JP3876375B2 - 内皮細胞の静電的接種及びｄｎａトランスフェクションのための装置及び方法 - Google Patents

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本願は、１９９５年１０月１２日付け出願の出願第０８／５４１，２４８号（発明の名称：内皮細胞の静電的接種のための装道及び方法）の一部継続出願である。
技術分野
本発明は、表面への細胞の結合を容易なものとするための方法及び装置に係る。さらに詳述すれば、本発明は、小径人工血管の管腔壁への内皮細胞の接種のための方法及び装置に係る。特に、本発明は、表面の電荷をより正の状態に一時的に変化させることによって、内皮細胞の結合及びＤＮＡのトランスフェクションを促進させるための方法及び装置に係る。
背景技術
これまで、ヒトにおいて、病変した又は損傷した小径（＜６ｍｍ）の血管を治療するため、実験では人工器官を使用することが知られている。小径人工血管の使用に伴う大きな問題点は、長期間の開通性に乏しいことである。これら人工血管への内皮細胞（ＥＣ）の接種は、ヒトにおける開通性の増大をもたらし、実験動物における完全な治癒をもたらす。小径人工血管の高い機能不全率の原因は、急性の自発性血栓症及び慢性の内膜の肥厚の発生である。血栓症は、血小板が各種の非内皮化（non-endothelialized）の外来表面と反応して血小板の栓が形成されることによって開始される。ついで、この栓は血液凝固タンパク質のためのテンプレートとして使用される。その後、この血小板の栓は成長を続け、その結果、小径の血管移植片の閉塞又は不全をきたす。このように、長期間の開通性を提供し、最終的には治癒を提供できるように、良好な人工血管へのＥＣ接種技術の必要性が認識されている。
正常な状況下では、血小板は非接着状態で血管系を循環する。この非接着性は血管系をライニングする内皮細胞によって達成される。ＥＣは非血栓形成メカニズムに寄与するいくつかのファクターを有する。これらファクターは、負の表面電荷；多糖外皮におけるヘパリンスルフェート；プロスタシリン、アデノシン二リン酸、内皮誘発弛緩因子の生産及び放出である。ＥＣに関するこのような認識の下で、移植前に移植片に自己ＥＣを接種することによって人工移植片を「仮装」させることが試みられている。研究によれば、接種工程の間により多くのＥＣを移植片に結合することが、治癒の機会を増大させ、不全率を低下させることが示されている。
人工血管移植片の慢性的な不全は、主に吻合で生ずる内膜の肥厚による。内膜の肥厚をもたらす正確な原因は、人工血管の長い間の不全を説明できるほどには調査において解明されていない。内膜の肥厚は、マイナスの血管−人工器官コンプライアンスミスマッチ及び増大されたせん断応力又は機械的ダメージ（ＥＣが平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を開始させるように生長因子を合成することを促進する）によるＥＣの表皮剥落を含む多数のファクターによって開始されるらしい。
内膜の肥厚は、細胞の表皮剥落及び細胞外マトリックスの蓄積の組合せによって生ずる。筋線維芽細胞は媒体内で線維細胞を発生させ、近接する自生の血管の内膜の肥厚を導く。自生の血管から人工血管の内膜へのＳＭＣの増殖も内膜の肥厚に寄与する。このＳＭＣの増殖は存在するＥＣによって開始され、制御されると思われる。研究によれば、ＳＭＣの増殖はＥＣの下でのみ生じ、ＥＣの不存在下では生じないことが示されている。増殖は、吻合領域を除き、ＥＣの回復が進行するにつれてゆっくりとなる。
多くのＥＣ接種技術が使用されている。これらの１つは、４工程プレ凝固技術を利用する単一段階技術である。他の技術は、強制注人、静的接着接種−プレ凝固、真空細胞接種、及び内皮下細胞外マトリックス接種である。
ＥＣ接種に関する単一段階技術は、移植片のプレ凝固の間に行われる。プレ凝固法は、移植片をプレ凝固させるためにトロンビン及びフィブリノーゲンの反応の十分な利点を利用することを意図するものである。方法の第１工程はトロンビンを形成することである。これは、自己血液を移植片の管腔に注入することによって達成される。移植片における血液の凝固はトロンビンの存在を示す。この間にも、移植片の間隙においてフィブリンが形成されつつある。
ついで、この移植片に非ヘパリン化自己血液を注入して移植片を数秒間接触させる。移植片の外側から、スポンジによって過剰の血液をふき取る。ついで、非ヘパリン化自己血液の他の一部を移植片の管腔に注入して、さらに数秒間移植片と接触させる。再び、移植片の外側をスポンジで拭って過剰の血液を除去する。これら２つの工程の目的は、フィブリンを形成させ、移植片の管腔をシールするために第１の工程で発生したトロンビンを利用することにある。
最終工程は、移植片をヘパリン内に置き、血流遮断が達成されるまで繰返し移植片にヘパリン化自己血液を充満させることである。この工程では、移植片の開放端を非破壊クランプで閉止する。この最終工程の目的は、移植片の間隙を完全にシールすると共に、移植片内ですべてのトロンビンを利用することにある。トロンビンの中和はヘパリンとの反応によって行われる。この中和は、血管移植片のトロンボゲン形成性が残留トロンビンによるものであったために必要であった。このプレ凝固技術の間におけるＥＣの接種は、回収された自己ＥＣを、方法の間に使用される初めの３つのアリコートの血液中に入れることによって達成される。
静的接着接種−プレ凝固技術では、回収したＥＣを適宜な懸濁媒体（たとえば、生理食塩水又は血漿）に懸濁させ、移植片の管腔内に入れる。移植片の両端を閉止する。ついで、充満させた移植片を水平方向に置き、数分間の間隔で定期的に回転させる。付着しなかった細胞を、生理食塩水で穏やかにすすぐことによって洗い流す。ついで、この移植片を移植に利用する。
強制注入接種−プレ凝固技術では、回収したＥＣを懸濁媒体（たとえばハンクス液）に再懸濁させる。この懸濁液をヘパリン化自己血液の数個のアリコートに分ける。ついで、この血液−ＥＣ混合物をプラスチック製注射器によって移植片に強制的に注入する。移植片の両端を閉止する。これらのプレ凝固−接種注入を、血流遮断が生ずるまで続ける。静的接着プレ凝固技術に沿ったこの種のプレ凝固に伴う１つの問題点は、充分にヘパリン化された患者については正確ではないことである。これら技術に伴う他の問題点は、プレ凝固後では、表面が粗であり、トロンボゲン形成性であることである。これらが、上記プレ凝固−接種技術の２つの重大な制限である。
移植前に人工血管上において迅速なＥＣの被覆を誘発させるために、真空セルＥＣ接種技術が開発された。この技術は、移植片が置かれる特殊なチャンバーを使用するものである。移植片を一端で閉止すると共に、他端で、洗浄媒体を充填した注射器及びＥＣ懸濁液を充填した注射器を取り付ける。ついで、系を真空とし、洗浄液を移植片を通って吸引する。圧力が平衡化した後、細胞懸濁液を移植片を通って吸引する。この方法の必要条件の１つは、多孔性の移植片でなければならないことである。この方法は、移植片の管腔上に均一に分布するＥＣ層をもたらす。この技術の１つの利点は、ＥＣ接種にかかる全時間が低減されることである。一方、この技術の１つの制限は、２時間のインキュベーション期間で行われる付着ＥＣの平板化に伴い、この時点でのＥＣが主に長球状接着相であることである。
内皮下細胞外マトリックス接種技術は、移植片の管腔を均一な、天然に生成された内皮下細胞外マトリックスでコーディングすることによって開始される。この細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、フィブロネクチン又は基底膜でコーティングされた移植片と比較する際、ＥＣの結合、生長及び分化に関してより安定な人工血管の管腔をもたらす。この技術の利点は、結合性のグリコプロテイン、プロテオグリカン（ヘパリンスルフェート）、及びＥＣ生長因子を含有することである。一方、この技術の制限は、培養時間が必要となることである。第１の培養期間は、移植片の管腔上でＥＣＭを生成させるために必要である。第２の培養期間は、自生の血管と似ている管腔を形成するために要求されるＥＣの接種処理のためのものである。
これまでの血小板結合試験では、血小板の結合が血小板−表面の相互作用ポテンシャルエネルギーによって制御されることが証明されている。このポテンシャルエネルギーは、２つの表面電荷の相互作用及びこれらの補足的な表面ポテンシャル、又は総ダブル層ポテンシャルによるものである。このダブル層ポテンシャルは、表面電荷と相互作用する懸濁媒体内のイオンによって発生される。ＥＣ実験でも、結合法において電荷の相互作用が示されている。
血小板試験では、結合処理が表面電荷を一時的に変化させることによって影響されることが示されている。表面電荷がより負になると、血小板の結合処理は阻害される。これらの条件下では拡散も遅くなると思われる。表面電荷が一時的により正になると、血小板の結合処理は促進される。同様に、拡散も、より正の表面電荷状態では促進される。
表面電荷を変更してＥＣ結合に関して行った実験は、血小板について得られたものと同様の結果を示した。表面電荷の負が増大するにつれてＥＣの結合処理は低減された。一方、表面電荷の正が増大するにつれてＥＣの結合が増大した。これら実験に伴う主な問題点は、表面電荷が材料及び不変性の関数であることである。表面壁により正に電荷を与えることはＥＣの結合を促進するが、正の電荷は、人工器官又は移植片が高度にトロンボゲン形成性となる原因である。これにより、血小板の結合を増大させ、血栓による移植片の不全をきたす。
これら実験の間の他の類似点は、一旦細胞が表面と接触することによる結合処理であることにある。細胞が表面に固着すると、血小板（ＥＣと共に）は偽足を延ばすことによって結合を開始する。ついで、細胞の中心部がこれら偽足につづいて平板化し、表面に結合する。結合処理のこの部分は、偽足を連結する「ウェビング（Webbing)」に似ている。正常な状況下では、ＥＣに関する結合及び拡散はが、どこでも、表面の条件に応じて数分から数時間を要する。
上述したように、表面電荷の変化は拡散時間を増大又は低減させる。接種されたＥＣの拡散を増大させることは、当該方法の重大な態様である。研究によれば、流動条件下での人工血管移植片材料へのＥＣの結合は、ＥＣ−表面の相互作用及び初めにせん断応力にさらされる以前の結合及び拡散に許される時間に左右されることを示した。強制注入ＥＣ接種技術を使用した場合、初めの数分間でＥＣの７０％程度が移植されたＥＣ接種移植片から除去され、３０分から２４時間で３．７％／時間が失われる。
提案された方法の実施後の移植片の表面に結合したＥＣの形態は、環状で、平板化したものであろう。環状で、平板化したＥＣは、移植によるせん断応力にさらされる際に、より延長され、平板化された形状に形態を変化させるものと推測される。多くの研究では、ＥＣは、局部的なせん断応力に応対して流れの方向と平行に再度整列することが示されている。
また、走査及び透過電子顕微鏡による研究では、表面のフリーエネルギーが移植片と平板化繊維芽細胞との間の接触部位の数を決定することが証明されている。高い表面フリーエネルギーは細胞の結合、拡散及び接触部位を増進させる。表面と繊維芽細胞との間の広い接触領域、接触部位も、表面電荷の負がより小さい場合に得られる。さらに、表面の電荷の負が増大することは接触領域の低減をきたすことが示されており、これにより、細胞結合処理において細胞−表面の静電的相互作用の重要性が示されている。
既に検討したように、小径の血管移植片に伴う１つの問題点は、これらが閉塞状態になり易いことである。ＤＮＡのトランスフェクション、すなわち、有益なＤＮＡストランドを媒体に取り込むことは、媒体の所望の特性を増大させることが知られている。接種されたＥＣの遺伝子的変性は、閉塞を阻止するために、ＥＣの平滑筋抗増殖性と共に、抗−トロンボゲン形成性を増大させる。容器（たとえば、セル又はペトリ皿）内において当該容器に電位を印がすることによるインビトロでのＤＮＡのトランスフェクション又はエレクトロポレーションの利用法が知られている。残念なことは、内皮細胞を接種する際のＤＮＡの静電的又はエレクトロポレーショントランスフェクションのための公知の方法はない。
従って、移植片の表面をトロンボゲン形成性にすることなく、非トロンボゲン形成性の移植片の表面に内皮細胞を静電的に接種するための装置及び方法を得ることが最も強く望まれている。さらに、ＥＣの結合を増大させるために負に帯電した材料の表面電荷を一時的に小さい負に帯電した表面に変化させ、ついで当該表面を元の負の表面電荷に戻すことが望まれている。当分野では、血管移植片の管腔壁上にＤＮＡプラスミドをトランスフェクトさせ、かつ同時に内皮細胞を接種したいとの要求もある。
発明の開示
上記に鑑み、本発明の目的は、小径（＜６mm）の人工血管の移植に先立って行われる接種の間においてＥＣの結合を増大させるための内皮細胞（ＥＣ）の接種技術及び装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、内皮細胞の結合及び成熟を増大させるために、重力と共に静電力を利用する上記ＥＣの接種技術及び装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、非トロンボヘゲン形成性である移植片表面上への増大された内皮細胞の結合を、該表面をトロンボゲン形成性とすることなく提供する上記ＥＣの接種技術及び装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、非トロンボゲン形成性の表面を一時的により正の電荷状態として、接種の間、該表面を内皮細胞に対してより誘引性なものとし、接種後移植片の材料を非トロンボゲン形成性の元の自生の負の表面電荷に戻すことができる上記のＥＣの接種技術及び装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、小径移植片を閉塞させる血栓を阻止し、人工器官の増大された長期間の開通性の結果、非内皮化域の治癒を可能にする上記ＥＣの接種技術及び装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、小径の人工血管の長期間の開通率をさらに増大させるＤＮＡのトランスフェクション及びＥＣの接種技術を提供することにある。
本発明の上記及び他の目的（詳細な説明の進行につれて明らかになるであろう）は、人工血管の管腔表面を変性させる装置において、変性されるべき管腔表面上の電荷を一時的に変化させる導体手段；及び内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの少なくとも１つを含有する懸濁液を管腔表面に近接して保持する支持手段を包含してなり、電荷の変化が、内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの少なくとも１つを懸濁液から管腔壁へ移動させるものである人工血管の管腔表面を変性させる装置によって達成される。
本発明の他の目的は、人工血管の管腔壁上に内皮細胞を接種すと共に、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトさせる装置において、該装置は、その長さ全体に延びる孔を有する外部導体；前記孔内に収容される人工血管内に収容されるように適合する内部導体；前記外部及び内部導体を通って電位を印加する電圧源を包含してなり、これによって、内皮細胞及びＤＮＡプラスミドを含有する懸濁液を人工血管に充満させ、しかも人工血管を内部導体上に封閉状で装着すると共に、外部導体の孔内において内部導体から間隔をおいて保持し、電圧源によって導体間に電位を印加して、人工器官の表面電荷を一時的に変化させて内皮細胞の結合及びＤＮＡプラスミドの内皮細胞へのトランスフェクションを容易なものとする人工血管の管腔壁上に内皮細胞を接種すると共に、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトさせる装置によって達成される。
本発明の他の目的は、人工血管の管腔壁に内皮細胞を接種し、ＤＮＡをトランスフェクトさせる方法において、前記人工血管の管腔を通って内部導体ワイヤを通し；該内部導体ワイヤの周りで人工血管の１つの端部を密閉し；充填装置内において前記内部導体ワイヤ及び人工血管を直立位置で懸架し；前記人工血管に内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの懸濁液を充満させ；前記人工血管の他の端部を密閉し；孔を有する外部導体を用意し；前記内部導体及び人工血管をこの孔内に入れ；前記人工血管を回転させ；及び前記人工血管を回転させながら、内部及び外部導体間に電位を一時的に印加する各工程を包含してなる人工血管の管腔壁に内皮細胞を接種し、ＤＮＡをトランスフェクトさせる方法によって達成される。
図面の説明
本発明の目的、技術及び構造が完全に理解されるように、以下の詳細な説明及び添付図面を参照する。
図１は、再懸濁液が酸化防止剤を含有するものである場合の平行板コンデンサー結合試験の結果を示すグラフであり；
図２は、再懸濁液が酸化防止剤を含有しないものである場合の図１と同様のグラフであり；
図３は、本発明による装置の側面図であり；
図４は、図３の装置の平面図であり；
図５は、図４の装置の線５−５に沿った断面図であり；
図６は、図４の装置の線６−６に沿った断面図であり；
図７は、本発明による充填装置の側面図であり；
図８は、本発明による１つの方法の工程を示すフローチャートであり；及び
図９は、本発明による他の方法の工程を示すフローチャートである。
発明を実施するための最良の形態
上述の技術背景を考慮しながら、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の結合に関する平板化エキスパンデッドポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）移植片材料の表面電荷の変化の影響を測定するため、平行板コンデンサーを使用してＨＵＶＥＣについて実験を行った。ＨＵＶＥＣを培養し、回収した後、細胞を計数してＨＵＶＥＣ／mlの数を算出した。平板化ｅ−ＰＴＦＥ移植片上の位置に保持したTeflon（E. I. du Pont de Nemours & Co.の登録商標）製リング内に、Dulbeccoリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液中に懸濁化させたＨＵＶＥＣの静止プールを置くことによって実験を行った。
ＨＵＶＥＣについて３つの実験を行った。第１は、ＥＣの形態を比較するために、非誘発表面電荷をもつ移植片上でのＥＣ結合の量及び質を測定するコントロール実験である。この実験を酸化防止剤を使用した場合及び使用しない場合の両方について行った。
第２の実験は、コンデンサーのプレートの間に置かれ、電位が印加された際の移植片上におけるＥＣ結合の量及び質を測定するためのものである。
第３の実験は第２のものと同様ではあるが、ＨＵＶＥＣ−ＤＰＢＳ溶液中に酸化防止剤が含まれる。
ＥＣは非合流状態ではより活性であり、合流状態では活性が劣る傾向があるため、各実験を合流及び非合流ＨＵＶＥＣの両方を使用して実施した。接触相互作用は増殖阻止及び膜安定性をもたらす。非合流の場合（ＥＣ間の接触が非常に少ない）は、増殖の間に活性なＥＣ状態をもたらす。このように、実験１及び３における酸化防止剤の存在は、活性状態にある間、ＥＣ膜を保護する。
実験２及び３については、印加電圧０．７５Ｖ、１．５０Ｖ及び１０．０Ｖを使用して行った。
ついで、各実験に関して、長球状、平円盤状及び平板化状のＨＵＶＥＣの数を測定し、印加電圧、合流及び非合流状態の影響及び酸化防止剤の影響を比較した。
得られた結果から、ｅ−ＰＴＦＥ上での内皮細胞の結合及び拡散は表面電荷によって影響を受けることが確認された。さらに、結果は、ｅ−ＰＴＦＥ材料における誘導された正の電荷の程度が増大することにより、（１）結合するＨＵＶＥＣの総数；（２）結合した平板化状ＨＵＶＥＣの総数及び百分率；及び（３）結合した平円盤状ＨＵＶＥＣの総数を増大させることを示す。
結果は、合流及び非合流ＨＵＶＥＣの間におけるデータの傾向をも示す。図１及び２から明らかなように、結合した平円盤状ＨＵＶＥＣの百分率及び総数は非合流に関して大きく、一方、長球状ＨＵＶＥＣの百分率及び総数は合流に関して大きい。しかしながら、酸化防止剤を含有する実験及び含有しない実験の間には顕著な傾向は見られない。従って、本発明は、小径の人工血管への内皮細胞の接種について、上述の実験結果の利点を適合させるために開発されたものである。
図面、特に図３〜７に関し、内皮細胞の静電的接種のための装置が総括的に符号１０で示されていることがわかる。装置１０は概略的に外部導体１１、内部導体１２、支持組立体１４、駆動機構１５、充填装置１６及び電圧源１８を包含する。
外部導体１１は、同心の内部孔１９を有する中空円筒形部材である。外部導体１１は、好適には、３０３ステンレス鋼のような適宜の機械加工可能な金属で造られている。導体１１は、移植片の重金属汚染を防止するために、適宜の導電性ポリマーで被覆されるか、あるいは代わりにこの導電性ポリマーで全体的に造られていることが望ましい。変形例では、誘電性被覆の非導電性ポリマーが採用されてもよい。導体１１はその外面２１に端部２２ａ及び２２ｂにそれぞれ接近して一対の固定ねじ溝２０ａ及び２０ｂを備えている。同様に、導体１１の面２１には、両溝２０のほぼ中間に駆動溝２３が設けられている。
特に図５に関し、内部導体１２は、好適には、W. L. Gore & Associates, Inc.の登録商標であるＧＯＲＥ−ＴＥＸ（登録商標）で被覆したＡＷＧ２２銀メッキ銅のような導電ワイヤ２４の素線から成っていることがわかる。ワイヤ２４の端部２６の各々は端末端子２７に固着されている。端末端子２７は、好適には、ニッケルメッキ銅の玉軸受スイベルである。導体１２は、ワイヤ２４に直接にモールド成形した一対のシリコンゴムプラグ２８をさらに備えている。説明を続行するにつれて明らかとなり得る理由のため、プラグ２８は、接種される移植片の内径に近い外径を有する。同様に、プラグ２８は、接種される移植片の長さよりも幾分短い距離をワイヤ２４に沿って互いに離間されている。プラグ２８は、E. I. du Pont de Nemours & Co.の登録商標であるＴｅｆｌｏｎ（登録商標）又は他の適宜の材料で作った分離モールド型を用い、Dow Cornig Corp.の登録商標であるＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）のような弾性ケイ素化合物からモールド成形できることが当業者には理解されよう。
再び図３及び４に関し、支持組立体１４は、脚３１を固着した台板部分３０を包含する。一対の端部支持体３２が台板３０の両端に配置されている。端部支持体３２は、好適には、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）で造られたブロックである。第１端部支持体３２ａは、実質的に心出しされた多少大きいプラグ受け孔３６を備えている。第２端部支持体３２ｂは、ねじ丸環３５ｂを受けるためのねじ穴３４ｂを備えている。図示のように、端部支持体３２は台板３０の側部３９の切欠部３８を介して台板３０に装着されている。支持プラグ３７がプラグ受け孔３６に収容されるようになっている。支持プラグ３７は同様にＴｅｆｌｏｎ（登録商標）のような適宜の材料で造られており、全体的に円筒形の頭部分４１及び縮径本体４５を包含する。プラグ３７の端面４９には、ねじ丸環３５ａを受けるためのねじ穴３４ａが設けられている。従って、プラグ３７の頭部分４１の径は端部支持体３２ａのプラグ受け孔３６の径よりも幾分小さいことが理解されよう。図示のように、コイルスプリングテンショナー５３がねじ丸環３５ａに取付けられている。
支持組立体１４はさらに、外部導体１１を回転可能に軸支するための支持マウント又はピローブロック４０を備えている。従って、外部導体１１は一対の軸受４２内に嵌装され、固定ねじ４３を軸受固定カラー４４内へ締付けて導体１１の外面２１の固定ねじ溝２０に係合させることによって、この軸受に固着される。軸受４２はピローブロック４０内に装着され、このピローブロックは台板３０に装着されている。非導電性ガスケット４６がピローブロック４０と台板３０との間に介装されてピローブロック４０を台板３０から電気的に絶縁する。導体１１の孔１９は端部支持体３２ａ及び３２ｂのそれぞれの孔３６及び穴３４と軸線方向に整合していることに注目されたい。
図７に示されているように、充填装置１６は、両端に配置された一対の端部分４８を有する支持部分４７を包含する。端部分４８ａは、支持組立体１４に関して前述した支持プラグ３７を収容するための孔５０を備えているのに対し、端部分４８ｂはねじ丸環３５ｃが設けられている。図示のように、端部分４８は、プラグ受け孔５０がねじ丸環３５ｃと軸線方向に整合するように支持部分４７の両端に配置されている。
次に図４及び６に関し、駆動機構１５は、支持組立体１４の台板部分３０に固定されたモータ支持台５１を包含する。モータ５２が取付ブラケット５４を介してモータ支持台５１に装着されている。モータ５２は、好適には、１１５Ｖ／６０Ｈｚで動作し時計回転方向に約１／１２ＲＰＭで動き得る同期Ａ．Ｃ．モータである。駆動滑車５５がモータ軸５６に装着されている。滑車５５は強化ナイロン又は他の適宜の材料で作られていてよい。駆動ベルト５８が外部導体１１の駆動溝２３に嵌装され、滑車５５に駆動的に係合する。
電圧源１８は、フルスケール読みで±０．０５％の精度でもって出力０〜２０Ｖを発生できる普通のマルチレンジ電圧キャリブレータであってよい。正リード線５９がピローブロック４０を介して外部導体１１に電気的に接続されるのに対し、負リード線６０がねじ丸環３５ａを介して内部導体１２に接続されている。従って、人口器官を横切って電位が印加され得る。前述したように、人口器官の管壁へのより多くの正電荷はこの管腔壁へのＥＣの結合を促進する。一度電位が除去されると、移植片は、血小板の誘引を防止してその凝固を最小限にするその初期電荷状態に戻る。
動作において、自己ＥＣを接種される小径人工血管又は移植片７０が、ワイヤ２４の端部２６を移植片７０の管腔に通すことによって、内部導体１２に取付けられる。移植片７０がプラグ２８を越えて位置され、２−Ｏ絹縫合糸又は同等物を用いながらこの移植片７０を下方プラグ２８ａに着座させることによって、導体１２に固着される。これにより、移植片７０とプラグ２８ａとの間には接種処理中の流体漏洩を防止するためのシールを生起する。ついで、ワイヤ２４の両端部２６が端部分４８ａ及び支持プラグ３７のそれぞれのねじ丸環３５ａ及びスプリング５３に固定される。次に、支持プラグ３７が充填装置１６の端部分４８ｂに装着されて、移植片７０の開放端部７１が上方に面する。その後、移植片７０には、移植片７０内の空気を無くすようにオーバーフロー点までＥＣ−生理食塩水がゆっくり充満される。移植片７０への充満が終了すると、開放端部７１が下方プラグ２８ａでしたと同様の方法で絹縫合糸を用いながら上方プラグ２８ｂに固着される。
移植片７０が充填され密閉された後、内部導体１２が充填装置１６から取外され、支持組立体１４に移される。内部導体１２は、リード線（図示しない）を用いながらワイヤ２４の端部２６を孔１９に通すことによって、外部導体１１内に装架される。それから、内部導体１２の両端末端子２７が図示のように端部支持体３２に固着される。
次に、外部導体１１の回転を開始するようにモータ５２を付勢することにより、移植片７０内でのＥＣの接種が行われる。同時に、電圧源１８により装置１０を横切って電位が印加される。内部及び外部導体が円筒形コンデンサーとして働く一方、移植片材料がこれら導体の間に介在される誘電体として働くことが当業者には理解されよう。こうして、ＥＣ結合のためのより良い環境を与えるために、移植片管腔の表面電荷がより一層正の状態に一時的に変更されるのである。接種処理が完了した後、電位が除去され、移植片の表面電荷はその初期のより一層負の非トロンボゲン形成性に戻る。ついで、移植片は絹縫合糸を抜くことによって内部導体から取外される。移植片は、余分のＥＣ−生理食塩水を除去するようにゆっくりすすがれた後に移植に供される。
本発明の方法は装置の作動に関する上述の検討により明らかであろうと考えられるが、図８を参照して、好適な方法について簡単に述べる。第１の工程は、移植法にとって適切なサイズ及び品質の人工血管を選択することである。次に、内部導体上で、人工器官内で適合するために適切なサイズのプラグをモールド成形する。同種の内皮細胞を回収し、懸濁媒体中に懸濁させる。内部導体を人工器官の管腔内を通し、人工器官の１つの端部を成形したプラグの１つで密閉することによって、内部導体を人工器官に取り付ける。ついて、人工器官を支持する内部導体を、その端末端子を第１の端末部分のねじ丸環及び支持プラグのばねにそれぞれ接続することによって充填装置内に直立して懸架する。直立して懸架された人工器官について、懸濁内皮細胞液を充満させてオーバーフローさせる。人工器官が充満されたところで、その開放端末を残りの成形プラグによって密閉する。
充満された人工器官を密閉した後、端末端子を第１の端末部分のねじから取外し、支持プラグを第２の端末端子から取外すことによって、充填装置から取出し、接種装置に移す。人工器官及び内部導体を、取外した端末端子を外部導体の孔を通って通し、孔内に人工器官を引き入れることによって接種装置に装着する。ついで、取外した端末端子を第１の支持ブロックのねじ丸環に接続し、一方、支持プラグを第２の支持ブロックの孔に取付ける。内部導体及び人工器官が接種装置に装着されたところで、モータを付勢することによって外部導体の回転を開始する。同時に、電力源を付勢することによって両導体間に電位を印加する。これにより、人工器官の管腔壁の表面電荷が一時的により正の状態に変化し、内皮細胞がより平板化した状態で管腔壁に結合することを可能にする。
本発明の他の具体例では、装置１０はＥＣ細胞と共にＤＮＡをトランスフェクトさせるためにも使用できることが認められる。移植片７０に同時にＤＮＡをトランスフェクトし、ＥＣを接種することによって、移植片の長期間の開通性が延長される。当業者により認められるように、血小板が結合しないようにするため移植片の管腔壁に抗凝固剤特性を付与するように特殊なＤＮＡプラスミドが選択される。さらに、身体の特別な部位への病気又は癌に対する医薬品の分配を容易なものとするために、移植片へＤＮＡプラスミドをトランスフェクトさせることができる。
図３〜５に見られるように、第１の電圧源１８と並列に第２の電圧源１００を接続できる。電圧源１００（好適な具体例では、選択された期間、選択された電圧で方形波パルスを放出できるＨｏｅｆｅｒホエフェプロジェネレーターパルスコントローラーである）は、移植片７０の電気衝撃を行って移植片へのＤＮＡのトランスフェクションを開始する。後述の詳細な説明において明らかになるように、パルス電位及びその期間は、トランスフェクションが狭い電圧及び期間範囲でのみ達成されるため、効果的なトランスフェクションには重要である。電圧源１８及び１００は、内皮細胞を接種しかつ適宜のＤＮＡをトランスフェクトさせるために必要な電位の印加を行う単一電圧源として具体化されうる。
同時に内皮細胞のトランスフェクション及び接種を行うため、酸化防止剤（１×１０^-4）アスコルビン酸ナトリウム、３．６×１０^-5Ｍグラチオン及び１．３×１０^-3Ｍジメチルスルホキシド）を含有するDulbeccoリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）又は他の同様の溶液にＥＣを懸濁させる。酸化防止剤は、電気刺激の際の細胞膜の損傷及びつづくフリーラジカルの発生を最小にするために存在する。ＤＰＢＳにおけるＥＣの濃度は約５×１０⁶ＥＣ／mlである。この濃度は、ｅ−ＰＴＦＥ移植片材料のＥＣ接種に最適なものとして決定されたものであり、同時に静電的ＥＣ接種法においても使用されている。もちろん、他の種類の移植片について使用されるサイズ及び材料に応じて他の濃度も使用できる。セル中での細胞懸濁液を使用するエレクトロポレーションの間におけるこのＥＣ濃度は、約１０⁶〜１０⁷細胞／mlの最適範囲内である。当業者によって認められるように、細胞濃度が低くなれば衝撃後の細胞の回収が乏しくなり、一方高濃度では、望ましくない細胞融合が生ずる。溶液中には、通常リニアライズドＤＮＡプラスミドの形のトランスフェクトされるべきＤＮＡも含まれる。直線状ＤＮＡプラスミドは、エレクトロポレーションの間に安定なトランスフェクションが得られるように要求される。好適な具体例では、接種／トランスフェクション溶液又は懸濁液における直線状ＤＮＡの濃度は１〜２μｇ／μｌの範囲である。ついで、この溶液又は懸濁液を充填装置及び上述の方法を使用して移植片７０内に入れる。同様に、前記具体例で使用した方法に従って、移植片７０と共に内部導体の外部導体内への装着を行う。
移植片７０にＥＣ−ＤＰＢＳ−プラスミド溶液を充満させた後、内部導体１２及び移植片７０を外部導体１１内に入れる。ＥＣのトランスフェクションを開始するため、細胞にエレクトロポレーション衝撃を与える。これは、電圧発生器１００により、外部及び内部導体１２及び１１の間に２０００Ｖ以下の電圧を約８μ秒以下の期間（５秒間隔で９回まで繰返すことができる）で印加することによって行われる。もちろん、電圧、期間及び電気衝撃を与える回数は、移植片７０のサイズ及び材料に応じて調整される。電圧源１００によって発生される通し電圧も、装置１０内において、細胞の損傷を防止するための最少量に制限される。さらに、装置の温度を約２２℃（７２°Ｆ）に維持することによって損傷を低減できる。内皮細胞の接種を開始するため、電圧源１８から外部及び内部導体１２及び１１に、特別な移植片の材料及び直径についてＥＣの接種で最適なものとして決定された期間電圧を印加する。この電位は２０Ｖ以下であり、いずれにしても１分〜２時間の期間印加される。この印加された電位はＥＣの結合を促進させるだけでなく、移植片の管腔表面上の維持され、衝撃を受けたＥＣにＤＮＡを吸着させることによってトランスフェクション効果にも寄与する。
前記具体例のように、トランスフェクション−接種操作の完了後、移植片７０を外部導体１１から取出し、ついで内部導体１２から取外す。ついで、接種され、トランスフェクトされた移植片を無菌のＤＰＢＳですすいで余剰の細胞又はプラスミドを除去する。すすいだ後、移植片を移植に供する。しかしながら、高い電圧の印加前に行われるＥＣの接種法（低い電圧の印加）が有利であることが評価されるであろう。加えて、使用した特別な移植片の材料及びＤＮＡの特性に応じて、接種／トランスフェクション操作を容易なものとするため、各種の電位の印加の組合せが使用される。
上述に基づき、同時トランスフェクション／接種法の利点は明らかであろう。第１に、この装置及び関連する方法は、接種されたＥＣの遺伝子的変性を容易なものとして、ＥＣの平滑筋抗−増殖特性と共に、抗−トロンボゲン形成性を増大させる。このように、上述の装置の使用は、小径人工血管の使用において現在遭遇している煩雑さ及び不全（現在、その開通性を低減させ、臨床的試みでの広範な利用を妨げている）低減又は解消する。この具体例の他の利点は、移植片の管腔表面で維持された表面電荷（ＥＣの結合を増大させる）がトランスフェクション効果を増大させるように働くことである。この増大された効果は、ＥＣと接触する表面に対する負に帯電したＤＮＡの吸引によって生ずる。さらに、誘発された管腔表面電荷は、初めの高い電気衝撃によって誘発された極性を保ち、管腔表面上に結合した細胞への多くの外来ＤＮＡの通過を許容できる。
このように、本発明の目的が上述の構造体によって満足されたことが理解できる。法の規定に従って最良の形態及び好適な具体例についてのみ詳述したが、本発明はこれらに又はこれらによって制限されないことは理解されなければならない。従って、本発明の真の精神及び範囲の評価については、以下の請求の範囲が参照されなければならない。

Claims (38)

1. 人工血管の全表面上に内皮細胞をインビトロで接種する装置において、開口のない内部導体及び該内部導体から間隔を置いて配置された外部導体を設けることによって、接種されるべき全表面上の電荷を一時的に変化させるための導体手段；及び前記導体手段によって表面上の電荷を一時的に変化させる間に、前記内部導体及び外部導体の間に接種されるべき全表面を保持する、細胞を含有する溶液を前記接種されるべき表面と接触状態に維持するための支持手段を包含してなる、人工血管の全表面上に内皮細胞をインビトロで接種する装置。
2. 導体手段が、さらに、内部及び外部導体の間及び前記人工血管の全表面を通って電位を印加する電圧源を包含してなるものである、請求項１記載の装置。
3. 内部導体が、連続する長い導電性ワイヤであって、該ワイヤを通って溶液が流動できない導電性ワイヤでなるものである，請求項２記載の装置。
4. 外部導体が長さ全体に延びる孔を有する長い導電性物質である、請求項２記載の装置。
5. 内部導体が、外部導体の孔内に配置され、これらの間に等しく離れた所定の距離で保持される、請求項４記載の装置。
6. 支持手段が、内部導体と係合する少なくとも１つの装着部材を包含してなるものであり、この少なくとも１つの装着部材が、接種されるべき表面を内部導体に対して間隔を置いて配置された関係に維持する、請求項３記載の装置。
7. 接種されるべき表面が少なくとも１つの装着部材と密閉係合で保持される、請求項５記載の装置。
8. 少なくとも１つの装着部材がワイヤ上でモールド成形された柔軟なプラグである、請求項６記載の装置。
9. 導体手段が、さらに、接種されるべき表面を回転させるための駆動手段を包含してなる、請求項２記載の装置。
10. 導体手段が、さらに、外部導体を回転可能に支持するための支承手段を有する支持組立を包含してなる、請求項２記載の装置。
11. 支持組立体が、内部導体を外部導体の孔内に保持及び緊張させるための手段を包含する、請求項９記載の装置。
12. 駆動手段が、モータ及び該モータ及び外部導体に駆動可能に接続された駆動ベルトを包含してなるものである、請求項８記載の装置。
13. 人工血管の管腔壁の実質的に全体上に内皮細胞をインビトロで接種するための装置において、該装置は、その長さ全体に延びる孔を有する外部導体；長い導電性ワイヤを含む内部導体であって、該ワイヤは前記外部導体の前記孔内に同心的に配置され、接種されるべき人工血管と密閉係合するものである内部導体；台板、該台板から延びる少なくとも１つの支持ブロック；前記台板上に装着された少なくとも１つのベアリングマウント、及び前記少なくとも１つのベアリングマウント内に外部導体を回転可能に支承する少なくとも１つのベアリングを有する支持組立体；接種されるべき人工血管を選択的に回転させるための駆動組立体であって、該駆動組立体は、モータ及び該モータに対してかつ人工血管と駆動伝達関係で接続された駆動ベルトを包含するものである駆動組立体；及び外部及び内部導体の間に及び管腔壁の実質的に全体を通って電位を印加する電力源を包含してなり、これにより、内皮細胞溶液が充満された人工血管が前記内部導体上に密閉装着されると共に、前記外部導体の前記孔内に前記内部導体から等しく間隔を置いて配置された関係で保持され、前記駆動組立体が人工血管を回転させる間に、前記電圧源は前記導体間に電位を印加し、これによって、内皮細胞の管腔壁の実質的に全体への結合を容易にするように人工血管の表面電荷を一時的により正の状態に変化させ、前記電圧源の除去が人工血管を非−トロンボゲン形成性に戻すことを特徴とする、人工血管の管腔壁の実質的に全体上に内皮細胞をインビトロで接種する装置。
14. さらに、人工血管が充満及び密閉される間、内部導体及び接種されるべき人工血管を支持するための充填装置であって、該充填装置は、台板及びこの台板から延びる一対の支持ブロックを有してなり、人工血管が充満及び密閉される間に、内部導体が前記支持ブロック間に懸架される充填装置を包含するものである、請求項１３記載の装置。
15. 内部導体が、その上でモールド成形された少なくとも１つの弾性プラグ部材を有し、該少なくとも１つの弾性プラグ部材が、接種されるべき人工血管の内径に相当する直径を有する、請求項１３記載の装置。
16. 人工血管の全管腔壁上に内皮細胞をインビトロで接種する方法において、人工血管の管腔を通って開口のない内部導体絶縁ワイヤを通し；該内部導体ワイヤの周りで人工血管の１つの端部を密閉し；懸濁した内皮細胞を含む溶液を人工血管に充満させ；人工血管の他の端部を密閉し；内部導体及び人工血管を外部導体の孔の中に入れ；人工血管を連続して回転させ；及び人工血管を回転させている間に、内部及び外部導体間及び管腔壁を通って電位を一時的に印加して、全管腔壁への内皮細胞の結合を容易なものとするように全管腔壁の表面電荷を一時的に変化させる各工程を包含してなる、人工血管の全管腔壁上に内皮細胞をインビトロで接種する方法。
17. さらに、人工血管の管腔を通って内部導体ワイヤを通す前に、内部導体ワイヤ上で少なくとも１つのプラグ部材をモールド成形する工程を包含し、前記プラグ部材の直径が人工血管の内径に相当するものである、請求項１６記載の方法。
18. 人工血管を密閉する工程を、該人工血管の両端部をプラグ部材に封止することになって行う、請求項１７記載の方法。
19. さらに、内部導体ワイヤ及び人工血管が外部導体の孔内にある間に、一対の支持ブロックの間に内部導体ワイヤ及び人工血管を装架する工程を包含する、請求項１６記載の方法。
20. 人工血管移植片のさらされる全管腔表面をインビトロで変性させるための装置において、外部導体から離して配置された開口のない内部導体を設けることによって変性されるべき管腔壁上の電荷を一時的に変化させる導体手段；及び内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの少なくとも１つを含有する懸濁液を全管腔壁に近接して保持及びさらす支持手段を包含してなり、前記支持手段は管腔壁を前記外部導体及び内部導体の間に維持し、電荷の変化が、内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの少なくとも１つを懸濁液からさらされる管腔壁へ移動させるものである、人工血管移植片のさらされる全管腔表面をインビトロで変性させるための装置。
21. 導体手段が、さらされる管腔壁を通って提供される電荷を変化させ、これによって、懸濁液内の内皮細胞をさらされる人工血管移植片の全管腔壁に結合させる、請求項20記載の装置。
22. 導体手段が、さらに、内部及び外部導体間に約２０Ｖ以下の電位を印加するための第１の電圧源を包含するものである、請求項２１記載の装置。
23. 懸濁液が内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの両方を含有するものであり、導体手段が、さらされる管腔壁を通って提供される電荷を変化させ、これによって、懸濁液内のＤＮＡプラスミドを少なくとも内皮細胞にトランスフェクトさせる、請求項２２記載の装置。
24. 導体手段が、さらに、内部及び外部導体間に約２０００Ｖ以下の電位を印加するための電圧源を包含するものである、請求項２３記載の装置。
25. 導体手段が、内部及び外部導体間に２つ電位の一方を印加する一対の電力源を包含してなり、これら電位の１つは懸濁液内の内皮細胞を管腔壁に結合させるために約２０Ｖ以下の範囲のものであり、他は懸濁液内のＤＮＡプラスミドを少なくとも内皮細胞にトランスフェクトさせるために約２０００Ｖ以下の範囲のものである、請求項２０記載の装置。
26. 外部導体が、懸濁液が充満された血管移植片を支持するために、長さ全体に延びる孔を有する長い導電性物質であり、内部導体は血管移植片内に配置される、請求項２５記載の装置。
27. さらに、外部導体を回転させるための駆動手段を包含してなる、請求項２６記載の装置。
28. 人工血管の管腔壁上に内皮細胞をインビトロで接種すると共に、ＤＮＡをトランスフェクトさせる装置において、該装置は、その長さ全体に延びる孔を有する外部導体；前記孔内に同心的に収容される人工血管に受け入れられる内部導体であって、該内部導体を通って流体の流動が生じない内部導体；前記外部及び内部導体を通って電位を印加する電圧源を包含してなり、これによって、内皮細胞及びＤＮＡプラスミドを含有する懸濁液を人工血管に充満させ、しかも、人工血管を内部導体上に密閉状で装着すると共に、外部導体の孔内において内部導体から間隔を導いて保持し、電圧源によって導体間及び管腔壁の全体に電位を印加して、管腔壁が誘電材料として働くと共に、より正の状態に変化され、これによって、一時的に人工器官の表面電荷を一時的に変化させて内皮細胞の結合及びＤＮＡプラスミドの内皮細胞へのトランスフェクションを容易なものとし、前記電位の除去が人工血管をより負の非−トロンボゲン形成性に戻すことを特徴とする、人工血管の管腔壁上に内皮細胞をインビトロで接種すると共に、ＤＮＡをトランスフェクトさせる装置。
29. さらに、人工血管に懸濁液が充満及び密閉される間、内部導体及び接種されるべき人工血管を支持するための充填装置であって、該充填装置は、台板及びこの台板から延びる１つの支持ブロックを有してなり、人工血管が充満及び密閉される間に、内部導体が前記支持ブロック間に懸架される充填装置を包含するものである、請求項２８記載の装置。
30. 内部導体が、その上でモールド成形された少なくとも１つの弾性プラグ部材を有し、該少なくとも１つの弾性プラグ部材が、接種されるべき人工血管の内径に相当する直径を有する、請求項２８記載の装置。
31. さらに、台板、該台板から延びる少なくとも１つの支持ブロック；前記台板上に装着された少なくとも１つのベアリングマウント、及び前記少なくとも１つのベアリングマウント内に外部導体を回転可能に支承する少なくとも１つのベアリングを有する支持組立体；及び人工血管を回転させるための駆動組立体を包含してなり、該駆動組立体がモータ及び該モータと外部導体との間を接続する駆動ベルトを包含するものである、請求項２８記載の装置。
32. 電圧源が、内部及び外部導体間に２つ電位の一方を印加するものであり、これら電位の１つは懸濁液内の内皮細胞を管腔壁に結合させるために約２０Ｖ以下の範囲のものであり、他は懸濁液内のＤＮＡプラスミドを少なくとも内皮細胞にトランスフェクトさせるために約２０００Ｖ以下の範囲のものである、請求項３１記載の装置。
33. 人工血管の全管腔壁上に内皮細胞をインビトロで接種し、ＤＮＡをトランスフェクトさせる方法において、前記人工血管の管腔を通って開口のない内部導体絶縁ワイヤを通し；該内部導体ワイヤの周りで人工血管の１つの端部を密閉し；充填装置内において前記内部導体ワイヤ及び人工血管を直立位置で懸架し；前記人工血管に内皮細胞及びＤＮＡプラスミドの懸濁液を充満させ；前記人工血管の他の端部を密閉し；孔を有する外部導体を用意し；前記内部導体及び人工血管をこの孔内に入れ；前記外部導体及び人工血管を回転させ；及び前記人工血管を回転させながら、内部及び外部導体間及び管腔壁を通って電位を一時的に印加して、管腔壁への内皮細胞の結合及びＤＮＡのトランスフェクションを容易なものとするように全管腔壁の表面電荷を一時的に変化させる各工程を包含してなる、人工血管の管腔壁に内皮細胞をインビトロで接種し、ＤＡＮをトランスフェクトする方法。
34. さらに、人工血管の管腔を通って内部導体ワイヤを通す前に、内部ワイヤ上で少なくとも１つのプラグ部材をモールト成形する工程、及び内部導体ワイヤ及び人工血管が外部導体の孔内にある間に、一対の支持ブロック間で前記内部導体ワイヤ及び人工血管を装架する工程を包含し、前記プラグ部材の直径が人工血管の内径に相当するものである、請求項３３記載の方法。
35. 電圧を印加するに当たり、さらに、ＤＮＡプラスミドを内皮細胞にトランスフェクトさせるために、電位を少なくとも８μ秒以下の期間、２０００Ｖ以下の電圧で変更させる、請求項３４記載の方法。
36. 電圧を印加するに当たり、さらに、内皮細胞を人工血管の管腔壁に接種するために、電位を２時間以下の期間、２０Ｖ以下の電圧で変更させる、請求項３４記載の方法。
37. さらに、約１０⁶〜１０⁷内皮細胞／ml及び線状ＤＮＡプラスミド約１〜２μｇ／μlを有する変性Dulbeccoリン酸塩緩衝化生理食塩水でなる懸濁液を用意する工程を包含する、請求項３４記載の方法。
38. さらに、酸化防止剤を含有する懸濁液を用意する工程を包含する、請求項３７記載の方法。

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