JP3848960B2 - 微粒子の予備検査方法、微粒子検出方法、及び微粒子検出器具セット - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、病原菌などの有害物質、あるいは特定核酸等を含む試料を取り扱う場合に、その作業の安全性，妥当性等を確認し、または試料の飛散状況を事前に検査するために使用される微粒子の検出法及び検出器具に関する。特に、核酸等を含有する極微量の溶液試料を操作する環境における微粒子の予備検査方法に関する。
背景技術
遺伝子操作において液体操作ないしは固体操作を行う場合、遺伝子を含む微小飛沫（微粒子）が発生することが考えられる。そのような微小飛沫は作業所内の空間中を漂い、思いも懸けない所に飛散する可能性がある。例えば、典型的なヒトＣ型肝炎を考えた場合、重篤患者のウィルス遺伝子濃度は約１０^８ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以下といわれている。（以下、「ｃｏｐｙ」を核酸数、「Ｌ」をリットル（ｄｍ^３）とする。）このうちＣ型肝炎ウィルス遺伝子１ｃｏｐｙが混入（コンタミネーション）するには、１０ｐＬ程度あれば十分である。即ち遺伝子操作では、このように極微量な遺伝子溶液の検出精度が要求される。従って遺伝子操作の各工程では、ごく僅かな遺伝子溶液のコンタミネーションも許されないため、高感度なコンタミネーション評価法が必要になる。しかし、遺伝子を含む溶液操作により生じる微小飛沫の飛散分布を高感度に確認するための方法は存在しなかった。唯一ウィルス遺伝子１ｃｏｐｙの混入を検出する方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法があるが、当該ＰＣＲは容器内に混入した微小飛沫しか認識することができず、容器外を含めた飛沫分布を確認することはできなかった。
ここで遺伝子診断の場合を考えると、医師は患者のウィルス遺伝子濃度に従って投与する治療薬の最適量を決定するため、ウィルス遺伝子濃度は正確に測定されるべきである。しかし、ウィルス遺伝子を含む液体操作において多数検体を同時に行う際に微小飛沫が発生すると、当該微小飛沫が他の検体に混入して正確なウィルス遺伝子濃度の測定ができない。例えば、本来陰性患者の検体に、高濃度のウィルス遺伝子を含む微小飛沫が混入した場合、感染もしていないのに陽性と診断される可能性（擬陽性）がある。また本来陽性患者の検体に、ＰＣＲ阻害物質などを含む微小飛沫が混入した場合、感染しているのに陰性と診断される可能性（擬陰性）がある。その他、試料を取り扱う場合に、その操作の妥当性，安全性などを事前に評価するために、その操作によって飛散するであろう試料の状況を正確に事前検査または事前確認することは、極めて重要である。しかも臨床検査となると、その確認方法は簡便且つ短時間に行えるものでなければない。
本発明は、液体操作ないしは固体操作により生じる飛沫の分布を極めて容易、且つ高精度に検査する方法及び装置を提供することに関する。
発明の開示
本発明は、所定の試料を所定の検査手順に従い処理した際の微粒子発生状況を確認できる、模擬検査手順，発光手順，検出手順を含む予備検査方法に関する。
模擬検査手順は、化学発光触媒を含む模擬試料を、所定の検査工程に従い取り扱う手順である。模擬試料は、所定の試料と近似する物性を有するため、飛散した模擬試料の飛散分布は、実際の検査工程によって生じる試料の飛散状況を再現したものとなる。
発光手順は、検査工程の実施により飛散した模擬試料の微粒子と、微粒子検出溶液を、担体を介して反応させる手順である。微粒子検出溶液は、模擬試料と反応して顕著に発光する溶液である。微粒子検出溶液と模擬試料は担体を介して接触するため、発光反応は長時間持続する。このため、極微量な模擬試料であっても顕著な発光を生じる。さらに、担体の特定位置に発光が生じ、これは微粒子の位置情報に依存している。
検出手順は、この発光に基づいて模擬試料の飛散分布を検出し、実際の検査工程により生じる試料の飛散状況を確認する。これにより、所定の試料を所定の検査工程に従い処理した際の微粒子発生状況を極めて容易、且つ高精度に事前検査できる。
また、本発明は、化学発光触媒を有する微粒子を、担体を介して微粒子検出溶液と反応させる微粒子検出方法、及び微粒子検出器具のセットに関する。
担体は、微粒子検出溶液を保持できる材質から成り、基質溶液を含有した微粒子検出溶液によりほぼ一様に潤おされている。ここで、微粒子と微粒子検出溶液が担体を介して接触すると、微粒子中の化学発光触媒が、微粒子検出溶液中に溶解し、発光反応を生じながら拡散する。つまり、微粒子位置を中心に発光が開始し、発光点がその周囲に拡大する。この発光を観察すると、微粒子の位置を容易かつ高精度に確認できる。
本発明における用語は、以下の意味で用いる。
試料；核酸，ウイルス，粉体，結晶などを含む溶液、又は固体であり、実際に検査，調査等の対象となる物質である。本発明において、実際の作業を行って飛散状況を検出することは、病原由来物質や特定核酸の核酸につながる可能性があるので、事前検査に実際の試料を使用することは困難である。
検査工程；所定の試料について実施する処理工程の組合せであり、例えば、試料を操作，分析，検査等する工程群の全体又は一部である。処理工程は、以下のものを含む広義の概念である。
１）生化学的反応工程のような１反応プロセス（例えば、ＰＣＲの試薬投入工程）
２）１つの分析機器における分析プロセス（例えば、分注工程）
３）複数の分析機器の組合せプロセス（例えば、核酸抽出装置と核酸増幅装置を組合せた核酸増幅工程）
４）作業所の処理環境（例えば、実験室の換気孔に起因した空気流）
検査対象試料；前記試料のうち、特定の前記検査工程における処理の対象となるものを意味する。
模擬試料；実際の検査や調査に使用される上記試料に代えて、物性（粘度，沸点，比重，粒径，粒度分布など）を模擬した液体試料又は固体試料である。
近似する物性；物性の各項目（粘度，沸点，比重，粒径，粒度分布など）の少なくとも一つが近似する意味である。特に、模擬試料と試料の粘度を近似させると、実際の作業によって生じる試料の飛散状況を再現できる。
模擬実験；模擬試料を用いて、実際の作業と実質的に同じ手順で実施する、検査工程，調査工程等の作業である。ただし、全ての検査工程，調査工程等を実施する必要はなく、場合により、飛沫飛散に関連する一部工程のみ実施でも良い。
微粒子；例えば、検査工程から飛散した模擬試料から成る微小飛沫であり、液状，固体状、及びその混合系を含む。浮遊中は湿潤状態、固着後は乾燥状態とを含む。
基質溶液；触媒によって顕著な発光を示す化学物質であり、例えば、ルミノールと酸化剤の混合液である。基質溶液は、微量の化学発光触媒に対し高感度に反応し発光する。発光時間のプロフィールは、光子積算の操作時間を考慮して、１分以降に極大を迎え、長時間発光するものが好ましい。
化学発光触媒；乾燥，湿潤に拘わらず、基質溶液と反応して顕著な発光を示す化学物質である。化学発光触媒は、微量な金属，微量な酵素等であり、例えばコバルトである。
担体；基質溶液を保持でき、化学発光触媒に基質溶液を供給できる物質であり、適当な方法で取り扱いできる程度の機械的強度を備えたものである。無色透明が望ましいが、不透明でも、化学発光が十分透過すれば良い。好適には、多孔質物質（ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）の濾紙，アガロースゲル，多孔質シリコン等である。ただし、親水化物質等を利用することもできる。
シート状（シート形状）；担体の微粒子検出領域の厚みが、略一定である形状をいう。つまり、一般的な平面形状のみならず、微粒子検出領域である中心部は平面形状であるが、その周辺部は盛り上がった形状等も含む。
核酸処理装置；核酸を含有する液体，固体等を処理して、所定目的を達成するための装置であり、例えば、遺伝子検査装置，分注装置である。
この発明の前記、及びその他の新規な特徴と利益について、添付図面を参照して説明する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の理解を容易にするため、以下の実施例の順序に従い本発明を説明する。
実施例１は、微粒子検出の基本的原理と、微粒子検出に用いる器具と各試薬に関する。
実施例２は、核酸処理装置の操作により生じる微小飛沫（微粒子）の飛散分布を、予備実験により高感度に検出する方法に関する。
実施例３、及び４は、予備実験を行うことにより、核酸処理装置からの微小飛沫（微粒子）の飛散を低減する方法に関する。
実施例５は、微粒子検出に用いる器具を保存する容器に関する。
実施例１
第１図は、微粒子検出の概略図であり、第１図（ａ）はその斜視図、第１図（ｂ）は第１図（ａ）のＡＢにおける断面図である。以下、図面を参照し、微粒子検出の基本的原理と、微粒子検出に用いる器具と各試薬について説明する。
飛沫（微粒子）３は、基盤７上に存在し、化学発光触媒溶液から成る。この飛沫３を検出するため、本実施例では、微粒子検出溶液を含んだシート１（担体）と、透明板８を用いる。
飛沫検出に用いるシート１（担体）は、シート形状の多孔体であり、微粒子検出溶液を浸潤して保持できる。例えば、濾紙，アガロースゲル等である。本実施例では、一辺が１５センチの正方形で、厚みが５００μｍの濾紙を用いている。このシート１の厚さは、上記シート１が無色透明であれば厚くてもよい。しかし、濾紙のような不透明なもの、アガロースゲル等厚いと不透明になるもの、ないし有色のものは、できるだけ薄い方が望ましい。つまり、微粒子に起因した化学発光を検出できる程度に、シート１は可視光を透過する必要がある。厚みが約５００μｍ以下の濾紙であれば、化学発光が十分透過することが分かっている。また、シート１の厚みは、微小飛沫３上に置載等する際に破けない程度の機械的強度を必要とする。自由な屈曲に対応できるよう、ヤング率の低い弾性体を用いると好ましい。
透明板８は、本実施例ではガラス板を用いる。しかし、これに限定されるものでなく、シート１が貼り付けられる平面を有し、化学発光を透過し、或る程度の機械的強度を備えた部材であればよい。例えば、アクリル樹脂等の透明樹脂を用いることもできる。透明板８により、基質溶液によるシート１の浸潤作業が容易に行え、シート１を基盤７へ正確に貼り付けることができる。さらに、シート１からの基質溶液の乾燥を防ぐことができる。また、透明板８の表面を塩化ビニリデン膜等で被うと、基質溶液による透明板８の汚染を防ぐことができる。
基盤７は、微粒子有無の検出対象であり、例えば、遺伝子診断装置が置かれた机や、遺伝子診断装置の在る部屋の換気孔である。基盤７の上には化学発光触媒を含有する飛沫群が存在している。検出対象である飛沫３は、例えば、遺伝子診断装置により臨床検体を取り扱う際に生じる全血や血漿の微小飛沫であり、または、人工的に発生させたＣｏ^２＋溶液の微小飛沫である。微小飛沫３の容積としては、１μＬ以下、特に１０ｐＬの微小飛沫を想定している。ウィルス遺伝子１ｃｏｐｙを混入（コンタミネーション）できる微小飛沫の最低容積が１０ｐＬ程度である。このため、１０ｐＬ程度の飛沫の存在有無を判断できれば、ウィルス遺伝子のコンタミネーションの危険性を判断できるからである。尚、１０ｐＬ程度の微小飛沫は基盤７への飛散後直ちに乾燥するため、通常固体として基盤７上に存在している。
本実施例において使用する試薬について説明する。本実施例では、化学発光であるルミノール発光を利用しており、基質溶液としてルミノール（化学発光基質）と過酸化水素水（酸化剤）の混合液を用いる。このように化学発光基質としてルミノールを用いているため、全血，血漿，血清の微小飛沫も検出できる。従って、血液等の臨床検体に特別の試薬を加えることなく、遺伝子診断装置から飛散した、遺伝子抽出前の血液等の飛散分布を検出できる。また、微小飛沫を人工的に発生させる場合は、コバルトイオン（２価金属イオン触媒）を含む溶液を用いる。以下、本実施例で用いる試薬と溶液について、その種類と１回に調製する代表的な試薬量を示す。
化学発光触媒
化学発光触媒溶液１ＭＣｏ^２＋溶液の調製方法を記述する（以下、Ｍ＝モル，Ｍ＝ｍｏｌ／Ｌ，ｍｏｌ＝６．０２×１０^２３ｍｏｌｅｃｕｌｅｓとする）。具体的には、２価の塩化コバルト６水和物２．３８ｇ（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、製造元：和光純薬工業、０３６−０３６８２）を超純水８ｍＬ（Ｈ_２Ｏ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）に溶かし、全体量が１０ｍＬになるまで超純水を適宜加える。但しＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅは潮解性があるので、調製前の試料は、デシケータ内に乾燥保存する。調製した溶液は、暗所で保存する。
基質溶液
基質溶液の調製方法を記述する。具体的には、１．５ｍＭ（×１）ルミノール溶液と１０ｍＭ過酸化水素水を等量加え、ピペットなどを用いて混和する。基質溶液は実験の直前に即時調製する。但し１．５ｍＭ（×１）ルミノール溶液と１０ｍＭ過酸化水素水は、実験毎に即時調製する。また冷暗所（４℃）に保管した場合、１時間程度は使用できる。尚、冷暗所（４℃）に保存した基質溶液は、暗所で常温になってから使用する。
ここで、ルミノール溶液の調製に用いる０．１Ｍ硼酸バッファー（ｐＨ１３）の調製方法を記述する。具体的には、硼酸６１８ｍｇ（Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ、製造元：和光純薬工業、製造番号：０２１−０２１９５）を超純水７０ｍＬ（Ｈ_２Ｏ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）に溶かし、１Ｍ ＮａＯＨ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，製造元，和光純薬工業）を溶液がｐＨ１３になるまで適宜加える。そして全体量が１００ｍＬになるまで超純水を適宜加える。但しＮａＯＨは潮解性があるので、調製前の試料は、デシケータ内に乾燥保存する。調製した溶液は、暗所に保管する。
化学発光基質溶液１５ｍＭ（×２０）ルミノール溶液の調製方法を記述する。２０倍の溶液を調製するのは、上記１倍溶液のルミノールが微量で秤量できないためである。具体的には、ルミノール２．７ｍｇ（ｌｕｍｉｎｏｌ，製造元：和光純薬工業，製造番号：１２３−０２５８３）を０．１Ｍ硼酸バッファー１ｍＬに溶かす。ルミノールは溶けにくいこともあるので、完全に溶けていることを確認する。使用時には、更に０．１Ｍ硼酸バッファーで×１溶液に希釈する。ルミノール溶液は即時調製する。但し暗所に保存した場合、２日間程度は使用することもできる。また冷暗所（４℃）に保存したルミノールは、暗所で常温になってから使用する。
ここで、酸化剤１０ｍＭ過酸化水素水の調製方法を記述する。具体的には、超純水４５ｍＬ（Ｈ_２Ｏ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）に３０％過酸化水素水５０μＬ（３０％ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｏｌ．，製造元：和光純薬工業，製造番号：０８１−０４２１５）を加え、全体量が５０ｍＬになるまで超純水を適宜加える。但し３０％過酸化水素水の取り扱いには、手袋や防護眼鏡など保護具を着用し、十分注意する。調製した溶液は、暗所で保管する事。
シート１（担体）を用いた微粒子の検出手順について、説明する。
先ず、シート１（１５センチ四方の平坦な濾紙）を、金属的に清浄なピンセットを用いて、透明板８上に置く。透明板８表面を塩化ビニリデン膜等で被うと、基質溶液による透明板８の汚染を防ぐことができる。
次に、シート１に基質溶液（本実施例では、化学発光基質であるルミノール溶液と酸化剤である過酸化水素水の混合液）を浸潤させる。浸潤は、透明板８上に固定されたシート１の上から、基質溶液５ｍＬを一様に滴下して行われる。これにより、基質溶液を含んだシート１を作製するとともに、透明板８に基質溶液を含んだシート１を固定することができる。この際、基質溶液の容量が少なかったり、基質溶液を一様に滴下しなかったりすると、基質溶液を含んだシート１に凹凸が発生する。そこで、金属的に清浄なマイクロチップの腹等により、基質溶液を含んだシート１を均し、平坦に透明板８へ密着させる。
そして、この透明板８を操作して、上記微小飛沫３が存在する基盤７上に、シート１を貼り付ける。基質溶液を含んだシート１が、化学発光触媒溶液の微小飛沫３と接触すると、乾燥した微小飛沫３が基質溶液に溶け出す。これにより、化学発光触媒と基質溶液が反応し、シート１上の飛沫群の存在位置に対応する位置に発光点９が生じる。この発光点９は、微小飛沫がシート１中を拡散するに従い拡大する。また、このシート１は基質溶液を多量に含んでいるため、長時間発光を持続させることができる。さらに、シート１は基質溶液を一様に含んでいるため、発光点９の発光状態（光度等）は、シート１と微小飛沫３の接触位置による影響を受けにくい。つまり、シート１上と飛沫３の接触位置に関わらず、ほぼ均一な発光点９が生じる。しかも、シート１を基盤７の上方からゆっくりと貼り付けることができるため、例えば霧吹き等で基質溶液を散布する場合に比較し、検出時の微小飛沫移動量が小さい。従って、シート１上の発光点９を観察することにより、微小飛沫３の飛散分布を正確に確認することができる。また、シート１からの化学発光は、簡単な暗箱を利用してシート１の周囲を暗くすると肉眼で十分確認できるため、検出作業が非常に容易である。
以下、本実施例にかかる微粒子検出方法の効果について調べた評価実験の結果を述べる。本実験では、先ず、基盤７上に人工的に１０ｐＬ程度の化学発光触媒溶液の微小飛沫３を生成し、次に顕微鏡１０により微小飛沫の位置を検出する。そして、本飛沫群検出方法により微小飛沫の位置を検出し、顕微鏡１０による結果と、本方法による結果を比較して評価する。
ここで、１０ｐＬ程度の化学発光触媒溶液の微小飛沫３を、基盤７上に生成する方法について説明する。微小飛沫３による汚染を防ぐため、基盤７上を塩化ビニリデン膜等で被い、また、周囲を閉塞した無風状態の空間で作業することが望ましい。基盤７上に置かれた平坦なパラフィンフィルムに化学発光触媒溶液（ＩＭＣｏ^２＋溶液）を５０μＬ滴下し、当該化学発光触媒溶液にシリコナイズされたマイクロチップを用いて空気５００μＬを２回程度送り込み、化学発光触媒溶液を発泡させる。これにより、基盤７上にｐＬ〜ｎＬ程度の化学発光触媒溶液の微小飛沫３が生成される。最後に、上記化学発光触媒溶液を滴下したパラフィンフィルムを慎重に除去し、生成作業は終了する。
顕微鏡１０による、微小飛沫の飛散位置及び状態の確認方法について説明する。まず、化学発光触媒溶液の微小飛沫３が存在する基盤７を顕微鏡１０で観察して、微小飛沫３を捜索し、飛沫位置を肉眼により認識できる大きさでマーキングする。次に、当該化学発光触媒溶液の微小飛沫３の直径を記録する。ここで、微小飛沫３を半球と仮定し、顕微鏡１０で計測した直径から微小飛沫３の容量を算出する。そして、顕微鏡１０による観察が全て終了したら、基盤７は顕微鏡１０下から元の位置に戻す。
第２図は、発光点９を検出するＣＣＤカメラ１１と、発光反応系（基盤７，シート１，透明板８）を遮光する暗箱８と、ＣＣＤカメラ１１からのデータを処理する画像処理装置１２と、当該画像処理装置１２を制御するコンピュータ１３からなる検出系による、シート１上に存在する発光点９の検出方法の概略図である。以下、第２図を参照して、本実施例による飛沫群の飛散状況の検出方法について説明する。尚、以下の操作は全て暗箱１４内で行われる。
まず、基盤７上の微小飛沫３を、上記マーキングを参考にＣＣＤカメラ１１の計測範囲に据える。ＣＣＤカメラ１１の視野は約１６ｃｍ×１６ｃｍである。また画像処理装置１２を用いて光子積算を行い、発光点９からの総光子量を計測できるようにする。そして、基質溶液を含んだシート１を固定した透明板８を、微小飛沫３を置載した基盤７に接触させる（ｔ＝０）。その後、直ちに暗箱１４を密閉し、一定時間後（ｔ＝２５ｓ）、画像処理装置１２によって光子積算を１分間行う。尚、化学発光基質と化学発光触媒を接触させると、約２分後に発光の極大を迎え、急激に衰退する。しかし、化学発光触媒が担体中を拡散し、次々と化学発光基質と反応するため、肉眼でも観測できる非常に強い発光点を長時間観測できる。この結果、急激に衰退する化学発光触媒溶液の微小飛沫３の位置に、肉眼でも観測できる非常に強い発光点を観測できる。また、検出した総光子量により微小飛沫の容量を算出することができる。
第３図に、顕微鏡１０下における化学発光触媒溶液の微小飛沫３の画像を示す。また、第４図に、画像処理装置１２による光子積算画像を示す。第３図と第４図を比較すると、化学発光触媒溶液の微小飛沫３（ａ，ｂ，ｃ）と、発光点９（ａ，ｂ，ｃ）との間に、位置的相関関係の存在が認められる。また、第３図に示されている化学発光触媒溶液の微小飛沫３（ａ）は、５０μｍ程度の直径から１０ｐＬ程度に相当すると推定されるが、第４図では、直径約１ｍｍ以上の大きな発光点９（ａ）として示されている。従って、１０ｐＬ程度の微小飛沫の飛散分布を高感度、且つ肉眼で検出できることが示された。
尚、本発明は、本実施例で開示した工程に限定されず、多種の態様が存在する。例えば、飛沫飛散が予想される領域に、微粒子検出溶液により浸潤した濾紙を置いた後に、飛沫が生じさせる方法である。
また、上記実験を、人工飛沫に１０^０Ｍ〜１０^−４Ｍ Ｃｏ^２＋溶液の濃度勾配をつけてそれぞれ行った。その結果、一番低濃度の１０^−４Ｍ ＣＯ^２＋溶液の場合であっても、発光点９の光度は肉眼で観測できた。従って、飛沫中の触媒濃度が１０^−４Ｍ程の低濃度であっても、飛散分布を検出できることが示された。
実施例２
本実施例は、核酸処理装置から生じる微粒子の飛散分布を、予備実験を行い高感度に検出する方法である。
以下、本検出方法の手順を説明する。先ず、微粒子の飛散分布状況を確認したい核酸処理装置により、模擬試料である発光触媒溶液（Ｃｏ^２＋溶液）を試料とみなして処理する。次に、実施例１記載の微粒子検出方法を使用して、上記化学発光触媒溶液の微小飛沫（微粒子）の飛散分布を検出する。つまり、核酸処理装置からの飛沫飛散が予想される箇所に、基質溶液を浸潤したシート１を貼り付け、発光点９の有無を確認する。これにより、ウィルス遺伝子１ｃｏｐｙのコンタミネーションの要因となる１０ｐＬ程度の飛沫飛散状況を容易かつ高精度に把握することができる。したがって、模擬試料を用いた予備実験を行うことにより、核酸処理装置のコンタミネーション発生の有無を推測できるため、実験系のバリデーションができる。更に化学試薬のみを用いる化学発光法を利用しているので、高感度で安価且つ迅速に測定が可能である。
本微粒子検出方法とＰＣＲ法の比較実験を行った。第５図は、模擬試料（λＤＮＡ溶液、又はＣｏ^２＋溶液）の投入したウェルと、コンタミネーションを検出したウェルの位置関係を示す概略図である。第６図は、ＰＣＲ法による検出結果である。第７図は本発明による検出結果である。以下、第５図〜第７図を参照して、本実施例にかかる検出方法とＰＣＲ法の比較実験の結果を説明する。
本実験では、自動分注装置（商品名：Ｂｉｏｍｅｋ２０００，製造元：Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いた。ＰＣＲ法では、模擬試料として、Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子の代わりに病原性のないλＤＮＡを採用し、ＰＣＲ法キット（製造元：ＴａＫａＲａ、製造番号：Ｒ０１１）を用いて検出した。
また本実験では、模擬試料を、ウェルの中央で吸引吐出する場合と、ウェルの側壁に液滴を接触させるように吸引吐出する場合の２種類の液体操作を行った。これは、ウェルの中央で液体の吸引吐出をすると液滴の滴下により微小飛沫は発生するが、ウェルの側壁に液滴を接触させるように吸引吐出しても微小飛沫は発生しないと考えられるためである。つまり、微小飛沫が生じる液体操作と生じない液体操作を自動分注装置で実施し、それぞれについて本検出方法とＰＣＲ法を実行した。
先ず、ＰＣＲ法によりコンタミネーションを評価した。９６穴マイクロタイタープレート（製造元：ＣＯＲＮＩＮＧ，製造番号：２５８０１）のウェルに、１０^９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬλＤＮＡ溶液（製造元：和光純薬工業，製造番号：３１８−００４１４）を１５０μＬ分注した。そのうち１００μＬを分注速度６０μＬ／ｓで２０回吸引吐出を繰り返した。第５図（ａ）に、マイクロタイタープレートへ分注した試薬の位置を示す。第５図（ａ）の◎の部分に陽性モデルとしてλＤＮＡ溶液を入れた。第５図（ｂ）は、第５図（ａ）の線ＡＢにおける断面図である。λＤＮＡのウェルに隣接したウェルには陰性モデルとして超純水２００μＬを分注した。λＤＮＡを吸引吐出する前後で、この超純水５０μＬをサンプルとしてコンタミネーションを評価した。この条件において、吸引吐出後の超純水から１０^２ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのλＤＮＡが検出されれば、１０ｐＬ程度のλＤＮＡを含んだ飛沫が超純水にコンタミネーション（擬陽性）した計算になる。第６図に、ＰＣＲ法による検出結果を示す。第６図は、λＤＮＡ溶液に隣接するウェルのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した後にＥｔＢｒ染色したものである。Ａ−Ｅは９６穴マイクロタイタープレートのウェルを示し、Ｍは遺伝子の分子量マーカーを示す。ウェルの側壁に液滴を接触させるように溶液を吸引吐出した場合（第６図（ａ））、２０回λＤＮＡ溶液を吸引吐出する前後において隣接するウェルにコンタミネーションを示すバンドは確認されなかった（実験回数：３）。一方、ウェルの中央でλＤＮＡ溶液を吸引吐出した場合（第６図（ｂ））、分注操作を行う前はλＤＮＡ溶液に隣接するウェルにおいてコンタミネーションは検出されなかった。しかし、λＤＮＡ溶液を２０回吸引吐出した結果、第６図（ｂ）の１列目Ｂのウェルに核酸の存在を示すバンドが検出された（図中矢印）。同時に泳動した分子量マーカー（Ｍ）より、このバンドはＰＣＲ法によって増幅したλＤＮＡの分子量と一致したためコンタミネーションの存在が確認された。更に既知濃度のλＤＮＡ希釈系列より、検出されたコンタミネーション量は、１０^２ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ〜１０^３ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであることが判明した（実験回数：３）。
同様に本微粒子検出方法についても、ウェルの側壁に液滴を接触させるように吸引吐出する場合と、ウェルの中央で吸引吐出する場合それぞれについて、コンタミネーションを評価した。９６穴マイクロタイタープレートに、ＰＣＲ法におけるλＤＮＡ溶液の代替として１ＭＣｏ^２＋溶液を１５０μＬ分注した。そして、１００μＬの１ＭＣｏ^２＋溶液を、分注速度６０μＬ／ｓで２０回吸引吐出を繰り返した。第５図（ａ）に、マイクロタイタープレートへ模擬試料を分注した位置を示す。第５図（ａ）の◎の部分に、陽性モデルとして化学発光触媒Ｃｏ^２＋溶液を入れた。当該Ｃｏ^２＋溶液のウェル以外のプレート上にパラフィンフィルムを置載し、上記Ｃｏ^２＋溶液を２０回吸引吐出後、上記パラフィンフィルムを金属的に清浄なピンセットなどを用いて基盤７上に置載した。そして暗箱１４内で、透明板８に固定した基質溶液を浸潤したシート１を、上記Ｃｏ^２＋溶液の微小飛沫が付着しているパラフィンフィルムに接触させた。当該パラフィンフィルムを透明板８に固定した濾紙４に接触させてから２５秒後に１分間光子積算測定を行った。その検出結果を第７図に示す。尚、第７図においてＡ−ＥはＰＣＲ法と同様９６穴マイクロタイタープレートの行を示し、１−４の数字は同じく列を示す。また、第７図中の白い○及び◎は、９６穴マイクロタイタープレートのウェル位置を表す。ウェルの側壁に液滴を接触させるように溶液を吸引吐出した場合は（第７図（ａ））、化学発光触媒Ｃｏ^２＋溶液を吸引吐出する前後いずれにおいても、隣接するウェル上のパラフィンフィルムにコンタミネーションを示す発光点９は存在しない（実験回数：３）。一方、ウェルの中央で化学発光触媒Ｃｏ^２＋溶液を吸引吐出した場合（第７図（ｂ））、分注操作を行う前は当該Ｃｏ^２＋溶液に隣接するパラフィンフィルムにおいてコンタミネーションは検出されなかった。しかし、上記Ｃｏ^２＋溶液を２０回吸引吐出する分注操作後は、コンタミネーションを示す多くの発光点９が認められた。具体的には、Ｃｏ^２＋溶液に隣接するウェル３列Ｄ行と４列Ｄ行に大きな発光があり、その周辺を含めて合計５つの発光点９が存在している（実験回数：３）。
ここで、ＰＣＲ法と本微粒子検出法を比較すると、ＰＣＲ法は核酸増幅を行うウェル内のコンタミネーション、つまり、上記３列Ｄ行と４列Ｄ行のウェルのコンタミネーションしか検出できない。しかし、本検出法はウェル以外のコンタミネーションについても検出できることが理解できる。つまり、本検出法は、高感度な遺伝子検出法として普及しているＰＣＲ法では検出できないウェル周辺の飛散分布を明瞭に把握することができる。
実施例３
本実施例は、実施例１又は実施例２の微粒子検出法を利用した予備実験により、核酸処理装置から飛散する微粒子を抑制する方法に関する。以下、実施例１及び実施例２と比較した場合の特徴的部分を記載する。
遺伝子操作作業において作業者の予想に反する実験結果を得ることがある。特に増幅反応を伴う場合、本来増幅しない遺伝子が増幅したり、逆に、増幅すべき遺伝子が全く増幅しないことがある。この原因は、不適切な液体操作ないしは固体操作とそれによる作業所の汚染である。すなわち、本来増幅しない遺伝子の増幅は、実験系に予期せぬ遺伝子がコンタミネーションしたことが原因である。また、全く増幅しないのは、実験系にＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅなどの消化酵素ないしは増幅反応の阻害物質がコンタミネーションした結果である。ここで、コンタミネーションは二つに大別される。一つは多検体間のキャリーオーバーであり、もう一つは核酸含有微小飛沫の飛散である。このうちキャリーオーバーは、使用器具の洗浄やディスポーザブル化によって解決できることが多い。一方、飛沫３の飛散の場合、その存在の把握が難しいため解決が困難である。なぜなら、例えば気圧１０^５Ｐａ且つ無風状態における直径ｄ＝５μｍの微小飛沫の重力沈降速度は約１ｍｍ／ｓであるため（謝国平：『エアロゾル研究』，９（１），ｐ．７−１３（１９９４））、遺伝子作業中にその周囲を人が往来したり、エアコンないしは換気扇が稼動している状態では、発生した飛沫３が作業所内を数十分間も漂うため、作業者が予期せぬ場所に飛散するからである。
そこで、例えば遺伝子診断装置が配置された部屋等、遺伝子を扱う作業所において実施例１及び実施例２の方法を実施すると上記の問題が解決できる。以下、その具体的方法を説明する。
先ず、遺伝子診断方法，実験方法等の、試料を取り扱う検査手順を特定し、該試料の代替として模擬試料を調製する。飛特に好適な模擬試料は、化学発光触媒を含む溶液であり、その濃度，溶媒などを選択して目的の模擬試料を作成する。模擬試料は、粘度，沸点，比重，粒径，粒度分布など物性を模擬した液体又は固体試料が望ましい。これにより、実際の作業によって生じる試料の飛散状況が再現できる。特に、模擬試料の粘度が、試料の粘度に近似すると、飛散状況の再現性が高まる。「近似」とは、飛散状況の再現性が、所定の目的を達成できる程度の広い意味である。通常の核酸含有試料の飛散状況調査に対しては、Ｃｏ^２＋溶液で十分である。ただし、試料とＣｏ^２＋溶液の物理化学的性質が顕著に異なる場合、デキストロースなど不活性な物質を加えて粘度などを調節する。粘度調製を必要とするものに、例えば、ウィルス外膜を溶解する６Ｍグアニジン誘導体がある。
次に、模擬試料を用いて例えばＢｉｏｍｅｋ２０００により分注操作，液体移動操作を取り扱う。例えば、通常の環境において、模擬試料をＢｉｏｍｅｋ２０００により処理する。分注操作では、最初上記流速で吸引吐出を繰り返す。そして液体移動操作では、一度吸引した溶液をＸ軸−Ｙ軸レールにより別の容器に移動させる。この際、分注操作と移動中に飛沫が飛散するおそれが考えられる。そして各処理工程において、飛沫飛散が予想される場所に、実施例１に記載した透明板８に固定した基質溶液を含んだシート１を接触させる。例えば、Ｂｉｏｍｅｋ２０００内のプレート，Ｂｉｏｍｅｋ２０００機体、またＢｉｏｍｅｋ２０００は開放系のため、作業台周辺等にシート１を貼り付けする。平面以外の部位は、透明板８を用いずにシート１を接触させる。場合により、作業手袋にも当該基質溶液を含んだシート１を接触させる。そして、シート１からの発光の有無を観測することにより、各処理工程における微小飛沫の飛散状況が確認できる。これにより、微小飛沫３の飛散分布が確認できれば、ここまでの液体操作、及び固体操作等の処理工程にて、上記遺伝子含有溶液が飛散したと判断することができる。特に、多サンプルを同時に扱う場合は、サンプル間のコンタミネーション発生を予測できる。
この結果に基づいて、作業プロセス、及び遺伝子取扱装置を見直すことにより、検査手順の各処理工程における飛沫３の発生を防ぐことができる。例えばＢｉｏｍｅｋ２０００における吸引吐出の場合、流速や吐出する容器との位置関係を最適化することにより、コンタミネーションを防止することができる。また液体移動操作の場合、チップの空気漏れや液体からの抜き差し速度，移動する速度及び加速度，移動先での流速や吐出する容器との位置関係などを最適化することにより、コンタミネーションを防止することができる。このため、試料取扱作業時における飛沫飛散を抑止できる。
実施例４
本実施例は、実施例１又は実施例２の微粒子検出法を利用して、核酸処理装置が配置された施設の清浄を担保する方法である。以下、実施例１及び実施例２と比較した場合の特徴的部分を記載する。
様々な実験系において、有害物質を取り扱うことがある。その際、保護具などを装着することが厚生労働省の安全基準で義務付けられているが、無意識の内に、作業者が保護具などにより作業所内外を有害物質で汚染していることがある。即ち、上記有害物質を用いて頻繁に使用する実験装置、及びその周辺器具、ないしは作業所の扉ノブ等を、上記有害物質が付着する可能性の高い保護手袋を着けたまま無意識に触れてしまう為である。また、作業者の知らないうちに、実験装置等から飛散し浮遊した有害物質を含む微粒子が、作業所内に拡散している可能性もあり、換気口等から作業所外に漏洩することもある。これは作業者の健康環境上非常に重要な問題である。これを解決するためには、汚染箇所を速やかに清掃するとともに、作業者の意識向上を図る必要もある。
本実施例では、上記問題を次の様に解決する。先ず、有害物質の代替として模擬試料を実験系で利用し、作業者は通常と同様に、液体ないしは固体操作作業をする。模擬試料は、有害物質の物性（粘度，沸点，比重，粒径，粒度分布など）と近似したものとする。次に作業所内に隈なく透明板８に固定した基質溶液を含んだシート１を接触させる。平面以外の部位は、透明板８を用いず上記基質溶液を含んだシート１を当該部位に接触させる。特に、粉体操作を行う場合、作業者が粉体を直接吸入したり、換気口から作業所外へ漏洩したりする可能性が高いため、換気口の内側及び外側周辺に基質溶液を含んだシート１を接触させる。これにより、模擬試料が飛散した箇所に発光点９を発生する。そして、発光点９の分布（飛沫３の飛散分布）の確認により、当該分布が有害物質による汚染箇所と判断できる。とりわけ、作業所外において飛沫分布が認められたときは上記有害物質が作業所外に漏洩している可能性が高く、早急に漏洩防止手段を講じることが必要である。
従って、有害物質を取り扱う作業所内外における、液体操作、又は固体操作による汚染について、状況所見を得ることが可能になる。
実施例５
本実施例は、実施例１〜４で説明されたシート１を即使用できる状態で、運搬及び保管する密閉容器である。第８図（Ａ）は保存時の透視図をしめす。第８図（Ｂ）は、運搬時における、第８図（Ａ）の線分ＡＢの断面図を示す。そして、第８図（Ｃ）は、調製時における、第８図（Ａ）の線分ＡＢの断面図を示す。以下、第８図（Ａ）〜（Ｃ）を参照に、本実施例４にかかる密閉容器２を説明する。
シート１に浸潤される基質溶液（化学発光基質４と酸化剤５の混合液）は、化学発光触媒（例えばコバルトイオン）が存在しなくても、接触することで徐々に反応する。そのため、化学発光基質４と酸化剤５は微小飛沫検出直前まで隔離しておく必要がある。
そのため、本実施例にかかる密閉容器２は、例えばアルミ箔に樹脂を裏打ちした材料で構成され、化学発光基質４及び酸化剤５を別々に収容する空間を有し、両者を分離して保存する。密封容器２は、化学発光基質４と酸化剤５を強い隔壁で隔離し、化学発光基質４及び酸化剤５とその下のシート１を脆い隔膜で隔離して、普段はこの状態で三者を保存する。
シート１を使用するときは、中央の取っ手を両側に引っ張ることで力Ｆを加えて脆い隔膜を破り、化学発光基質４及び酸化剤５の混合液をシート１に浸潤させる。密閉容器２のシート１が収納されている側に切り口が形成されているため、作業者はここから密閉容器２を開封して基質溶液が浸潤したシート１を取り出すことが出来る。
尚、本実施例では密封容器２が、シート１を化学発光基質４及び酸化剤５と分離して保持しているがこれに限定されるものではなく、シート１が一方の溶液を浸潤するように保持してもよい。
また、シート１は、化学発光基質４及び酸化剤５と一体に保存される必要はない。例えば、筒状の密閉容器２に化学発光基質４及び酸化剤５を脆い隔膜で隔離して保存し、シート１を別の清浄な容器で分離して保存することもできる。
以上により、化学発光触媒を含有する微小飛沫を即座に検出できる状態でシート１を保存することができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、病原菌などの有害物質、あるいは特定核酸等を含む試料を取り扱う際に発生する飛沫の飛散分布を、容易かつ高精度に検出することができる。これにより、試料を取り扱う作業の安全性，妥当性等を確認でき、また、作業により飛散する試料を低減できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、シート１と透明板８の使用状態を示す。
第２図は、微粒子の飛散位置及び状態の確認方法。
第３図は、顕微鏡３下における化学発光触媒溶液の微粒子２の画像を示す。
第４図は、画像処理装置９による光子積算画像を示す。
第５図は、マイクロタイタープレートへ試薬を分注した位置を示す。
第６図は、ＰＣＲ法による実際の液体操作によるコンタミネーション検出結果を示す。
第７図は、実際の液体操作によるコンタミネーション検出結果を示す。
第８図は、密閉容器を示す。

Claims (20)

1. 以下の手順を含む予備検査方法。
   （１）検査対象試料と同一、又は近似する物性を有し、かつ化学発光触媒を含む模擬試料を、検査工程により取り扱う模擬検査手順。
   （２）模擬検査手順において飛散した模擬試料と、基質溶液を、担体において反応させ、発光を生じさせる発光手順。
   （３）前記検査工程に起因する微粒子の飛散分布を検出する検出手順。
2. 請求の範囲１記載の予備検査方法であって、以下の手順を含む方法。
   （４）前記検査工程を変更し、前記模擬検査手順，前記発光手順、及び前記検出手順を再度行う調製手順。
3. 特許請求の範囲１記載の予備検査方法であって、
   前記手順（２）が、「模擬検査手順により飛散した模擬試料を含む領域に、基質溶液により潤された担体を接触させ、飛散した模擬試料と基質溶液を担体において反応させ、発光を生じさせる発光手順」である予備検査方法。
4. 特許請求の範囲１記載の予備検査方法であって、
   前記担体がシート形状である予備検査方法。
5. 特許請求の範囲２記載の予備検査方法であって、
   前記手順（４）が、「検出手順において１０ピコリットル以上の微粒子の飛散を検出した場合、前記検査工程を変更し、前記模擬検査手順，前記発光手順、及び前記検出手順を再度行う調製手順」である予備検査方法。
6. 特許請求の範囲１記載の予備検査方法であって、
   前記化学発光触媒がコバルトを含み、前記基質溶液がルミノールを含む予備検査方法。
7. 請求の範囲１記載の予備検査方法であって、
   前記検査工程が、検査対象試料を核酸処理装置により処理する工程を含む予備検査方法。
8. 請求の範囲１記載の予備検査方法であって、
   前記手順（３）が、「発光を光子積算測定し、検査工程に起因する微粒子の飛散分布を検出する検出手順」である予備検査方法。
9. 以下の手順を含む微粒子検出方法。
   （１）化学発光触媒を含む微粒子と、シート形状の担体を接触させる接触手順
   （２）担体において、前記微粒子と、基質溶液を反応させ、微粒子の位置情報に依存した発光を前記担体から生じさせる発光手順。
   （３）前記発光に基づいて、微粒子を検出する検出手順。
10. 請求項９記載の微粒子検出法であって、
    前記手順（１）が、「化学発光触媒を含む微粒子と、基質溶液により潤されたシート形状の担体を接触させる接触手順」である微粒子検出法。
11. 請求項１０記載の微粒子検出法であって、
    前記基質溶液が、ルミノールを含む微粒子検出法。
12. 請求項９記載の微粒子検出法であって、
    前記手順（３）が、「前記発光に基づいて、１０ピコリットル以上の微粒子を検出する検出手順」である微粒子検出方法。
13. 請求項９記載の微粒子検出法であって、
    核酸分析装置から飛散した微粒子を検出する微粒子検出法。
14. 請求項９記載の微粒子検出方法であって、
    前記手順（３）が、「発光を光子積算測定して、微粒子を検出する手順」である飛沫群検出法。
15. 以下の部材を含む微粒子検出器具セット。
    （１）化学発光触媒を含む模擬試料。
    （２）基質溶液を含む微粒子検出溶液。
    （３）微粒子検出溶液を保持できる担体。
16. 請求の範囲１５記載の微粒子検出器具セットであって、
    前記担体が多孔質である微粒子検出器具セット。
17. 請求の範囲１５記載の微粒子検出器具セットであって、
    前記担体がシート形状である微粒子検出器具セット。
18. 請求の範囲１５記載の微粒子検出器具セットであって、
    前記模擬試料の物性が、検査対象試料の物性と、同一又は近似している微粒子検出器具セット。
19. 請求の範囲１５記載の微粒子検出器具セットであって、
    前記化学発光触媒が、コバルトを含む微粒子検出器具セット。
20. 請求の範囲１５記載の微粒子検出器具セットであって、
    前記基質溶液が、ルミノールを含む微粒子検出器具セット。

Images