＰｔとＮ−７窒素原子間の距離および幾何学的不整合により、分子内環化は起こらなかった。結果として、グアニン部位における切断は、外部塩基（例えば、ピペリジン）の補助を必要とすることがわかった。別の実験では、過剰の錯体１が２’−デオキシグアノシン溶液に添加され、ピペリジン処理された。ＬＣマスクロマトグラフィにおけるＥＳＩ検出器の分析でシグナル１０６３．９（Ｍ＋Ｈ+）の中間体が、４２％の収率で検出された。中間体は、暗所によらずに３５０ｎｍ−ＵＶ光を照射して、シグナル７９２．０（Ｍ＋Ｈ+）の環化生産物を、８０％の収率で生成することができた。下記式は、当該反応を表したものである。
【００３８】
【化９】
上記結果により、錯体１が、制御された条件下で良好なＤＮＡ結合剤または効果的な切断剤となり、またＵＶ光が開始剤として機能して、プリン残基における切断が誘発されることがわかった。
【００４０】
本明細書に開示した技術的特徴の全ては、様々に組み合わせて利用することができる。本明細書に開示したそれぞれの特徴は、同一の、等価の、同様の目的を達成する他の特徴に置き換えてもよい。したがって、開示したそれぞれの特徴は、別途明白に記述しない限り、包括的な等価のまたは同様の特徴の単に例示に過ぎないものである。
【００４１】
当業者は、上記記載から、本発明の本質的特徴を容易に達成することができ、その概念および範囲から外れることなく、本発明を種々変更し修正して、種々の用途や状態に適応させることができる。従って、他の実施形態もまた本出願の特許請求の範囲に含まれるものである。
Claims (9)
- 式
で表される有機金属錯体。 - 式
- 核酸の切断に用いられる、請求項１または２に記載の有機金属錯体。
- 前記核酸の切断が、前記有機金属錯体へのＵＶ照射によって行われる、請求項３に記載の有機金属錯体。
- 前記ＵＶが、３００ｎｍを超過する波長を有する、請求項４に記載の有機金属錯体。
- 前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の有機金属錯体。
- 前記核酸の切断が、５〜８のｐＨ値を有する緩衝液中において行われる、請求項３〜６のいずれか１項に記載の有機金属錯体。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の有機金属錯体の有効量、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 腫瘍の治療に用いられる、請求項８に記載の医薬組成物。
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